EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (DOKTORA TEZİ) KATI KÜLTÜR FERMANTASYONU İLE KSİLANAZ ENZİM ÜRETİMİNİN OPTİMUM KOŞULLARININ BELİRLENMESİ

Transkript

1 EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (DOKTORA TEZİ) KATI KÜLTÜR FERMANTASYONU İLE KSİLANAZ ENZİM ÜRETİMİNİN OPTİMUM KOŞULLARININ BELİRLENMESİ Sayıt SARGIN Biyoteknoloji Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu : Sunuş Tarihi: Tez Danışmanı : Prof Dr. Ahmet KOCATAŞ Bornova-İZMİR

2 IV

3 V ÖZET KATI KÜLTÜR FERMANTASYONU İLE KSİLANAZ ENZİM ÜRETİMİNİN OPTİMUM KOŞULLARININ BELİRLENMESİ SARGIN, Sayıt Doktora Tezi, Biyoteknoloji Anabilim Dalı Tez Yöneticisi : Prof. Dr. Ahmet KOCATAŞ Temmuz 2003, 101 sayfa Bu çalışmada, katı kültür fermantasyon yöntemi ile ksilanaz enzimi üretiminde optimum koşullar belirlenmiştir. Trichoderma longibrachiatum fungus kültürü ile yapılan ve çeşitli tarımsal ürünlerin (buğday kepeği, mısır koçanı, pirinç kepeği, ayçiçek küspesi, pamuk küspesi, malt çimi) substrat olarak kullanıldığı üretimlerde, ph, başlangıç nem oranı ve sıcaklığın ksilanaz aktivitesine etkisi belirlenmiştir. Optiumum koşullarda, (malt kökçüğü-buğday kepeği karışımı 3:1, ph 6.50, başlangıç nem oranı % 60 ve 28 C) maksimum enzim aktivitesi 6658 IU/g kuru substrat olarak elde edilmiştir. Bunun yanısıra ksilanaz enziminin C sıcaklık ve ph aralığında optimum aktivite gösterdiği saptanmıştır. Çeşitli ekstraksiyon yöntemlerinin ksilanaz enzim verimine etkisi incelenmiş 30 dakikalık temas süresinin ekstraksiyon için yeterli olduğu belirlenmiştir. 15 l hacimli biyoreaktörde yapılan üretimlerde ise maksimum ksilanaz aktivitesi 0.5 cm substrat kalınlığında ve 3.33 l/dak/kg substrat havalandırma hızında 3467 IU/g kuru substrat olarak elde edilmiştir. Anahtar sözcükler : ksilanaz, malt çimi, buğday kepeği, hemiselülaz, katı kültür fermantasyonu, Trichoderma longibrachiatum.

4 VI

5 VII ABSTRACT DETERMINATION OF OPTIMUM CONDITIONS FOR XYLANASE PRODUCTION IN SOLID STATE FERMANTATION SARGIN, Sayıt Ph.D in Biotechnology Supervisior: Prof. Dr. Ahmet KOCATAŞ July, 2003, 101 pages In this study, optimum conditions for the production of xylanase in solid state fermentation has been determined. Various substrates (wheat bran, corn cobs, rice bran, sunflower seed cake, cotton seed cake, malt sprouts) were used for the production of xylanase from the fungus Trichoderma longibrachiatum. The effect of initial ph, initial moisture content and production temperature was determined. Under optimized conditions (malt sprouts and wheat bran mixture (3:1), ph 6.50, 60 % of initial moisture content and at 28 C) maximum enzyme yield 6658 IU/g dry substrate was obtained. The optimum temperature range C and ph range were found to be optimum for xylanase assay. The effect of different extraction methods was also studied. 30 minutes of contact time was found to be sufficient during the extraction. In 15 L bioreactor experiments the maksimum xylanase activity obtained was 3467 IU/g dry substrate at 0.5 cm substrate depth and 3.33 L/min/kg substrate aeration rate. Key words : xylanase, malt sprouts, wheat bran, hemicellulase, solid state fermentation, Trichoderma longibrachiatum.

6 VIII

7 IX TEŞEKKÜR Tez çalışmalarımda yönlendirici yaklaşımlarını ve desteğini esirgemeyen, talihsiz rahatsızlığı nedeniyle çalışmalarımın yazım ve sunum aşamasında yer alamayan ancak bu süreçte de her zaman yanımda olduğunu bildiğim değerli hocam Prof. Dr. Ş. Suha Sukan a öncelikle teşekkür ederim. Danışmanım Prof. Dr. Suha Sukan ın rahatsızlığı sonrasında danışmanlık görevini üstlenen ve her türlü sorunumda bana yardımcı olan Sayın Prof. Dr. Ahmet Kocataş a; tez izleme komite üyelerinden Sayın Prof. Dr. Ali Tanrısever e ve her zaman teşvik edici, moral verici ve çözüm üretici yaklaşımları için Sayın Yrd. Doç. Dr. Gaye Öngen e teşekkür ederim. Sağladığı imkanlar, çalışma ortamı ve her türlü destek için Biyomühendislik Bölüm Başkanı Sayın Prof. Dr. Fazilet Vardar Sukan a teşekkürü bir borç bilirim. Tez çalışmalarım boyunca her zaman yanımda olan ve manevi desteğini esirgemeyen aileme, reaktör çalışmalarındaki yardımlarından dolayı Sayın Araş. Gör. Suphi Öncel e, yazım aşamasında sağladığı kolaylıklardan dolayı Sayın Araş. Gör. Erbil Kalmış a ve adını sayamadığım tüm çalışma arkadaşlarıma teşekkür ederim. Ayrıca bu çalışmanın gerçekleştirilmesinde mali destek sağlayan Ege Üniversitesi Araştırma Fon Saymanlığına teşekkür ederim.

8 X

9 XI İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET.. V ABSTRACT... VII TEŞEKKÜR.. IX ŞEKİLLER DİZİNİ.. XV ÇİZELGELER DİZİNİ XIX 1. GİRİŞ LİTERATÜR ÖZETİ Ksilanın Yapısı Ksilanaz Enzimleri Ksilanaz enzimlerinin endüstriyel kullanım alanları Katı Kültür Fermentasyonu Katı kültür fermantasyonunun tanımı ve tarihçesi Katı kültür fermantasyonunda üretim koşulları Substratlar Nem ph Sıcaklık Havalandırma ve karıştırma Mikroorganizmalar Katı kültür fermantasyonun derin kültür fermantasyonu ile karşılaştırılması Katı kültür fermantasyonunda kullanılan biyoreaktör çeşitleri Tepsili biyoreaktörler Döner tamburlu biyoreaktörler.. 22

10 XII İÇİNDEKİLER (devam) Dolgulu kolon tipi biyoreaktörler Ksilanaz Enzimi Üretim Çalışmaları Genetik Çalışmalar MATERYAL ve METOD Materyal Mikroorganizmalar Substratlar Metod Substratlara uygulanan ön işlemler Erlenmayerlerde üretimi Üretim ortamının hazırlanışı İnokulasyon Üretim koşulları ve örnek alma Biyoreaktörde üretim İnokulasyon Üretim ve örnek alma Üretim sonrası işlemler Ekstraksiyon ph ölçümü Enzim ekstraktının elde edilmesi Ksilanaz aktivitesi tayini Toplam azot tayini Nem tayini SONUÇLAR ve TARTIŞMA Mikroorganizma Seçimi Kullanılan Substratlar. 41

11 XIII İÇİNDEKİLER (devam) Buğday kepeği Mısır koçanı Ayçiçek küspesi Pamuk küspesi Pirinç kepeği Malt çimi Malt kökçükleri Malt kökçüklerinin değişik oranlarının ksilanaz aktivitesine etkisi Partikül boyutunun küçültülmesinin ksilanaz aktivitesine etkisi Üretimlerin hacimsel verimliliklerinin karşılaştırılması Üretim Parametrelerinin İncelenmesi ph Nem Spor konsantrasyonu Sıcaklık Optimize Edilmiş Koşullarda Üretilen Ksilanaz Aktivitesinin Literatürdeki Yeri Üretim Sonrası Çalışmalar Ekstraksiyon Yöntemi Ksilanaz enziminin ph optimumunun belirlenmesi Ksilanaz enzimin optimum sıcaklığının belirlenmesi Enzimin taşıyıcı üzerinde raf ömrü Biyoreaktörde Üretim Hava beslemesi yapılmayan üretim. 77

12 XIV İÇİNDEKİLER (devam) Havalandırmalı üretim ÖNERİLER KAYNAKLAR DİZİNİ.. 85 ÖZGEÇMİŞ

13 XV ŞEKİLLER DİZİNİ 2.1 Ksilan molekülünün yapısı ve mikrobiyal ksilanazların etki noktaları Ksilanaz enziminin kağıt hamuru fibrillerine etki mekanizması Tepsili sistemde koji üretimi Tamburlu-karıştırıcılı KKF biyoreaktörü Ksilanaz enzimi üretiminde kullanılan biyoreaktör ve bağlantı elemanları Ksiloz standartları ile hazırlanan standart eğri Buğday kepeğinin substrat olarak kullanıldığı üretimde ksilanaz aktivitesi değişimi Mısır koçanının substrat olarak kullanıldığı üretimde ksilanaz aktivitesi değişimi Mısır koçanı ve buğday kepeği (3:1) substrat karışımında ksilanaz aktivitesi değişimi Mısır koçanı buğday kepeği substrat karışımında (1:1) ksilanaz aktivitesi değişimi Ayçiçek küspesinin substrat olarak kullanıldığı üretimde ksilanaz aktivitesi değişimi... 48

14 XVI ŞEKİLLER DİZİNİ (devam) 4.6 Ayçiçek küspesi ve buğday kepeği karışımının (1:1) kullanıldığı üretimde ksilanaz aktivitesi değişimi Pamuk küspesinin substrat olarak kullanıldığı üretimde ksilanaz aktivitesi değişimi Pamuk küspesi ve buğday kepeği karışımında (1:1) ksilanaz aktivitesi değişimi Pirinç kepeği (pçk) ve pirinç kepeği + buğday kepeği (pçk+bk) substrat kombinasyonunda (1:1) ksilanaz aktivitesi değişimi Malt çimi-buğday kepeği karışımında (1:1) ksilanaz aktivitesi değişimi Malt çimi elek üstü-buğday kepeği (1:1) karışımında ksilanaz aktivitesi değişimi Malt kökçüğü-buğday kepeği karışımında (1:1) besin elementi ilaveli ve destile su ile yapılan üretimde ksilanaz aktivitesi değişimi Malt kökçüğü ve malt çimi elek üstü kısımlarının üretimin 5. günündeki misel gelişimi Malt kökçüğü-buğday kepeği (2.5:1) karışımında ksilanaz aktivitesi değişimi Malt kökçüğü-buğday kepeği (3:1) karışımında aktivitesi değişimi

15 XVII ŞEKİLLER DİZİNİ (devam) 4.16 Malt kökçüğü-buğday kepeği (4:1) karışımında ksilanaz aktivitesi değişimi Malt kökçüğü-buğday kepeği (9:1) karışımında ksilanaz aktivitesi değişimi Malt kökçüğü-buğday kepeği (19:1) karışımında ksilanaz aktivitesi değişimi Üretim ortamındaki değişik malt kökçüğü oranlarında elde edilen maksimum enzim aktiviteleri Üretim ortamındaki toplam azot miktarları Maya ekstraktının azot kaynağı olarak kullanıldığı ortamda ksilanaz aktivitesi değişimi Öğütülmüş malt kökçüğü ile yapılan üretimde ksilanaz aktivitesi değişimi Başlangıç ph değerinin ksilanaz aktivitesi üzerine etkisi Başlangıç nem oranının ksilanaz aktivitesine etkisi Değişik spor konsantrasyonlarının ksilanaz üretimine etkisi Üretim sıcaklığının ksilanaz enzimi üretimine etkisi Değişik ekstraksiyon yöntemlerinin ksilanaz aktivitesi üzerine etkisi

16 XVIII ŞEKİLLER DİZİNİ (devam) 4.28 Enzim aktivite tayininde ph değişiminin ksilanaz aktivitesine etkisi Enzim aktivite tayininde değişik sıcaklıkların ksilanaz aktivitesine etkisi Malt kökçükleri üzerine tutturulan ksilanaz enziminin 3 ay sonunda aktivite değişimi Reaktörde hava beslemesi yapılmayan koşullarda 0.5 cm substrat kalınlığında ksilanaz aktivitesi değişimi Hava beslemesi yapılamayan üretimde 1.0 cm substrat kalınlığında ksilanaz aktivitesi değişimi Havalandırmalı üretimde (0.5 substrat kalınlığında) (3.3 l/dak/kg substrat) ksilanaz aktivitesi değişimi Havalandırmalı koşullarda (0.5 substrat kalındığında) 6.6 l/dak/kg hava hızında ksilanaz aktivitesi değişimi Havalandırmalı koşullarda (1.0 cm susbtrat kalındığında) 3.3 l/dak/kg hava hızında ksilanaz aktivitesi değişimi Havalandırmalı koşullarda (1.0 cm substrat kalındığında) 6.6 l/dak/kg hava hızında ksilanaz aktivitesi değişimi... 81

17 XIX ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge Sayfa 2.1 Ticari ksilanazlar ve üretici firmalar KKF ile elde edilen çeşitli ürünler Ksilanaz üretiminde kullanılan çeşitli funguslar Üretim ortamında kullanılan nemlendirme sıvısı içerisinde yer alan besin elementleri Üretime alınan fungusların ksilanaz aktiviteleri Ksilanaz üretiminde kullanılan substratların elde edildiği tarımsal ürünlerin Türkiye de üretim miktarları Ksilanaz üretiminde kullanılan substratların toplam azot içerikleri Kullanılan substratlar ile elde edilen hacimsel verimlilik değerleri Erlenmayerlerde yapılan üretimin literatürdeki yeri Reaktörde yapılan üretimdeki maksimum ksilanaz aktiviteleri... 82

18 XX 1. GİRİŞ Enzimler, metabolizmanın katalitik etkiye sahip temel taşları olmaları sebebiyle dünyada yapılan bir çok araştırmada odak noktası olmuşlardır. Enzimlere karşı bu ilgi yalnızca biyoloji alanında çalışanlarla sınırlı kalmamış, proses tasarımcıları ve mühendisleri, kimya mühendisleri ve diğer bilim alanlarında çalışan araştırmacıların da ilgi alanına girmişlerdir. Enzimler eski çağlardan beri şarap, peynir, ekmek üretimi ve nişastanın modifikasyonu gibi çeşitli alanlarda rol oynamışlardır. 20. yüzyılın ikinci yarısında mikroorganizmalar ve ürettikleri metabolitlere ilişkin yoğun bir bilgi birikimi sağlanmış ve enzimlerin endüstriyel uygulamaları büyük önem kazanmıştır (Beg et al., 2001). Enzimler, hayvansal, bitkisel kaynaklardan ve mikrobiyal kaynaklardan elde edilebilirler. Günümüzde gıda ve yem teknolojisinde, deterjanlarda, tekstil endüstrisinde, hastalıkların teşhisinde ve daha birçok alanda kullanım alanına sahip maddelerdir. Enzim teknolojisi ekonomi, verim ve ekolojik dengenin korunabilmesi gibi ihtiyaçlar sayesinde hızla gelişmekte ve sürekli olarak eski uygulama alanlarından farklı yeni endüstriyel sektörler içerisinde yerini almaktadır (Tamerler, 2001). Biyoendüstri pazarı içerisinde en önemli alanlardan birisini oluşturan enzimler, farklı kategorilerde farklı isimler, sektörler ve kalemler altında yerli pazara girdikleri ve tüketildikleri için pazar hacminin bütününün tek bir rakam halinde tespiti mümkün değildir. Ancak bu değerin milyar dolarlar seviyesinde olduğu belirtilmektedir (Özer, 2002). Günümüzde enzim üretimi konusunda gerçekleştirilen araştırmalarda temel amaç, üretim şartlarının optimize edilerek mümkün olan en düşük maliyetle en yüksek faydayı sağlayacak enzimi üretmektir. Bunun için enzim üretim proseslerinde yenilenebilir doğal kaynakların kullanımı önem kazanamıştır. Bu kaynaklar

19 XXI içerisinde selülozdan sonra en yaygın olarak bulunan polimer hemiselülozdur. Ksilan hemiselülozun başlıca bileşenidir. Doğada toplam biyokütlenin % ini oluşturmaktadır (Kulkarni et al., 1999). Ksilanın hidrolizinde yer alan başlıca enzim, ß-1,4 bağları ile bağlanmış ksiloz birimlerinden oluşan iskeleti hidrolizleyen endo-1,4-ß-ksilanazlar (1,4-ß-D-ksilan ksilanohidrolaz) (EC ) dır (Singh et al., 2003). Ksilanaz enzimi, ülkemizde özellikle kanatlı yemi katkısı olarak kullanılmakta, bunun yanı sıra gıda ve kağıt endüstrisinde de geniş bir kullanım olanağı bulunmaktadır. Bütün bu porseslerde kullanılan ksilanaz enzimlerinin yurt dışında faaliyet gösteren firmalardan ithal edildiği bilinmektedir. Bu projede başlıca hedef, ksilanaz enziminin (endo-1,4-ß-ksilanaz) katı kültür fermantasyonu yolu ile üretiminin gerçekleştirilmesidir. Ksilanaz enziminin katı kültür fermantasyonu ile üretiminin optimum koşullarının saptanması için çeşitli tarımsal ürünler (buğday kepeği, mısır koçanı, pamuk küspesi, ayçiçek küspesi, pirinç kepeği, malt çimi) substrat olarak kullanılmış ve üretim parametrelerinin (ph, başlangıç nem oranı, sıcaklık) ksilanaz üretimine etkisi belirlenmiştir. Bunun yanısıra laboratuvar ölçeğinde geliştirilen biyoreaktörde substrat kalınlığı ve havalandırmanın ksilanaz enzimi üretimine etkisi incelenmiştir. Ekonomisi büyük ölçüde tarım ve hayvancılığa dayalı olan ülkemizde ksilanaz enzimi üretiminin, çeşitli ekonomik ve mühendislik avantajları olan katı kültür fermantasyonu ile yapılmasının hayvancılığa ve hayvan yemi sektörüne olan katkısı yadsınamaz. Ayrıca sınırsız bir yenilenebilir substrat kaynağı olan tarımsal atıkların bu enzimin üretiminde hammadde kaynağı olarak değerlendirilmelerinin çok önemli ekonomik katkısı bulunmaktadır.

20 XXII 2. LİTERATÜR ÖZETİ 2.1 Ksilanın Yapısı Hemiselüloz terimi ilk kez 1891 de Schulze tarafından bitki materyalinden seyreltik alkali muamelesi ile ekstrakte ettiği fraksiyonları tanımlamada kullanılmıştır (Bastawde, 1992). Hemiselülozlar içerisinde ksilan, mannan, galaktan ve arabinan başlıca heteropolimerlerdir. Bu polimerlerin sınıflandırılmasında yapılarında yer alan şeker birimleri göz önüne alınmıştır. Bu yapılar içerisinde yer alan başlıca monomerler sırasıyla D-ksiloz, D-mannoz, D- galaktoz ve L-arabinozdur. Ksilan, hemiselülozun başlıca bileşenlerindendir. Doğada bitkisel materyalde bulunan ve selülozdan sonra toplam biyokütlenin % ini oluşturan bir polimerdir ( Descampes and Huet 1985; Royer and Nakas, 1989; Tuohy and Coughlan, 1992; Purkathofer and Steiner, 1993; Kulkarni et al., 1999). Bitkilerde, ksilan ya da hemiselülozlar yan grupların etkileşimi ile lignin zincirine değişik noktalarda kovalent bağlar ile bağlanırken selüloz liflerinin üzerinde hidrojen bağları sayesinde bir tabaka oluşturacak şekilde dağılım göstermektedirler (Uffen, 1997). Ksilan, ksiloz birimlerinin β-1,4-glukozidik bağlarla bağlanması ile oluşan kompleks bir polisakkarittir (Şekil 2.1). Ksilanın ana zinciri β-ksilopiranoz birimlerinden oluşmaktadır. Sert odunlu bitkilerde daha yaygın olarak bulunmasına karşılık (%15-30) yumuşak odunlu bitkilerde ksilan oranı daha düşüktür (%7-12). Sert odunlu bitkisel materyalde bulunan ksilan O-asetil-4-Ometilglukuranoksilandır. Bu polisakkarit, en az 70 adet β-ksilopiranoz biriminin β-1,4-glukozidik bağlarla bağlanması ile oluşmuştur. Tekrarlanan her 10. ksiloz birimi iki nolu pozisyonda bir adet 4-O-metilglukuronik asit taşımaktadır. Sert

21 XXIII odunlu materyallerdeki ksilan, yüksek oranda asetillenmiştir (huş ağacı ksilanı 2 mol ksiloz başına 1 mol asetik asit içermektedir). Asetillenme C-2 pozisyonuna oranla C-3 pozisyonunda daha sıklıkla görülür. Yapıda asetil gruplarının varlığı ksilanın sudaki kısmi çözünürlüğünü sağlar. Ksilan alkali ile muamele edildiğinde bu gruplar kolaylıkla yapıdan uzaklaştırılabilmektedir (Eriksson, 1997). Yumuşak odunlu bitkisel materyalde yer alan ksilan ise arabino-4-ometilglukuronoksilandır. Bu moleküller yapılarında sert odunlu ksilanlara göre daha yüksek oranda 4 O-metilglukuronik asit içerirler. 4 O-metil glukuronik asit birimleri ana iskelete C-2 pozisyonunda bağlanmışlardır. Yumuşak odunlu ksilanlar asetillenmemişlerdir. Asetil grubu yerine C-3 pozisyonunda α-1,3- glukozidik bağlarla bağlanmış α-l-arabinofuranoz birimleri içerirler. Yumuşak odunlu ksilanlar sert odunlu ksilanlara göre daha kısadır ve daha az dallanmış yapıdadırlar. Hidrokinamik asitler arabinoz birimlerine C-5 konumundan bağlanmışlardır. Lignin ve hemiselüloz arasındaki kovalent bağlar birçok durumda ksilanın yapısında bulunan bu gruplar yoluyla oluşmaktadır. Bunun yanında arabinoz üzerinden eter bağlarıyla ve glukuronik asit üzerinden ester bağlarıyla lignine bağlanma sözkonusudur (Uffen, 1997; Beg et al., 2001; Singh et al., 2003). 2.2 Ksilanaz Enzimleri Ksilan, tekrarlanan ksilopiranoz gruplarına farklı pozisyonlarda bağlanan değişik şekerler ya da asidik maddelerden oluşan bir polimer olduğundan enzimatik hidrolizin efektif bir şekilde gerçekleşmesi için değişik özgün nitelikleri olan ve etki mekanizmaları farklı bir dizi enzimin faaliyeti gereklidir. Ksilanın hidrolizinde yer alan başlıca enzimler ; ß-1,4 bağları ile bağlanmış ksiloz birimlerinden oluşan iskeleti hidrolizleyen endo-1,4-ß-

22 XXIV ksilanazlar (1,4-ß-D-ksilan ksilanohidrolaz, (EC ) endoksilanazların etkisiyle açığa çıkan ksilobioz ve Şekil 2.1 Ksilan molekülünün yapısı ve mikrobiyal ksilanazların etki noktaları (Beg et al., 2001)

23 XXV diğer kısa zincirli ksilooligosakkaritlerin hidrolizini gerçekleştiren ß- ksilosidazlar (EC ), dallanma noktalarında etkin olan α-larabinofuranosidaz gruplarını uzaklaştıran asetil esterazlar ile fenil yan gruplarını uzaklaştıran arilesterazlarlardır (bkz. Şekil 2.1) (Poutanen et al., 1987; Belancic et al., 1995; Sater and El-Said, 2001; Singh et al., 2003) Ksilanaz enzimlerinin endüstriyel kullanım alanları Ksilanaz enzimi bakteri, maya ve fungus grubunda yer alan çeşitli mikroorganizmalar tarafından üretilebilmektedir (Souza et al., 2001). Endüstriyel proseslerdeki biyoteknolojik potansiyelleri sebebiyle mikroorganizmalardan elde edilen ksilanazlara olan ilgi son on yılda artmıştır. Ksilanaz enziminin çeşitli endüstriyel uygulama alanları : 1. Ksilanazların başlıca ümit verici uygulama alanı kraft hamurunun renginin ağartılmasında kullanımıdır. Kağıt hamurunun konvansiyonel kimyasal yöntemler ile ağartılması işleminde klor ve klor bazlı kimyasallar kullanılmaktadır. Bu kimyasal işlemler sırasında oluşan yan ürünler toksiktir ve biyolojik sistemler üzerinde olumsuz etkileri bulunmaktadır. Günümüzde klor, oksijen, ozon, hidrojen peroksit gibi kimyasal maddeler ile yapılan bu işlemin yerini enzimlerin kullanıldığı biyo-ağartma işlemi almaya başlamaktadır. İşlemin prensibi, enzimler ya da mikroorganizmaların kullanılmasıyla ligninin direkt olarak depolimerizasyonunun yanı sıra hemiselülozun parçalanmasını sağlayarak ligninin depolimerizasyonunu kolaylaştırmaktır (Eriksson, 1997) (Şekil 2.2). Ksilanaz enzimleri, kağıt hamurundaki lignin-selüloz ara yüzeyindeki hemiselülozik fraksiyonu parçalayarak hamura zarar vermeden lignin uzaklaştırılmasını sağlamaktadır (Techapun et al., 2003). Bu işlem ile aynı zamanda kağıt hamurundaki fibrillerin su tutma kapasitesi artırılmakta ve ksilanın seçici olarak uzaklaştırılması mümkün olmaktadır (Viikari et al. 1994). Bu sayede

24 XXVI renk ağartma işleminde kullanılan kimyasal madde ihtiyacı % 25 e varan oranlarda düşürülmektedir (Haarhoff et al., 1999). Odundan kağıt hamuru elde etme işlemi yüksek sıcaklık ve alkali koşullarda yapıldığından biyo-ağartmada kullanılacak olan enzimlerin yüksek termal kararlılığının olması ve yüksek ph değerlerinde aktivite göstermesi istenmektedir (Haki and Rakshit, 2003). 2. Buğday bazlı yemlerle beslenen piliçlerde kilo kazanımının baskılanması ve yem dönüşüm verimliliği bağırsaklardaki viskozite ile ilgilidir. Ksilanaz enzimi ilave edilen piliç yemleri bağırsaktaki viskoziteyi düşürerek kilo kazanımını ve yem dönüşüm verimliliğini arttırmaktadır (Cosson et al., 1999 ; Bedford, 2000). Enzimlerin kanatlı yemlerine eklenmesi ile polisakkarit yapıdaki moleküller parçalanmaktadır. Bu sayede sindirim sisteminde su tutma kapasitesi artmakta ve yemdeki besin elementlerinin daha etkin kullanımının yanında kuru dışkı elde edilmektedir (Colombatto et al., 2003). Şekil 2.2 Ksilanaz enziminin kağıt hamuru fibrillerine etki mekanizması (Techapun, et al., 2003)

25 XXVII 3. Ekmeğin kalitesinin ve hacminin arttırılmasında amilaz ve ksilanaz enzim kombinasyonlarının kullanımı etkili olmaktadır (Gil et al., 1999). 4. Tarımsal endüstrilerden ve gıda endüstrisinden ortaya çıkan birçok atık önemli ölçüde ksilan içermektedir. Ksilanazlar atık sulardaki ksilanı ksiloz birimlerine hidroliz ederler. Ksilanaz enzimleri hemiselüloz içeren atıkların bertaraf edilmesinde ve biyokütle ve yakıt olarak kullanılabilecek (etanol) yüksek katma değerli ürünlere dönüştürülmesinde önemli rol oynamaktadırlar (Biely 1985; Duarte and Ferreira, 1994; Carmona et al., 1997). 5. Ksilanazlar, selülaz ve pektinazlar ile birlikte meyve sularının durultulmasında ve meyve sularınının meyve pulpundan ekstraksiyonunda kullanılmaktadırlar (Biely, 1985; Berovic and Ostroversnik, 1997). Endüstriyel kullanım alanları göz önüne alınarak ticari üretimleri gerçekleştirilmiş olan fungal kaynaklı ksilanaz enzimleri Çizelge 2.1 de sunulmuştur. Çizelge 2.1 Ticari ksilanazlar ve üretici firmalar (Beg et al., 2001). Firma adı Ticari marka Uygulama Alanı Alko Rajamaki, Finlandiya Ecopulp Renk ağartma Sandoz, Charlotte, İsviçre Cartazyme HS10 Renk ağartma Genercor, Finlandiya Irgazyme 40-4X Renk ağartma Ciba Giergy, İsviçre Albazyme-10A Ekmekçilik Multifect xylanase Yem Voest Alpine, Avusturya VAI xylanase Renk ağartma

26 XXVIII Çizelge 2.1 (devam) Novo Nordisk, Pulpzyme HA Renk ağartma Biofeed Beta, Ceremix Bicon India, Bangalore Bleachzyme F Yem Biracılık Renk ağartma Rohn Enzyme OY; EcopulpX-100 Renk ağartma Primalco, Finlandiya Rohm, Almanya Rholase 7118 Gıda Sovay, Interox, USA Optipulp L-8000 Renk ağartma Thomas Swan, İngiltere Ecozyme Renk ağartma Iogen, Kanada GS-35, HS70 Renk ağartma Sankyo, Japonya Sanzyme PX Yem Alpelase F Sanzyme X Enzyme Development, Enzeko xylanase USA Gıda Gıda Ekmekçilik Gıda, yem

27 XXIX 2.3 Katı Kültür Fermentasyonu Katı kültür fermantasyonunun tanımı ve tarihçesi Fermantasyon işlemleri genel olarak derin kültür ve katı kültür olmak üzere ikiye ayrılabilir. Bu iki biyo-işlem arasındaki temel farklılık substrattaki serbest su miktarıdır. Derin kültürde gerçekleştirilen fermantasyon işlemlerinde katı madde miktarı 50 g/l substratın üzerine çıkmamaktadır ve aynı zamanda katı substrattaki nem oranı %12 nin altına düşmemektedir (Robinson et al., 2001). Katı kültür fermantasyonu ise serbest su bulunmayan nemlendirilmiş katı substratlar üzerinde mikroorganizma gelişimini ve metabolik faaliyeti ifade eder. Katı kültür fermantasyonunda (KKF) mikroorganizma, gelişimi için gerekli suyu substratın içindeki nemden karşılar ( Cannel and Young, 1980; Mitchell et al., 2000; Gessesse and Mamo, 1999). Son yıllarda KKF bir çok biyo -işlemin ve ürünlerin geliştirilmesinde ümit verici bir fermantasyon tekniği olarak görülmektedir (Souza et al., 2001). Bu fermantasyon yöntemi, literatürde katı substrat fermantasyonu ya da katı faz fermantasyonu olarak da adlandırılmaktadır. Bu durum karışıklığa neden olmaktadır. Katı substrat fermantasyonu, serbest su bulunmayan koşullarda substratın karbon ve enerji kaynağı olarak kullanıldığı durumları ifade etmektedir. Katı faz fermantasyonunda ise ya karbon ve enerji kaynağı olarak kullanılan bir substratı ya da destek materyali olarak kullanılan bir maddeyi ifade etmekte kullanılmaktadır (Mitchell and Berovic, 1998). Bu fermantasyon işlemi nadiren de olsa literatürümüzde yüzey fermantasyonu olarak adlandırılmaktadır. Ancak yüzey fermantasyonlarında kullanılan ortamlar sıvı ortamlar da olabilmektedir. Bu nedenle bu fermantasyon işlemine Katı Kültür Fermantasyonu denilmesi daha uygun görülmüştür. Bilinen klasik gıda fermantasyonları ve enzim üretimi KKF ile ortaya çıkmıştır. Tarihte tipik KKF örnekleri uzakdoğu kaynaklı geleneksel yiyeceklerin

28 XXX üretiminde kullanılan yöntemlerdir. Bunlardan Japonların koji olarak adlandırdıkları yiyecek üretimi MÖ 1000 yıllarından bu yana yapılmaktadır. Bu işlem, buhar ile muamele edilmiş pirincin substrat olarak kullanımını ve Aspergillus oryzae ile fermente edilmesini içermektedir. Endonezya kökenli bir başka örnek ise yumrulu sebzelerden tempeh üretimidir. Bu işlem patojen olmayan Rhizophus spp. fermantasyonu ile gerçekleştirilir (Pandey et al., 2001). Bu gibi işlemlerde elde edilen geleneksel yiyecek maddelerinde her zaman substratın tamamıyla zenginleştirilmesi söz konusu değildir. Hatta soya fasulyesi gibi yüksek protein içeriği olan sebzelerde besin değerinin kaybedilmesi bile mümkündür. Ancak bu maddelerin spesifik olarak dolaylı yollardan zenginleştirilmesi, sindirilebilirliğin arttırılması toksinlerin uzaklaştırılması yolu ile toksik etkinin ortadan kaldırılması, organik azot içeriğinin değişimi ve tad, koku, doku gibi karakteristiklerin geliştirilmesi yolları ile mümkün olmaktadır (Mitchell and Berovic, 1998). KKF da nem oranının düşük olması nedeniyle yaygın olarak kullanılan mikroorganizma grubu funguslardır. Termofilik bakteri ve mayalar daha seyrek olarak kullanılmaktadırlar (Subramaniyan and Prema, 2000; Archana and Satyanarayana, 1997). Katı materyaldeki serbest su miktarı ve mikrobiyal gelişimle ilgili olan en önemli parametre su aktivitesidir (a w ). Su aktivitesi, substratın buhar basıncının aynı sıcaklıktaki saf suyun buhar basıncına oranı olarak tanımlanmaktadır. Kapalı bir sistem için su aktivitesi nispi nemin 100 e bölümüyle elde edilebilir. Birçok bakteri a w =0.91 in altında üreyemez. Bu değer mayalar için a w =0.88 funguslar için ise a w = tir (Raimbault, 1998). Fungusların doğada ağaç kabukları, yapraklar, bitki kökleri gibi yerlerde üreyebildikleri göz önüne alındığında KKF için uygun bir mikroorganizma grubu oldukları açıktır (Cannel and Young, 1980).

29 XXXI KKF genel olarak biyoremediasyon, zararlı maddelerin biyolojik olarak parçalanması, agro-endüstriyel atıkların biyolojik detoksifikasyonu tahılların ya da yan ürünlerinin besinsel açıdan zenginleştirilmesi amacıyla biyo-dönüşümleri, ikincil metabolitler gibi katma değeri yüksek ürünlerin elde edilmesi, enzimler, organik asitler, biyo-yakıtlar ve aroma maddeleri üretimi gibi uygulama alanları bulmuştur (Raimbault, 1998; Robinson et al., 2001) (Çizelge 2.2). Çizelge 2.2 KKF ile elde edilen çeşitli ürünler (Mitchell and Berovic, 1998) Ürün/işlem Mikroorganizma Substrat Proteince zenginleştirme Kafein uzaklaştırma Pektin uzaklaştırma Fitik asidin uzaklaştırılması Tat karakteristiğinin geliştirilmesi Siyanidin uzaklaştıtılması Proteazlar Amilazlar α-amilaz glukoamilaz Selülazlar Aspergillus spp. Aspergillus niger Aspergillus niger Trichoderma reesei Trichoderma reesei Coprinus spp. Aspergillus tamari Sporotrichum pulverulentum Trichoderma viride Fusarium spp. Aspergillus terreus Rhizophus oligosporus doğal microflora Fusarium spp. Aspergillus ficuum Rhizopus oligosporus Rhizophus sp. Rhizopus oligosporus Aspergillus flavus Aspergillus oryzae Bacillus licheniformis Aspergillus oryzae Aspergillus niger Aspergillus niger Neuspora crassa Aspergillus niger Trichoderma harzianum nişastalı materyaller muz atıkları turunçgil kabukları saman şeker pancarı küspesi saman şeker pancarı küspesi cassava şeker pancarı küspesi saman+buğday kepeği şeker kamışı yan ürünleri çeşitli fasulyeler kahve bitkisi pulpu çavdar samanı kanola nohut cassava kabuğu pirinç kepeği buğday kepeği buğday kepeği buğday kepeği buğday kepeği buğday k. + pirinç k. buğday k. + mısır unu talaş şeker pancarı küspesi şeker pk+buğday

30 XXXII Trichoderma reesei Trichoderma viride T.reesei+A.niger(karışık Penicillium citrinum kepeği saman+kepek+talaş pirinç kepeği tatlı sorghum silajı pirinç kavuzu Lipazlar Penicillium spp. buğday kepeği Diğer enzimler Rennet Endo-ß glukonazlar Hemiselülazlar Pektinazlar Kitinaz Tanin açil hidrolaz Oligosakkarit oksidaz Etanol Mucor meihei Penicillium capsulatum Thermonospora Aspergillus niger Aspergillus niger Taralomyces flavus Aspergillus niger Acremonium sp. Aspergillus niger Lentinula edodes Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Schwanniomycescastelli Fitaz, fitik asit Aspergillus carbonarius kanola Sitrik asit Aspergillus niger kahve Aspergillus niger kabukları, Laktik asit Lactobacillus casei Rhizophus oryzae buğday kepeği buğday kepeği kahve işleme atıkları elma pektini kahve pulpu turunçgil pulpu şeker pancarı küspesi buğday kepeği buğday kepeği odun üzüm küspesi mısır kırıntıları şeker pancarı küspesi sorghum pancar küspesi bitkisi buğday kepeği, pancar pulpu, pancar melası preslenmiş şeker kamışı şeker pancarı küspesi Aminoasitler Rhizophus oligosporus tohum kabukları Kojik asit Aspergillus oryzae buharla haşlanmış pirinç Giberallik asit Antibiyotikler Penisilin Oksitetrasiklin Tetrasiklin iturin Fusarium monoliforme Giberella fujukiroi Fusarium monoliforme Penicillium chrysogenum Streptomyces rimosus Streptomyces iridifaciensis Bacillus subtilis Pigmentler Monascus purpureus pirinç AflatoksinB1 Aspergillus parasiticus pirinç buğday kepeği buğday kepeği mısır unu+buğday kepeği şeker pancarı küspesi tatlı patates artığı tatlı patates artığı buğday kepeği

31 XXXIII Okratoksin Aspergillus alliaceus mısır ve buğday Aroma maddeleri Penicillium roqueforti granüler lor Biyolojik kontrol ajanları Colletotrichum truncatum nemlendilerek Mikoherbisit Beauveria bassiana tavlanmış tarımsal Bioinsektisit atıklar Biyokütle Aspergillus tamarii Pleurotus spp. tahta parçaları, talaş Delignifikasyon mantarları Phlebia tremellosa Pleurotus florida Pleurotus cornucopiae Katı kültür fermantasyonunda üretim koşulları Substratlar ağaç kütüğü pirinç kepeği kaktüs yaprakları KKF da kullanılan substratlar tarımsal kökenlidir. Genel olarak kullanılan substratları içeriklerine göre 3 gruba ayırmak mümkündür: Nişasta içeren substratlar (pirinç, cassava, buğday kepeği, pirinç kepeği, mısır, patates artıkları, muz artıkları) Lignoselülozik substratlar (saman, ağaç parçaları talaş v.b) Çözünür şekerleri yapısında bulunduran substratlar (şeker pancarı, üzüm küspesi, meyve artıkları) (Durand et al., 1993). Birçok durumda substratın ön işlemden geçirilmesi gerekli olabilir. Uygulanan ön işlemler mekanik ya da kimyasal işlemlerdir. Bu işlemlerin amacı daha küçük moleküller elde ederek mikrobiyal penetrasyonun arttırılmasıdır. Buhar uygulama, kırma, taneleme, su ile tavlama, küçük parçalara ayırma, elekten geçirme, öğütme, alkali ya da NaCl ile muamele etme bu işlemler arasında sayılabilir (Mitchell and Berovic, 1998). KKF da en önemli fiziksel özellik partikül boyutudur. Partikül büyüklüğü yüzey alanının hacme oranını belirleyen bir niceliktir. Partikül boyutu aynı zamanda partiküller arasındaki boşluk hacmini de etkileyen bir faktördür. Küçük boşluklar

32 XXXIV fungal miseller tarafından kolaylıkla doldurulmaktadır ve difüzyonu büyük oranda kısıtlayarak havalandırmalı sistemlerde yüksek basınç düşmelerine neden olmaktadırlar (Raimbault, M., 1998). Değişik boyutta partiküller söz konusu ise küçük partiküller, büyük partiküllerin arasındaki boşlukları doldurarak toplam boşluk hacmini düşürmektedirler (Pandey, 1991) Nem Mikrobiyal üremeyi etkileyen başlıca faktör a w dir. Ancak ortamdaki mevcut su miktarının ölçümü daha kolaydır. Su miktarı, bir materyalin ağırlığının su tarafından oluşturulan yüzdesidir. Su aktivitesi ise materyalin buhar basıncının aynı sıcaklıktaki suyun basıncına oranıdır ve mikroorganizma için elverişli olan su miktarını ifade eder. Farklı substratlar değişik su tutma kapasitesine sahip olduklarından serbest suyun görünür hale geldiği düzeyler değişmektedir. Bu nedenle KKF işlemlerinde su miktarları kullanılan substrata göre %30 ile %80 arasında değişmektedir. Bunun yanında su miktarı ile a w arasındaki ilişki de geniş bir aralıkta lineer olarak değişmemektedir. Su miktarındaki büyük artışlar a w de küçük değişimlere sebep olabilir (Pandey et al., 2001). Nemin mikroorganizma fizyolojisi üzerine olan direkt etkisinin yanısıra substrat karakteristiklerini değiştiren etkileri de vardır.yüksek nem oranı partiküller arasında gazların yer değiştirmesine ve substrat partiküllerinin kümeleşmelerine neden olmaktadır. Her iki durum da gaz difüzyon kısıtlamalarının oluşumunu hızlandırır. Ayrıca yüksek nem oranı, substrattaki çözünebilen besin öğelerinin substrat dışına çıkmasına yol açmaktadır (Cannel and Young, 1980).

33 XXXV ph Mikrobiyal gelişim substratın ph değerinde önemli değişikliklere neden olmaktadır. Substratın tamamıyla okside edilememesi ya da amonyum iyonlarının bünyeye alınması sonucunda ph düşerken ürenin ya da diğer aminlerin deaminasyonu sonucu amonyum iyonlarının açığa çıkması ile ph yükselir. ph değişimlerinin şiddeti, mikroorganizmanın metabolik aktivitesi ve substratın tamponlama kapasitesi ile bağlantılıdır. Üretim sırasında ph değeri mikroorganizmanın gelişimini engelleyecek düzeye gelebilir. Ancak KKF da ph kontrolu oldukça zordur. Bu nedenle geniş bir ph aralığında üreyebilen mikroorganizmaların seçilmesi daha uygun bir durumdur (Mitchell and Berovic, 1998) Sıcaklık Metabolik aktivite sonucunda oluşan sıcaklık artışı fermantasyon işlemlerinde önemli sorunlar yaratmaktadır. KKF da sıcaklık kontrolü derin kültür fermantasyonuna göre daha zordur. Homojen olmayan substrat özellikleri nedeniyle sıcaklık gradyanları oluşmaktadır. Bu durum sistemde ısı transferini güçleştirerek bölgesel sıcaklık artışlarına sebep olmaktadır. Bunun sonucunda mikrobiyal gelişim yavaşlamakta ya da bazı durumlarda mikrobiyal hücreler ölmektedirler. Bu nedenle oluşan ısının sistemden uzaklaştırılması gereklidir. KKF sistemleri tasarımında göz önüne alınması gereken en önemli kriterlerden biri de ısının uzaklaştırılmasıdır (Mitchell et al., 2000). KKF da kullanılan birçok mikroorganizma mezofiliktir. Optimum üreme sıcaklığı 20 C ile 40 C arasında değişmektedir. Maksimum üreme sıcaklığı ise 50 C nin altındadır (Pandey et al., 2001).

34 XXXVI Havalandırma ve karıştırma KKF işlemlerinin büyük çoğunluğu aerobik koşullarda gerçekleştirilmektedir. Gaz fazı katı partiküller ile temas halindedir ve katı partikül üzerindeki sıvı tabakasına oksijen transferi için oldukça geniş bir yüzey alanı mevcuttur. KKF da temel hedef, partiküller arasında yüksek oksijen bulunmasını sağlarken karbondioksit miktarının düşük seviyede tutulmasıdır (Desgranges and Durand, 1990). Partiküller arası boşluktan oksijen alımı 4 ana basamakta gerçekleşir: Oksijenin partiküller arasındaki yoğun fazdan partikül yüzeyindeki durgun gaz film tabakasına transferi, Oksijenin durgun gaz tabakasından substrat yüzeyindeki sıvı tabakasına transferi, Misellerin konumuna bağlı olarak mikroorganizmanın oksijeni substrat yüzeyindeki durgun gaz tabakasından ya da sıvı tabakasından bünyesine alması, Oksijenin substrattaki sıvı tabakasından partikülün iç kısmına geçişi (Mitchell and Berovic, 1998). Havalandırmada göz önünde bulundurulması gereken önemli bir nokta da biyoreaktöre giren havanın kalitesi ve nemidir. Doygun hava kullanımı substratın kurumasını ve su aktivitesinin düşmesini önlemede yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Ancak bu uygulama her zaman tavsiye edilmemektedir. Havalandırmanın bir fonksiyonu da fermantasyon sırasında oluşan ısıyı uzaklaştırmaktır (Murthy et al., 1993). Suyun buharlaşması ve çevre ile yapılan ısı transferi işlemleri fermantasyon sıcaklığını istenilen düzeyde tutmayı sağlayan işlemlerdir. Dolayısıyla nemin korunması ve aynı zamanda ısının uzaklaştırılması gibi çelişkili iki durum söz konusudur (Mitchell et al., 1999).

35 XXXVII KKF da heterojen yapıyı düzenlemek üzere yapılabilecek işlemlerden birisi de karıştırma işlemidir. Karıştırma, oluşan gradyanları ortadan kaldırarak homojen bir yapı meydana getirmeyi sağlar. Ancak özellikle fungal kültürlerin kullanıldığı sistemlere karıştırma uygulandığında misellerin zarar gördüğü belirtilmektedir (Purkarthofer et al., 1993). Bunu aşmak için kesikli bir karıştırma işlemi uygulandığında genellikle olumlu sonuçlar alındığı belirtilmektedir (Kalegoris et al., 2003). Bakterilerin kullanıldığı üretimlerde ise eğer hücreler substrat üzerinde çok sıkı bir yapı oluşturmamışlarsa sürekli bir karıştırma işleminin biyokütle verimini arttırdığı belirtilmektedir (Pandey et al., 2001) Mikroorganizmalar Funguslar dışında nadiren de olsa maya ve bakterilerin kullanıldığı katı kültür ya da yarı katı kültür fermantasyonları yolu ile üretimler yapılmaktadır. Mayalar genel olarak katı substratlar üzerinde üreyebilen mikroorganizmalar içinde ikincil öneme sahip mikroorganizma grubudur. Anaerobik koşullarda tarımsal ürünlerin % nem oranında fermente edildiği silaj işleminin erken aşamalarında mayaların etkisi söz konusudur. Mayalar içerisinde Saccharomyces cerevisiae elma küspesinde, şeker pancarı ve üzüm küspesi kullanılarak etil alkol üretiminde yarı katı kültürde kullanılmıştır. Ayrıca çeşitli nişastalı substratların proteince zenginleştirilmelerinde mayalar kullanılmışlardır (Mitchell and Berovic, 1998). Bakteriler de KKF da birincil ya da ikincil mikroorganizmalar olarak önem taşımaktadırlar. Silaj işleminde laktobasiller önemli rol oynamaktadırlar. Bacillus subtilis Japonların Natto adını verdikleri fermente yiyecekte soya fasulyesi üzerinde yapışkan bir tabaka oluşturan organizmadır (Raimbault, M., 1998). Bunun yanı sıra özellikle Bacillus sp. bakterilerin enzim üretiminde kullanıldığı KKF çalışmaları da bulunmaktadır (Babu and Satyanarayana, 1995; Archana and

36 XXXVIII Satyanarayana, 1997). Bakterilerin KKF daki bir başka önemi de gerek geleneksel fermente gıda maddelerinin üretiminde gerekse diğer KKF da kontaminasyona neden olmalarıdır Katı kültür fermantasyonun derin kültür fermantasyonu ile karşılaştırılması KKF yönteminin kullanımının derin kültür üretim tekniğinin kullanıldığı sistemlere göre çeşitli avantajları vardır. Sistemin avantajları şu şekilde sıralanabilir: 1. Basit ve ucuz substratların kullanımı, 2. Az miktarda su kullanımı ve substratın konsantre olması, 3. Direkt olarak spor aşılaması yapılması sebebiyle ön aşı hazırlama tankına ihtiyaç duyulmaması, 4. Düşük nemli substrat üzerinde bakteriyel kontaminasyon riskinin az olması, 5. Substrat partikülleri arasında boşlukları bulunması nedeniyle havalandırmaya olanak tanıması, 6. Ekstrakte edilecek olan ürün için az miktarda ekstraksiyon sıvısı kullanılması. Elde edilen ürünün derişik olması nedeni ile ayırma/saflaştırma işlemlerinin maliyetinin düşük olması, 7. Verimin derin kültür sistemlerindekine eşit ya da daha yüksek olması, 8. Sıvı atık miktarının ya çok düşük olması ya da hiç olmaması, 9. Üretim sonrası geriye kalan katı kısmın da hayvan yemi olarak değerlendirilebilmesi (Haltrich et al., 1996; Raimbault, 1998; Mitchell and Berovic, 1998; Pandey et al., 2001),

37 XXXIX 10. Katı kültür fermantasyon tesisi, aynı kapasitede bir derin fermantasyon tesisine oranla önemli ekonomik avantajlar içermektedir. Üretilecek enzim tipine göre: Toplam yatırım %50-80 daha azdır Enerji harcaması %30-60 daha azdır Ana hammadde % daha ucuzdur (Pandey et al., 2001) Katı kültür fermantasyonunda kullanılan biyoreaktör çeşitleri KKF sistemlerinde kullanılan subtratın ve üretim koşullarının çoğu zaman heterojen bir karakter sergilemesinden dolayı mikrobiyal gelişim kinetiği, üretim sırasındaki besin gereksinimleri, ürün oluşum kinetiği ve mikrobiyal aktivitenin kontrolü ile düzenlenmesi konusunda yeterli bilgi edinilememektedir (Mitchell et al., 2000). Ancak ideal bir üretim için tasarımı yapılacak olan biyoreaktörün genel olarak aşağıdaki koşulları sağlaması beklenir; Sterilizasyon işlemine uygun olmalı ve kontaminasyona olanak vermemeli, Fermente edilen substratın kızışmasını (ısı artışını) önleyecek ekipmana sahip olmalı, Isı ve kütle iletimini arttıracak ve homojen bir dağılım sağlayacak karıştırma sistemi olmalı, Oksijen ihtiyacını karşılamak üzere havalandırma sistemi olmalı, Önemli üretim parametrelerinin ölçümünü sağlamalı ve inokulasyon ve örnek alma işlemlerinin yapılacağı ekipmanlara sahip olmalıdır (Mitchell and Berovic, 1998).

38 XL KKF da kullanılan biyoreaktörlerin dizaynı önemli aşamalardan biridir. Son 25 yıllık zaman aralığında KKF için değişik biyoreaktör tasarımları yapılmıştır. KKF işlemlerinde fizyolojik yapıların farklılığı ve ısının uzaklaştırılması gerekliliği nedeniyle derin kültürde ölçek büyütme işlemleri için uygulanan yöntemlerin KKF sistemlerine doğrudan uygulanması mümkün değildir. Derin kültürde aerobik koşullarda oksijen transferi kısıtlayıcı faktör olarak görülmekteyken, KKF işlemlerinde ısı uzaklaştırma temel kriterlerden birisidir (Oostra et al., 2000). KKF işlemlerinde yapılan reaktör tasarımlarında temel olarak üç çeşit reaktör tipine rastlamak mümkündür. Yüzeyden havalandırılan tepsili reaktörler (Durand et al, 1993). Döner tamburlu (karıştırmalı) reaktörler (Almanza et al., 1995). Dolgulu kolon reaktörler (Mitchell et al., 1999) Tepsili biyoreaktörler Bu reaktör tipinde yan yana ve üst üste sıralanmış bir dizi tepsinin üzerinden kontrollü sıcaklık ve neme sahip olan havanın sirküle ettirilmesi söz konusudur (Şekil 2.3). Kullanılan tepsilerin üst yüzeyleri açık alt kısımları ise gözeneklidir. Tepsi içerisine yerleştirilen substrat katmanının kalınlığı 5-15 cm arasında değişmektedir (Pandey et al., 2001) Eski dönemlerde tepsiler tahtadan ya da bambu kamışından yapılırken (Şekil 2.3) günümüzde korozyona dayanıklı metalden yapılmaktadır. Karıştırma işlemi (gerekli ise) el ile yapılabilmektedir. Bu reaktör çeşidi ile ilgili olarak eski dönemlerden günümüze değin yeni sayılabilecek modifikasyonlar ve ilerlemeler kaydedilmemiştir (Mitchell et al., 2000).

39 XLI Şekil 2.3 Tepsili sistemde koji üretimi ( Bu reaktör çeşidinde çeşitli ısı ve kütle aktarımı sorunları olduğu belirtilmektedir. Bunun en önemli sebeplerinden biri substrat katmanının orta noktasındaki sıcaklık artışlarına bağlı olarak mikrobiyal gelişimin yavaşlamasıdır. Bunun için substrat katmanı kalınlığının optimizasyonu zorunludur. Bu durum oluşan ısının uzaklaştırılması ve O 2 iletimi açısından da önem taşımaktadır. Genel olarak 5 cm lik bir kalınlığın üzerinde ısı ve kütle aktarımı sorunları yaşandığı belirtilmektedir (Ghildyal et al., 1992). Bu reaktörler, laboratuvar çapında, küçük çaptaki fermantasyon işlemlerinde kullanıldığı gibi ticari boyuttaki çeşitli uygulamaları da bulunmaktadır. Bu reaktörlerin yatırım masrafları ve teknoloji ihtiyacı düşük olmasına karşılık, üretim sırasında ve sonrasındaki işçilik giderleri yüksektir. Bunun için işçilik masraflarının düşük olduğu ülkelerde tercih edilmesi gereken bir üretim sistemidir. Ayrıca bu üretim sisteminin bir başka dezavantajı

40 XLII da kapasite arttırımının ancak tepsi sayısının arttırımıyla mümkün olabilmesidir (Mitchell et al., 2000) Döner tamburlu biyoreaktörler Bu reaktörlerin karakteristikleri: Yatay durumda ya da eğimli olarak duran silindirik gövdenin içerisine gövdenin bir kısmını (genellikle yarı hacmini) dolduracak substrat bulunan, gövdenin ortasından geçen eksen etrafında döndürülen ya da karıştırıcı aparatları bulunan, bazı durumlarda gövde etrafına yerleştirilmiş engeller ile efektif karıştırma sağlanan ve reaktörün başlığından içeriye hava beslenen sistemlerdir (Mitchell et al., 2000) (Şekil 2.4). Tasarımda göz önünde bulundurulması gerek iki önemli nokta; uzunluğun çapa oranı ve engellerin bulunup bulunmadığıdır. İşlem sırasında dikkat edilmesi gereken noktalar ise: Katı madde yükü Beslenen havanın debisi ve nemi Dönme hızıdır. Bu reaktörlerde substrat yatağına gaz iletimi yatağın hareketi ile sağlanır. Yatak yeterli şekilde karıştırıldığında substrat, tepe boşluğunda hareket eder ve substrat partikülleri arasındaki boşluklar oksijen ile doldurulur. Engeller bulunmadığında, karıştırma etkinliği tamburun dönüş hızına bağlıdır. Düşük dönüş hızlarında substrat tambur döndüğü sürece iç yüzeyde kayarak hareket eder. Bu durumda substartın efektif bir şekilde karıştırılması mümkün değildir. Orta derecedeki dönüş hızlarında ise yatak içinde akış rejimleri uygun şekilde oluşur ve substrat partikülleri yuvarlanarak karışırlar. Yüksek dönüş hızlarında ise yatak iyi bir

41 XLIII şekilde karışır ve bazı substrat parçalarının hava akımı içerisine girmesi sağlanır (Stuart et al., 1999). Şekil 2.4 Tamburlu-karıştırıcılı KKF biyoreaktörü ( Ancak karıştırma hızları konusunda literatürde değişik yaklaşımlar bulunmaktadır. Bir çok araştırmacı düşük karıştırma hızlarını (1-15 dev/dak) kullanırken bazıları yüksek dönüş hızlarını kullanmışlardır. Hızlı karıştırmanın başlıca dezavantajı misellerin zarar görmesidir. Ancak soya sosu üretimi gibi bazı işlemlerde karıştırmanın (mekanik ya da el ile)gerekli ve yararlı olduğu belirtilmektedir (Pandey et al., 2001). Bu sistemin küçük çaptaki çalışmalarda başarılı olduğu belirtilmektedir. Reu et al., (1993), 4.7 l kapasitedeki biyoreaktörün ısıyı uzaklaştırma veriminin, karıştırıldığı durumlarda iyi sonuç verdiğini belirtmişlerdir. Ancak sitemin ölçek büyütüldüğündeki davranışı konusunda kesin bir veri bulunmamaktadır.

42 XLIV Dolgulu kolon tipi biyoreaktörler Bu reaktör tipinde cam ya da metalden yapılmış kolonun alt kısmında gözenekli bir plaka ve bu plakanın üzerinde kolon boyunca yerleştirilmiş substrat bulunmaktadır. Havalandırma, alttaki gözenekli plakadan kolonun içine beslenmektedir. Son 10 yılda bu reaktör modeli üzerindeki deneysel ve modelleme çalışmaları yoğunluk kazanmıştır (Mitchell et al., 2000). Deneysel çalışmalar, bu reaktör içerisinde oluşan sıcaklık değişim hızlarının, mikrobiyal gelişimi, O 2 değişim hızlarına göre daha yüksek oranda etkilediğini göstermektedir. Bu eksenel sıcaklık değişimleri, sisteme su ile doyurulmuş hava verilse dahi su kaybını arttırıcı bir etkiye neden olurlar. Çünkü hava kolon boyunca ısındıkça su tutma kapasitesi artar. Bu durumda substratın kuruması mikrobiyal üremeyi engeller. Karıştırma işlemi yapılmaksızın kolona yeniden su beslenmesi ise pratik değildir (Mitchell and Berovic, 1998). Bu sebeple oluşan ısının uzaklaştırılmasında başka yollar denenmiştir. Roussos et al. (1993) Zymotis tipi biyoreaktörde yarıçapsal ısı iletimini sağlamak üzere yatağın içerisine yerleştirdikleri yan yana dizilmiş bir dizi plaka kullanmışlardır. Bu reaktör tipinin kullanıldığı fermantasyon işlemlerde dikkat edilmesi gereken bir başka nokta ise meydana gelen basınç düşmesidir. Büyük basınç düşüşleri, kolon içerisinde kanalların oluşmasına substrat yığının çatlamasına neden olmaktadır. Sonuç olarak, dolgulu kolon tipi reaktörlerde ısıyı uzaklaştıracak plakalar bulunmadığında büyük ölçekte sorunlar ortaya çıkmaktadır. Bu tasarım, küçük çapa sahip kolonlarda ısının iletiminin ve uzaklaştırılmasının kolaylaşması nedeniyle daha başarılı sonuçlar vermektedir. Plakalı sistemlerde ise substrat yüklemesi, inokulasyon ve temizleme işlemleri sorunlar yarattığından tepsili tip biyoreaktördeki gibi işçilik giderleri yükselmektedir (Mitchell et al., 2000).

43 XLV 2.4 Ksilanaz Enzimi Üretim Çalışmaları Bakteri maya ve fungus türü çok sayıda mikroorganizma ksilanaz üretebilmektedir. Bu mikroorganizmalar içerisinde bu çalışmanın ilgi alnına giren ksilanaz üretime kapasitesine sahip çeşitli funguslar Çizelge 2.3 de sunulmuştur. Ksilanaz enzimlerinin efektif bir şekilde üretilmesini etkileyen temel faktörler, enzim üretimini indükleyici substratın seçimi ve optimum üretim koşullarının sağlanmasıdır (Singh et al., 2003). Laboratuvar ölçeğinde yapılan çalışmalarda saflaştırılmış ksilanların kullanımı bir çok durumda yüksek enzim verimi sağlamaktır. Purkarthofter and Steiner (1995), Thermomyces lanuginosus kullanarak mg/l konsantrasyon aralığında denedikleri indüktörler içerinde maksimum indükleyici etkinin saf ksilanın kullanıldığı durumda oluştuğunu belirtmişlerdir. Benzer şekilde termostabil Talaromyces emersonii kullanılarak derin kültürde yapılan üretimde saf ksilanın başarılı sonuçlar verdiği belirtilmektedir (Tuohy and Coughlan, 1992). Çizelge 2.3 Ksilanaz üretiminde kullanılan çeşitli funguslar. Mikroorganizma Kaynak Aspergillus awamori Siedenberg et al., 1997 Aspergillus niger Kim et al., 1997 Aspergillus kawachii Ito et al., 1992 Aspergillus nidulans Fernandez-Espinar et al.,1992 Aspergillus fischeri Raj and Chandra, 1996 Aspergillus sojae Kimura et al., 1995 Aspergillus sydowii Ghosh and Nanda, 1994 Aspergillus tamarii Souza et al., 2001 Fusarium oxysporum Christako-Polous et al., 1996 Paecilomyces varioti Kelly et al., 1989