ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ DETERJAN KATKI MADDESİ OLARAK MİKROBİYAL KAYNAKLI LİPAZ ÜRETİM KOŞULLARININ ARAŞTIRILMASI Banu Şükran ŞENGEL KİMYA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ANKARA 2007 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi DETERJAN KATKI MADDESİ OLARAK MİKROBİYAL KAYNAKLI LİPAZ ÜRETİM KOŞULLARININ ARAŞTIRILMASI Banu Şükran ŞENGEL Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Serpil TAKAÇ Süt mamulleri üretim tesisi yağlı atığından izole edilen ve genetik tanımlama ile türünün Debaryomyces hansenii olduğu belirlenen mikroorganizmadan, deterjanlarda kullanılmak üzere aktif ve kararlı lipaz üretimi için karbon ve azot kaynakları, metal iyonları, sıcaklık, ph gibi uygun üretim koşullarının belirlenmesi amaçlanmıştır. TBA ortamında çoğaltılan mikroorganizma, steril koşullarda öncelikle sıvı ön çoğalma ortamına, ön çoğalma ortamından da farklı üretim parametrelerinin incelendiği üretim ortamlarına 1/10 aşılama oranı ile aktarılmış ve çalkalamalı hava banyosunda N=150 rpm de izoterm koşullarda enzim üretimi gerçekleştirilmiştir. Farklı kalma sürelerinde üretim ortamlarından alınan örneklerle hücre derişimi, protein derişimi ve lipolitik aktiviteler izlenmiştir. Mikroorganizma derişimi türbidimetrik olarak spektrofotometre ile ölçülmüş; lipaz aktivitesi ise titrimetrik ve spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. Mikroorganizmanın ürettiği protein miktarı Bradford yöntemi ile ölçülmüştür. Hücre içi lipaz aktiviteleri belirlenirken, hücre cam boncuklu homojenizatörde parçalanmıştır. Lipaz üretimi için en uygun koşullar belirlendikten sonra, bu koşullarda üretilen lipaz saflaştırılmıştır. Bu amaçla ardışık olarak ultrafiltrasyon ve anyon değişim kromatografisi yapılmıştır. Son olarak kısmen saflaştırılmış lipazın SDS, EDTA, Triton X-100, H 2 O 2, amilaz ve proteaz gibi deterjan katkı maddelerinin varlığında aktivitesi incelenmiş ve enzimin deterjanlarda kullanıma uygun olup olmadığı araştırılmıştır. Sonuç olarak lipolitik aktivite için en uygun koşullar, karbon kaynağı olarak %1 derişimde soya yağı, azot kaynağı olarak %1 derişimde soya unu, metal tuzları içerisinde 10 mm KCl, üretim sıcaklığı T=30 o C, üretim başlangıç ph ı 6.5 olarak belirlenmiştir. Mikroorganizmanın hücre dışına salgıladığı lipazın aktivitesi, hücre içi lipaz aktivitesinden daha yüksektir. Kısmen saflaştırılmış olan lipaz, deterjan katkıları varlığında aktivitesinin büyük çoğunluğunu koruyabildiği için üretilen enzimin deterjanlarda kullanım potansiyeline sahip olduğu düşünülmektedir. 2007, 158 sayfa Anahtar Kelimeler : Debaryomyces hansenii, deterjan enzimleri, lipaz, lipaz aktivitesi, mikrobiyal lipaz üretimi i

3 ABSTRACT Master Thesis INVESTIGATION OF MICROBIAL LIPASE PRODUCTION CONDITIONS AS DETERGENT ADDITIVE Banu Şükran ŞENGEL Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering Supervisor: Prof.Dr. Serpil TAKAÇ The aim of this study is to produce active and stable extracellular lipase enzyme by yeast isolated from waste of a milk products plant; and to test its compatibility with detergent additives. The yeast was determined as Debaryomyces hansenii using molecular identification methods; and the most effective conditions for lipase production including carbon and nitrogen sources, temperature, initial ph and metal ions were investigated. The microorganism grown on TBA was first inoculated into preculture medium and then transferred into enzyme production medium with the volume ratio of 1/10. Enzyme production was carried out in shake flasks isothermally at 150 rpm. Samples drawn from the medium with certain time intervals were analyzed for the determination of cell concentration, protein concentration and lipolytic activity. The cell concentration was determined turbidimetrically and the protein concentration was measured by Bradford method. Lipolitic activity was determined by spectrophotometrically and titrimetric analysis. To determine intracellular lipase activity, the cells were disrupted with a homogenizator using glass beads. The enzyme produced under optimal conditions was partially purified by ultrafiltration and anion exchange chromatograpy in successive. Partially purified enzyme was tested for its recovered activity in the presence of detergent additives such as SDS, EDTA, Triton X- 100, amylases and proteases. As a result, optimal parameters for lipase production from D. hanseneii were found out to be soybean oil (%1v/v) as carbon source, soybean flour (%1 w/v) as nitrogen source and 10 mm KCl as metal salt. The optimal temperature and initial ph for high lipase activity were T=30 o C and ph=6.5, respectively. The extracellular lipase activity was found to be higher than intracellular lipase activity. The partially purified lipase succeeded to recover its activity in the presence of detergent additives tested; therefore, the enzyme has been considered to have a required potential for the usage in detergent industry. 2007, pages 158 Key Words : Debaryomyces hansenii, detergent enzymes, lipase, lipase activity, microbial lipase production ii

4 TEŞEKKÜR Yüksek lisans çalışmam boyunca bilgi ve deneyimleriyle bana yol gösteren, çalışmamın her aşamasında ilgi ve desteğini gördüğüm danışman hocam Prof. Dr. Serpil TAKAÇ a çok teşekkür ederim. Çalışmamda, mikroorganizmanın genetik olarak tanımlanmasındaki yardımları için Doç. Dr. Hilal ÖZDAĞ a; DNA izolasyonu ve mikroorganizmanın morfolojik olarak tanımlanmasındaki yardımları için Prof. Dr. Gönül DÖNMEZ ve Prof. Dr. Sedat DÖNMEZ e, bitkisel yağların analizlerindeki yardımları için Prof. Dr. Aziz TEKİN e; enzim saflaştırma basamağındaki yardımlarından dolayı Dr. Duygu ÖZEL DEMİRALP e; Tez çalışmamın mikroorganizma izolasyonu kısmında bana yardımcı olan Araş. Gör. Sevgi ERTUĞRUL ve Araş. Gör. Nur KOÇBERBER KILIÇ a; mikroorganizmanın tür tayini ile ilgili kısmındaki yardımlarından dolayı Gamze ÖZSÖZ e; zamanımın büyük bir kısmını geçirdiğim Reaksiyon Mühendisliği Laboratuarındaki çalışma arkadaşlarım Başak MARUL, Araş. Gör. Ayşe Ezgi ÜNLÜ BÜYÜKTOPÇU ve Banu ERDEM e; Maddi ve manevi destekleri ile yanımda olan, üzüntülerimi, sevinçlerimi paylaştığım, çalışmalarım süresince birçok fedakarlıklar göstererek beni destekleyen, her şeyimi borçlu olduğum annem Canan ŞENGEL ve babam Mustafa ŞENGEL e; beni anlayan, dinleyen ve hep destek olan Funda OĞUZKAYA ve Remzi KAYA ya çok teşekkür ederim. Bu tez çalışmasını maddi olarak destekleyen Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü ne (Proje No: ) ve Bilimsel Araştırma projelerine (Proje No: HPD) teşekkür ederim. Banu Şükran ŞENGEL Ankara, Temmuz 2007 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET.i ABSTRACT.ii TEŞEKKÜR iii SİMGELER DİZİNİ.vii ŞEKİLLER DİZİNİ ix ÇİZELGELER DİZİNİ.xv 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Enzimler ve Kullanım Alanları Enzimlerin Deterjan Formülasyonlarındaki Yeri ve Deterjanlarda Kullanımının Önemi Enzim Esaslı Deterjanlardaki Gelişme Enzimlerin Deterjanlarda Bulunuş Şekilleri ve Formülasyona Katılacak Enzimin Hazırlanması İdeal Deterjan Enzimlerinin Özellikleri Deterjan Enzimleri Proteazlar Selülazlar Amilazlar Lipazlar Lipaz kaynakları Lipaz üretiminde önemli parametreler Karbon ve azot kaynakları etkisi ph etkisi Sıcaklık etkisi Metal iyonları etkisi Oksijen aktarımı etkisi Lipazların kullanım alanları Lipazların deterjan enzimi olarak kullanımı ve üretimi Lipazın saflaştırılması Saflaştırmanın önemi.31 iv

6 Protein saflaştırma yöntemleri Çöktürme Diyaliz ve ultrafiltrasyon Kromatografik yöntemler Debaryomyces hansenii Mayasından Lipaz üretimi MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Yöntem Mikroorganizma izolasyonu Mikroorganizma tür tayini Mikroorganizmanın morfolojik tanımlaması Mikroorganizmanın genetik tanımlaması Mikroorganizma ve lipaz üretim ortamlarının hazırlanışı Agar ortamı Ön çoğalma ortamı Lipaz üretim ortamı Hücre parçalama Lipaz saflaştırması TCA çöktürmesi SDS-PAGE yöntemi Analizler Spektrofotometrik yöntemle lipaz aktivitesi Titrimetrik yöntemle lipaz aktivitesi Proteaz aktivitesi Hücre derişimi Protein derişimi Bitkisel yağ analizleri Verilerin Değerlendirilmesi Spesifik aktivite Mikroorganizmanın özgül çoğalma hızları BULGULAR Mikroorganizma İzolasyon ve Tanımlama...55 v

7 4.2 Lipaz Üretiminde Önemli Parametreler Karbon kaynaklarının etkisi Bitkisel yağların etkisi Yağ asidi esterlerinin etkisi Yağ asitlerinin etkisi Gliserolün etkisi Glukozun etkisi Peyniraltı suyu etkisi Triton X-100 etkisi Azot kaynaklarının etkisi ph etkisi Sıcaklık etkisi Metal iyonları etkisi En iyi koşullarda lipaz üretimi Lipazın Üretim Ortamından Ayrılması ve Kısmi Saflaştırılması Kısmi Saflaştırılmış Lipazın Deterjan Katkı Maddeleri ile Kullanım Potansiyeli TARTIŞMA ve SONUÇ KAYNAKLAR EKLER EK 1 Deneylerde Kullanılan Kimyasal ve Biyokimyasal Maddeler EK 2 Polimeraz Zincir Reaksyonunun Bileşenleri EK 3 Spektrofotometrik Aktivite Örnek Hesabı EK 4 Titrimetrik Aktivite Örnek Hesabı EK 5 Proteaz Kalibrasyon Grafiği EK 6 Proteaz Aktivitesi Örnek Hesabı EK 7 Kuru Hücre Kalibrasyon Grafiği EK 8 Protein (BSA) Kalibrasyon Grafiği EK 9 Bitkisel Yağların Yağ Asitleri Analizi EK S ve 26S rrna Analizi EK 11 BLAST Sonuçları ÖZGEÇMİŞ vi

8 SİMGELER DİZİNİ A Absorbans APS Amonyum Persülfat b Işının çözelti içinde aldığı yol (cm) BLAST Basic Local Alignment and Search Tool BSA Bovine Serum Albumin C Çözelti derişimi (mg/ml) CAL Candida antarctica lipazı CM Karboksi Metil Cx Hücre derişimi (mg hücre/ml) Cxo t=0. saatteki hücre derişimi (mg hücre/ml) DEAE Di Etil Amino Etil dntp Deoksiribonükleozid trifosfatlar EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit IDR Image Development Reagent N Karıştırma hızı (rpm) SDS Sodyum Dodesil Sülfat SDS-PAGE Sodyum Dodesil Sülfat -Poliakrilamid Jel Elektroforez PAGE Poliakrilamid Jel Elektroforez PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu pi İzoelektrik nokta PL Fosfo Lipaz pnf p-nitrofenol PNFP p-nitrofenil palmitat RDR Reduction Moderator Solution rrna Ribozomal RNA r x Hücre çoğalma hızı (mg hücre/ml.st -1 ) vii

9 SCS Silver Complex Solution SDS Sodyum Dodesil Sülfat SDS-PAGE Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforez T Sıcaklık ( o C) TAED Tetra Asetil Etilen Diamin TBA Tribütirin Agar TCA Trikloroasetik asit TEMED Tetra Etil Metilen Diamin Tm Bağlanma annealing sıcaklığı ( o C) U Ünite (µmol/dk) U/mg Spesifik aktivite U/mg hücre Hücre miktarı başına aktivite UV Ultraviyole V Hacim (ml) ε Molar absorptivite katsayısı (L/mol.cm) λ Dalga boyu (nm) µ Özgül çoğalma hızı (st -1 ) viii

10 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Lipazların kristal yapısı Şekil 3.1 SDS-PAGE aparatlarının şematik olarak gösterimi Şekil 4.1 Mikroorganizmanın ışık mikroskobu altındaki görüntüsü..55 Şekil 4.2 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi. 59 Şekil 4.3 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi..59 Şekil 4.4 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin spesifik aktiviteye (U/mg) etkisi...60 Şekil 4.5 Bitkisel yağların %1 derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi..60 Şekil 4.6 Soya yağının farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi..62 Şekil 4.7 Soya yağının farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi..62 Şekil 4.8 Soya yağının farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye (U/mg) etkisi 63 Şekil 4.9 Soya yağının farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi..63 Şekil 4.10 Susam yağı (2) nin farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi...65 Şekil 4.11 Susam yağı (2) nin farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi...65 Şekil 4.12 Susam yağı (2) nin farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye (U/mg) etkisi Şekil 4.13 Susam yağı (2) nin farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi...66 Şekil 4.14 Mısır yağının farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi ix

11 Şekil 4.15 Mısır yağının farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi...68 Şekil 4.16 Mısır yağının farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye (U/mg) etkisi...69 Şekil 4.17 Mısır yağının farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi Şekil 4.18 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki bitkisel yağlar ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml) Şekil 4.19 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki bitkisel yağlar ile elde edilen en yüksek spesifik aktiviteler (U/ml) 71 Şekil 4.20 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi...73 Şekil 4.21 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi Şekil 4.22 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine (U/mg)etkisi...74 Şekil 4.23 Yağ asidi esterlerinin %1 derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi...75 Şekil 4.24 Tristearinin farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi Şekil 4.25 Tristearinin farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi 76 Şekil 4.26 Tristearinin farklı derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi..77 Şekil 4.27 Tristearinin farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi 77 Şekil 4.28 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asidi esterleri ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml) x

12 Şekil 4.29 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asidi esterleri ile elde edilen en yüksek spesifik lipaz aktiviteleri (U/mg)...79 Şekil 4.30 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi Şekil 4.31 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin protein derişimine (mg/ml)etkisi Şekil 4.32 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi..82 Şekil 4.33 Yağ asitlerinin %1 derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi 83 Şekil 4.34 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin lipaz aktivitesine (U/ml) etkisi...84 Şekil 4.35 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi. 84 Şekil 4.36 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi Şekil 4.37 Palmitik asit ve stearik asitin farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi..85 Şekil 4.38 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asitleri ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml)...86 Şekil 4.39 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asitleri ile elde edilen en yüksek spesifik lipaz aktiviteleri (U/mg)...87 Şekil 4.40 %1 Gliserol içeren ortamın lipaz aktivitesi (U/ml), protein derişimi (mg/ml) ve spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi...88 Şekil 4.41 %1 Gliserol içeren ortamın hücre derişimine (mg/ml) etkisi 89 Şekil 4.42 Glukozun farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi...90 xi

13 Şekil 4.43 Glukozun farklı derişimlerinin deney sonunda (87. saat) hücre derişimine etkisi...90 Şekil 4.44 %1 Peyniraltı suyu içeren ortamın lipaz aktivitesi(u/ml), protein derişimi (mg/ml) ve spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi...91 Şekil 4.45 %1 Peyniraltı suyu içeren ortamın hücre derişimine (mg/ml) etkisi 92 Şekil 4.46 %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100 içeren ortamların lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi 93 Şekil 4.47 %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100 içeren ortamların protein derişimine (mg/ml) etkisi..94 Şekil 4.48 %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100 içeren ortamların spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi 94 Şekil 4.49 %1 Triton X-100 ve %1 soya yağı + %0.5 Triton X-100 içeren ortamların hücre derişimine (mg/ml) etkisi...95 Şekil 4.50 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi..97 Şekil 4.51 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının protein derişimine (mg/ml) etkisi...98 Şekil 4.52 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi.. 99 Şekil 4.53 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarının hücre derişimine (mg/ml) etkisi Şekil 4.54 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynakları ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml)..101 Şekil 4.55 Farklı tür ve derişimdeki yağ asitleri ile elde edilen en yüksek spesifik lipaz aktiviteleri (U/mg) Şekil 4.56 Farklı ortam ph larının lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi Şekil 4.57 Farklı ortam ph larının protein derişimine (mg/ml) etkisi.105 Şekil 4.58 Farklı ortam ph larının spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi xii

14 Şekil 4.59 Farklı ortam ph larının hücre derişimine (mg/ml) etkisi Şekil 4.60 Farklı ortam ph ları ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml) Şekil 4.61 Farklı ortam ph ları ile elde edilen en yüksek spesifik lipaz aktiviteleri (U/mg)..108 Şekil 4.62 Farklı sıcaklıkların lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi Şekil 4.63 Farklı sıcaklıkların protein derişimine (mg/ml) etkisi.110 Şekil 4.64 Farklı sıcaklıkların spesifik lipaz aktivitesine (U/mg) etkisi Şekil 4.65 Farklı sıcaklıkların hücre derişimine (mg/ml) etkisi Şekil 4.66 Farklı ortam sıcaklıkları ile elde edilen en yüksek lipolitik aktiviteler (U/ml) Şekil 4.67 Farklı ortam sıcaklıkları ile elde edilen en yüksek spesifik lipaz aktiviteleri (U/mg) Şekil 4.68 Farklı metal tuzlarının 1 mm lık derişimlerini içeren ortamların 48. saatteki lipaz aktiviteleri (U/ml) Şekil 4.69 Farklı metal tuzlarının 1 mm lık derişimlerini içeren ortamların 48. saatteki hücre derişimleri (mg/ml) Şekil 4.70 KCl nin farklı derişimlerinin lipolitik aktiviteye (U/ml) etkisi Şekil 4.71 KCl nin farklı derişimlerinin protein derişimine (mg/ml) etkisi Şekil 4.72 KCl nin farklı derişimlerinin spesifik aktiviteye (U/mg) etkisi.118 Şekil 4.73 KCl nin farklı derişimlerinin hücre derişimine (mg/ml) etkisi Şekil 4.74 En iyi koşullarda hücre içi ve hücre dışı titrimetrik lipaz aktiviteleri (U/mg) Şekil 4.75 En iyi koşullarda hücre içi ve hücre dışı spektrofotometrik lipaz aktiviteleri (U/mg hücre) Şekil 4.76 En iyi koşullarda hücre içi ve hücre dışı proteaz aktiviteleri (U/mg hücre) xiii

15 Şekil 4.77 En iyi koşullarda hücre dışı protein ve hücre derişimleri (mg/ml).122 Şekil 4.78 Anyon değişim kromatografisi sonucunda elde edilen kromatogram Şekil 4.79 SDS-PAGE analizi sonuçları..125 xiv

16 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Endüstride kullanılan bazı enzimler..3 Çizelge 2.2 Deterjan formülasyonlarında ve diğer uygulamalarda kullanılan ticari enzimler...7 Çizelge 2.3 Toz ve sıvı deterjanların bileşimi.10 Çizelge 2.4 Bazı mikrobiyal lipazların özellikleri...21 Çizelge 2.5 Mikrobiyal lipazların endüstriyel uygulamaları Çizelge 2.6 Ticari deterjan lipazları 29 Çizelge 4.1 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki bitkisel yağları içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma hızları...71 Çizelge 4.2 Kullanılan yağ asidi esterleri ve basit formülleri...72 Çizelge 4.3 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asidi esterlerini içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma hızları..79 Çizelge 4.4 Kullanılan yağ asitleri, içerdikleri karbon sayıları ve molekül formülleri...80 Çizelge 4.5 Karbon kaynağı olarak kullanılan farklı tür ve derişimdeki yağ asitlerini içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma hızları.87 Çizelge 4.6 Farklı tür ve derişimdeki azot kaynaklarını içeren ortamlarda hesaplanan özgül çoğalma hızları Çizelge 4.7 Farklı ortam ph larında hesaplanan özgül çoğalma hızları. 108 Çizelge 4.8 Farklı ortam sıcaklıklarında hesaplanan özgül çoğalma hızları. 113 Çizelge 4.9 KCl nin farklı derişimleri için hesaplanan özgül çoğalma hızları.119 Çizelge 4.10 Lipaz enzimi saflaştırma basamakları Çizelge 4.11 Saflaştırılmış lipaz enzimi aktivitesine deterjan katkıları etkisi 126 xv

17 1. GİRİŞ Enzimler reaksiyonların ılımlı koşullar altında gerçekleşmesini sağlayan yüksek katalitik etkinliğe sahip biyokatalizörlerdir. Bu özellikleri ile günümüzde gıda, kozmetik, farmasötik, tekstil, deri, kağıt ve deterjan gibi çok çeşitli endüstrilerde kullanım alanı bulmaktadırlar. Enzimlerin en önemli uygulama alanlarından biri deterjan endüstrisidir. Deterjanlara, temizleme etkilerini artırabilmek amacıyla katkı maddeleri konulur. Bunlar yüzey aktif maddeler, temizleme gücünü arttırıcı maddeler, yapıcı maddeler (alkaliler, kompleks yapıcılar, iyon değiştiriciler), köpük düzenleyiciler, enzimler, ağartıcılar, korozyon önleyiciler, parfüm, antiseptik maddeler, antidepozitörler ve aşınma önleyicilerdir. Deterjan katkı maddeleri içinde önemli bir yeri olan enzimler, deterjan formülasyonuna lekelerin çıkarılmasını kolaylaştırmak amacıyla katılırlar. Deterjan enzimleri, başlıca proteinlere etki eden proteazlar, nişastalara etki eden amilazlar ve yağlara etki eden lipazlardır. Deterjanlarda kullanılan enzimler, yüksek ph ve sıcaklıkta kararlı olmalı, oksidasyona, şelatlama ajanlarına dayanıklı olmalı, düşük derişimlerde aktif olmalı ve geniş substrat spesifikliğine sahip olmalıdır. Deterjan formüllerinde ilk olarak kullanılan enzim 1913 yılında bir proteaz olan tripsin, sonra sırasıyla amilaz, selülaz ve lipaz olmuştur. Enzimler etkilerini kısa sürede gösteremezler ve genellikle 50 o C ın altında aktiftirler; daha yüksek sıcaklıklarda ise bozunabilirler. Enzimlerin, özellikle yıkama prosesinin esas yıkamaya geçmeden önce ön hazırlık olarak soğuk suyla ıslatma içerdiği durumlarda kullanımları daha uygundur. Yıkama koşullarının ılımlı hale getirilmesi - çevre kirliliği etkileri düşünülerek fosfat içermeyen deterjanların kullanımı ve enerji kullanımının azaltılması- ile düşük yıkama sıcaklıklarında çalışılması enzimlerin deterjan formülasyonlarındaki önemini artırmaktadır. Günümüzde Japonya, Amerika ve Avrupa ülkelerinin çoğu, deterjanlarda enzim kullanmaktadır. Japonya daki tüm deterjan markaları enzim içermektedir. Avrupa da 38

18 çok uzun zamandan beri kaliteli deterjanların vazgeçilmez unsuru olan enzimler, Türkiye de 1982 yılından itibaren kullanılmaya başlanmıştır. Deterjan enzimlerinin üretimi ve özelliklerinin geliştirilmesi, bugün pek çok bilim insanının üzerinde çalıştığı bir konudur. Deterjanlarda kullanılan hidrolitik enzimler içerisinde önemli bir yere sahip olan lipazlar, proteaz içeren deterjanların yıkama kapasitesini artırır; trigliseritleri yağ asidi ve gliserole hidrolizleme özellikleri ile yağlı yiyecek lekelerinin ve kumaşlardaki sebumun çıkarılmasını sağlarlar. Lipazlar bitki ve hayvan dokularından ekstraksiyonla veya mikroorganizmalardan fermantasyon yoluyla üretilirler. Ticari lipazlar genelde mikrobiyal kaynaklıdır. Lipaz üreten mikroorganizmalar bakteriler, fungi ve mayalardır. Mikrobiyal lipazlar çoğunlukla sıvı ortamda üretilir. Lipaz üretiminde karbon ve azot kaynaklarının türü ve derişimi, üretim ph ı, sıcaklık, metal iyonları ve çözünmüş oksijen derişimi etkilidir. Tez projesi kapsamında, süt mamulleri üretim tesisi yağlı atığından izole edilen ve genetik tanımlama ile türünün Debaryomyces hansenii olduğu belirlenen mayadan, deterjanlarda kullanımını araştırmak üzere aktif ve kararlı lipaz üretimi için karbon ve azot kaynakları, metal iyonları, sıcaklık, ph gibi uygun üretim koşullarının belirlenmesi amaçlanmıştır. Mikroorganizmadan üretilen lipaz kısmen saflaştırılarak, bazı deterjan katkı maddelerinin varlığında aktivitesi incelenmiş ve enzimin deterjanlarda kullanıma uygunluğu araştırılmıştır. Çalışma, lipaz üretimi için atıktan izole edilmiş bir mikroorganizmanın kullanılması, türü sekans analizlerini kapsayan genetik bir çalışma sonucu Debaryomyces hansenii olarak belirlenmiş mayadan lipaz üretim koşullarının optimizasyonu ile ilgili literatürde bir çalışmanın olmaması, üretilen lipazın dünya pazarında önemli yeri olan deterjan sektöründe kullanım potansiyelinin olması nedeniyle önem kazanmaktadır. 39

19 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Enzimler ve Kullanım Alanları Enzimler canlı sistemlerde gerçekleşen biyokimyasal reaksiyonlarda yer alarak reaksiyonun daha ılımlı şartlar altında gerçekleşmesini sağlayan ve biyokatalizör olarak bilinen, protein yapılı moleküllerdir. Günümüzde enzimler; gıda, tekstil, farmasötik, deterjan, kağıt ve deri endüstrisi, kozmetik, parfümeri, biyosensör üretimi gibi çok çeşitli alanlarda kullanılmaktadır. Enzimlerin katalitik potansiyeli anlaşıldıktan sonra, bu çok faydalı maddelerden endüstride geniş ölçüde yararlanılmaya başlanmıştır. Bugün çok sayıda enzim bilinmesine rağmen, büyük miktarlarda üretimi yapılan ve endüstriyel amaçla kullanılan enzim sayısı azdır. Endüstride kullanılan bazı enzim grupları ve uygulama alanları Çizelge 2.1 de verilmektedir. Çizelge 2.1 Endüstride kullanılan bazı enzimler (Telefoncu 1997) Uygulama Alanı Yağların parçalanması ve interesterifikasyon Peynir üretimi Sindirime yardımcı Etin gevrekleştirilmesi Dericilik Nişasta hidrolizi Sakkoroz inversiyonu Meyve suyu, sirke ve şarap berraklaştırma Lezzet kontrolü (tat verici) Besin maddesinden istenmeyen ve toksik bileşiklerin uzaklaştırılması Oksidasyonun önlenmesi ve besin maddelerinde renk kontrolü Amino asit üretimi Peynir atık suyu ve sütteki laktozun hidrolizi Selüloz hidrolizi Dekstroz üretimi Penisilin üretimi Enzim Lipazlar Rennin, pepsin Çeşitli proteazlar Papain Çeşitli proteazlar Amilaz (α ve β), pullulanaz Invertaz Pektinazlar Nükleazlar Hidrolitik enzimler Oksidazlar Pronaz, amino peptidaz Laktaz (β-galaktosidaz) Selülaz Amiloglikosidaz Penisilin amidaz 40

20 Çizelge 2.1 Endüstride kullanılan bazı enzimler (devam) Organik sentezler Sterilizasyon ve soğuk pastörizasyon Glukozun fruktoza dönüştürülmesi Değişik enzimler Katalaz Glukoz izomeraz 2.2 Enzimlerin Deterjan Formülasyonlarındaki Yeri ve Deterjanlarda Kullanımının Önemi Deterjanlarda genel olarak yüzey aktif maddeler, yapıcı maddeler, köpük düzenleyiciler, asıltı yapıcı ve yeniden çökmeyi önleyici maddeler (antidepozitörler), enzimler, korozyon önleyiciler, ağartıcılar, yumuşatıcılar, parfüm ve antiseptik maddeler bulunur. Enzimler lekeleri çıkarmak için ihtiyaç duyulan üstün bir temizleme performansı göstermeleri nedeniyle deterjanlarda kullanılmaya başlanmıştır. Her bir enzim, belirli tipte bir lekeyi çıkarma yeteneğine sahiptir. Enzimler tekrarlanan yıkamalara olan ihtiyacı, daha ilk yıkamada zorlu kirlerin büyük çoğunluğunu çıkararak önleyebilirler. Enzimler yıkama sıcaklığını düşürerek tüketicilerin enerji masrafını azaltırlar. Enzimler çevre dostudur. Sentetik deterjanlar yavaş bir şekilde biyobozunmaya uğrayarak ciddi ekolojik problemlere neden olmakla birlikte enzim kullanımıyla bu problemlerin üstesinden gelinebilmektedir. Ayrıca toksisitelerinin az oluşu ve korozif olmamaları enzimlerin deterjanlarda kullanımını özendirici diğer üstün özellikleridir. 2.3 Enzim Esaslı Deterjanlardaki Gelişme Enzimler deterjan katkısı olarak ilk kez 1913 yılında Alman kimyacı Otto Rohm tarafından kullanılmıştır. Rohm, pankreatik enzimlerin (tripsin, kimotripsin gibi proteazlar) çamaşır temizlemede yıkama yardımcıları olarak kullanılabileceğini gösterdikten sonra Rohm patentli ürün Burnes adı altında ön yıkama deterjanı olarak piyasaya sunulmuştur. Ürün, esas olarak sodyum karbonat ve hayvanların pankreatik bezlerinden elde edilmiş az miktarda pankreatin içermektedir. Enzimin proteolitik 41

21 aktivitesi günümüz deterjanlarından oldukça düşüktür. Bu ürün yaklaşık 50 yıl Avrupa marketlerinde satılmıştır (Starace 1983, Telefoncu 1997, Kumar et al. 1998). İkinci Dünya Savaşında, yağ ve sabuna olan ihtiyaç sonucunda enzimatik yıkama ajanları önem kazanmıştır larda İsviçre de enzimlerin sabun tüketimini azaltabileceğine dair raporlar yayınlanmıştır ların sonuna yaklaşılırken, insülin üretimi için pankreatik bezlere olan talep tripsinin çamaşır yıkama ürünlerinde kullanımını sınırlamıştır. Pankreatik enzimlerin çamaşır yıkama maddelerine karşı nispeten daha az kararlılık göstermesi, bilim adamlarına bakteriyel fermantasyonla üretilecek enzimin, pankreatik tripsine avantajlar sağlayabileceğini düşündürmüştür. Bu şekilde bulunan nötral bakteriyel proteaz, tripsine göre büyük bir gelişme olmasına rağmen enzim, hala ph 9-10 aralığında düşük bir kararlılık göstermekteydi (Starace 1983) da İsviçreli kimyacı Dr. Jaag, Bio 40 olarak adlandırılan tripsin yerine bakteriyal bir proteaz içeren yeni bir ürün geliştirmiştir ( 2005) ların ortalarında, Bacillus licheniformis tarafından üretilen bir proteaz örneği, alkali ph larda (ph=8-10) kararlı ve aktif olup Novo Industry A/S tarafından Alkalase ticari ismiyle piyasaya sunulmuştur (Kumar et al. 1998) lerde proteazların deterjanlarda kullanımında geçici bir duraklama olmuştur; çünkü bazı üreticiler ve kullanıcılarda alerjik reaksiyonlar gözlenmiştir. Bu problem, toz oluşumunu önleyen, enzimi saklarken diğer deterjan bileşenlerinin olumsuz etkilerinden koruyan tozsuz granüllerin geliştirilmesiyle çözülmüştür (Kumar et al. 1998) te Novo, Humicola isolens ten elde edilmiş, kiri ortadan kaldırmak, pamuklu tekstilleri yumuşatmak ve eski renklerine kavuşturmak için üretilmiş olan, deterjan sanayinde bir devrim yaratan selülaz deterjan enzimini, Cellulase ı sunmuştur (Kumar et al. 1998). 42

22 Son yirmi yılda, rekombinant DNA teknolojilerinin başka bir ifade ile genetik ve protein mühendisliğinin uygulamaları ile enzimolojideki yeni gelişmeler, biyomühendislik ürünü enzimlerin çağını başlatmıştır. Novo 1988 de deterjan lipazını ilk biyomühendislik ürünü olarak Lipolase adıyla sunmuştur (Kumar et al. 1998). Novo enzimin, 60 o C a kadar olan sıcaklıklarda ve ph 7-11 de kararlı olduğunu bildirmiştir. Lipolase, aktivitesini, fosfat ve surfaktan gibi diğer deterjan bileşenlerine karşı koruyabiliyor ve proteinleri parçalayan proteaz enzimiyle birlikte kullanılabiliyordu (Gillis 1988) da yine rekombinant DNA teknolojisine dayanılarak başka enzimler de pazara sunulmuştur (Kumar et al. 1998): Savinase-Novo Nordisk, Denmark Maxacal-Gist-brocades, Delft Subtilisin Novo-Genencor International of California Daha sonra enzim deterjanı imalatçıları, daha iyi yıkama performansı ve perboratlar gibi oksidatif ağartma ajanlarına karşı daha kararlı yeni jenerasyon enzimler keşfetmiştir (Kumar et al. 1998): Maxapem- Solvey Enzymes, Germany Durazym- Novo Nordisk, Denmark Çizelge 2.2 de deterjan formülasyonlarında ve diğer uygulamalarda kullanılan enzimlere örnekler verilmiştir. 43