Rejeneratif Pulpa Tedavilerinde Bir Güncelleme. An Update of Regenerative Pulp Therapies

Transkript

1 DERLEME (Review) Hacettepe Diş Hekimliği Fakültesi Dergisi Cilt: 32, Sayı: 2, Sayfa: 21-27, 2008 Rejeneratif Pulpa Tedavilerinde Bir Güncelleme An Update of Regenerative Pulp Therapies *Dt. Ebru CANOĞLU, *Doç.Dr. Zafer Cavit ÇEHRELİ *Hacettepe Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Pedodonti Anabilim Dalı ÖZET Diş kayıplarını önlemede yeni bir yaklaşım olan rejeneratif endodontik prosedürler, zarar görmüş bir dişin pulpa ve dentin yapılarının yenilenmesini hedef almaktadır. Bu amaçla yola çıkan doku mühendisliği, rejeneratif endodontinin triadı olan kök hücre, doku iskelesi ve indükleyici morfojenik sinyalleri kapsayan çalışmalara hız vermiştir. Son dönemde özellikle eksfoliye süt dişi pulpasından elde edilen kök hücrelerin olağanüstü yeteneklerinin keşfi ile önemli gelişmeler kaydedilmiştir. Halen deneme aşamasında olan rejeneratif pulpa tedavi tekniklerinin ileride daha da geliştirileceğine ve süt dişi pulpasından elde edilen kök hücrelerinin dişten farklı dokuların rejenerasyonuna yardımcı olacağına inanılmaktadır. ABSTRACT Regenerative endodontic procedures, which is a relatively new approach in the prevention of tooth loss which aims at the regeneration of pulp and dentin of the injured teeth.to this end, tissue engineering studies including stem cell, tissue scaffolds and stimulator morphogenic signals have considerably ramped up and great evolutions have been achieved recently, especially with the discovery of the excellent ability of stem cells obtained from human exfoliated deciduous teeth. Although it is believed that regenerative pulp treatment techniques are still at an elementary stage, bountiful advances are expected in the near future, with more emphasis on the use of stem cells from human exfoliated deciduous teeth that will enable regeneration of different tissues from teeth. ANAHTAR KELİMELER Rejenerasyon, kök hücre, pulpa tedavisi. KEYWORDS Regeneration, stem cell, pulp treatment.

2 22 Diş çürüğü, dişlerin yapısal bütünlüğünü geri dönüşümsüz olarak bozan problemlerin başında yer almaktadır. Çürük dişlerin restorasyonu sırasında kullanılan bazı dental materyaller pulpa hücrelerinin ölümüne neden olabilmekte 1,2, aşırı madde kaybı olan birçok dişte ise endodontik tedavinin yerine dişin çekimi tercih edilerek; diş kaybı protez veya implant uygulamaları ile telafi edilmeye çalışılmaktadır 3,4. Bu kayıpların önlenebilmesi amacıyla, pulpa-dentin kompleksinin rejenerasyonu operatif dişhekimliği ve endodontinin temel hedeflerinden biri haline gelmiştir 3. Rejeneratif endodontik prosedürler, pulpadentin kompleksindeki hücrelere ek olarak dentin ve kök yapısını da içeren zarar görmüş yapıların yenisi ile yer değiştirmesini sağlayan biyolojik temelli işlemler olarak tanımlanır 4. Endodontide rejeneratif prensiplerin uygulamaya aktarılabilmesi için doku mühendisliği uygulamalarına gereksinim vardır. Doku mühendisliği kanser, hastalık veya travma nedeniyle zarar görmüş veya bozulmuş dokuların, yapı ve fizyolojilerinin fonksiyonel restorasyonunu ile ilgilenen ve multidisipliner kapsamı sürekli genişleyen bir uygulama alanıdır 5,6. Doku mühedisliğinin triadı; kök hücreler, doku iskelesi ve indükleyici morfojenetik sinyaller şeklinde tanımlanabilir 3. KÖK HÜCRE Vücuttaki tüm dokular kök hücrelerden köken alırlar 7. Kök hücre; kendi kendine devamlı bölünme yeteneğine sahip olan ve çeşitli doku hücrelerine farklılaşabilen özelleşmemiş hücre olarak tanımlanır 8. Kök hücreler embriyonik (fetal) veya erişkin (postnatal) olarak sınıflandırılabilir 9. Erişkin kök hücrelerinin kaynağı; göbek kordon kanı, göbek kordonu, kemik iliği, periferal kan, hemen hemen tüm vücut dokuları 10 ve diş pulpasıdır farklı kök hücre tipi vardır 4. Totipotent hücreler, zigot oluşumunu takip eden 1-3 gün içinde bölünme ile meydana gelen 8 hücredir. Pluripotent hücreler, zigot oluştuktan sonra günler arasında gelişen blastosistin iç tabakasındaki hücrelerdir. Multipotent hücreler ise erişkin dokularda kısmi farklılaşma gösteren kök hücrelerdir. Tüm kök hücrelerin ortak özelliklerinden biri olan plastisite; hücrenin köken aldığı dokudan farklı dokulara farklılaşabilme yeteneği olarak tanımlanır 12. Embriyonik kök hücrelerinin plastisitesinin erişkin kök hücrelerden daha fazla olması, bu hücreleri daha değerli kılmaktadır 13. Ancak embriyonik kök hücrelerin elde edilmesinde süregelen etik ve yasal tartışmalar 4 ve teratom oluşma riski 14 nedeniyle, araştırmacılar erişkin kök hücreler üzerine odaklanmışlardır. Pulpa kök hücresi: Birçok çalışma, erişkin diş pulpasından yüksek derecede proliferasyon özelliği olan ve in vitro şartlarda odontoblastlara dönüşen hücrelerin izole edilebileceğini ortaya koymaktadır 11, Son yıllarda yürütülen çalışmalarda ise insan diş pulpası kök hücresi, in vivo şartlarda hidroksiapatit ve trikalsiyumfosfatla beraber immün olarak sakatlanmış (immün kompromize) fareye transplante edilmiştir. Bu çalışmaların sonuçları, hücrelerin kendi kendini yenileyebilme ve odontoblastlara farklılaşabilme yetenekleri sayesinde tübüler dentin sentezleyebildiklerini göstermiştir 23,24. Ancak bu hücrelerin odontoblastlara dönüşüm mekanizması ile ilgili araştırmalar halen primer aşamadadır 25. Eksfoliye süt dişinden elde edilen kök hücreler Yakın geçmişte, erişkin kök hücrelerinin olağanüstü plastisite özelliklerine sahip olduğu ileri sürülmüştür. Miura ve ark. 26, eksfoliye süt dişinden elde edilen kök hücrelerin (SHED: Stem cells from Human Exfoliated Deciduous teeth) de bu olağanüstü plastisite özelliğine sahip olduğunu tespit etmişlerdir. SHED yüksek derecede proliferatif; nöral hücreler, adipozitler ve odontoblastlar gibi farklı hücre tiplerine farklılaşma yeteneğine sahip klonojenik (genetik olarak kendisiyle tamamen aynı hücreleri oluşturabilen) multipotent hücrelerdir 26. Bu hücreler aynı zamanda runt-ilişkili transkripsiyon faktörü 2 (Runx2), alkalen fosfataz (ALP), matriks ekstrasellüler fosfoglikoprotein (MEPE), kemik siyaloprotein (BSP) ve dentin siyalofosfoprotein (DSPP) gibi osteoblastik/odontoblastik markerları eksprese etmektedirler 27. Miura ve ark. 26, SHED in in vivo transplantasyonundan sonra yeni kemik oluşturduğunu, dentin yapımına yol açtığını ve fare beyninde nöral markerların ekspresyonu boyunca hayatta kaldığı bulmuşlardır.

3 23 SHED in odontoblast formuna dönüşüm kapasitesini kanıtlamak amacıyla bu hücreler immün kompromize farelere transplante edilmişlerdir. Transplantasyon sonucunda hücrelerin bir bölümünün insana özgü odontoblastlara farklılaştığı ve bu hücreler tarafından sentezlenenen rejenere dentin in dentin siyalofosfoprotein (DPSS) e immünoreaktif olduğu saptanmıştır 23,24. SHED; yüksek proliferasyon oranı, hücre kümesi oluşturma yeteneği ve in vivo şartlarda kemik yapımını uyarabilme kapasitesi ile diş pulpası kök hücreleri (DPSC: Dental Pulp Stem Cells) nden üstün görünmektedir. Ancak SHED, kusursuz bir pulpa-dentin kompleksi yaratmada DPSC ler kadar başarılı değildir 26. Dikkat çekici bir başka nokta ise, SHED in diş pulpasının nöral krest kökeniyle ilişkili olabilecek nöronal ve glial hücre markerlarını da eksprese etmesidir 28. Daha önce yapılmış çalışmalar, kemik iliği stromal kök hücrelerinin in vivo transplantasyondan sonra nöron benzeri hücrelere farklılaşabildiklerini göstermiştir 29. Diş pulpası hücrelerinin nörotrofik faktör ürettiği ve hatta spinal kord yaralanmaları nedeniyle hasar görmüş motonöronları tamir edebildiği bilinmektedir 30. Nöral progenitörler son zamanlarda memelilerin deri tabakasında da tanımlanmıştır 31. Bu kanıtlar, nöral olmayan dokuların kök hücrelerinin (örneğin SHED) nöral hücrelere farklılaşabileceği görüşünü desteklemektedir 26. Sonuç olarak süt dişleri, zarar görmüş diş dokularının tamir edilmesinde, kemik rejenerasyonu oluşturmada ve belki de nöral doku yaralanmaları ve dejeneratif hastalıklarının tedavisinde en ideal kök hücre kaynağı olabilir 26. DOKU İSKELESİ Pulpa kök hücrelerinin 3 boyutlu bir yapı içinde organize olması ve damarlanma ile desteklenmesi düşünüldüğünde; pöröz polimerlerden oluşan biyolojik doku iskelelerinin kullanımını gündeme gelmiştir 32. Ekstrasellüler matriksin taklidi olan doku iskeleleri, kök hücrelerin prolifere olması ve farklılaşmasına yardımcı olması için büyüme faktörleri; beslenmeleri ve gelişmeleri için besin; bakteriyel gelişimi önlemek için de antibiyotik içermelidir Bu özellikleri sağlayabilmek amacıyla yeterli pöröziteye ve por genişliğine sahip olmalıdır 36. İskele aynı zamanda biyouyumlu, optimal fiziksel ve mekanik özellikli olmalı ve toksik olmamalıdır 3. Bir doku iskelesinin istenilen en önemli özelliklerden biri ise, görevini yerine getirdikten sonra cerrahi olarak kaldırmaya gerek olmadan biyoçözünür (bioresorbable) veya biyobozunur (biodegradable) olmasıdır 3. 7 MORFOJENLER ve BÜYÜME FAKTÖRLERİ Morfojenler, epitelyal-mezenşimal etkileşim sırasında morfogenezisi düzenleyen ve ekstrasellüler olarak sentezlenen sinyallerdir. 38,39 Morfojenetik sinyal ağı, BMP (Bone morphogenetic protein) gibi proteinleri ve FGF (Fibroblast growth factor), TNF (Tumor necrosis factor), TGF-β (Transforming growth factor-β) gibi büyüme faktörlerini içerir farklı BMP tanımlanmıştır (Bmp2 Bmp7). 41 rh BMP2, rh BMP4 ve rh BMP7 nin rejeneratif dentin formasyonunu arttırdığı kanıtlanmıştır Morfojenik özelliğe sahip büyüme faktörlerinden biri olan olan TGF-β (Transforming growth factor-β), odontoblast farklılaşması ve dentin matriksi sekresyonunun uyarılmasında önemli rol oynar 40. Günümüzde sadece TGF-β1 ve β3 ün odontoblast farklılaşmasını uyarabildiği gösterilmiştir 45. Ayrıca, rh IGF 1 (insülin benzeri büyüme faktörü) 46, kemik siyaloprotein 47 ve mine matriks türevleri 48 ile yapılan pulpa kaplamaları sonrasında da iyi mineralize olmuş ve homojen reperatif dentin oluştuğu kanıtlanmıştır. REJENERATİF PULPA TEDAVİ TEKNİKLERİ 1. Kök kanalının yeniden damarlanması: Bu yöntem ile nekrotik kök kanalının tamamen dezenfekte edilmesi ve kan pıhtısı oluşturarak bir fibrin matriksi oluşumunun sağlanması amaçlanmaktadır. Tamamen gelişmiş (kapalı) apeksli ve nekrotik pulpalı dişlerde bu işlem; el aletleri ile apikal çapın 2 mm ye kadar genişletilmesi ve kök kanalının içine doğru bir kanama başlamasına izin verilmesi ile gerçekleştirilir. 4 Bu teknik sonucunda oluşan rejenere dokunun yapısal olarak pulpa ile benzerliği tam olarak ispatlanamamıştır. Ancak bu teknikle ilgili yayınlanmış vaka raporları, devam eden kök formasyonu ve termal pulpa testlerine pozitif cevap veren bir

4 24 iyileşmeyi göstermişlerdir 49. Bu tekniğin doku mühendisliği prensipleri yönünden güvenilirliği halen tartışma konusudur Erişkin kök hücre tedavisi: Kök hücre tedavisi; hastalanmış veya fonksiyon kaybına uğramış dokulardaki hücrelerin, sağlıklı ve düzgün çalışan hücrelerle yer değiştirilmesine ve bu dokuların yeniden yapılanmasına olanak sağlayan teknikler ve teknolojiler olarak tanımlanabilmektedir. Dişhekimliğinde erişkin kök hücre tedavisindeki en basit yaklaşım, apeksler açıldıktan ve kök kanalı dezenfekte edildikten sonra, kök hücrelerin kanal içine enjekte edilmesidir 50. Bu tekniğin en önemli problemlerinden birisi, erişkin pulpasıdan toplanan birçok hücre populasyonu arasından farklılaşmadan sorumlu erişkin kök hücrelerinin tanımlanmasıdır 4. Sonuç olarak, yeni ve fonksiyonel bir pulpa dokusu oluşturmak istendiğinde, iskele ve biyoaktif sinyal molekülleri olmadan sadece kök hücrelerin pulpa odasına enjekte edilmesi ile yüksek başarı elde etme olasılığı bulunmamaktadır Pulpa implantasyonu: Pulpa implantasyonu, bazı yöntemlerle hazırlanmış pulpa dokusunun temizlenmiş ve şekillendirilmiş kök kanal sistemine transplante edilmesi ile gerçekleştirilen bir tedavi şeklidir. Kültür ortamında çoğaltılan pulpa dokusu in vitro olarak biyoçözünür polimer nanofiber tabakada veya kollajen-1 veya fibronektin gibi ekstrasellüler matriks protein tabakası üzerinde yetiştirilirler 51,52. Ancak şimdiye kadar kollajen-1 ve kollajen-3 üzerinde yetiştirilmiş pulpa hücreleri başarılı olamamıştır İskele implantasyonu: İskeleler iki tür polimer grubundan yapılmaktadırlar. Doğal polimerlerin, iyi hücre uyumluluğu ve biyoaktivite gibi avantajları vardır 54. Kollajen, fibronektin, kitosan, GAG (glikozaminoglikan) ve kemik siyaloproteinleri (BSP) bu polimerlere örnektir 55. Sentetik polimerler; degradasyon oranı, pörözite, mikroyapı ve mekanik özellikler gibi fizikokimyasal özellikleri kontrol edebilme imkanı verir 54. Bu polimerler, polilaktikasit, poliglikolikasit, polikaprolakton ve insan vücudunda degrede olabilen tüm polyester materyallerden yapılabilmektedir 56. Aljinat hidrojel, MTA (mineral trioksit agregate) 5 ve alendronat sodyum 57 bu gruba örnektir. 5. Enjekte edilebilir doku iskelesi uygulaması: Kök kanal sistemlerinde doku mühendisliği ürünü olan pulpa yapısal destek gerektirmediğinden, yumuşak üç boyutlu iskele matriksleri geliştirilmiştir. Bunun en önemli örneği olan Hidrojel, şırınga ile uygulanan enjekte edilebilir bir doku iskelesidir 58,59. Teorik olarak, hidrojel, organize doku yapısı içinde hücre proliferasyonu ve farklılaşması için bir substrat işlevi görerek pulpa rejenerasyonunun gerçekleşmesine yardımcı olur 60. Hidrojel ile ilgili araştırmalar daha çok erken safhadadır ve bu sistemin in vivo etki mekanizması net bir şekilde tanımlanamamıştır Üç boyutlu hücre yayması: Bu teknikte sprey boya cihazlarına benzer bir cihaz kullanılarak ve hücre tabakaları hidrojel içine dağıtılarak, pulpa dokusu yeniden oluşturulabilmektedir 62. Üç boyutlu hücre yayma tekniği doğal pulpa dokusunun tam olarak taklidini oluşturabilmektedir 4. Ancak yapılan araştırmalar, bu tekniğin in vivo olarak fonksiyonel doku yarattığını henüz gösterememiştir Gen tedavisi: Gen tedavisi; somatik hücrelere büyüme faktörleri, morfojenler, transkripsiyon faktörleri ve ekstrasellüler matriks molekülleri sentezlemeleri için gen nakledilmesini tanımlayan bir tedavidir 64. Gen nakli sistemi için viral ve nonviral vektörler olmak üzere iki türlü hücre kullanılabilir 65. Gen tedavi girişimleri ise iki yolla yapılabilmektedir. İn vivo sistemde genler sistemik olarak kan dolaşımına veya lokal olarak hedef dokuya, enjeksiyon veya solunumla nakledilmektedir 66. Ex vivo sistemde ise, genetik manipülasyon in vitro olarak yapılmakta, daha sonrasında modifiye edilmiş bu hücreler rejenerasyon alanına yerleştirilmektedir 66. Endodontideki potansiyel gen naklinin uygulamalarından biri, dokudaki mineralizasyonunu hızlandırmak için mineralizasyonla ilişkili genlerinin pulpa dokusuna implante edilmesidir. Rutherford 67, dağ gelinciği (ferret) pulpasına fare BMP7 si

5 25 ile transfekte cdna implante etmiş; ancak reperatif cevap gözlemleyememiştir. Öte yandan Nakashima ve ark. 68, Gdf11 plazmidlerin ultrason aracılığı ile mikrokabarcıklarla naklinden sonra, in vitro şartlarda pulpa kök hücrelerinin odontoblastlara farklılaştığını ve in vivo şartlarda ise homojen reperatif dentinin şekillendiği göstermiştir. Araştırmacılar gen tedavisinin endodontik tedavinin bir parçası olarak ilerleme kaydedemeyeceğine 4 ve gen tedavisi sırasında bazı istenmeyen sağlık problemlerinin (hastalık, malignensi) meydana gelebileceğine işaret etmişlerdir 66. Görüldüğü üzere, gen terapisi henüz başlangıç aşamada olup daha çok yol alması gereklidir 4 Yukarıda anlatılan yedi rejeneratif tekniğin endodontik uygulamaları, henüz başlangıç aşamasındadır. Bu tekniklerin avantaj ve dezavantajları özet olarak Tablo I de yer almaktadır 4 REJENERATİF PULPA TEDAVİSİNİN GELECEĞİ Rejeneratif tekniklerin her birinin avantajları ve dezavantajları bulunmakta, bazı teknikler ise etik olarak uygun görünmemektedir. Unutulmaması gereken en önemli nokta, rejeneratif endodontik tekniklerle ilgili tüm araştırmaların henüz başlangıç safhasında olduğudur 4. Yakın gelecekteki araştırmalar, temel olarak diş dokusunun gelişiminde kök hücrelerin tanımlanması, bu hücrelerin farklılaşma yolunun haritasının çıkartılması ve ayrıca lokal faktörlerin gelişimsel sonucu nasıl etkilediği gibi problemlere çözüm arayacaktır. Yakın zamanda, FDA tarafından da onay gören BMP2, BMP4 ve BMP7 gibi rekombinant protein morfojenler, büyük olasılıkla dişhekimliğinde kraniofasyal yapıların tamirine yardım amacıyla kullanılabilecektir 5. TABLO I Rejeneratif pulpa tedavilerinin avantaj ve dezavantajları TEKNİK AVANTAJ DEZAVANTAJ KÖK KANAL REVASKÜLARİZASYONU KÖK HÜCRE TEDAVİSİ PULPA İMPLANTASYONU *Düşük immün ret riski *Düşük patojen geçiş riski *Hızlı *Kolay nakil *En az ağrılı *Hücreleri toplama kolaylığı *Hücre tabakasını yetiştirmek kolay *Çözünür hücrelerin enjeksiyonundan daha stabil *Çok az yayınlanmış vaka raporu *Tekrar enfekte olması halinde dokuda nekroz riski *Hücrelerin düşük yaşama şansı *Hücrelerin yeni fonksiyonel pulpa yaratamaması *Komplikasyon riski yüksek *Tabaka damarsız olduğundan, sadece küçük yapı oluşturma olasılığı *Kök kanalının şekline tam olarak uydurarak yapılandırılmalı İSKELE İMPLANTASYONU *Hücreleri destekleyen yapı varlığı *Bazı materyaller damarlanmayı hızlandırabilir *İmplantasyondan sonra hücrelerin düşük yaşama şansı *Kök kanalının şekline tam olarak uydurarak yapılandırılmalı ÜÇ BOYUTLU HÜCRE YAYMASI ENJEKTE EDİLEBİLİR İSKELE GEN TERAPİ *Çok sayıda hücre tipi tam olarak yerleştirilebilir *Kolay nakil *Ekstrasellüler matriks yerine geçerek rejenerasyonu hızlandırabilir *Kök kanalının temizleme ve şekillendirmesi yapılmayabilir *Kök hücre nakline gerek olmayabilir *Kök kanalının şekline tam olarak uydurarak yapılandırılmalı *Başlangıç araştırmaları fonksiyonel in vivoyu henüz desteklemiyor *Doku formasyonu üzerinde sınırlı kontrol *Hücrelerin düşük yaşama şansı *Başlangıç araştırmaları fonksiyonel in vivoyu henüz desteklemiyor *Nekrotik dişteki çoğu hücre zaten ölü *Kontrolü zor *Sağlığa zarar riski *FDA onaylamıyor

6 26 KAYNAKLAR 1. Gurpinar OA, Beklen A, Hukkanen M, Cehreli ZC, Onur MA, Konttinen YT. Effects of two multi-step self-etch primer/adhesives on apoptosis in human gingival fibroblasts in vitro. J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2006;79: Gurpinar OA, Onur MA, Cehreli ZC, Tasman F. Cytotoxicity of Two-step Selfetching Primer/Adhesives on L929 Cells. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 2006;21: Nakashima M. Bone morphogenetic proteins in dentin regeneration for potential use in endodontic therapy. Cytokine Growth Factor Rev 2005;16: Murray PE, Garcia-Godoy F, Hargreaves KM. Regenerative endodontics: a review of current status and a call for action. J Endod 2007;33: Nakashima M, Reddi AH. The application of bone morphogenetic proteins to dental tissue engineering. Nat Biotechnol 2003;21: Reddi AH. Role of morphogenetic proteins in skeletal tissue engineering and regeneration. Nat Biotechnol 1998;16: Smith AG. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol 2001;17: Rao MS. Stem sense: a proposal for the classification of stem cells. Stem Cells Dev 2004;13: Fortier LA. Stem cells: classifications, controversies, and clinical applications. Vet Surg 2005;34: Gimble J, Guilak F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy 2003;5: Tsukamoto Y, Fukutani S, Shin-Ike T, Kubota T, Sato S, Suzuki Y et al. Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch Oral Biol 1992;37: Martin-Rendon E, Watt SM. Exploitation of stem cell plasticity. Transfus Med 2003;13: Gardner RL. Stem cells: potency, plasticity and public perception. J Anat 2002;200: Weissman IL. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell 2000;100: Buchaille R, Couble ML, Magloire H, Bleicher F. A substractive PCR-based cdna library from human odontoblast cells: identification of novel genes expressed in tooth forming cells. Matrix Biol 2000;19: Kettunen P, Karavanova I, Thesleff I. Responsiveness of developing dental tissues to fibroblast growth factors: expression of splicing alternatives of FGFR1, -2, -3, and of FGFR4; and stimulation of cell proliferation by FGF-2, -4, -8, and -9. Dev Genet 1998;22: Kuo MY, Lan WH, Lin SK, Tsai KS, Hahn LJ. Collagen gene expression in human dental pulp cell cultures. Arch Oral Biol 1992;37: Nakashima M. Establishment of primary cultures of pulp cells from bovine permanent incisors. Arch Oral Biol 1991;36: Nakashima M. The effects of growth factors on DNA synthesis, proteoglycan synthesis and alkaline phosphatase activity in bovine dental pulp cells. Arch Oral Biol 1992;37: Nakashima M, Nagasawa H, Yamada Y, Reddi AH. Regulatory role of transforming growth factor-beta, bone morphogenetic protein-2, and protein-4 on gene expression of extracellular matrix proteins and differentiation of dental pulp cells. Dev Biol 1994;162: Shiba H, Fujita T, Doi N, Nakamura S, Nakanishi K, Takemoto T et al. Differential effects of various growth factors and cytokines on the syntheses of DNA, type I collagen, laminin, fibronectin, osteonectin/secreted protein, acidic and rich in cysteine (SPARC), and alkaline phosphatase by human pulp cells in culture. J Cell Physiol 1998;174: Yokose S, Kadokura H, Tajima Y, Fujieda K, Katayama I, Matsuoka T et al. Establishment and characterization of a culture system for enzymatically released rat dental pulp cells. Calcif Tissue Int 2000;66: Gronthos S, Brahim J, Li W, Fisher LW, Cherman N, Boyde A et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res 2002;81: Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97: Goldberg M, Lasfargues JJ. Pulpo-dentinal complex revisited. J Dent 1995;23: Miura M, Gronthos S, Zhao M, Lu B, Fisher LW, Robey PG et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100: Shi S, Gronthos S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J Bone Miner Res 2003;18: Chai Y, Jiang X, Ito Y, Bringas P, Jr., Han J, Rowitch DH et al. Fate of the mammalian cranial neural crest during tooth and mandibular morphogenesis. Development 2000;127: Azizi SA, Stokes D, Augelli BJ, DiGirolamo C, Prockop DJ. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts. Proc Natl Acad Sci U S A 1998;95: Nosrat IV, Widenfalk J, Olson L, Nosrat CA. Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury. Dev Biol 2001;238: Toma JG, Akhavan M, Fernandes KJ, Barnabe-Heider F, Sadikot A, Kaplan DR et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol 2001;3: Nakashima M. Tissue engineering in endodontics. Aust Endod J 2005;31: Karande TS, Ong JL, Agrawal CM. Diffusion in musculoskeletal tissue engineering scaffolds: design issues related to porosity, permeability, architecture, and nutrient mixing. Ann Biomed Eng 2004;32: Oringer RJ. Biological mediators for periodontal and bone regeneration. Compend Contin Educ Dent 2002;23: , , 512 passim; quiz Tabata Y. Nanomaterials of drug delivery systems for tissue regeneration. Methods Mol Biol 2005;300: Sachlos E, Czernuszka JT. Making tissue engineering scaffolds work. Review: the application of solid freeform fabrication technology to the production of tissue engineering scaffolds. Eur Cell Mater 2003;5:29-39; discussion

7 Schopper C, Ziya-Ghazvini F, Goriwoda W, Moser D, Wanschitz F, Spassova E et al. HA/TCP compounding of a porous CaP biomaterial improves bone formation and scaffold degradation--a long-term histological study. J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2005;74: Ohazama A, Sharpe PT. TNF signalling in tooth development. Curr Opin Genet Dev 2004;14: Thesleff I, Mikkola M. The role of growth factors in tooth development. Int Rev Cytol 2002;217: Roberts-Clark DJ, Smith AJ. Angiogenic growth factors in human dentine matrix. Arch Oral Biol 2000;45: Aberg T, Wozney J, Thesleff I. Expression patterns of bone morphogenetic proteins (Bmps) in the developing mouse tooth suggest roles in morphogenesis and cell differentiation. Dev Dyn 1997;210: Nakashima M. Induction of dentin formation on canine amputated pulp by recombinant human bone morphogenetic proteins (BMP)-2 and -4. J Dent Res 1994;73: Nakashima M. Induction of dentine in amputated pulp of dogs by recombinant human bone morphogenetic proteins-2 and -4 with collagen matrix. Arch Oral Biol 1994;39: Six N, Decup F, Lasfargues JJ, Salih E, Goldberg M. Osteogenic proteins (bone sialoprotein and bone morphogenetic protein-7) and dental pulp mineralization. J Mater Sci Mater Med 2002;13: Tziafas D, Smith AJ, Lesot H. Designing new treatment strategies in vital pulp therapy. J Dent 2000;28: Lovschall H, Fejerskov O, Flyvbjerg A. Pulp-capping with recombinant human insulin-like growth factor I (rhigf-i) in rat molars. Adv Dent Res 2001;15: Decup F, Six N, Palmier B, Buch D, Lasfargues JJ, Salih E et al. Bone sialoprotein-induced reparative dentinogenesis in the pulp of rat s molar. Clin Oral Investig 2000;4: Nakamura Y, Hammarstrom L, Lundberg E, Ekdahl H, Matsumoto K, Gestrelius S et al. Enamel matrix derivative promotes reparative processes in the dental pulp. Adv Dent Res 2001;15: Banchs F, Trope M. Revascularization of immature permanent teeth with apical periodontitis: new treatment protocol? J Endod 2004;30: Kindler V. Postnatal stem cell survival: does the niche, a rare harbor where to resist the ebb tide of differentiation, also provide lineage-specific instructions? J Leukoc Biol 2005;78: Fukuda J, Khademhosseini A, Yeh J, Eng G, Cheng J, Farokhzad OC et al. Micropatterned cell co-cultures using layer-by-layer deposition of extracellular matrix components. Biomaterials 2006;27: Venugopal J, Ramakrishna S. Applications of polymer nanofibers in biomedicine and biotechnology. Appl Biochem Biotechnol 2005;125: Huang GT, Sonoyama W, Chen J, Park SH. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell Tissue Res 2006;324: Sharma B, Elisseeff JH. Engineering structurally organized cartilage and bone tissues. Ann Biomed Eng 2004;32: Guo T, Zhao J, Chang J, Ding Z, Hong H, Chen J et al. Porous chitosan-gelatin scaffold containing plasmid DNA encoding transforming growth factor-beta1 for chondrocytes proliferation. Biomaterials 2006;27: Taylor MS, Daniels AU, Andriano KP, Heller J. Six bioabsorbable polymers: in vitro acute toxicity of accumulated degradation products. J Appl Biomater 1994;5: Cengiz SB, Batirbaygil Y, Onur MA, Atilla P, Asan E, Altay N et al. Histological comparison of alendronate, calcium hydroxide and formocresol in amputated rat molar. Dent Traumatol 2005;21: Dhariwala B, Hunt E, Boland T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue Eng 2004;10: Trojani C, Weiss P, Michiels JF, Vinatier C, Guicheux J, Daculsi G et al. Three-dimensional culture and differentiation of human osteogenic cells in an injectable hydroxypropylmethylcellulose hydrogel. Biomaterials 2005;26: Alhadlaq A, Mao JJ. Tissue-engineered osteochondral constructs in the shape of an articular condyle. J Bone Joint Surg Am 2005;87: Luo Y, Shoichet MS. A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration. Nat Mater 2004;3: Sanjana NE, Fuller SB. A fast flexible ink-jet printing method for patterning dissociated neurons in culture. J Neurosci Methods 2004;136: Barron JA, Krizman DB, Ringeisen BR. Laser printing of single cells: statistical analysis, cell viability, and stress. Ann Biomed Eng 2005;33: Bonadio J, Smiley E, Patil P, Goldstein S. Localized, direct plasmid gene delivery in vivo: prolonged therapy results in reproducible tissue regeneration. Nat Med 1999;5: Li J, Zheng C, Zhang X, Liu X, Zhang C, Goldsmith CM et al. Developing a convenient large animal model for gene transfer to salivary glands in vivo. J Gene Med 2004;6: Jullig M, Zhang WV, Stott NS. Gene therapy in orthopaedic surgery: the current status. ANZ J Surg 2004;74: Rutherford RB. BMP-7 gene transfer to inflamed ferret dental pulps. Eur J Oral Sci 2001;109: Nakashima M, Tachibana K, Iohara K, Ito M, Ishikawa M, Akamine A. Induction of reparative dentin formation by ultrasound-mediated gene delivery of growth/differentiation factor 11. Hum Gene Ther 2003;14: Geliş Tarihi : Received Date : 02 April 2008 Kabul Tarihi : Accepted Date : 16 May 2008 İLETİŞİM ADRESİ Dt. Ebru CANOĞLU Hacettepe Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Pedodonti Anabilim Dalı Ankara Tel: Faks: E-posta: p_ebru@yahoo.com