Gıda Mikrobiyolojisinde MembranFiltrasyon Uygulamaları. Doç. Dr. Serap COŞANSU AKDEMİR

Transkript

1 Gıda Mikrobiyolojisinde MembranFiltrasyon Uygulamaları Doç. Dr. Serap COŞANSU AKDEMİR 1

2 Neden membranfiltrasyonyöntemine ihtiyaç duyulur? Membranfiltrasyonyöntemi, su (içme, işletme, kullanma), meşrubat gibi sıvı gıdaların ve suda tam olarak çözülen katı gıdaların analizinde ve özellikle gıdada aranılan mikroorganizma sayısı 10 ml 'de 1 veya daha az ise uygulanabilecek hemen hemen tek yöntemdir. Genel olarak bakteriyolojik analizlerde 0,45 μm por çaplı filtreler kullanılır. Az sayıda bakteri 0,20-0,22 μm çaplı filtrelerin kullanımını gerektirecek kadar küçüktür. 2

3 Membran filtreler sayımı kolaylaştırmak amacı ile; a) Kare şeklinde alanlar (çizgiler) basılı olarak, b) Kare şeklinde hidrofobik alanlar (çizgiler= ızgaralar) basılmış şekilde hazırlanır. Bunlardan sadece kare şeklinde alanlar basılmış olanlarda kolonilerin yayılması önlenemez, alanlar sadece sayım kolaylığı oluşturulmak için basılmıştır. Buna karşın kare şeklinde alan oluşturacak şekilde hidrofobik ızgara basılmış olan filtrelerde, ızgaralar hidrofobik özellikte olduğu için ızgara üzerinde koloni gelişmesi mümkün değildir. 3

4 Ayrıca membran filtreler gıda mikrobiyolojisinde; Sterilizasyon amacı ile de kullanılır (Isıl işlem uygulanamayan başta antibiyotikler ve vitaminler olmak üzere bazı besiyeribileşenleri membran filtrasyon ile sterilize edilmektedir.) Benzer şekilde bakteriyofajçalışmalarında da fajizolasyonu için membranfiltrelerden yararlanılır. 4

5 Membranfiltrasyonyönteminde kullanılan filtreler kurutularak ve sterilize edilmiş saydam plastik, cam vb. ambalajlar içinde uzun süre korunabilir, hatta mikroorganizmaya zarar vermeden kurutulan filtreler ileri çalışmalarda kullanılmak üzere mektupla dahi başka laboratuvarlara gönderilebilir. Bu gibi üstünlükler diğer sayım ve/veya arama yöntemlerinde yoktur. 5

6 Membranfiltrasyonyönteminin kullanımındaki sınırlamalar: Suda tam olarak eriyebilenlerin dışında kalan katı gıdalar ile boza ve şeftali suyu gibi pulplusıvılar normal filtrasyonişlemi ile membranfiltreden geçirilemezler. Benzer şekilde normal yağlı süt de kolaylıkla filtre edilemez. Bununla beraber, bu gibi gıdaların filtrasyonuiçin özel çözücüler ve/veya enzimler ve/veya ön filtre kullanımı ile membranfiltrasyonyöntemi pek çok katı gıdada başarılı bir şekilde kullanılmaktadır. 6

7 Gıda mikrobiyolojisinde membran filtrasyon uygulamaları temel olarak; 1. Kültürel yöntemler 2. Mikroskobik yöntemler olmak üzere iki ana grup altında toplanabilir. Kültürel yöntemler de kendi içinde; 1. Kolonilerin gözle sayımı 2. Mikrokolonilerin mikroskop ile sayımı olarak ikiye ayrılabilir. 7

8 FiltrasyondaEnzim Uygulamaları Membranfiltrasyonuygulamalarında en büyük zorluk filtre edilecek materyalin filtreyi tıkamasıdır. Bu gibi durumlarda yapılması gereken tek şey sayımı yapılacak bakterilere zarar vermemek kaydı ile filtreyi tıkayabilen organik maddelerin enzimler ilefiltreyi tıkayamayacak daha küçük moleküllere parçalanmasıdır. 8

9 9

10 Kültürel Yöntemler 10

11 Standart Membran Filtrasyon Yöntemi Yöntemin prensibi, belirli bir hacimdeki sıvı (ya da homojenize edilmiş katı) gıda örneğindeki mikroorganizmaları, porçapları bilinen bir membranfiltre üzerinde tutmak, bu filtreyi aseptik koşullarda uygun bir standart katı besiyeri veya besiyeri emdirilmiş absorbantpedüzerine yerleştirerek koloni oluşmasını sağlamak ve bu kolonileri sayarak gıdadaki mikroorganizma sayısını bulmaktır. Genellikle, bakterilerin tespiti için porçapı 0,45 μm, mayaların tespiti için 0,65 μm 11

12 Sayımı yapılacak mikroorganizmaya göre genel ya da selektif besiyeri kullanılabilir. Standart kültürel yöntemlerde olduğu gibi var/yok testleri için zenginleştirme kültürleri membran filtreden geçirilerek bu filtreler uygun bir selektif besiyerine yerleştirilebilir. Veya MUG içeren besiyerlerikullanılarak E. colisayımı/ aranması yine bu sistem ile yapılabilir. Bir diğer deyiş membranfiltrasyonyöntemi, kullanılacak besiyerinebağlı olarak her tür mikroorganizmanın aranması veya sayılmasında kullanılabilir. 12

13 Membran, besiyerineyerleştirildikten ve inkübasyonsonucu oluşan koloniler sayıldıktan sonra örnekteki mikroorganizma sayısı hesaplanabilir. Örneğin, 100 ml içme suyu membrandan geçirildi ve inkübasyondansonra 25 koloni sayıldı ise sayım sonucu 25 adet/100 ml ya da 0,25 adet/ ml olarak verilir. 13

14 Membranfiltrasyonyönteminde seyreltme kavramı; Katı ve sıvı besiyerinde yapılan sayımlarda uygulanan seyreltme kavramından farklıdır. Örneğin su analizi yapılacak ise, istenilen hacimde su membrandan geçirilebilir. Membran filtrasyonda standart 5 cm çaplı filtre kullanılıyor ise bu membran üzerinde koloni oluşacak düzeyde örnek filtre edilmelidir. Bu amaçla 3 farklı membrandan örneğin, 1 ml; 10 ml; 100 mlsıvı filtre edilmelidir. Mikroorganizma yükü fazla ise 0,1; 0,01 ml pipetlemek hatalı sonuca neden olur.bu gibi durumlarda standart 10-1, 10-2 seyreltmeler yapılıp bu seyreltilerden 1 'er ml alınmalıdır. 14

15 Membranınıslanmasını sağlamak için kullanılacak steril su hacmi analiz sonucunu etkilemez. İstenir ise (örneğin içme suyunda klor veya başka bir inhibitör varsa) analizde sahte negatif sonuç almayı önlemek için su örneğinden sonra yeteri kadar steril su veya özel yıkama çözeltisi geçirilerek (bir anlamda filtre edilerek) membranüzerinde kalabilecek inhibitörler uzaklaştırılabilir. Yine burada kullanılacak steril yıkama suyu ya da yıkama çözeltisi miktarı analiz sonucunu etkilemez. Membranfiltrasyontekniği ile sayımın en önemli üstünlüklerinden birisi de sadece membran filtrasyon haznesine konulan sayım yapılacak sıvının miktarının önemli olması, bunun üzerine konulacak steril sıvıların miktarının önemli olmamasıdır. 15

16 Standart membranfiltrasyonyöntemi ile gıdaların mikrobiyolojik analizinde dikkat edilmesi gereken noktalar: Yüksek oranda yağ içeren gıdaların (peynir, sosis, çikolata, mayonez, krema, tereyağı gibi) analizinde örnek, o C 'a ısıtılmış ve önceden sterilize edilmiş bir emülgatörile muamele edilmelidir. Emülgatörolarak en fazla kullanılanlar Tween80 (%0,5-1 konsantrasyonlu) ve Triton X-100 (%1-5 konsantrasyonlu) 'dür. 16

17 Şeker ve şekerli ürünler maya, küf ve bakteri tespiti açısından analize alınmaktadır. Bu ürünler 10 veya 100 katı steril su ile karıştırılarak çözülmekte veya yaklaşık 40 o C 'da ısıtılarak çözülmesi kolaylaştırıldıktan sonra filtre edilmelidirler. Sebze ve baharat gibi örnekler küçük parçalara ayrılır o C 'da fizyolojik tuzlu suda 20 dakika kadar ıslatılıp, mikroorganizmaların sıvı faza geçmeleri sağlanmalıdır. Filtrenin tıkanmasına neden olacak gıdalarda ön filtrasyonişlemi uygulanmalıdır. Kullanılan ön filtrenin por çapı 12 μm kadar olabilir. 17

18 MembranFiltrasyonSeti Üçlü, 100 ml huni kapasiteli membran filtrasyon sistemi Vakum Pompası Cam Vakum Erleni vakum pompası vakum hortumu vakum erleni ana gövde filtre gövdesi filtre 18

19 Burada kullanılan ana gövdenin otoklavda sterilizasyona dayanıklı camdan veya tercihen paslanmaz çelikten yapılmış olması gerekir. Filtrelerin por çapları, filtrenin üst yüzeyinden alt tarafa doğru ilerledikçe 3-5 kat genişleyecek şekilde yapılmıştır. Bu nedenle bakteriler üst tarafta tutulurken, besiyeri kapiller hareketle kolayca yukarıya doğru yükselebilmekte ve böylece filtre üzerinde kalan mikroorganizmaların besin maddelerini alarak gelişmeleri ve koloni oluşturmaları sağlanmaktadır. 19

20 Filtreler yapıldıkları membranlarıncinsine göre tek kullanımlık veya tekrar kullanılabilir özelliktedir. Burada kullanılan pedler, steril dehidre besiyeri içerdikleri için 3,0-3,5 ml steril demineralizesu ile ıslatılıp, hemen kullanıma hazır hale getirilebilir. Besiyerinirehidrehale getirmek için kullanılan steril suya, istenen maddeler ilave edilerek zenginleştirilmiş besiyeri de hazırlanabilir. 20

21 Filtrasyonİşlemi 1. Filtrasyonsetinin gövdesi otoklavda 121 o C 'da dakika sterilize edildikten sonra filtre düzeneği kurulur. 2. Filtre yatağı steril su ile ıslatılır. Membranfiltre koruyucu diski ile birlikte filtre tutucuya yerleştirildikten sonra, koruyucu disk uzaklaştırılır. 3. Belirli bir hacimdeki su veya seyreltmelerden alınan örnek ana gövdeye aktarılır. 4. Vakum pompası çalıştırılarak örnek filtre edilir ve daha sonra filtre tutucunun iç kısmı steril su, fizyolojik tuzlu vb. ile yıkanarak esansiyelyağ asitleri ve dezenfektan gibi inhibitörler uzaklaştırılır. Membranfiltrasyondaporlarçok küçük olduğu için sistem bir anlamda hidrofobiközellik göstermektedir. Dolayısı ile filtrenin altı ile üstü arasında üst taraf lehine bir basınç farkı olmaz ise sıvının filtreden geçmesi mümkün değildir. Filtre altına vakum uygulanarak filtrasyon işlemi gerçekleştirilir. 21

22 5. Steril bir pens ile aseptik koşullarda alınan filtre daha önceden Petrikutularında hazırlanmış katı besiyerleriveya 50 mm 'likher plastik Petrikutusu için 3,0-3,5 ml steril su ilave edilerek rehidrehale getirilmiş pedlerüzerine, arada hava kabarcığı kalmayacak ve filtrenin mikroorganizmaların bulunduğu kareli kısmı üste gelecek şekilde yerleştirilir. 6. Petrikapakları üstte kalacak şekilde, ters çevrilmedenamaca uygun sıcaklık ve atmosfer koşullarında inkübasyonabırakılır. 22

23 Eğer ön filtre kullanılmış ise;ön filtre de benzer şekilde Petrikutusuna yerleştirilir ve inkübasyonabırakılır. İnkübasyonsonunda ön filtrede ve asıl filtrede oluşan koloniler sayılarak bunların toplamı analiz edilen gıdadaki mikroorganizma sayısı olarak verilir. 23

24 Koloni Boyama Teknikleri Bazı durumlarda oluşan kolonilerin rengi ile filtre arasında yeterli kontrast sağlanamadığı için kolonilerin sağlıklı bir şekilde sayımı mümkün olmaz. Bu gibi durumlarda oluşan kolonilerin boyanması söz konusudur. Bu amaçla negatif boyama ile ortamın boyanıp kolonilerin renksiz kalması ya da pozitif boyama ile kolonilerin doğrudan boyanması ile sayım işlemleri kolay hale getirilebilir. 24

25 a) Negatif boyama : İnkübasyon sonrasında membran %0,01'lik malahit yeşili ile 3-10 saniye muamele edilir, sonra fazla boya dezenfektan olan bir çözeltiye dökülür. Bu boyama şeklinde membran filtre boyanıp, koloniler boyanmadan kalacağı için sayım yapılan sahada berrak kalan alanlar bakteri kolonileri olarak sayılır. 25

26 b) Pozitif boyama : Membran filtre %0,01 'lik metilen mavisi ile 5 dakika muamele edilip, membran filtre fazla boyanın akıtılması amacı ile suya konulur. Metilen mavisi bakteri kolonilerine oranla membrandan daha kolay olarak yıkanır ve böylece membran üzerindeki boyalı kısımlar bakteri kolonileri olarak sayılır. 26

27 HidrofobikGridMembranFiltrasyon (HGMF) Yöntemi Bu yöntem 1974 yılında, Sharpeve Michaudadlı araştırıcıların filtre olarak hidrofobikızgaralı membranlarıgeliştirmelerinden sonra kullanılmaya başlamıştır. ISO-Gridhidrofobikmembranfiltreler üzerinde olmak üzere 1600 adet küçük bölme bulunmaktadır. Bu bölmeler içine yerleşen mikroorganizmalar inkübasyondansonra dairesel koloniler oluşturmaktadır. Filtre üzerinde bulunan hidrofobikızgara sistemi sayesinde kolonilerin yayılarak birbirine karışması engellenmekte ve bu durum sayım kolaylığı sağlamaktadır. 27

28 HGMF yönteminde, standart membran filtrasyon yönteminde olduğu gibi gerekli ön hazırlıklar yapıldıktan sonra; Gıda örneği, yüzeyinde belirli sayılarda ve belirli por çaplarına sahip hidrofobikbölme bulunan filtrelerden geçirilir. Filtreler aseptik koşullar altında uygun bir besiyerine yerleştirilerek inkübasyona bırakılır. İnkübasyonsonunda içinde mikrokolonilergelişen hücreler (hidrofobik ızgara; alan) sayılır. 28

29 Sayım gözle veya otomatik makineler ile yapılabilir. Pozitif hücre sayısı aşağıdaki formülde yerine konularak hesaplandığında gıda örneğinin 1 mililitresi veya 1 gramındaki mikroorganizma sayısı bulunur ve sonuç "gelişme görülen bölmelerdeki en muhtemel sayı"(mostprobablenumberof Growth Unit; MPNGU) olarak ifade edilir. FDA tarafından önerilen formül; EMS = {N ln[n / (N -A)]} Formüle göre toplam kare sayısının toplam negatif kareye (N-A) bölünmesi ile elde edilen sayının e tabanına göre logaritması (ln) toplam kare sayısı ile çarpılır. N = membran filtre üzerindeki toplam kare sayısı A = pozitif olarak sayılan kare sayısı 29

30 HGMF sisteminde koloni değil alan sayıldığı için filtre üzerinde ideal olarak pozitif saha sayılması gerekir. Bu sınırların dışındaki sayımlarda ekimin tekrarlanması önerilir. Prensip olarak gözle yapılan sayımlarda pozitif alan sayısı 200 'ü geçmiyor ise alanların tümü sayılır, bu değeri aşan sayımlar için yatay ve düşey boyutta 4 'er olmak üzere her biri 40 alan olmak üzere toplam 8 hat boyunca sayım yapılıp sonucun 5 ile çarpılması önerilir. 30

31 ISO-GRID/NEO-GRID MembranFiltrasyonSistemi 31

32 ISO-GRID/NEO-GRID NEO-GRID (tek kullanımlık) Gıda İçecek örneklerinin analizinde kullanılabilir. Su Küf-Maya Toplam Canlı Sayımı Koliform E. coli E. colio157:h7 Salmonella Listeria spp. Listeria monocytogenes S. aureus 32

33 Besiyerleri BMA Agar (6903A) E. coli nin doğrulanması EF-18 Agar (6901A) Salmonella nın belirlenmesi ve doğrulanması LM-137 Agar (6913A) Listeria ve Listeria monocytogenes nin sayımı. LMG Agar (6902A) Koliformların belirlenmesi SCCRAM Broth (6910A) Salmonella nın zenginleştirilmesi SD-39 Agar (6907A) E. coli ve E. coli O157:H7 nin sayımı TSAF Agar (6905A) Toplam bakteri sayısının belirlenmesi YM-11 Agar (6904A) 48 saatte maya-küf sayısının belirlenmesi 33

34 Enzimler Gıda partiküllerinin parçalanarak 0.45 μm gözenek çaplı filtreden geçmesini sağlarlar. AMG (6852E) Nişastalı gıdalar APUG (6851E) Proteinli gıdalar Cellulase(6853E) Gam Hemicellulase(6854E) Gam Papain (6850E) Proteinli gıdalar 34

35 35

36 36

37 MİKROSKOBİK UYGULAMALAR 37

38 Basit (Direk) Mikroskobik Sayım Yöntemi Breedyöntemi, Howardlamı gibi mikroskobik sayımlarda olduğu gibi membranfiltrasyonyöntemi ile birlikte kullanılan basit mikroskobik sayımlarda da canlı ve ölü hücreler beraberce sayılırken, bu yöntemlerin en büyük üstünlüğü kısa sürede sonuç vermeleridir. Basit mikroskobik sayım, diğer deyişle direkt mikroskobik sayım (DMC) yöntemi genellikle rutin kontrollerde uygulanan bir yöntemdir. Bu yönteme göre örnek filtreden geçirilip mikroorganizmalar filtre üzerinde tutulduktan sonra uygun şekilde boyama ve yıkama işlemleri uygulanarak mikroskop altında sayım yapılmaktadır. Bu metot özellikle örnekte çok az sayıda mikroorganizma olduğu durumlarda uygundur. 38

39 Yöntemin uygulanmasında filtrasyonişlemi tamamlandıktan sonra filtre ana hazneden çıkartılmaz, bunun üzerine standart boyama tekniklerinde kullanılan metilen mavisi gibi bir boya filtreyi kaplayacak miktarda ilave edilir ve 5 dakika kadar beklenir. Hangi boya kullanılırsa kullanılsın boyanın önceden filtre edilmesi gerekmektedir. Bu amaçla sayım yapılacak filtre üzerine başka bir membranfiltre konulması önerilir. Sonra vakum pompası tekrar çalıştırılıp boya filtre üzerinden uzaklaştırılır ve bol miktarda destilesu geçirilerek membran yıkanır. 39

40 Daha sonra filtre çıkartılıp kurutulur, bir Petrikutusunda bulunan immersiyonyağına daldırılarak yağ ile doygun hale getirilir. Filtrelerden mikroskobik sayıma uygun boyutta (örneğin 1 cm 2 ) alanlar kesilip mikroskopta inceleme yapılır. Sonucun hesaplanması standart Breedyöntemine benzer. İlave olarak toplam filtrasyonalanı standart şekilde formüle ilave edilir ve filtreden geçirilen hacimdeki toplam canlı ve ölü bakteri sayısı hesaplanır. 40

41 Direkt Epifloresan Filtre Tekniği (DEFT) Kısa dalgalı ışınlara maruz bırakılan çeşitli maddeler uzun dalgalı fluoresans ışığı yayarlar ve bu özellik, mikroskobik analizlerde kullanılmaktadır. Fluoresant mikroskobunda basit ışık mikroskobundan farklı olarak; yüksek basınçlı cıva lambası ile elde edilen kuvvetli bir ışık kaynağı, (örneğin, 200 W HBO - 200, Osram lambası), kaynaktan çıkan ışınlar için iyi geçirgen bir kondensör, iz halinde bile kırmızı ışık geçmesine izin vermeyen, sadece 420 nm dalga boyunda mavi ışığın geçmesine izin veren kondensör önüne yerleştirilen kaynak filtresi ve oküler önüne yerleştirilen, kaynaktan çıkan fazla ışınları elimine edecek bir koruma filtresi bulunur. 41

42 DEFT, floresan boyalar ve floresan mikroskobu kullanılarak uygulanır. Yöntem orijinal olarak çiğ ve ısıl işlem görmüş süt örneklerinde bakteri sayımı için geliştirilmiş, ancak daha sonra dondurulmuş balık, et, kıyma, mayonezli salatalar, krema ve krema benzeri ürünler, peynir altı suyu, domates salçası, şarap ve su gibi değişik gıdaların analizinde de yaygın kullanım alanı bulmuştur. Bu teknik ile elde dilen sonuçların klasik Petrisayım sonuçları ile paralellik gösterdiği belirlenmiş olup, gıdaların mikrobiyolojik analizlerinde hızlı arama yöntemi olarak kabul edilmektedir. 42

43 Bu yönteme göre belirli oranlarda seyreltilmiş gıda homojenizatıeğer gerekli ise süt örneğinde olduğu gibi ön filitrasyonamacı ile 5 μm'liknaylon filtreden geçirilir ve elde edilen filitrattriton X-100 ve tripsinile 50 o C 'da muamele edilir. Burada kullanılan Triton X-100 ve tripsiningörevi sütteki sırasıyla yağ globüllerinive somatik hücreleri parçalayarak filtrenin tıkanması engellemektir. Elde edilen bu filitratinkübasyonabırakıldıktan sonra 0,6 μm por çaplı nükleopor polikarbonat membrandan geçirilip elde edilen filtre akridinoranjile boyanır ve kurutulduktan sonra boyanan hücreler epifloresan mikroskop ile sayılır. 43

44 DEFT yönteminde canlı ve ölü hücreler ayrılabilir. DNA ve RNA farklı yapıları nedeniyle akridin oranj ile farklı renklerde boyanırlar. Yani RNA kırmızı, DNA ise yeşil renkte boyanır. Canlı hücrelerde RNA konsantrasyonu fazla olduğundan oluşan floresan kırmızıdır. Ölü hücrelerde ise RNA konsantrasyonu düşüktür, bu nedenle ölü hücreler DNA dan kaynaklanan yeşil floresan nedeniyle yeşil renkte görülürler. İsteğe göre sadece canlı hücreler ya da hücrelerin tamamı (canlı + ölü) sayılır. 44

45 45

46 Hesaplama Breed yöntemindekine benzer; Toplam hücre sayısı (ml) = [A FMF] / V A: Görüş alanlarındaki ortalama hücre sayısı FMF: membranfiltrenin alanı / mikroskop görüş alanı (FMF: Filtre Mikroskop Faktörü) V: Filtre edilen örnek hacmi (ml) 46

47 Bu yöntem direkt mikroskobik sayım yönteminden yaklaşık 100 kat daha hassastır. Son yıllarda DEFT yönteminin Howard lamı ile küf sayımına alternatif olarak kullanımı üzerine yapılan araştırmalar DEFT yönteminin diğerine göre çok daha hassas olduğunu ortaya koymuştur. 47

48 Mikrokoloni-DEFT Mikrokoloni-DEFT yöntemi koloni oluşturabilen canlı hücrelerin sayımında kullanılan hızlı bir analiz sistemidir. Bu yönteme göre gerekli ön işlemlerden geçirilmiş gıda homojenizatı membran filtreden geçirilmekte ve uygun bir katı besiyerinin yüzeyine yerleştirilerek inkübasyona bırakılmaktadır. Mikrokolonilerin oluşması için gerekli inkübasyon süresi Gramnegatif hücrelerde 3 saat, Gram-pozitif hücrelerde ise 6 saattir. Daha sonra bu filtreler akridinoranjile boyanarak oluşan mikrokolonilermikroskop altında sayılmaktadır. Bu teknik kullanılarak 10 3 /g Staphylococcus, Pseudomonasveya koliformgrup mikroorganizma 8 saat içinde tespit edilebilmektedir. 48

49 Antikor Direkt Epifloresan Tekniği (Ab-DEFT) DEFT yönteminin bir modifikasyondur ve patojen bakterilerin spesifik olarak sayımına olanak sağlar. İşlem aşamaları: Örneğin homojenizasyonu (Gerekli ise ön filtrasyon) Tripsin ve Triton-X ile muamele 0,2 µm porçaplı siyah polikarbonatfiltreden geçirme Filtrenin fluoresanboya ile işaretlenmiş antikor ile boyanması Filtrenin yıkanması Floresan mikroskopta inceleme 49