Dr Banu Cahide Tel. Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Ab.D., Sıhhiye Ankara. Parkinson Hastalığı

Transkript

1 MPTP'li marmosetler (Callithrix jacchus) üzerinde kronik L-DOPA ve D-2/D-3 dopamin agonisti tedavisinin striatal kanabinoit CB1 reseptor mrna ekspresyonuna etkisi Dr Banu Cahide Tel Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Ab.D., Sıhhiye Ankara Parkinson Hastalığı İstemli hareketlere başlama zorluğu veya hareket edememe ile karakterize, ilerleyici bir nörodejeneratif hastalıktır. Kardinal semptomları: Bradikinezi/akinezi Tremor Rijidite 1

2 Parkinson Hastalığı Patolojisi, mezensefalonda bulunan Substantia nigra pars compacta daki (SNpc) melanin içeren dopaminerjik nöronların kaybına bağlı striatum denervasyonudur Basal Ganglia Devresi Premotor/motor Korteks (Glutamat) Beyin sapı ve Medulla Spinalis D -2/A2a Striatum D -1 (GABA, ENK) (GABA, SP, DYN) Globus Pallidus Eksterna (GABA) İndirekt Yolak Substantia Nigra p.compacta (dopamin) Direkt Yolak Talamus (glu) Subtalamic nucleus (glu) Globus Pallidus Interna /Substantia Nigra reticulata (GABA) Fasilitatör İnhibitör 2

3 Parkinson Hastalığı Beyin sapı ve Medulla Spinalis Premotor/motor korteks (Glutamat) D -2/A2a Striatum D -1 (GABA, ENK) (GABA, SP, DYN) External Globus Pallidus (GABA) Indirekt Yolak Substantia Nigra pc (dopamine) Direkt Yolak Talamus (glu) Subtalamic nükleus (glu) Globus Pallidus Interna /Substantia Nigra reticulata (GABA) Fasilitatör İnhibitör Patogenez Parkinson hastalığında SNpc deki dopaminerjik nöronların selektif ölüm sebebi bilinmemekte çevresel toksinler viral enfeksiyonlar serbest oksijen radikalleri genetik yatkınlık gibi faktörlerin biraraya gelmesi ile meydana geldiği sanılmaktadır (Betarbet ve ark., 2000; McNaught ve ark., 2001; Dauer ve Przedborski, 2003; Dawson ve Dawson, 2003; Di Monte, 2003). 3

4 Tedavi En yaygın olarak kullanılan tedavi dopamin replasmanı ya da dopamin agonistleri ile tedavidir. L-DOPA (L-3,4-dihidroksi fenilalanin), dopaminin metabolik prekürsörüdür ve Parkinson hastalığı tedavisinde kullanılan en potent ilaçtır. Uzun süreli L-DOPA tedavisi yan etkilerini de beraberinde getirir. L-DOPA Yan etkileri Psişik yan tesirler Cevaptaki flüktüasyonlar On-off (aç-kapa) olayı Doz sonu akinezisi Gİ bozukluk Kardiyovasküler yan tesirler Diskineziler 4

5 Diskineziler Korea, üst ve alt ekstremitelerin istemsiz, düzensiz, sık, asimetrik hızlı ve kısa süreli hareketleri Atetoz, ekstremitelerin istemsiz, düzensiz yavaş hareketi, Ballismus, bir ekstremitenin bütününün şidettli salınımı Distoni, uzun süreli istemsiz kas kasılmaları, anormal ekstremite postürünün uzun süre Diskineziler Nigrostriatal dejenerasyon derecesi Dopaminerjik stimülasyon derecesi Dopamin reseptörlerinin non-fizyolojik uyarımı Bazal gangliyonlarda bulunan direkt ve indirekt yolakların arasındaki dengenin bozulması 5

6 Diskinezilerde ileri sürülen Bazal Ganglia Akışşeması Premotor/Motor Korteks (Glutamat) Beyin sapı ve Medulla Spinalis Striatum D -2/A2a D -1 (GABA, ENK) (GABA, SP, DYN) Globus Pallidus Eksterna (GABA) Indirekt Yolak Substantia Nigra pc (Dopamine) Direkt Yolak Talamus (Glu) Subtalamic nucleus (Glu) Globus Pallidus Interna /Substantia Nigra reticulata (GABA) Fasilitatör İnhibitör Dopamin D2/D3 agonistleri bromokriptin ropinirol piribedil düşük diskinezi oluşturma potansiyeline sahip, kronik kullanımda terapötik etki 2 yıldan sonra azalır 6

7 Dopaminerjik tedavi Nörodejenerasyonun ilerlemesi Tolerans gelişimi nedeniyle ilaçların etkinliği kaybolmakta ve yan etkiler gelişmektedir. Sonuç olarak, tedavinin yan etkilerinden korunarak uzun süreli fayda sağlamak için yeni farmakolojik ajanların ya da hedeflerin geliştirilmesine gerek vardır. Yeni hedef:kanabinoitler Marihuana'nın (Cannabis sativa) etken maddesi olan Δ-9-tetrahidrokanabinol, motor etkileri kanabinoit CB1 üzerinden değiştirir Rimonabant'ın L-DOPA ile indüklenen diskinezileri azalttığı, MPTP'li marmosetlerde endojen kanabinoitlerin arttığı gösterilmiştir. 6-OHDA ile lezyonlanmış sıçanlarda L-DOPA uygulamasında CB1 mrna artışı (Zeng ve ark., 1999). 7

8 Amaç Parkinson hastalığında striatumda, değişik derecelerde diskinezi oluşturan L-DOPA ve dopamin D2/D3 agonistleri (bromokriptin, ropinirol ve piribedil) ile maniplasyonunun kanabinoit CB1 reseptörlerine etkisi marmosetler üzerinde in situ hibridizasyon yöntemiyle araştırılmıştır. MPTP uygulanmış marmoset modeli MPPP sentetik eroin türevi (1982) MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin) MAO B MPTP MPP + (glia) Dopaminerjik terminallerden uptake Kompleks I inhibisyonu Hayvan modeline insanlardan uygulanmıştır 8

9 Marmoset (Callithrix jacchus) Gereç ve Yöntem MPTP Uygulanması Beş gün arka arkaya, marmosetlere (n= 20) günde bir kez 2 mg/kg MPTP subkütan enjeksiyonu yapıldı Belirgin akinezi, bradikinezi ve rijidite Anormal postür, vokalizasyon azalması, koordinasyon bozukluğu 4-8 hafta elden beslenme 9

10 İlaç Tedavisi İlaçlar, oral olarak 30 gün boyunca uygulanmıştır: MPTP kontrol grubu (n= 4) L-DOPA (12.5 mg/kg)+karbidopa (12.5 mg/kg, bid) grubu (n= 4) bromokriptin (1 mg/kg) grubu (n= 4) ropinirol (0.5 mg/kg) grubu (n= 4) piribedil (1 mg/kg) grubu (n= 4) MPTP uygulanmamış normal kontrol grubu (n= 5) Lokomotor Aktivite ve Skorlama Gözlem kafeslerine konup, ortama uyum sağlaması için dakika beklendikten sonra lokomotor aktivite ölçümleri yapıldı. 10 üzerinden skorlama: Dikkat ve uyanıklılık (normal 0, azalmış 1, uykulu 2), kafa hareketleri (var 0, azalmış 1, yok 2), hareketlilik (normal 0, bradikinezi 1; akinezi 2), postür (normal 0, anormal gövde 1, çok anormal 2), denge/koordinasyon (normal 0, dengesiz/spontan düşüş 1) ve vokalizasyon (normal 0, azalmış 1). 10

11 Diskinezi Skorlaması Kore, üst ve alt ekstremitelerin istemsiz, düzensiz, sık, asimetrik hızlı ve kısa süreli hareketleri), Atetoz, ekstremitelerin istemsiz, düzensiz yavaş hareketi, Distoni, uzun süreli istemsiz kas kasılmaları, anormal ekstremite postürünün uzun süre korunması Diskinezi skorlaması : 0= yok, 1= hafif, az ya da nadir diskinetik postür ve hareketler, 2 = normal davranışı etkilemeyen orta derece-de ya da belirgin anormal hareketler, 3= normal aktiviteyi engelleyen, belirgin, sık ve bazı zamanlarda sürekli diskinezi ve 4= hayvanların normal hareketlerini engelleyen ileri derecede sürekli diskinetik aktivite. Dokuların Hazırlanması Hayvanlar terminal pentobarbital anestezi (60 mg/kg) dekapitasyonu takiben beyinler izopentan içinde dondurulup -70 C de saklanmışlardır. Koronal kesitler -20 C de kriyostat yardımıyla 20 µm kalınlıkta alınmıştır. Marmoset beyin atlası (Stephan ve ark., 1980) yardımı ile striatumun kesitler, jelatin kaplı lamlara alınmıştır ve deney yapılana kadar -70 C te saklanmıştır. 11

12 [ 3 H]-Mazindol Bağlanması Striatumun dopaminerjik nöron terminallerinde bulunan uptake bölgelerini ölçmek için bu bölgelere spesifik bağlanan [ 3 H]-mazindol kullanılmıştır. In Situ Hibridizasyon İnsan kanabinoit CB1 reseptörü mrna sına komplimanter oligonükleotit problar kullanılmıştır (Matsuda ve ark., 1990). 42 baz uzunluğundaki prob [ 35 S] datp (1300 Ci/mmol) ile terminal deoksinükleotidil transferaz tarafından işaretlenmiştir. Kesitler 37 C de 12 saat> radyoaktif kanabinoit CB1 reseptör probu ile inkübe edilmiştir. Kontrol RNAaz ile ön muamele yapılmış kesitler 50 kat fazla radyoaktif işaretlenmemiş problar kullanılmıştır. 12

13 Analiz Kesitler [ 14 C] standartları (Amersham, UK) ile birlikte X-ray filmlere 3 hafta boyunca maruz bırakıldıktan sonra banyo edilmiştir. Filmlerin kantitatif analizi bilgisayarlı densitometre (MCID Image Analyser, Imaging Research Inc., Canada) yardımı ile yapılmıştır Ortalama Yetersizlik Skoru MPTP MPTP+L-DOPA MPTP+Bromokriptin MPTP+Ropinirol MPTP+Piribedil Günler 13

14 Ortalama Lokomotor Aktivite MPTP MPTP+L-DOPA MPTP+Bromokriptin MPTP+Ropinirol MPTP+Piribedil Baseline Hafta Ortalama Diskinezi Skoru MPTP MPTP+L-DOPA MPTP+bromokriptin MPTP+ropinirol MPTP+piribedil Günler 14

15 Ortalama spesifik densite (fmol/mg) Kontrol MPTP MPTP+L-DOPA MPTP+bromokriptin MPTP+ropinirol MPTP+piribedil 0 Kaudat Nükleus Putamen + p < 0.01 Mazindol bağlanması Normal MPTP L-DOPA Bromokriptin Ropinirol Piribedil 15

16 12 10 Ortalama optik dansite (nci/mg) * Kontrol MPTP L-DOPA+MPTP Bromokriptin+MPTP Ropinirol+MPTP MPTP+Piribedil 2 0 Caudate Nükleus * p < Ortalama optik dansite (nci/mg) * Kontrol MPTP L-DOPA+MPTP Bromokriptin+MPTP Ropinirol+MPTP MPTP+Piribedil 2 0 Putamen + Normal kontrolden farklı, p < 0.05 ; * MPTP 'den farklı p <

17 Ortalama optik dansite (nci/mg) * Kontrol MPTP L-DOPA+MPTP Bromokriptin+MPTP Ropinirol+MPTP MPTP+Piribedil Nucleus Accumbens * MPTP 'den farklı p < 0.05 Kanabinoit CB-1 reseptör mrna ekspresyonu Normal MPTP L-DOPA Bromokriptin Ropinirol Piribedil 17

18 Fotoğrafik emülsiyon (çalışmalar devam ediyor) Normal MPTP L-DOPA İşaretlenmemiş prob Bromokriptin Ropinirol Piribedil RNAaz önuygulaması Tartışma Nigrostriatal denervasyon başarılı. MPTP nin oluşturduğu denervasyon gruplar arası farklılık göstermedi. oluşan diskinezi farklılıklarından sorumlu değil CB1 reseptörlerinin primat striatumunda bulunan GABAerjik nöronlarda lokalize L-DOPA ile indüklenen diskineziler, striatal CB1 reseptör sinyalizasyonunda azalma ile ilişkili olabilir 18

19 Devam etmekte olan çalışmalar Direkt ve indirekt yolakların CB1/Enk ve CB1/SP probları kullanılarak doublelabelling in situ hibridizasyon yöntemiyle incelenmesi Basal Ganglia Devresi Premotor/motor Korteks (Glutamat) Beyin sapı ve Medulla Spinalis D -2/A2a Striatum D -1 (GABA, ENK) (GABA, SP, DYN) Globus Pallidus Eksterna (GABA) İndirekt Yolak Substantia Nigra (dopamin) Direkt Yolak Talamus (glu) Subtalamic nucleus (glu) Globus Pallidus Interna /Substantia Nigra reticulata (GABA) Fasilitatör İnhibitör 19

20 Destek Bu çalışma National Parkinson Foundation, USA Parkinson's Disease Society, UK tarafından desteklenmiştir. Teşekkür Prof. Peter Jenner ve Dr Sarah Salvage e (King s College London) destekleri, Marmoset Ünitesi teknisyeni Michael Jakcson a yardımlarından ötürü, Dr Kim Stockwell, Ghassan Al-Barghouthy, Dr Lance Smith, Linda Foster, Salma Bukhatwa ve Atsuko Hikima'ya gözlemlerinden dolayı, Ghassan Al-Barghouthy'e çekimleri için teşekkür ederim. 20