AKTİF AKCİĞER TÜBERKÜLOZU ve SEKEL AKCİĞER TÜBERKÜLOZU AYRIMINDA NEOPTERİNİN YERİ (Uzmanlık Tezi)

Transkript

1 T.C SAĞLIK BAKANLIĞI YEDİKULE GÖĞÜS HASTALIKLARI ve GÖĞÜS CERRAHİSİ EĞİTİM ve ARAŞTIRMA HASTANESİ 6. KLİNİK Doç. Dr. FİLİZ KOŞAR AKTİF AKCİĞER TÜBERKÜLOZU ve SEKEL AKCİĞER TÜBERKÜLOZU AYRIMINDA NEOPTERİNİN YERİ (Uzmanlık Tezi) Dr. Asuman Yeğen İstanbul-2004

2 BAŞLARKEN Uzmanlık eğitimim süresince, üstün bilgi ve tecrübesinden yararlandığım, titiz, disiplinli ve yenilikçi çalışmalarından dolayı yanında çalışmaktan onur duyduğum, hiç bir zaman sabır, özveri ve hoşgörüsünü bizden esirgemeyen değerli hocam Sayın Doç.Dr. Filiz Koşar a, Değerli bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım hocalarım Başhekimimiz Sn. Doç.Dr. Sedat Altın a, eski başhekimimiz Sn. Dr. Saadettin Çıkrıkçıoğlu na ve diğer servis şeflerimiz Doç. Dr. Güngör Çamsarı ya, Dr. Arman Poluman a, Doç. Dr. Veysel Yılmaz a, Dr. Emel Çağlar a, Doç.Dr. Esin Tuncay a ve cerrahi servis şeflerimiz Doç. Dr. Atilla Gürses e ve Dr. Mehmet Ali Bedirhan a, Rotasyonlarım sürecinde eğitimime değerli katkılarından dolayı Şef Dr. Ömer Şenkal a, Şef Doç.Dr. Paşa Göktaş a ve Şef Doç. Dr. Murat Ulusoy a, Eğitimim boyunca katkılarını ve dostluklarını esirgemeyen baş asistanım Uz. Dr. Sibel Yurt, Uz. Dr. Nevin Işık ve Uz. Dr. Ayşegül Aydın Tosun a, Bir süre beraber çalışma fırsatı bulduğum, Uz. Dr. Fatime Yavuz, Uz. Dr. Lütfiye Erkan, Uz Dr. Cem Tigin ve Uz. Dr. Tunç Karadeli ye, Asistanlığım süresince birlikte çalışmaktan mutluluk duyduğum, acı tatlı pek çok şeyi paylaştığım, katkı ve yardımlarını gördüğüm değerli arkadaşlarım Dr. Nevin Yaman, Dr. Burcu Arpınar Yiğitbaş, Dr. Evren Canel, Dr.Pelin Uysal, Dr. Kamil Özdemir e, Uzmanlık eğitimim süresince uyum içinde çalıştığım diğer servislerin şef muavinleri, baş asistanları, uzmanları, asistanlarına, Asistanlığım süresince uyum içinde çalıştığım, her zaman yardım ve dostluklarını gördüğüm 6. servis hemşirelerine, Tez çalışmamdaki yardımlarından dolayı hastanemiz biyokimya bölümü çalışanlarına, Tezimin laboratuar analizlerini yapan ve ilgisini esirgemeyen Doç. Dr. Hafize Uzun a, Hastanemiz diğer tüm servis hemşireleri ve personeline, teşekkürlerimi sunarım. En içten

3 KISALTMALAR NP : Neopterin TDM : Tüberküloz dışı mikobakteriler LAM : Lipoarabinomannan GAD : Geç tip aşırı duyarlılık Hİ : Hücresel immünite PMNL : Polimorf nüveli lökosit GTP : Guanozin trifosfat IFN : İnterferon TNF : Tümör nekroz faktör IL : İnterlökin PAS : Paraaminosalisilik asit INH : İzoniazid MHC : Major doku uygunluk kompleksi MIF : Makrofaj göçünü inhibe eden faktör GM-CSF: Granülüsit makrofaj koloni sitimülan faktör MCP-1 : Monosit kemotaktik protein-1 MIP-1 : Makrofaj inflamatuar protein-1 TTİA : Transtorasik iğne aspirasyonu PPD : Pirüfiye protein derivesi TBSA : Tüberkülostearik asit VEGF : Vasküler endotelyal büyüme faktörü FGF : Fibroblast büyüme faktörü BAL : Bronkoalveoler lavaj KOAH : Kronik obstüriktif akciğer hastalığı CRP : C-reaktif protein

4 İÇİNDEKİLER GİRİŞ ve AMAÇ. 1 GENEL BİLGİLER 4 MATERYEL ve METOD BULGULAR. 47 TARTIŞMA.. 57 ÖZET ve SONUÇ KAYNAKLAR.. 67

5 GİRİŞ VE AMAÇ Tüberküloz hastalığı az gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde halen yeterli koruma ve tedavi düzeylerine erişilememesi, gelişmiş ülkelerde de artan HIV infeksiyonuna eşlik etmesi nedeni ile tüm dünyada önemli bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir (1). Tüberküloz tanısında bugün kullanılan yöntemler (tüberküloz basilinin yayma ve kültür methodları, tüberkülin testi ve akciğer grafisi) yaklaşık 100 yıl önce bulunmuş ve ne yazık ki son 50 yılda bu alanda ciddi bir ilerleme sağlanamamıştır (2). Akciğer tüberkülozu tanısında en yaygın kullanılan ve hızlı sonuç veren yöntem, asidorezistan basil (ARB) boyama olmakla birlikte sıklıkla balgam olarak alınan klinik örnek, basil miktarı az ise negatif sonuç vermektedir (3). İlerlemiş akciğer tüberkülozlu birçok hastadan muayene için uygun balgam alınabilmesine rağmen, lezyonları minimal olan veya balgam çıkaramayan olgularda (özellikle kadın ve çocuklarda) ve ekstrapulmoner tüberkülozlularda tetkik için örnek almak zordur (4). Ayrıca daha önce akciğer tüberkülozu geçirdiği bilinen ve aktiviteden şüphelenilen, balgam çıkaramayan olgularda da aktif-inaktif ayrımında sorunlar yaşanmaktadır.tüberküloz

6 tanısında altın standart kültürdür. Kültür mikroskopiden daha duyarlıdır. Ancak M.tüberkülozis 1 çok yavaş ürer (4-6 hafta). Sonuç alabilmek için haftalarca beklemek gereklidir. Ek olarak kültür yöntemi için de balgam gerekmektedir(5,6). Tanı için bir sonraki aşamada izlenecek yol bronkoskopik işlemle alınan örneklerin bakteriyolojik ve/veya histopatolojik incelemesi ya da kültür sonuçlarının değerlendirilmesidir. Ancak bu yöntemlerin bazı olumsuz ve eksik noktaları vardır (7). Bronkoskopik işlem ve histopatolojik inceleme için doku örneklerinin alınması invaziv girişimleri gerektirmekte, diğer yandan konvansiyonel kültür yöntemleri ise geç sonuç vermektedir (8). Son yıllarda, tüberküloz insidansının ve ilaçlara dirençli basillerle oluşan hastalığın artması, tanı için duyarlı ve hızlı sonuç veren yöntemlerin aranmasına gerek göstermiştir (7). İmmunolojik ve genetik alanındaki gelişmelerle, PCR (polimeraz zincir reaksiyonu), nükleik asit probları, DNA parmak izi metodu ve vb. gibi bazı yeni tetkikler geliştirilmiştir. Ancak bu tekniklerin pahalı ve karmaşık oluşu, eğitilmiş elemana ihtiyaç göstermesi nedeni ile yaygın kullanıma girememişlerdir. Özellikle gelişmekte olan ülkelerde, geleneksel yayma ve kültür yöntemlerine alternatif olabilecek ucuz, çok özel alet gerektirmeyen, hızlı ve daha güvenilir testlere ihtiyaç vardır (9). Bir guanozin monofosfat derivesi olup, lenfosit kaynaklı interferon gama (IFN γ) tarafından uyarılmış makrofajlardan salınan NEOPTERİN in (NP), yapılan son çalışmalarda, aktif akciğer tüberkülozlu hastaların vücud sıvılarında yüksek seviyeler gösterdiği saptanmıştır. NP seviyeleri, ucuz ve kolay bir yöntem olan ELISA ile ölçülebilmektedir. Daha önce yapılmış çalışmalarda aktif akciğer tüberkülozunda NP konsantrasyonlarının hem serum hem de idrarda kontrol gruplarına göre anlamlı artış gösterdiği ve hastalık aktivitesi ve tedaviye cevabın değerlendirilmesinde

7 faydalı bir parametre olarak kullanılabilir olduğu saptanmıştır (125, 126, 127, 149, 150, 152). Ancak daha önce aktif akciğer tüberkülozu ile sekel akciğer 2 tüberkülozlu olguların NP değerlerini karşılaştırmaya yönelik bir çalışma yapılmamıştır. Aktif-sekel ayrımı klinik, radyolojik ve bakteriyolojik tam olarak yapılamayan hastalarda NP in yerinin belirlenmesi gerektiğini düşünmekteyiz. Biz bu çalışmamızda, yayma pozitif akciğer tüberküloz olguları, sekel akciğer tüberküloz olguları ve sağlıklı erişkinlerde serum ve idrar NP düzeylerinin ölçümünün, tüberküloz tanısında ve aktif-sekel tüberküloz olgularının ayrımında kullanılabilirliğini ve yararını araştırdık.

8 3 GENEL BİLGİLER TARİHÇE İnsanlık tarihi kadar eski bir hastalık olan tüberküloz hakkındaki bilgiler, İsa nın doğumundan 3000 yıl önceye kadar uzanmaktadır (10). Tüberküloz tanımı M.Ö. 4. yüzyılda Hipokrat tarafından yapılmıştır (11). 19. yy a kadar sadece klinik olarak tanımlanan tüberkülozun bulaşıcı bir hastalık olduğu ilk defa 1868 yılında bir Fransız askeri doktoru olan Jean Antoin Villemin tarafından saptanmıştır (2, 12). İlk kez 1882 yılında Berlin de tüberküloza neden olan etkeni bulduğunu açıkladığında, mikrobiyolojide yeni bir çığır açan Robert Koch, bundan kısa bir süre sonra 1891 yılında, benzer şekilde immunolojide de çığır açan Koch fenomenini tanımlamıştır (13) yılları arasında çalışan Calmette ve Guerin günümüzde de profilakside en önemli silah olan BCG aşısını bulmuşlardır (2, 12). Kemoterapi döneminden önceki tedaviler hastanın doğal direncini arttırmak amacıyla yapılmaktaydı. Selman Walksman ın 1944 yılında streptomisini bulmasıyla kemoterapi dönemi başlamış oldu. Sonraki yıllarda

9 PAS, INH ve günümüzde de kemoterapide kullanılan diğer ilaçlar bulunmuştur (2, 11, 12). 4 Bugün hala, dünyada en fazla ölüme yol açan infeksiyöz etken, tüberküloz basilidir. Dünya nüfusunun yaklaşık üçte birinin bu basille enfekte olduğu, her yıl yaklaşık 8 milyon yeni tüberküloz vakasının ortaya çıktığı ve yine her yıl yaklaşık 3 milyon kişinin ölümüne neden olduğu tahmin edilmektedir (13). MİKOBAKTERİLER Sınıflama: TAKIM Seçilmiş [ mikobakteriler ve ilişkili türler Actinomycetales için taksonomik ağaç. TDM:Tüberküloz dışı mikobakteriler(17) FAMİLYA Genel [ bir Mycobacteriacea terim olarak tüberküloz Actinomycetaceae basili Mikobakterium Streptomycetaceae tüberkülozis e kompleks olarak adlandırılan dört bakteri türünü içermektedir. Bunlar; CİNS [ Mycobacterium Nocardia Actinomyces Streptomyces M.tüberkülozis, M.bovis, M.africanum, M.microti dir. M tüberkülozis hariç grubun diğer üyelerinde bulaştırıcılık yoktur. S.Griseus TÜR [ Mycobacterium komplex TDM M.leprae (streptomisinin Tüberküloz dışı mikobakteriler Runyon sınıflamasına göre; fotokromojenler, skotokromojenler, M.tuberculsis nonkromojenler ve hızlı üreyenler olarak 4 gruba ayrılmıştır. pigment M.bovis M.microti M.africanum Fotokromojenler:Üreme döneminde ışığa maruz kaldıklarında sarı meydana getirirler (M.kansasii, M.marinum, M.smiae, M.asiaticum). 5 Fotokromojenler Skotokromojenler Nonkromojenler Hızlı üreyenler Skotokromojenler:Hem ışıkta hem de karanlıkta sarı ve turuncu pigment meydana getirirler (M.scrofulaceum, M.xenopi, M.celatum, M.szulgai, M.gordonae). M.gordonae dışındakiler potansiyel patojenlerdir. kaynağı) S.Mediteranei (rifampisinin kaynağı) Nonkromojenler:Ne ışıkta ne de karanlıkta pigment oluşturmazlar.m.avium, M.intracelulare, M.malmoense, M.ulcerans,

10 M.paratuberculosis, M.haemophillum, M.genavense patojeniktirler. Genellikle saprofitik olup nadiren hastalık yaptığı düşünülenler M.gastri, M.terrae, M.triviale, M.nonkromogenicum ve M.schimodei dir. Hızlı Üreyenler:Kültürde bir haftadan kısa sürede koloni oluştururlar. Patojenik olanlar; M.fortiutum group (M.fortiutum, M.pregrinum), M. cheloane group (M.cheloane, M.abcessus). Saprofitik olanlar; M.thermoresistible, M.smegmatis, M.vaccae, M.phlei, M.flavescens dir. M. tüberkülozis ve M.lepra insandan insana geçişte kesin ve önemli patojenlerdir (5, 14, 15, 16). M.TÜBERKÜLOZİS İN MORFOLOJİSİ M. tüberkülozis, tipik olarak hafif eğri ya da düz çubuk şeklinde bir mikroptur. İn vitro kültürde üretildiğinde birçok bakteriyel patojenden daha küçüktür. 1-4 µm uzunlukta ve 0,3-0,6 µm çaplı, kapsülsüz, sporsuz, hareketsiz bir basildir. Ancak hastalıklı konakçı doku kültürlerinde basil değişik özellikler taşıyabilir. M.tuberculosis doku kültürlerinde üretildiğinde, basilin daha uzun olduğu ve daha belirgin tomurcuklanma ile birlikte düzensiz bir şekilde boya alma eğiliminde olduğu gözlenmiştir (17). Hücre duvarının yüksek lipid içeriği nedeniyle boyanın penetrasyonuna dirençlidir. Anilin boyaları ile kolaylıkla boyanmazlar. Gram boyamada çok az mavi boya alarak gram (+) boyanırlar. 6 Fakat hücre duvarı lipid içeriği ve antibiyotik direnci bakımından gram (-) bakterilere benzerler. Aside ve alkole dayanıklıdır. Zorunlu aerob olması en önemli biyolojik özelliğidir. İstemli intrasellülerdir. Oksijen konsantrasyonunun yüksek olduğu dokulara yerleşme eğilimindedir. Diğer bir özelliği de yavaş üremesidir. İnvitro üreme süresi saattir. Uygun besiyerinde 3-8 haftada

11 üreme saptanabilir. Basilin endotoksini ve ekzotoksini yoktur. Ancak hücre duvarı ve sitoplazmada değişik yapıda antijenler içerdiğinden basil hücresinin parçalanması ile açığa çıkan komponentler toksiktirler ve konakçının yanıtını etkilerler ( 5, 17, 18, 19). YAPISAL ve ANTİJENİK ÖZELLİKLER Mikobakteriler, bir plazma membranı ile sınırlanan sitoplazmadan ve bunları çevreleyen lipidden zengin bir hücre duvarından oluşmuşlardır. Hücre membranı iki tabaka polar fosfolipid içerir. İçteki tabaka hidrofobik, dıştaki tabaka ise hidrofiliktir. Hücre duvarları, mikobakterilerin en karmaşık parçasını oluşturur. Temel özelliği çok yüksek oranda (hücre duvarı ağırlığının %60 ı) lipid içermeleridir. Hücre duvarının bu yapısı mikobakterilere özgü bazı temel özelliklerin de ortaya çıkışına yol açmaktadır. Bunlar; aside dayanıklılık, hücrelerin bir araya toplanımı, konakçı hücreleri tarafından yapılan litik enzimlere ve bakterisidal ilaçlara direnç ve muhtemelen bazı besinler hatta antibiyotiklerin hücre içine girişinin engellenmesi şeklinde özetlenebilir (20). Biyokimyasal çalışmalar, mikobakteriyel hücre duvarı iskeletlerinin temel yapı bloklarının üç makromolekülden oluştuğunu göstermektedir: peptidoglikanlar, arabinogalaktanlar ve mikolik asitler (17). 7 Şekil 1:Mikobakteriyel hücre zarfı (membran ve duvar) modeli (20). Pitioserol dimikoserozat Kord faktör Sulfolipid Mikolik asit

12 Arabinogalactan Peptidoglikan Plazma membranının üstünde bulunan en içteki tabaka Plazma membranı peptidoglikandan (murein) oluşmuştur. Basile sıkı yapı ve şekil kazandırma, fiziksel dayanıklılık, lizozomlara direnç ve adjuvant etkisi gibi rolleri vardır (2,5). Bu tabakada bulunan lipoarabinomannan (LAM) ve lipomanmanın potansiyel patojenik rolü vardır. LAM ın makrofaj fonksiyonlarına olan yönetici etkisi nedeniyle antijen sunan hücreler ile mikobakteriyel peptidleri / proteinleri inhibe edebilme yeteneği ve TNF-α üretimini uyarması dikkate alınarak, bu bileşik bir virulans faktörü olarak değerlendirilmektedir (17). Peptidoglikanlara Sitoplazma bitişik tabaka arabinogalaktan tabakasıdır. Arabinogalaktonların yan zincirlerine mikolik asit denen uzun zincirli yağ 8 asitleri bağlıdır. Bunlar hücre duvarı kalınlığı ve büyük oranda da hücrenin aside dirençli oluşundan sorumludur. Mikolik asitleri şekerle bağlanması sonucu ortaya çıkan kord faktörün toksik olup virulans ile ilgili olduğu düşünülmektedir. Ayrıca granülom oluşumuna yol açar. En dış tabaka bir grup heterojen peptidoglikolipidler veya fenolik glikolipidlerden oluşmuştur ve Mikozidler olarak adlandırılırlar (18, 20).Türe özgü lipidlerdir. Aglütinasyon serotipini, kolonial morfolojiyi ve bazı durumlarda virulansı belirler ve bakteriyofaj reseptör bölgesi olarak da görev yapar (18, 21). Mikobakteriler sitoplazmalarında (solübl), hücre duvarlarında lipidlere bağlı (insolübl) antijenik yapılara sahiptir. Şimdiye kadar bilinen antijen sayısı 90 kadardır. Antijenik peptidler hapten gibi davranabilirler ve geçikmiş tip aşırı duyarlılık reaksiyonu (geç tip aşırı duyarlılık-gad) ortaya çıkarabilirler. Ribozomal protein antijenleri de GAD ortaya çıkarabilirler (2). Protein antijenleri 6 grupta incelenir. 1)Sitoplazmik proteinler 2)Membranla ilişkili proteinler

13 3)Peptidoglikanla ilişkili proteinler 4)Dış hücre duvarı proteinleri 5)Isı şok proteinleri 6)Salınan proteinler Bu antijenlerin konak immun yanıtının oluşmasında katkıları vardır. (20). Polisakkaritler mikobakterilerin önemli antijenik kısımlarını oluştururlar. Arabinoz, galaktoz ve mannoz içeren polisakkarid I molekülleri GAD yanıtı oluştururlar. Polisakkarid II molekülleri ise GAD oluşturamazlar fakat serolojik aktivite gösterirler. 9 Mikobakteriyel lipidler sitoplazmada da bulunmalarına karşın en çok hücre duvarında yer alırlar. Mikolik asitler, fosfolipidler, Wax D, mikozidler ve diğer glikolipidlerin tümü hücre duvarında bulunmaktadır. Bir glikolipid olan kord faktör granülom oluşumuna yol açar, fakat bu özelliğin makrofaj kemotaksisi ve uyarısına ikincil geliştiğine inanılmaktadır (20). TÜBERKÜLOZDA İMMUNOLOJİ ve PATOGENEZ Tüberkülozda immun yanıt, başlıca iki hücreye bağlı olarak zincirleme seyreden bir seri etkileşimler sonucu gelişir (22). Bu immun yanıt T lenfositler, makrofajlar ve bunlardan salınan sitokinlerle oluşur (2). İnhalasyon yoluyla alınan ve alveollere ulaşan mikobakteri alveoler makrofajlarca fagosite edilir (23). Fakat çok sayıda basil ile enfeksiyon veya basilin virulans özelliği makrofajların basili tahrip etme özelliğini sınırlamaktadır. Aktive olmamış makrofaj içinde basil kolayca çoğalarak hücrenin erimesine yol açabilmektedir. Açığa çıkmış olan mikobakteriler, inflamatuar cevap nedeniyle lezyon bölgesine gelmiş olan diğer monositer serideki hücreleri de enfekte

14 ederler. Enfekte makrofajların bazıları bölgesel lenf bezlerine giderek immun yanıtı başlatırlar (24). Konağın tüberküloz enfeksiyonunu kontrol etme yeteneği, etkin bir hücresel immun cevap oluşturmasına bağlıdır (13). Hücresel immunitede antijeni spesifik olarak tanıyan hücreler T lenfositlerdir. Bu sistemin effektör hücreleri ise makrofajlardır (25). İnfeksiyon zengin bir antikor yanıtı oluşturmakla birlikte, humoral immunitenin konakçı savunmasında anlamlı bir katkısı yoktur (23). Makrofajların sindirme ve yok etme etkisinden kurtulabilen basiller (virulan basiller) fagozomlarda çoğalmaya başlarlar (23). Alveoler makrofajlar, TNF-α serbestleştirir, bu makrofajın kendisini uyarır, otokrin bir aktifleşme 10 olayıdır. Sonrasında CD4+, CD8+ ve gama/delta T hücrelerini olay yerine çeken ve uyaran IL-1 ve IL-12 salgılarlar (17). Alveol makrofajı aynı zamanda, kanda bulunan çeşitli hücrelerin yerel endotele tutunmasına neden olan çeşitli kemokinler serbestleştirir. Alveol içindeki basil antijenik yapılarından bazıları, makrofajların sitoplazmasında bulunan major doku uygunluk kompleksine (MHC) bağlanırlar. Bu bileşik yapı makrofaj yüzeyine taşınır. (4, 13, 22, 23). Tüberküloz infeksiyonuna karşı oluşan immunolojik cevapta basilin çeşitli antijenlerine karşı spesifik reseptörler taşıyan T lenfositler vardır. T lenfositlerin % 95 inde T hücre reseptörü α ve β zincirinden oluşurken % 5 inden azı da γ ve δ zincirinden oluşur. CD4+ (T helper) T lenfositler α/β antijen reseptörleri taşırlar ve MHC sınıf II molekülleri ile kendilerine sunulan antijenleri tanırlar. CD8+ (T supresör/sitotoksik) T lenfositler de α/β antijen reseptörleri taşırlar ve kendilerine sunulan antijenleri MHC sınıf I molekülleri ile tanırlar. γ/δ T lenfositleri ise basili bir bütün olarak tanırlar ve CD4+ ve CD8+ molekülü taşımazlar (17, 26).

15 Tüberküloz infeksiyonuna karşı gelişen hücresel immun yanıtın düzenlenmesinde esas sorumlu T hücre alt grubu CD4+ (T helper) lenfositlerdir. CD4+ T lenfositler sitokin üretimlerine göre iki alt gruba ayrılır. T helper 1 (Th1) ve T helper 2 (Th2). Bu alt grupların makrofaj aktivasyonu konusunda birbirlerine karşı zıt etkileri vardır. Th1 lenfositler IL-2 üreterek klonal genişleme gösterirler ve aktive olurlar. Aktive olunca da IFN-γ, TNF-β, MIF, GM-CSF, IL-3, IL-6 gibi sitokinler salgılarlar. Bu sitokinler sinerjistik etki göstererek antijenlerin bulunduğu yerde makrofajları aktive ederler. Aktive olmuş makrofajlar içlerinde taşıdıkları basilleri yok edebilme yeteneği kazanarak hücre içi basil çoğalmasını etkin olarak kontrol ederler (17, 27). Th2 lenfositler ise makrofaj aktivasyonunu baskılayan başta IL-10 olmak üzere IL-4, IL-5, IL-6 ve IL-13 gibi sitokinler üretirler ve humoral immun yanıtta rol 11 oynarlar. Makrofajların basil antijenlerini Th2 yerine Th1 lenfositlerine sunmalarının, makrofajlarca üretilen IL-12 nedeni ile gerçekleştiği düşünülmektedir (17, 23, 28). Hem Th1 hem de Th2 alt grupları IL-3, GM-CSF ve TNF-α üretirler (14). İnvitro olarak CD8+ T lenfositlerinin basillerde erime yaptığı gösterilmiştir. Bununla birlikte IFN-γ salgılayarak patojenler için çoğalma ortamı oluşturan immatür fagositlerin yıkımını da uyarırlar ve mononükleer fagositleri aktive ederler.(29, 30, 31). Hücresel immunite (Hİ) ve geç tip aşırı duyarlılık (GAD), tüberküloz patogenezinde konağa ait temel immunulojik olaylardır. Tüberküloz basilleri, bu immun yanıtlar gelişene dek konak dokularına hasar vermezler. Hücresel immünite, mikrobik antijen varlığında lokal olarak sitokin oluşturabilen geniş bir spesifik T lenfosit popülasyonuyla karakterize olan yararlı bir konakçı yanıtı biçiminde tanımlanabilir. Bu lenfosit populasyonu Th1 hücrelerdir. Salgılanan sitokinler, kan akımından lezyona monosit/makrofajları

16 çekerler ve onları aktive ederler. IFN-γ ve TNF-α en önemli makrofaj aktive edici sitokinlerdir (32). Aktive makrofajlar, reaktif oksijen ürünleri, lizozomal enzimler ve diğer faktörleri üreten fagosite edici hücreler oldukları için tüberküldeki basilleri yok edebilirler. IFN-γ nın makrofajlardaki IL-2 reseptörlerini uyarmasından sonra T lenfositlerden salınan IL-2 makrofajların mikrobisidal etkilerini arttırır (33, 34). Geç tip aşırı duyarlılık (GAD) konakçının doku hasarı yapan bir yanıtı olup, içinde tüberküloz basili çoğalan inaktif makrofajları ve bu arada komşu dokuları harap eden bir süreç olarak değerlendirilebilir (13). GAD oluşumundan sorumlu hücreler Th1 ve Th2 sitokin kalıplarına göre sınıflandırılmışlardır. (35). Hİ ve GAD her ikisi de aynı immünolojik mekanizmada rol oynamasına karşın GAD konakçı için zararlı olabilmekte Hİ ise yararlı olmaktadır. Tüberkülin pozitif bir konakçıda düşük konsantrasyondaki antijen 13 lokal olarak makrofaj aktivasyonu ile immünitenin gelişmesini uyararak konakçı için yararlı olabilir. Diğer taraftan yüksek konsantrasyondaki lokal antijen genellikle doku destrüksiyonu, kazeifikasyon ve likefaksiyona yol açmaktadır (24). Hücresel immunite tam olarak geliştiğinde, T lenfositler ve aktive makrofajların basilleri çevrelemesi ile granülom formasyonu ve tüberküloza özgü tüberkül denen lezyon gelişir. Granülomun amacı, basilleri sınırlamak ve yayılmalarını önlemektir. Granülom oluşumundaki temel sitokin aktive makrofajlardan salınan TNF-α dır. Ayrıca IFN-γ, IL-1, IL-2, MCP-1 ve GM- CSF de granülom oluşumunda etkilidirler (17, 28). Tüberküloz iki aşamalı bir hastalıktır. Birinci aşamada, basiller akciğerlere gelmekte ve primer tüberküloz infeksiyonu veya hastalık kliniği

17 oluşursa primer tüberküloz hastalığı ortaya çıkmaktadır. Primer tüberküloz infeksiyonunun genelde sessiz seyredip latent döneme girmesi veya primer tüberküloz hastalığının iyileşmesinden sonra bireyin yeniden hastalandığı ikinci aşama da postprimer tüberküloz olarak kabul edilmektedir (36). PRİMER TÜBERKÜLOZ Normal bir bireyde tüberküloz infeksiyonunun gelişimi 4 evrede olmaktadır. Bu 4 evre alveoler makrofajların ilk infeksiyonundan, kavite oluşumuyla sonuçlanan süreci içermektedir (17). Evre I:Başlangıç Evresi Tüberküloz infeksiyonu, basillerin alveole alındıktan sonra güçlü bir basilin zayıf bir makrofaj tarafından fagosite edilmesiyle başlar. Önce basillerin yerleştiği alanda hemen viseral plevranın altında kapiller dilatasyon ve kandan 14 gelen polimorf nüveli lökositlerin eksüdasyonu olur. Daha sonra lezyon bölgesinde alveoler makrofajlar toplanmaya başlar ve spesifik olmayan bir inflamatuar yanıt oluşur. Göreceli olarak zayıf makrofaj içindeki virulan basil çoğalabilir ve hastalığı başlatabilir fakat genellikle güçlü bir alveoler makrofaj içindeki zayıf basilin çoğalması engellenir, inhibe edilir veya yok edilir. Bu yok etme yeteneği alveoler makrofajların doğal mikrobisidal gücüne ve alınan basilin virulansına bağlıdır. Virulans, fagositik hücreler içinde basilin canlılığını sürdürebilme ve çoğalabilme yeteneğidir. İnfeksiyon oluşması için gereken partikül sayısı tam olarak bilinmemekle birlikte 10 dan fazla olduğu tahmin edilmektedir. İşte tüberküloz basilinin organizmaya girdiği ve başlangıçta PMNL ler ve aktive olmamış makrofajlarca fagosite edildiği bu evrede tüberküloz infeksiyonu başlamıştır (17, 36, 37).

18 Evre II:Ortak Yaşam ve Basillerin Logaritmik Çoğalma Evresi (2-3 hafta) Alveoler makrofajlar basili yok etmede yetersiz kalırsa basiller çoğalmaya başlar. Makrofajların ölümü ile açığa çıkan basiller yine alveoler makrofajlar tarafından fagosite edilir. Hangi nedenle basil yüklü makrofajların öldüğü bilinmemekle beraber, son çalışmalar metabolik olarak aktif tüberküloz basilinin makrofajdaki apoptozisi indüklediği, ölü basilin ise bunu inhibe ettiğini göstermektedir. Birçok kan kaynaklı monosit, muhtemelen serbestleşen basillerden açığa çıkan kemotaktik faktörlerin etkisiyle (C5a, MCP-1) olay yerine gelirler ve makrofaja dönüşürler. Bu yeni olgunlaşmamış makrofajlar, serbestleşen basilleri içlerine alırlar. Bu aşamada simbiyotik bir ilişki gelişmiştir. Konağın makrofajı ve basil birbirlerine zarar vermezler. İnaktif durumdaki bu yeni makrofajların sitoplazmalarında bulunan fagositik vakuoller, basilin logaritmik çoğalması için ideal bir hücre içi ortam işlevi görür (13, 14, 37). Bu evrede gittikçe daha fazla sayıda basil ve makrofaj toplanması ile 15 oluşan, basilin ilk yerleştiği odağa primer odak (Ghon odağı) denir. Bu odak hemen daima subplevral yerleşim gösterir, tektir ve orta-alt akciğer zonlarında bulunur. Lezyon bölgesindeki basiller, direkt veya makrofajlar içinde lenfatik yayılım ile hiler lenf nodlarına, hematojen yayılım ile akciğer apekslerine, böbreklere, kemik büyüme plaklarına ve vertebralara yayılırlar. Kan kaynaklı makrofajlar henüz aktive değildir. Böylece basilleri ne yok edebilir ne de çoğalmalarını durdurabilirler. Konakçı GAD geliştirinceye kadar basiller makrofaj için toksik değildir. Zamanla çok daha fazla makrofaj ve basil lezyon alanına toplanır (17, 36, 37).

19 Evre III:Hücresel İmmünite ve Geç Tip Aşırı Duyarlılık Gelişmi ve Enfeksiyon kontrolü Basilin inhalasyonundan 2-3 hafta sonra konakçı hem Hİ hem de GAD geliştirir. Tüberkülozda Hİ, antijen varlığında (tüberküloz basilleri) makrofajları aktive eden sitokinleri üreten geniş bir antijen spesifik Th1 lenfosit populasyonu ile karakterize yararlı bir konak yanıtıdır (14, 28, 37). Hİ tam olarak geliştiğinde, aktive T hücreleri ve makrofajların basilleri çevrelemesi ile granülom formasyonu ve tüberküloza özgü tüberkül denen lezyon gelişir. Granülomun amacı basilleri sınırlamak ve yayılmalarını önlemektir. Lezyon bölgesindeki basil sayısı Hİ ile yok edilemeyecek kadar fazladır. GAD basil yüklü makrofajları yok ederek inaktif makrofajlar içindeki basillerin çoğalmasını durdurur. Bu sırada çevre dokularda da harabiyet oluşarak, granülomların merkezinde kazeöz nekroz odakları oluşur. Oluşan kazeöz nekroz ortamında, anoksik koşullar, düşük ph, toksik yağ asitlerinin varlığı ve henüz bilinmeyen nedenlerle basiller çoğalamazlar fakat canlılıklarını sürdürebilirler. 16 Hem Hİ, hem de GAD ın basillerin çoğalmasını eşit oranda inhibe ettiği saptanmıştır. Ancak Hİ bu işlemi makrofajları fagosite ettikleri basilleri öldürmeleri için aktive ederek gerçekleştirirken, GAD basil içeren aktive olmamış makrofajları ve çevre dokuları yok ederek basilin büyümesi için çok uygun olan hücre içi çevreyi ortadan kaldırarak yapar (14). Kazeöz dokularda basillerin bir kısmı ölür, diğerleri yıllarca hatta yaşam boyu dormant halde (canlı ve çoğalamayan) kalırlar. Böylece konakçı hücre içi basil çoğalmasını durdurmuş fakat bunun için kendi dokularında da harabiyet yapmak durumunda kalmıştır. Primer infeksiyonun oluştuğu ve tüberkülin deri testinin pozitifleştiği bu evreden sonra, akciğerler ve diğer

20 organlarda primer kompleks lezyonları GAD ve Hİ arasındaki karşılıklı etkileşime bağlı olarak ilerleyebilir veya gerileyebilir (14, 28, 37). Bu evrede eğer konağın Hİ si iyi gelişmiş ise (%90-95 olguda) infeksiyon granülom oluşması ile sonlanır ve kontrol altına alınır. Primer lezyon ve metastatik odaklar geriler, minimal sekel bırakır. Konağın immun cevabı yetersiz ise (%5-10 olguda) progresif akciğer tüberkülozu veya ekstrapulmoner hastalık oluşur (14, 17, 23, 28, 36). POSTPRİMER TÜBERKÜLOZ Primer infeksiyonun geçirilmesinden sonra hayatın herhangi bir evresinde vücudun genel direncinin kırılması (diabet, beslenme bozukluğu, stresler, mide ameliyatı, pnömokonyoz, immunosupresif ilaçların kullanılması vb.) ve primer odaktaki dormant basillerin yeniden aktivasyonu ve çoğalması ile tüberküloz hastalığı gelişebilir (postprimer tüberküloz). Burada lezyon apikal ve subapikal bölgelerdeki (daha önce hematojen yayılım odakları, simon odakları) lezyonların bronkojen yolla yayılımı ile gelişir (38). Reaktivasyon akciğer dışındaki alanlarda olursa ekstrapulmoner tüberküloz tipleri ortaya çıkar. 17 Akciğer tüberkülozunun en sık rastlanan şekli endojen reaktivasyondur; ancak ekzojen reenfeksiyon da olabilir. Postprimer tüberkülozun patognomomik özelliği erime ve kavite oluşumudur (23). Evre IV:Erime (Likefaksiyon) ve Kavite Oluşumu Geç tip aşırı duyarlılık (GAD), solid kazeöz merkezin likefaksiyonu ile birliktedir. Likefiye kazeöz materyalde basil tekrar uygun çevre bulur ve fazlasıyla çoğalır. Lezyon bölgesinde toplanan çok sayıda makrofajlardan salınan hidrolitik enzimlerin protein, lipid ve nükleik asitleri hidrolize etmesi ve GAD ın erimeden sorumlu olabileceği düşünülmektedir (37). Sonuçta bronş duvarı erozyonu ile kavite oluşumu gözlenir. Bronşial yol ile basiller ve erimiş

21 materyal akciğerin diğer bölgelerine yayılır ve öksürükle dışarı atılır. Böylece hasta bulaştırıcı olur. Kavite oluşumu hem hastalığın akciğere yayılmasına hem de hastanın bulaşıcı nitelik kazanmasına neden olur ayrıca çok sayıda basil içermesi nedeniyle ilaca dirençli mutantların ortaya çıkmasına ve uygun olmayan tedavi koşullarında dirençli tüberküloz gelişimine sebebiyet verir (14, 17, 23, 28, 37). TÜBERKÜLOZDA KLİNİK Primer infeksiyonu izleyen ilk 5 yıl içinde gelişen tüberküloz primer tüberküloz (çocuk tüberkülozu), primer infeksiyondan en az 5 yıl sonra yaşamın herhangi bir döneminde gelişen tüberküloz ise postprimer tüberküloz (yetişkin tip tüberküloz) olarak tanımlanmıştır (39). Primer Tüberküloz (Çocuk Tüberkülozu) Genelde infeksiyon solunum yoluyla bulaştığından primer tüberküloz akciğerlerde gelişir. Daha önce M.tüberkülozis ile karşılaşmamış veya BCG ile 18 aşılanmamış tüberkülin negatif bir kişide, inhalasyon yoluyla alınan tüberküloz basili ilk 2-3 haftada gerek akciğerde ilk yerleştiği yerde, gerekse lenfohemotojen yayım odaklarında süratle çoğalır ve buralarda ilk granülomlar oluşmaya başlar. İmmun yanıtın gelişimiyle bu lezyonlarda kazeifikasyon nekrozu oluşur. Basil çoğalması ve lenfohemotojen yayılım durdurulur ve tüberkülin testi pozitifleşir. İmmun yanıtın yeterince güçlü olduğu kişilerde lezyonlar genellikle hiçbir klinik ve radyolojik bulgu oluşturmaksızın, sıklıkla minimal skar ve kalsifikasyonla iyileşir (Evre 1-3).Tüm bu süreç primer infeksiyon olarak tanımlanır ve konakçıda tüberkülin testi pozitifliği ile karakterizedir. Eğer konakçının immun yanıtı yeterli değil ise granülomlardaki

22 kazeifikasyon nekrozu genişleyecek ve sonuçta akciğerdeki aynı taraf lenf bezlerindeki ve hematojen yayılım odaklarındaki lezyonlar ilerleyecektir. Akciğerdeki primer odak ve bu lezyonun drene olduğu komşu lenf bezlerinde (primer kompleks) granülomatöz inflamasyon genişleyecek ve radyolojik olarak görünür hale gelecektir. Konakçıda değişik klinik tablolara yol açan bu gelişme Primer Tüberküloz olarak adlandırılır (23). Primer tüberkülozda tipik olarak akciğerin periferinde, orta ve alt zonlarda lober veya segmental yerleşimli pnömonik bir lezyon gelişir (primer odak veya ghon odağı). Akciğerdeki primer odak ve aynı tarafta büyümüş hiler veya paratrakeal lenf bezi birlikte primer kompleks veya gohn kompleksi olarak adlandırılır (23). Primer tüberkülozun en sık lokalizasyonu olan primer akciğer tüberkülozunda klinik bulgular çok silik olabilir ve genellikle farkına varılmaz. En sık görülen bulgu ateştir. Genellikle 2-3 hafta kadar sürer ve sıklıkla subfebrildir. Ateşli dönemde tibia üstünde, büyüklükleri mercimek-fındık arasında değişen ağrılı ve morumsu şişlikler (erythema nodosum) gelişebilir. Çocuklarda primer tüberküloz düşündürecek bulguların başında 19 tüberkülin testinin pozitifleşmesi gelir. Büyümüş hiler lenf bezinin varlığı çocuklardaki primer akciğer tüberkülozunun en sık görülen radyolojik bulgusudur (40). Milier tüberküloz: Tüberküloz basilinin kan yoluyla yayılması sonucunda akciğerlerde 2 mm çapında darı tanesi görünümünde nodüllerin oluşması ile karakterizedir. Daha çok 0-4 yaş grubu, immun sistemi zayıf ve virulansı yüksek basille enfekte olan çocuklarda görülür. Primer infeksiyondaki kan yayımı sırasında intimada kazeöz vaskülit oluşur ve basiller buradan kan

23 dolaşımına geçer, tüm organlara dağılır, özellikle karaciğer ve dalakta yerleşir (41). Yetişkin hastalarda da eski bir tüberküloz lezyonunun yeniden aktive olması ve kan damarlarında erozyon yapmasıyla veya tüberküloz lezyonu içeren bir organda yapılan cerrahi işlemler ile basil kana karışabilir ve milier tüberküloz gelişebilir. Postprimer Tüberküloz (Erişkin Tüberkülozu) Tüberkülozun en sık görülen şekli olup hastalığın yayılmasında da en fazla rolü oynar. Bu tüberküloz şekli sıklıkla endojen reaktivasyon veya eksojen reenfeksiyonla gelişir. Endojen Reaktivasyon: Primer enfeksiyon sırasında lenfohematojen yolla akciğerlerden diğer organlara yayılan basiller, bu organın retiküloendotelyal sistemi tarafından tutulurlar ve yayım odaklarında küçük tüberküller oluştururlar. Bu lezyonlarda çoğalan basiller belirgin sayıya ulaştıklarında aktive T lenfositler lezyonlara girerek kazeifikasyon nekrozu oluştururlar ve yayım odaklarının çoğu kontrol altına alınır ve yok edilir. Fakat oksijen parsiyel basıncı yüksek olan bazı organlarda (kemik, böbrek, akciğer apeksleri gibi) geride kalan az sayıda basil, makrofajlar, kazeöz odaklar veya kalsifiye odaklarda canlılıklarını sürdürebilirler. Geçirdikleri primer infeksiyon nedeniyle tüberkülin 20 deri testleri pozitifleşen bu kişilerde, yaşamlarının ileriki yıllarında stres, steroid tedavisi, kanser kemoterapisi veya HIV infeksiyonu gibi hücresel immun yanıtta geçici supresyon yapan olaylar gelişebilir. Bu durumda, yayım odaklarında dormant haldeki basiller çoğalmaya başlar. Hücresel immun yanıt düzeldikten sonra, yeterli basil çoğalmasının veya basil antijen birikiminin bulunduğu odaklara T lenfositler girerek yaygın kazeöz nekroza ve erimeye yol

24 açarlar. Bu olay akciğer dışı organ tüberkülozu ve akciğer apeksinde kaviter akciğer tüberkülozu gelişimine neden olur. Apikal-subapikal akciğer tüberkülozu gelişimindeki bu süreç endojen reaktivasyon olarak tanımlanır. Endojen reaktivasyon primer komplekste değil akciğer apekslerindeki hematojen yayım odaklarından gelişmektedir (23). Eksojen Reenfeksiyon: Primer tüberküloz geçirmiş bir kişinin yeniden dışardan M.tüberkülozis ile enfekte olmasıyla gelişir. Eksojen reenfeksiyon primer lezyon aktif bir durumda iken dışarıdan yeni basil alınmasıyla meydana gelebilir bu bir süperenfeksiyon niteliğindedir (42). Her iki şekilde de ortaya çıkan klinik tablo aynıdır. Lenf bezi tutulumu olmaz ve genellikle lenfohemotojen yayılım görülmez. Bu dönem hastalık bronkojen yayılım ve kaviteleşme ile karakterizedir (43). Tüberküloz infeksiyon riskinin yüksek olduğu toplumlarda, postprimer tüberküloz genellikle immun sistemi zayıflamış kişilerde yeni infeksiyonlar sonucu ortaya çıkmaktadır. Eksojen reenfeksiyona bağlı hastalanma olasılığının geçmişte sanıldığından daha fazla olduğu son yıllarda yapılan mikobakterilerin genetik olarak kodlanmasına dayalı moleküler epidemiyolojik çalışmalarla ortaya konulmuştur (43). Erişkin akciğer tüberkülozunda erken dönemde hiçbir semptom olmayabilir. Hastalık tesadüfen çekilen akciğer grafisi ile saptanabilir.fakat basil sayısı belirli bir düzeye ulaşınca, özgül olmayan yapısal semptomlar ve 21 solunum sistemi ile ilgili semptomlar ortaya çıkmaya başlar. Tüberkülozda semptomlar sinsi bir başlangıç gösterir ve hastalık kronik bir seyir izler. En sık görülen semptomlar; iştahsızlık, yorgunluk, kilo kaybı, öğleden sonraları yükselen ateş, gece terlemesi, öksürük ve öksürükle birlikte mukoid-

25 mukopürülan veya kanlı balgam çıkarmadır. Hemoptizinin varlığı yaygın akciğer tutulumunun oluştuğunu gösterir fakat hastalığın aktivitesi hakkında fikir vermez. Kazeöz materyalin atılması veya endobronşial erozyon nedeniyle oluşan hemoptizi genellikle hafiftir. Tüberküloz zemininde gelişen bronşektazi, eski bir kavitenin duvarındaki dilate bronşial arterin rüptürü (Rasmussen anevrizması), bakteriyel veya fungal infeksiyonlar, kalsifiye lenf bezlerinin hava yolu duvarında yaptığı erozyonlar da hemoptiziye neden olabilir. Yaygın parankim tutulumunda dispne gelişebilir (23). TÜBERKÜLOZDA RADYOLOJİ Akciğer grafisi hastalığın tanısında, yaygınlığını ve niteliğini belirlemede ve tedaviye yanıtı değerlendirmede yardımcıdır. Hiçbir radyolojik görünüm tüberkülozda mutlak tanısal değere sahip değildir, fakat bazı lezyonlar tüberkülozu kuvvetle düşündürür (46). Akciğer tüberkülozu düşündüren semptom ve bulgulara sahip hastalarda standart PA ve lateral akciğer grafileri çekilmelidir. Kalbin ve kemik yapıların arkasındaki lezyonların görülebilmesi için apiko-lordotik veya oblik grafiler gerekebilir. Bilgisayarlı tomografi veya manyetik rezonans görüntüleme gibi özel görüntüleme teknikleri standart grafilerde izlenen nodülleri, kaviteleri, kistleri, kalsifikasyonları, büyük bronşların sınırlarını ve akciğer parankimindeki damarsal ayrıntıları değerlendirmede yardımcı olabilir (47). 22 Primer tüberkülozda hiçbir radyolojik bulgu olmayabilir. Tipik olarak orta-alt akciğer zonlarında periferik infiltrasyon ve buna eşlik eden aynı taraf hiler/paratrakeal lenfadenopati ile kendini gösterebilir. %15 oranında bilateral

26 hiler lenfadenopati görülebilir. Seyrek olarak genişlemiş lenf bezinin basısına bağlı atelektazi, akciğerdeki primer odağın ilerlemesi ile kaviteli pnömonik lezyonlar görülebilir. Genellikle 0-2 yaş grubundaki malnütrisyonlu çocuklarda milier görünümler ortaya çıkabilir, buna karşılık geç edinilmiş primer infeksiyon plevral efüzyonla kendini gösterebilir (46). Erişkin tüberkülozunda lezyonlar, sıklıkla üst lobların apikal ve posterior segmentlerinde ve alt lobların superior segmentlerinde yamalı infiltrasyonlar şeklinde kendini gösterir. Lezyonlar sağ akciğerde daha sık izlenir. %40 oranında kaviter lezyonlar görülür. Kavite içeriğinin boşalmasıyla oluşan erken bronkojenik yayılım kavite etrafında ve aynı akciğerin diğer alanlarıyla, karşı akciğerin orta ve alt loblarında birden çok, aynı yumuşak infiltrasyonların veya bunların birleşmesiyle oluşan geniş infiltrasyonların oluşmasına yol açabilir, bu odaklar daha sonra nadiren ilerler, genellikle düzenli sınırlara sahip ayrı lezyonlar şeklinde iyileşir. Akciğer grafisindeki lezyonların niteliği ve aktivitesi konusunda tek bir grafi ile yorum yapmak, skarlaşma, fibronodüler veya kalsifik değişiklikleri hemen eski tüberküloz şeklinde yorumlamak yanlıştır. Altı ay ara ile çekilmiş akciğer grafisinde lezyonlar değişiklik göstermemişse, stabil lezyonlar şeklinde yorumda bulunmak daha sağlıklı bir yaklaşımdır(23). Akciğer radyolojisinde, lezyonlar tüberkülozu düşündürebilir. Fakat tüberkülozda görülen lezyonlar başka bir çok hastalıkta da vardır. Akciğer filmlerinin, aktif tüberküloz tanısında duyarlılığı %70-80 dir. Özgüllük ise nispeten daha azdır (%60-70) (48). 23 TÜBERKÜLOZDA TANI YÖNTEMLERİ TÜBERKÜLOZDA BAKTERİYOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ

27 Klinik, radyolojik ve/veya histolojik bulgularla bir hastada tüberkülozdan kuşkulanılabilir. Ancak hastalığın kesin tanısı sadece klinik örneklerde tüberküloz basilinin gösterilmesi ile mümkündür (9). Bakteriyolojik tanı yöntemleri dünyanın her yerinde her türlü gelişmişlik düzeyindeki ülkeler için en güvenilir tanı yöntemleridir (49). 1)Direkt Mikroskopik İnceleme: İncelenmesi istenen klinik örneğin (balgam, bronş lavajı, BAL, plevra ve BOS sıvısı, mide lavajı, kan, idrar, gaita, bronkoskopik iğne aspirasyonu, TTİA vb) uygun biçimde lama yayıldıktan sonra Ziehl Neelsen veya florokrom boyaları (Auramin O, Auramin-Rhodamin) ile boyanıp ışık mikroskopu veya floresan mikroskopta incelenmesidir (23, 50). Direkt yayma preparat kolay, süratli, tedavinin etkinliği ve kontrolü bakımından değerlidir, hemen her yerde yapılabilir. Alınan örnekte basil görülebilmesi için balgamın her ml sinde basil bulunmalıdır (51). Zielhl Neelsen yöntemi ile boyanan preparatta basiller, yağlı immersiyon sahasında mavi zemin üzerinde kırmızı renkte basil ya da kokobasil şeklinde görülürler. Florokrom metodu ile aside dirençli organizmalar sarıturuncu renkte floresan verirler (23, 51). Florokrom metodu daha hassastır. Kısa zamanda geniş bir tarama imkanı verir. Ancak florokrom metodu özel mikroskop, özel teknik ve boyama gerektiren bir metoddur. Bu metodla canlı olmayan organizmaları ayırt etmek de mümkün değildir. Bu nedenden dolayı bir 24 çok ülkede rutin olarak Ziehl Neelsen metodu kullanılır (51). 2)Homojenizasyon-Dekontaminasyon-Konsantrasyon:

28 Mikobakteriumların çoğalma zamanı, solunum yolu örneklerinde sık görülen diğer bakteri örneklerine göre uzundur. Kontamine olan diğer bakteriler inhibe edilmezse, mikobakteriumların üremesi bunlar tarafından engellenir. Ayrıca bakteri artık ürünleri ortamda birikebilir ve mikobakteriumların büyümesini potansiyel olarak inhibe edebilir. Ayrıca direkt metodla muayene edilen basil sayısının düşük olması nedeni ile bakteri saptanamadığı durumlarda da bu yöntem kullanılır. Klinik örnekler önce dekontamine edilir (%4 lük NaOH ile), daha sonra sıvılaştırılıp homojenize edildikten sonra santrifüje edilir. Dipte kalan sedimentin bir kısmı direkt lama yayılır, bir kısmı da besiyerine ekilir. 3)Konvansiyonel Kültür Teknikleri: Tüberküloz tanısı için altın standart hala kültürdür. Örneğin mililitresinde basil bulunduğunda pozitif sonuç verir. Ancak M.tüberkülozis çok yavaş ürer. Sonuç alabilmek için haftalarca beklemek gerekir (6, 52, 53). Yapay ortamda çoğalma için, potasyum, magnezyum, fosfor ve sülfür gereklidir. Nitrojen gereksinimi amonyum tuzları ve bütün yumurta içeriği, karbon gereksinimi ise glukoz veya gliserol tarafından karşılanır. Mikobakteriumların en iyi çoğaldığı ph 6,5-7 dir. CO 2 konsantrasyonunun %5-10 arasında olması gerekir. CO 2, kültür çoğalması sırasında yavaşça üretilir. Ancak inkübasyonun ilk 3-4 haftasında CO 2 ortamı gerekir. Nem nispeten yüksek olmalı ve inkübasyon ısısının o C arasında bulunması gerekir (54). 25 Mikobakterium Tüberkülozis i üretmek için ; 1)Genel besiyerleri,

29 2)Sıvı besiyerleri, 3)Seçici besiyerleri olmak üzere üç grup besiyeri kullanılmaktadır. 1)Genel besiyerleri: Lövenstein-Jensen, Pentegrani, American Trudeau Society nin yumurtalı besiyeri, Middlebrook 7H10 ve 7H11 gibi agarlı besi yerleridir. Burada kontaminasyonu önlemek için malaşit yeşili kullanılmaktadır. 2)Sıvı besiyerleri: Bu besiyerlerinde dekontaminan olarak tween 80 kullanılmaktadır. Bu besiyerleri daha çok BCG ve uzmanlaşmış labaratuarlarda kullanılmaktadır. BACTEC 12B, Middlebrook 7H9, Septi-Check AFB, Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) besiyerleridir. 3)Seçici besiyerleri: Besiyerlerine gereğine göre antibiyotik, vitamin, kimyasal maddeler ilave edilerek hazırlanırlar. Klinik laboratuarlarda en sık kullanılan besiyeri Löwenstein- Jensen olmakla birlikte besiyerinin opak görünümü nedeniyle üremenin fark edilmesi daha zor ve inkübasyon zamanı daha uzundur. Ortalama 6-8 haftalık bir süreye ihtiyaç duyulur (55). Yapılan çalışmalarda sensitivitesi %94, spesifitesi %100 bulunmuştur (56). YENİ TANI YÖNTEMLERİ Tüberküloz basili yavaş ürediğinden kültürler geç sonuç vermektedir. En hızlı sonuç veren ve en yaygın kullanılan test olan direkt metod da örnekte basil miktarı az ise negatif çıkmaktadır. Tüberküloz tanısı için duyarlı ve hızlı sonuç veren yöntemler aranmaktadır (57). 26

30 Teknolojinin gelişmesi ile bazı yeni tanı yöntemleri geliştirilmiştir: 1)Bakteriyolojik yöntemler 2)Biyolojik bileşiklerin kimyasal saptanımı 3)Moleküler biyolojik yöntemler 4)Serolojik yöntemler 1)Bakteriyolojik Yeni Tanı Yöntemleri: BACTEC (Radyometrik Kültür Sistemi) yönteminde C 14 ile işaretli palmitik asitin mikobakteriler tarafından metabolize edilmesi sonucunda oluşan radyoaktif CO 2 saptanarak basilin üremesi belirlenir. Bu yöntemde eritme, dekontaminasyon ve konsantrasyon işlemlerinden geçirilen klinik örnekler C 14 ile işaretli palmitik asit içeren kültür ortamına (Middlebrook 7H12) ekilir. Yayma (+) örneklerde ortalama 8 günde, yayma (-) örneklerde ise ortalama 14 günde üreme olmaktadır. BACTEC sistemine nükleik asit probları ya da gaz likid kromotografisi ile hücre duvarındaki lipidlerin analizi gibi yöntemlerin eklenmesi tanı süresini daha da kısaltmaktadır. Bu yöntemle erken tanı dışında, mikobakteri kültürlerinde tip tayini (BACTEC-NAP testi) ve duyarlılık testleri yapılmaktadır. Sistemle ilgili en önemli sorunlar; maliyetin fazla, tekniğin karmaşık olmasıdır (15, 23, 36, 52, 53, 58, 59, 60). MGIT (Mycobacterium Growth Indicator Tube); selektif 7H9 buyyon içeren tüplerin dibinde silikonla emdirilmiş O 2 ye duyarlı bir floresan madde içermektedir. Ekim yapılan tüpler wood lambası altında incelenir.bu sistemde üreme BACTEC yönteminde olduğu gibidir (13, 36, 58). 2)Biyolojik Bileşiklerin Kimyasal Saptanımı: Mikobakterilerin hücre duvarında çok miktarda lipid materyal bulunur. Bazı lipid formlarının değişik kromotografik yöntemlerle belirlenmesi hızlı 27

31 tanıda yararlı olabilir (53, 60). Tüberkülostearik asit (TBSA) mikobakteriler ve aktinomiçetales üyelerinde bulunan uzun zincirli, dallı doymuş yağ asitidir. Gaz likid kromotografisi ve kütle spektrometresi ile TBSA saptanması; basil saptanması ve tip tayininde yeni bir yaklaşımdır. Ancak TBSA nın tüberküloz dışı mikobakterilerde, nokardialarda ve kornebakterium larda bulunması, testin pahalı ve karmaşık oluşu nedeni ile yaygın kullanıma girememiştir (23). Mikobakteriye spesifik olan mikolik asitin saptanması da tanı yöntemi olarak tartışılmaktadır.yüksek performans likid kromotografi (Highperformance liquid chromatography-hplc) ile bakteriyel kültürlerde belirlenebilir.henüz klinik örneklere uygulanmamıştır. Sadece birkaç özelleşmiş laboratuarda kullanılmaktadır. Bu yöntem için 10 ila 100 milyon mikobakteri gereklidir (52, 60). 3)Moleküler Biyolojik Tanı Yöntemleri: Nükleik asit probları: Mikobakteriye spesifik DNA ve RNA probları ile çalışmalar yapılmaktadır. DNA Probları: DNA çift sarmalı sıcaklık veya tuz konsantrasyonunun değiştirilmesiyle iki tek sarmal haline dissosiye olur. DNA dissosiye olduktan sonra yeniden birleşebilir. Problar ilgilenilen genetik diziyi yansıtan tek sarmal nükleik asit parçalarıdır. Probun belirlenmesine olanak sağlamak için radyoaktif veya nonradyoaktif işaret eklenir. Prob klinik örnekteki DNA ile hibridize olursa bağlı işaret ölçülerek organizmanın bulunduğu sonucuna varılır. RNA Probları: DNA probları için alternatif bir yaklaşım, organizma içinde multipl kopyaları bulunan bir nükleik asit dizisi aramaktır. Prob için bir çok hedef bulunacağından yöntemin sensitivitesi artar. Büyük veya ribozomal RNA probları geliştirilmiştir. Ribozomal RNA problarının avantajı bir 28

32 mikroorganizma içinde binlerce hedef bulunmasıdır. Hibridizasyonu belirlemek için bunlara da işaret takılır (61). Nükleik asit probları ile M.tüberkülozis i saptayabilmek için örnekte en az 10 6 basil bulunması gerekmektedir. Bu kadar basilin klinik örneklerde bulunması güç olduğundan günümüzde nükleik asit probları kullanılmamaktadır (23). Polimeraz Zincir reaksiyonu (PCR): İlk kez 1985 te Mulis ve arkadaşları tarafından geliştirilen bir yöntemdir (62). Probla saptanmayacak kadar çok az hedef DNA veya RNA parçalarının olması durumunda, özgül nükleotid sıralarını bollaştırmak için polimeraz enzimlerinin kullanıldığı bir sistemdir. Eldeki veriler, yayma (+) hastalarda PCR ın yüksek bir tanısal duyarlılığa sahip olduğunu (%88-95), ancak yayma (-) hastaların saptanmasında sorunlar bulunduğunu (%57-71) göstermektedir. Ölü ve canlı basili ayırt edememesi ve kolay kontamine olması nedeni ile yanlış pozitif sonuçlara yol açması, pahalı ve karmaşık bir yöntem olması PCR ın dezavantajlarıdır (9, 23). DNA Parmak İzi Metodu:1986 dan beri kullanılan bir moleküler biyolojik tanı yöntemidir. İzolatları tiplendirmede özgül sonuçlar verir (14, 23, 58). Fragman Uzunluk Polimorfizmi Restriksiyon Analizi (RFLP): DNA restriksiyon endonükleazları DNA molekülünde tanıma bölgeleri denilen az sayıda fakat belirli nükleotid sıralarını tanımlar ve o noktadan DNA molekülünü keserler. Kesilen kısım 4 ile 8 nükleotid uzunlukta parçalara ayrılır. Parçalar agaroz jel ile elektroforezde yürütüldüğünden birbirine benzer boyutta çok sayıda bantlar oluşur. DNA nın jelden membrana transferi yapılır. DNA prob uygulaması ile gösterilebilir (23, 63, 64). Luciferase Testi: Ateş böceklerinin ışık vermesini sağlayan enzim olan luciferase genini taşıyan bir mikobakteriyofaj kullanılır. Luciferase ATP 29

33 varlığında luciferin ile reaksiyona girer ve ışığı etrafa saçar. Bu faj kullanıldığında canlı mikobakteri kültürleri ışıldamaktadır. Bunun için mikobakteri gerekmektedir. Ayrıca duyarlılık testleri de yapılabilmektedir (64). Ligaz Zincir Reaksiyonu:Bu yöntemde enzim olarak ısıya dayanıklı DNA ligaz kullanılr. DNA ligazın fonksiyonu DNA nın iki iplikçiğini bağlamak ve çift sarmal yapısını korumaktır. Bu yöntem ile nükleotid hatasını saptamak mümkündür. Virulans veya direnç gibi herhangi bir fenotipik değişikliğe sebep olan mutasyon gerçekleşirse oluşan nükleotid hatasını saptamak mümkündür. İlaç rezistansını saptamak için kullanılan bu yöntemin dezavantajı aynı fenotip ile sonuçlanan değişik multipl mutasyonların olmasıdır. Ümit verici olmakla birlikte klinik laboratuarlarda uygulamak için kullanışlı değildir (7). 4)Serolojik Yöntemler: Son yirmi yıldır, immunolojik yöntemlerle (RAST ve ELISA) hem klinik örneklerde mikobakteriyel antijenlerin gösterilmesi hem de mikobakteriyel antijenlere karşı oluşan antikorların saptanmasına yönelik çalışmalar sürmektedir (17, 23, 53). Mikobakteriyel antijenlerin saptanmasına yönelik testler kültür sistemlerine uygulanıp organizmanın belirlenmesi hızlandırılabilmektedir (53). Serolojik testlerin en değerli olduğu konular, akciğer dışı organ tüberkülozu ve yayma (-) tüberküloz olgularıdır. Akciğer dışı organ tüberkülozlu olgularda akciğer grafisi ya da balgam gibi kolay ulaşılabilen tanısal hedefler yoktur (17, 23). Serolojik tanı testlerinin tüberküloz tanısında yeterli duyarlılık ve özgüllüğü sağlayamamasının değişik nedenleri vardır. M.tüberkülozis, çapraz reaksiyon veren çok sayıda antijene sahiptir ve bu antijenlerin büyük bir kısmı diğer mikobakterilerde, nokardialarda, kornebakterilerde ve rodokoklarda da

34 30 bulunmaktadır. Bu durum kontrol grubunda gözlenen yanlış pozitif sonuçları açıklayabilir. BCG ile aşılama da yanlış pozitifliğe sebep olur (65). Serolojik testlerden en çok üzerinde çalışılan ve umut verici olanlar şunlardır: Antijen 5 Çok sayıda araştırma, tüberkülozun serolojik tanısında M. tüberkülozis antijeni 5 in rolünü incelemiştir. Genel olarak bu araştırmalar bu tekniğin marjinal duyarlı olduğunu göstermiştir (17). Daniel ve arkadaşlarının 1985 yılında yaptıkları bir çalışmada duyarlılık %45,8-63,4, özgüllük %91,5-98,3 olarak bulunmuştur (66). Chan ve arkadaşlarının yaptığı başka bir çalışmada yayma (+) olgularda duyarlılık %30-52 iken yayma (-)olgularda ise %16-22 civarında idi (67). Antijen 60 Tüberkülinin ısıya dayanıklı temel bileşeni Antijen 60 olarak adlandırılır. Nokardia ve korinebacteriumda bulunduğu gibi mikobakteriumda da bulunur. Antijen 60 a karşı hem IgM hem de IgG düzeyleri için ELISA testleri incelenerek çalışmalar yapılmış, akciğer tüberkülozundan şüphelenilen fakat balgam yaymaları (-) olan 83 hastada duyarlılık %76, özgüllük %98 bulunmuştur (68). Ülkemizden Koşar ın 1992 yılında yaptığı bir çalışmada ise duyarlılık %86, özgüllük %85,7 olarak bulunmuştur (151). 38 kd Antijeni Bothamlet ve arkadaşlarının 1992 de gerçekleştirdikleri bir çalışmada, yayma (+) olgularda duyarlılık %80, özgüllük %100, yayma (-) olgularda ise duyarlılık %15 olarak bulunmuştur (69). 31