TAZE DONMUŞ MASİF FEMUR UYGULANMIŞŞ TAVŞANLARDA DÜŞÜK YOĞUNLUKLUU KESİKLİ ULTRASONUN OSTEOİNTEGRASYONUNA ETKİSİNİN HİSTOPATOLOJİK

Transkript

1 T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ ORTOPEDİİ VE TRAVMATOLOJİ ANABİLİM DALI TAZE DONMUŞ MASİF FEMUR ALLOGREFTİİ UYGULANMIŞŞ TAVŞANLARDA DÜŞÜK YOĞUNLUKLUU KESİKLİ ULTRASONUN ALLOGREFT OSTEOİNTEGRASYONUNA ETKİSİNİN HİSTOPATOLOJİK İNCELENMESİ Dr. Sefa KILIÇ UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI Yrd. Doç. Dr. Mehmet Ali DEVECİ ADANA- 2014

2 TEŞEKKÜR Çukorova Üniversitesi Tıp Fakültesi Ortopedi ve Travmatoloji Anabilim Dalında eğitim sürecim boyunca benim yetişmemde büyük katkıda bulunan, bütün eğitim sürecim boyunca benden sabır ve hoşgörülerini esirgemeyen, bilgi tecrüblerini meslek hayatım boyunca taşıyacağım değerli hocalarım Prof. Dr. İsmet Tan, Doç. Dr. Cenk Özkan, Yrd. Doç. Ömer Sunkar Biçer, Yrd. Doç. Mehmet Ali Deveci, Yrd. Doç. Gazi Huri ve Uzm. Dr. Mustafa Tekin'e ve eğitimimin birinci senesinde emekliye ayrılan Prof. Dr. Hüseyin Bayram ve Prof. Dr. Mustafa Herdem e sonsuz teşekkür ve şükranlarımı sunarım. Beş yıllık çalışma sürecim boyunca birlikte zevkle zaman geçirdiğim uzman olan ve halen asistanlıkları devam eden doktor arkadaşlarıma; servis, poliklinik ve ameliyathane hemşirelerine, personellerine ve sekreterlerine teşekkürü borç bilirim. Tezimde bana yardımcı olan ve birlikte çalışmaktan mutluluk duyduğum Prof. Dr. Gülfiliz Gönlüşen ve Arş. Gör. Dr. Nazlı Cerit Soygun'a bu çalışmanın gerçekleşmesinde laboratuar imkanlarını ve yardımlarını esirgemeyen Doç. Dr. Kenan Dağlıoğlu'na, çalışmalarımda emek ve yardımlarından ötürü ÇÜTF-DETAUM personellerine, projede kullanılan ultrason cihazlarınn temininde kolaylık sağlayan Plato Grup a teşekkürü borç bilirim. Bütün eğitim hayatım boyunca beni destekleyen, maddi ve manevi yardımlarını esirgemeyen annem babam ve kardeşime, zorlu Ortopedi ve Travmatoloji eğitimim sırasında gösterdiği anlayıştan dolayı hayat arkadaşım Elif Kılıç a ve kayınvalideme, varlığıyla ailemize neşe veren biricik kızım Naz a gönülden teşekkür ederim. Dr. Sefa KILIÇ Adana, 2014 I

3 İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR... I TABLOLAR LİSTESİ... IV ŞEKİLLER LİSTESİ... V KISALTMALAR LİSTESİ... VI ÖZET... VII ABSTRACT... VIII 1.GİRİŞ GENEL BİLGİLER Kemik Greftleri Kemik Greftlerinin Sınıflandırılması Otojen Kemik Greftleri Kansellöz Otojen Kemik Greftleri Kortikal Otojen Kemik Greftleri Vaskülerize Otojen Kemik Greftleri Allogreftler Taze Allogreftler Taze Donmuş Allogreftler Donmuş Kurutulmuş Allogreftler Demineralize Kemik Matriksi Ksenogreftler Kemik Greftlerinin Biyolojisi ve İyileşme Mekanizması Osteogenez Osteoindüksiyon Osteokondüksiyon Kırık İyileşmesinde Düşük Yoğunlukta Ultrason Uygulaması II

4 Tarihsel Gelişim Kemik İyileşmesindeki Etki Mekanizmaları Fiziksel Etkiler Piezoelektrik Etki Biyolojik Etki GEREÇ VE YÖNTEM Gereç ve Yöntem Femur Allogreftlerinin Alınması ve Saklanması Allogretlerin Çalışma ve Kontrol Grubuna Nakli Çalışma Grubuna Düşük Yoğunluklu Kesikli Ultrason Uygulaması Çalışmanın Radyolojik İncelenmesi Çalışmanın Histolojik İncelenmesi Çalışmanın İstatistiksel Analizi SONUÇLAR Radyolojik Sonuçlar Histolojik Sonuçlar TARTIŞMA SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKÇA ÖZGEÇMİŞ III

5 TABLOLAR LİSTESİ Tablo 1. Greft iyileşme aşamaları Tablo 2 : Otogreft ve allogreftlerin özellikleri Tablo 3: Taira ve ark. greft iyileşmesi ile ilgili tarifledikleri radyolojik skorlama sitemi Tablo 4: Huo ve ark'nın histolojik sınıflaması Tablo 5: Santoni ve ark.'nın allogreft iyileşme skorlaması Tablo 6: Çalışmanın radyolojik skoları Tablo 7: Çalışmanın radyolojik sonuçlarının istatistiksel analizi Tablo 8: Çalışmanın histolojik sonuçlarının istatistiksel değerlendirilmesi Tablo 9: Çalışmanın histolojik sonuçlarının istatiksel değerlendirilmesi IV

6 ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 1: Taze donmuş proksimal humerus osteoartiküler allogrefti... 6 Şekil 2: Donmuş kurutulmuş allogretfler... 7 Şekil 3:Demineralize kemik matriksi a) Enjekte edilebilen formu b) Yonga crunch formu... 8 Şekil 4: : Fare tibia kırığı modelinde kırık iyileşme fazları a) inflamasyon fazı b)revaskülarizasyon ve kallus oluşumu c) Remodelizasyon fazı... 9 Şekil 5: Kemik grefti inkorporasyonunu etkileyen majör faktörler Şekil 6: Mezenkimal kök hücrelerden osteoblast farklılaşması Şekil 7: BMP nin mezenkimal kök hücrelerden osteoblast öncülleri ve osteoblast farklılaşmasına etkileri Şekil 8: : Pohlman ve ark. tarafından geliştirilen ultrasonik dalgalar yayabilen cihaz Şekil 9: : Duyulabilir, tanısal ve tedavi edici ses dalgası aralıkları Şekil 10: Tavşanların ağırlıklarının ölçülmesi Şekil 11: Femura lateralden yaklaşım. Vastus lateralis kası ile intermuskuler septum arasından girilir Şekil 12: : a) Verici tavşanın hazırlanması b) Tavşanın sol uyluğuna yapılacak insizyon c) Vastus lateralis ve intermusküler septum arasından femura ulaşılması d) Femurun testere yardımıyla osteotomize edilmesi Şekil 13: a) Alınan femur greftinin boyunun ölçülmesi b) Greftin saklandığı materyaller c) Greftin steril poşete yerleştirilmesi d) Steril plastik şişeye yerleştirme e) Plastik şişenin steril poşete koyulması Şekil 14: Femur allogreftlerinin yerleştirilmesi Şekil 15: Femur allogreftlerinin radyolojik görüntüsü Şekil 16: Çalışma grubundaki tavşanlara DYKU uygulaması Şekil 17: Sakrifiye edilen tavşanların femurlarının radyolojik görüntüsü a) Çalışma grubundan örnek b) Kontrol grubundan bir örnek Şekil 18: Çalışmanın radyolojik sonuçlarının şematik görünümü Şekil 19: a-b) Çalışma grubundan iki farklı örnek Şekil 20: a-b) Kontrol grubundan iki farklı örnek Şekil 21: Gruplara göre köprüleme skorlarının dağılımı Şekil 22: Gruplara göre kallus boyutu dağılımı Şekil 23: Gruplara göre kallus tipi dağılımı V

7 KISALTMALAR LİSTESİ DYKU: Düşük yoğunluklu kesikli ultrason LIPUS: Low-intensity pulsed ultrasound (Düşük yoğunluklu kesikli ultrason) Khz: Kilohertz Mhz: Megahertz mw: Miliwatt cm 2 : Santimetrekare μm: Mikron (mikrometre) TGF: Transforming growth faktör (Dönüştürücü büyüme faktörü) BMP: Bone morphogenic protein (Kemik morfojenik protein) kgy: Kilogray HIV: Human immunodeficiency virüs (İnsan immün yetmezlik virüsü) DKM: Demineralize kemik matriksi meq: Milieqivalan HCL: Hidroklorik asid Gr: Gram μsn: Mikrosaniye mv: Milivolt FDA: Food and Drug Administration (Gıda ve İlaç Dairesi) mrna: Mesajcı ribonükleik asit PDGF: Platet derived growth faktör (Trombosit kökenli büyüme faktörü) VEGF: Vasküler endotelyal growth faktör (Vasküler endotelyal büyüme faktörü) NO: Nitrik oksit inos: İndüklenebilir nitrik oksit sentaz HİF-1α : Hipoksi ile indüklenen faktör 1-alfa LAP: Longitudinal allograft perforasyonu VAS: Vizüel analog skalası (Görsel ağrı skoru) ALP: Alkalen fosfataz VI

8 ÖZET Taze Donmuş Masif Femur Allogrefti Uygulanmış Tavşanlarda Düşük Yoğunluklu Kesikli Ultrasonun Allogreft Osteointegrasyonuna Etkisinin Histopatolojik İncelenmesi Amaç: Taze donmuş masif femur allogrefti uygulanmış tavşan modeli üzerinde düşük yoğunluklu kesikli ultrasonun (DYKU) allogreft osteointegrasyonu üzerine etkilerini histolojik ve radyolojik olarak göstermeyi amaçladık. Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda gr ağırlığında yetişkin Yeni Zellanda cinsi toplam 24 adet tavşan kullanıldı. 8 er tavşanlık 3 grup oluşturuldu. Birinci grup femur allogrefti kaynağı olan tavşan grubu iken ikinci grup DYKU uygulanacak olan çalışma grubu, 3. grup ise kontrol grubu olarak planlandı. Birinci gruptaki 8 adet tavşanın her iki ekstremitesinden toplam 16 adet femur grefti alındı. Alınan femur greftleri steril paketlerde -80 derece sıcaklıkta 4 hafta saklandı. 4 hafta sonunda allogreftler, çalışma ve kontrol grubundaki tavşanların femurlarında oluşturulan yaklaşık 15 mm lik defektler yerine yerleştirildi ve 2 adet kirshner teli ile intramedüller olarak tespit edildi. Çalışma grubuna, 8 hafta boyunca, haftada 6 gün, günlük 20 dakika 1,5 mhz sinüs dalgalı, 1 khz frekans aralığında, yoğunluğu 30 mw/cm2 (Exogen, Smith&Nephew, Memphis, ABD) uygulandı. 8 hafta sonunda çalışma ve kontrol grubundaki tavşanlar sakrifiye edildi ve femurları eksize edildi. Alınan femurlar histolojik ve radyolojik olarak incelendi. Histolojik incelemede, Santoni ve ark. ile Huo ve ark. nın tarifledikleri skorlama yöntemi kombine edilerek kullanıldı. Radyolojik incelemede ise Taira ve arkadaşlarının skorlamasından faydalanıldı. İstatistiksel önem düzeyi 0,05 alındı. Bulgular: Histolojik incelemede, çalışma grubunda kortikal köprüleme, kallus boyutu ve kallus tipi açısından, kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar elde edildi (p<0,05). Osteoblast/osteoklast devamlılığı, greft vaskülaritesi ve greft üzerinde canlı hücre varlığı yönünden her iki grupta istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadı (p>0,05). Radyolojik incelemede, çalışma grubunda, kontrol grubuna göre istatiksel olarak anlamlı farklılıklar saptandı (p<0,05). Sonuçlar: DYKU nun kırık iyileşmesi üzerine etkinliği literatürde birçok çalışma ile gösterilmiştir. DYKU nın allogreftler (özellikle tümör cerrahisinde sıkça kullanılan taze donmuş masif allogreftler) üzerinde etkinliği açısından literatürde çalışma sayısı azdır. Çalışmamızda DYKU nın taze donmuş masif allogreft uygulanmış tavşan femurlarında osteointegrasyonu arttırdığı sonucuna varılmıştır. DYKU ile taze donmuş masif allogreft uygulanan ve kaynama gecikmesi veya kaynamama yaşayan olgularda klinik kullanımda başarılı sonuçlar elde edilebilir. Ancak, allogreft osteointegrasyonu etkinliği ve bu etkiyi hangi mekanizma ile sağladığını bulmak için daha fazla in vitro ve hayvan çalışmasına ihtiyaç vardır. Anahtar sözcükler: Düşük yoğunluklu kesikli ultrason, masif kemik allogrefti, osteointegrasyon VII

9 ABSTRACT Histopathological Evaluation of the Effects with Low-Intensity Pulsed Ultrasound to Allograft Osteointegration on Massive Fresh Frozen Femur Allograft Applied Rabbits Objectives: We aimed to show the effects of low-intensity pulsed ultrasound to allograft osteointegration on fresh-frozen massive femoral allografts applied rabbit model. Material and Methods: In our study, twent four skeletally-mature New Zealand rabbits were used that the weights were among 2750 to 3250 g. They devided three groups equally. The first group are the source of rabbit femoral allografts group and the second group of LIPUS study group that will be applied, and group 3 was planned as a control group. Totally, sixteen femoral allografts were taken from both limbs of the first group of eight rabbits. Taken femoral allografts were stored in sterile packs for 4 weeks at a temperature of -80 degrees. After 4 weeks allografts were placed instead of the defects that created on femur of rabbits in both study and control groups. The allografts were fixed with two kirschner wires as intramedullary. LIPUS was applied 20 minutes per day, 6 days a week, during 8 weeks to the study group. After 8 weeks, study and rabbits were sacrificed in both study and control group, and than femurs were excised. Taira et al scoring was utilized for radiological examination. Statistical significance levels were Results: On histological examination, the study group in terms of cortical bridging callus size and type of callus achieved a statistically significant difference compared to control group (p <0.05). Osteoblast / osteoclast continuum, graft vasculature and presence of live cells on the graft for the both groups was not statistically significant difference (p> 0.05). Radiological examination of the study group, showed statistically significant difference compared to control group (p <0.05) Conclusion: In the literatüre, activity on fracture healing of LIPUS has been shown in many studies. The number of studies of effectiveness for allograft (especially fresh frozen allografts that used in solid tumors surgery frequently) is less in the literature. In our study concluded that LIPUS increase the osteointegration of fresh-frozen massive allograft on rabbit femur model. With LIPUS that may be obtained successful for clinical use to patient who applied massive fresh-frozen allograft results delayed union or nonunion. However, to find the effectiveness of allograft osteointegration and this effect provides by which the mechanism that is needed more in vitro and animal studies. Key Words: Low intensity pulsed ultrasound, massive bone allograft, osteointegration VIII

10 1.GİRİŞ Kemik tümörlerinin çıkartılması sonrası oluşan interkalar ve osteoartiküler defektlerin rekonstriksiyonunda taze donmuş masif kemik allogrefti kullanımı sık uygulanan bir yöntemdir. Kemik allogrefti uygulaması sonrası allogreftin kemiğe osteointegrasyonu uzun ve karmaşık bir süreçtir ve birçok araştırmacı tarafından araştırma konusu olmuştur. Duarte (1) nin 1983 yılında yayınlanan çalışmasından sonra düşük yoğunluklu kesikli ultrasonun kırık iyileşmesi üzerine etkilerine olan ilgi hızla artmıştır. O günden bu yana birçok in vitro ve hayvan çalışmasında düşük yoğunluklu kesikli ultrasonun uzun kemiklerin kırık iyileşmesini hızlandırdığı gösterilmiştir. Ayrıca randomize, plasebo kontrollü klinik çalışmalarda da düşük yoğunluklu kesikli ultrasonun insan (2) (3) (4) tibia, radius ve skafoid kırıklarında iyileşmeyi hızlandırdığı rapor edilmiştir. Çalışmamızda, hayvan modeli kullanarak daha önceden kırık iyileşmesine olumlu etkileri olduğu bilinen non-invaziv bir yöntem olan düşük yoğunluklu kesikli ultrasonun, taze donmuş masif allogreft uygulanmış femurların osteointegrasyonu üzerine etkilerini araştırmayı hedefledik. 1

11 2.GENEL BİLGİLER 2.1. Kemik Greftleri Kemik dokusu, vücutta en sık nakil edilen dokudur. Travma, kemik enfeksiyonları, konjenital anomaliler, kas iskelet sistemi tümör cerrahisi, revizyon artroplasti cerrahisi ve spinal cerrahi gibi rekonstrüktif işlemler sırasında oluşan kemik defektlerini tedavi etmek amacıyla kemik greftleri ve kemik yerini tutabilecek maddeler artan sıklıkla kullanılmaktadır. (5) (6) Kemik, insan vücudunda yaralanma sonrası yeniden oluşum yeteneğine sahip, şeklini ve işlevini yeniden kazanabilen bir dokudur. Hücre farklılaşması ile başlayan şekil oluşturma, farklılaşan bu hücrelerin düzenlenerek doku ve organlara dönüşmesiyle tamamlanmaktadır. İyileşme kapasitesi bu kadar yüksek olan bir yapı olmasına karşın, iyileşme ile kapatılamayacak doku kayıpları oluşabilmektedir. Bu nedenle kemik yerine kullanılabilecek biyolojik maddeler üzerine çalışmalar büyük ilgi görmektedir (7) Kemik eksikliklerinin yerine konmasında kullanılan materyallerde aranan başlıca özellikler; tek bir cerrahi işlemle elde edilebilme, antijenik özelliğinin olmaması, yeniden damarlanma, osteoindüksiyon, osteokondüksiyon ve osteogenezisi kolaylaştırabilme, hasarlı bölgede stabilite ve destek sağlama, kolayca şekil verilebilme, ısı açısından yalıtkan olma, radyolusen bir görünüm verme ve uzun süre (8) (9) saklanabilmedir. Bazı uygulamalarda bir işlev diğerinden daha önemli hale gelebilir. Çoğu zaman her iki işlev de kullanılır. Greftler tek başına biyolojik hareketlilik göstermezler. Sinyallerine cevap verecek hücrelere ve bazen kan desteği için çevre dokulara ihtiyaç duyar. Greftin konduğu yerin mekanik özellikleri de önemlidir. Kemik greftleri mekanik yük altında yeniden şekillenirler. Yetersiz veya aşırı yüklerin olumsuz etkileri olabilir. Kemik greftlerinin sağlam kemik doku ile birleşmesi karmaşık bir prosedür (9) (10) olup birçok faktör, inkorporasyon hızını ve tamamlanma süresini etkiler. 2

12 2.2. Kemik Greftlerinin Sınıflandırılması Kemik greftleri, otogreft, allogreft, ksenogreft 3 ana başlık altında sınıflandırılabilir. Allogreft ya da allojenik greft aynı türden fakat genetik olarak farklı iki birey arasında yapılan doku transferidir. Ksenogreft ise, bir türden farklı bir türe yapılan doku naklidir Otojen Kemik Greftleri Aynı bireyde bir yerden başka bir sahaya nakledilen grefte otogreft denir. Otolog ya da otojen greft olarak da isimlendirilebilir. Osteojenik etkiye sahip tek greft türüdür. (11) Osteojenik hücreler bulundurması ve immünolojik reaksiyona sebep olmamasıyla en avantajlı greft materyali olarak gösterilmektedirler. Bu nedenle greftlemede altın standart olarak kabul edilir. Ancak verici bölgede ikinci bir operasyona ihtiyaç olması, uzun süreli postoperatif ağrı ve hareket kısıtlılığı görülebilmesi ve bakım süresinin uzaması bu grubun dezavantajlarıdır. (11) (12) Otojen kemik greftleri de kendi arasında kansellöz, kortikal ve vasküler olmak üzere 3 gruba ayrılırlar Kansellöz Otojen Kemik Greftleri Otolog kansellöz kemik greftleri halen spinal füzyon, kemik boşluklarının doldurulması ve kırık tedavisinde kemik iyileşmesini sağlayan en etkili greft materyali olarak bilinir. Otojen kansellöz kemik içinde osteojenik kemik ve kemik iliği hücreleri, osteokondüktif kollajen ve mineral matriksi, matriks proteinleri ve osteoindüktif matriks proteinleri nakledilir. Burwell (13) 1960'lı yıllarda yaptığı çalısmalarda, otogreft uygulaması sonrası gelişen yeni kemik dokusunda primitif osteojenik hücrelerin nakil sonrası hayatta kalarak ileri dönemde osteoblastlara dönüştüğünü göstermiştir. Transplante kemikten indüktif proteinler ve büyüme faktörleri salınır. Kemik şekillendirici proteinlerin (BMP) salınım süresi 2 hafta ile 6 ay arasında değişir ve 6. haftada pik yapar. (14) İliak kanattan, Gerdy tüberkülünden, radius distal ucundan ve tibia distalinden otojen kansellöz kemik grefti alınabilir. (15) Bu greftlerin alınaması sırasında verici alana ait morbiditelerle sık karşılaşılmaktadır. (16) (17) (18) (19) Bu greftlerin, bir diğer dezavantajı, mekanik desteği sağlayamamalarıdır. Bunu engelleyebilemek için, kortikokansellöz kemik greftleri de kullanılabilmektedir. 3

13 Kortikal Otojen Kemik Greftleri Kortikal kemik greftleri, otojen kansellöz kemik greftlerine göre biyolojik uyum olarak daha az başarılıdır. Kortikal kemiğin porozitesinin az olması nedeniyle damarsal yapıların greftin içine doğru ilerlemesi zor ve yavaştır. Kortikal kemik, trabeküler kemiğe göre daha az sayıda osteoblastik progenitor hücre içerir. Kortikal kemikteki hücreler, oksijen diffüzyonu ve besin aktarımının az olması nedeniyle nakledilmeye daha az dirençlidir. (16) Kortikal kemik greftlerinin başlıca avantajları; mekanik olarak dayanıklı olmaları ve büyük kemik kayıplarının doldurulmasında miktar olarak yeterli olmalarıdır. 5-6 cm'in üzeri kemik kayıplarında otolog kortikal kemik greftleri iyi seçenektir. (16) Ancak 12 cm'nin üzeri kemik kayıplarında, damarlı olmayan greftlerin başarısız olma oranının %25-50 olması nedeniyle, damarlı greftler tercih edilir. (15) Kortikal greftlerin periostunda osteojenik potansiyeli olan az sayıda hücre canlı kalabilmiş olsa da greftteki osteositlerin çoğunluğu nakil sonrasında ölür ve kalan matriks, alıcı sahadan gelen ve osteojenik özellikleri olan hücrelerin üzerine yerleşebilecekleri bir cansız iskelet görevi görür. Nekrotik trabeküllerden oluşan iskeletin üzerine yeni kemik oluşumu öncesinde nekrotik osteonların resorbsiyonuna ihtiyaç duyarlar. Bu da kortikal greftte porozitenin artmasına ve torsiyonel dayanıklılığın azalmasına yol açar. Sonuçta, yeniden damarlanma ve onarım için oluşan kortikal porozite, özellikle büyük kortikal greftlerde görülen greft kırılması, kaynama gecikmesi ya da kaynamama sorunlarının görülmesindeki en önemli nedenlerdendir. (21) Kortikal greftler baslangıçta yapısal dayanıklılığa sahiptirler. Fakat 6 ile 18 ay arasında süren yeniden damarlanma ve yeniden yapılanma evrelerinde gücünün yaklaşık üçte birini kaybeder. Zaman içinde normal yapısına yaklaşarak yaklaşık 2 yılda normal kortikal kemiğin gücüne ulaşır. Yine de greftin içinde yer yer rezorbe olmamış canlı olamayan kemik adacıkları varlığını sürdürür. (22) Vaskülerize Otojen Kemik Greftleri Mikrocerrahi tekniklerinin ilerlemesi ile damarlı otogreftler sık kullanılmaya başlanmıştır. Transplantasyon sırasında hem arter hem de veni anastomoz edildiğinde, osteositlerin yaklaşık %90'ı hayatta kalır ve inkorporasyon ve kaynama için kemiğin osteoklastik rezorbsiyonu görülmez. Damarlı olmayan otogreftlerdeki gibi rezorbsiyon ve ardından osteokondüksiyon ve remodelasyon izlenmez ve bundan dolayı damarlı 4

14 olmayan otogreftlere göre ilk 6 haftalık dönemde daha dayanıklıdırlar. (23) Bu greftler, yapısal bütünlüklerini kaybetmeden inkorpore olur ve nakledildikleri alanın mekanik özellikleri ve Wolf kanunları doğrultusunda hipertrofiye olurlar. En sık tercih edilen kemik fibuladır Allogreftler Allojenik greftler ya da diğer adıyla allogreftler, aynı türden fakat farklı genotipe sahip farklı bireylerden elde edilen greft materyalleridir. En kullanışlı allogreft kaynaklarından biri kalça replasmanı yapılan kişilerden elde edilebilecek femur başıdır. Diğer kemik kaynakları ise multi-organ vericileri ve post-mortem vericilerdir. (6) Oda sıcaklığında bulunan ve 12 saatten daha kısa süre önce ölüm gerçekleşen vericilerden ya da 4 C sıcaklıkta saklanan 24 saatten daha kısa süre önce ölüm gerçekleşen vericilerden alınan allogreftler steril cerrahi teknikle alınmış olmak koşulu ile ek bir sterilizasyon gerektirmez. Buna karşın ölümün 24 saatten daha kısa süre önce gerçekleştiği, ancak steril tekniklerle alınmayan allogreftler için etilen oksit ya da gama radyasyonla sterilizasyon gerekir. (25) Greft materyalinin sterilitesinden emin olmak için; vericinin uygun bir biçimde taranması, greftin steril koşullarda alınması ve işlemden geçirilmesi, son üründe sıkı bir kalite kontrol testi uygulanması gerekir. Aseptik işlemler doku kontaminasyonu riskini tümüyle ortadan kaldırmaz. Mikrobiyolojik güvenliği artırmak için greft materyali gama radyasyon uygulanarak sterilize edilmelidir. Kırk kgy den fazla radyasyon dokunun biyomekanik ve biyolojik özelliklerini bozar. Radyasyonun dozu konusunda tam bir uzlaşma olmamakla birlikte kgy radyasyon dozu uygun görülmektedir. (26) (27) İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) için bu doz yeterli olmayıp, ek taramalar ve inaktive edici işlemler gereklidir. Allogreft kullanımının en önemli avantajı donör alan gereksinimini ortadan kaldırmasıdır. Allogreftler, kadavralardan taze(fresh), taze donmuş(fresh-frozen), dondurarak kurutulmuş(freeze-dried) olarak ya da demineralize edilerek hazırlanabilir. (28) (29) Greftlere gösterilecek olası immün yanıt, greftin hazırlanmasından sonra kalan antijenin sayısı ve tipine bağlıdır. Allogreftler 4 ana grupta sınıflandırılabilir; 5

15 Taze Allogreftler Taze allogreftler,, herhangi bir işleme maruz bırakılmadan direkt olarak vericiden alıcıya nakledilirler. Bu tür allogreftler aşırı immünolojik yanıt gösterir. Tıbbi kullanımları sınırlıdır Taze Donmuş Allogreftler Taze donmuş greft yönteminde greft, vericinin ölümündenn 12 saat içerisinde alınıp antibiyotikli solüsyonda yıkandıktan sonra 80 dondurulur. Bu greftler taze allogreftlere oranla daha düşük immünolojik yanıt gösterirler. g Kemik morfojenik proteinleri üzerlerinde korunur. (30)) Ayrıca, taze donmuş allogreftlerde mekanikk kuvvet korunur. Daha az kırılgan olmaları nedeniyle, masif allogreft ile rekonstriksiyon planlanırken tercih edilir (Şekil 1). Özellikle, tümör cerrahisinde interkalar veya osteokondral allogreft uygulamalar rında kullanılır. (31) -80 C de saklandığında raf r ömrü 5 yıldır. (25) Bununla birlikte; saklanmaları ve taşınmaları esnasında soğuk zincir gerekmesi, bakteriyel-viral enfeksiyon riski ve yüksek maliyeti m (elde etme ve saklama koşulları nedeniyle) dondurulup kurutulmuş allogreftlere göree dezavantajlarıdır. Vericiden alıcıya HIV bulaşma riski 2 milyonda 1 dir. (32) Şekil 1: Taze donmuş proksimal humerus osteoartiküler allogrefti Donmuşş Kurutulmuş Allogreftler Dondurarak kurutulan greftler liyofilizasyon adı verilen v işlemden geçirilir. Greft antibiyotikli solüsyon ile yıkandıktan sonra 80 C de dondurulur. Bir vakum yöntemi uygulanarak su içeriği %5 altına indirilir. Dondurarak kurutulan greftler oda sıcaklığında saklanabilir. Raf ömrü yaklaşık beş yıldır. (25)) Dondurarak kurutma yöntemi 6

16 ile hazırlanan greftlerde mekanik özelliklerde azalma görülür. Bunlarda eğilme ve torsiyonel kuvvet sırasıyla %105 ve %60 azalırken kompresif kuvvet korunur. (25) Kemik morfojenik protein içermezler. Ancak, taze donmuş allogreftlere oranla, daha az immunojenik, daha osteokondüktifler. Sıkıştırılabilmeleri daha hızlıdır bu yüzden cerrahi sırasında avantaj sağlar (30) (Şekil 2). Vericiden alıcıya HIV bulaşma riski 2.8 milyarda 1 dir. (32) Şekil 2: Donmuş kurutulmuş allogretfler Demineralize Kemik Matriksi Demineralize kemik matriksi (DKM), osteokondüktif ve farklı derecelerde osteoindüktif bir materyal olarak kemik kayıplarını ve boşluklan doldurmak için kullanılır. DKM hızlı bir şekilde yeniden damarlanır ve aynı zamanda otolog kemik iliği için iyi bir taşıyıcıdır. Demineralize kemik matriksin en uygun kullanım alanları (6) (25) (33) kaynama gecikmesi ve kaynama yokluğudur. Urist ve Strates (34) tarafından tarif edilen ve daha sonra Reddi ve Huggins (35) tarafından geliştirilen standardize edilmiş yöntemle DKM elde edilir. Bu yöntemde allojen kemik μm partikül büyüklüğüne erişene kadar ezilir ve ardından üç saat 0,5 meq/gr'da HCL de demineralize edilir. Kalan, steril su, etanol ve etil eter ile yıkanır.(2-21) DKM elde etme aşamalarına göre (demineralizasyon zamanı, asit uygulaması, ısı, yağdan arındıncı ajan uygulamaları ve gama ışınlan veya etilen oksit ile sterilizasyon) doku bankalan ve firmalar arasında farklılıklar bulunur. (25) Demineralize kemik matriksinin biyolojik aktivitesi, ekstrasellüler matrikste bulunan proteinler ve büyüme faktörleri ile olur. Demineralize kortikal kemik; kollajen, BMP gibi proteinler, glikoprotein ve proteoglikanları içerir. Osteoindüksiyonun 7

17 görülebilmesi için BMP, taşıyıcı (sıklıkla kollajen tip I) ve indüklenebilecek hücre gereklidir. Demineralizee kemik matriksin en önemli üstünlüğü BMP ve kollajen tip I içermesidir. DKM'nin osteoindüktif kapasitesi; kemiğin işlenmesi, saklama sekli, sterilizasyon yöntemi ve donöre göre değişebilir. Ürün; dondurulmuş-kurutulmuş toz, ezilmiş granüller veya yongalar, jel veya macun şeklinde kullanılabilir (25) (Şekil 3). Gliserol, hyaluronik asit, kalsiyum sülfat ve jelatin ile karıştırılarak bu formlar elde edilir. Şekil 3:Demineralizee kemik matriksi a) Enjekte edilebilen formu b) Yonga crunch formu DKM bazı dezavantajlar daa taşımaktadır. Allojenn bir madde olması nedeniyle HIV (Human immunodeficiency virüs) bulaştırma riski taşır. Ancak alıcıı seçimi sırasında yapılan değerlendirmeler ve dekalsifikasyon işlemi esnasında virüsün inaktive olması sebebiyle bu risk çok düsüktür. Bugüne kadar yapılan yayınlarda demineralize kemik matriksi kullanımı sonrası HIV geçisi bildirilmemiştir Ksenogreftler Ksenogreftler, alıcı canlıdan farklı bir türde canlıdan elde edilen greft materyalleridir. Ksenojenik kemikk greftleri memeli kemiklerindenn veya mercan dış iskeletinden elde edilebilmektedir. (36) Domuz ve fare kaynaklı ksenogreftler de bulunsa da sığır kaynaklı kemik en sık kullanılan heterojen greft kaynağıdır. Ksenogreftler 1960 larda popüler hale gelmiş, ancak sığır kaynaklı kemik transplantasyonu sonrası rapor edilen bazı otoimmün hastalıklar greftin kullanımını azaltmıştır. (12) 1990 larda kemik partiküllerinin deproteinize e edilmesinin gerçekleştirilmesiyle birlikte antijenik özellikleri azaltılmış ve tekrar kullanılmaya başlanmışt tır. (37) Sonuç olarak kemiğin organik komponentinin tamamen uzaklaştırılması amaçlanmıştır. Bunun sonucu olarak 8

18 da organik kısmın osteoindüktif kabiliyeti kaybedilmiş olur ve greft osteokondüktif özellik gösterir. Otojen greftlerle kombine kullanımı önerilmesi, konak immün cevap oluşturma riski ve greft rezorbsiyon hızının yavaş olması gibi dezavantajları vardır Kemik Greftlerinin Biyolojisi ve İyileşme Mekanizması Herhangi bir kemik grefti cerrahi olarak yerleştirildiğinde, kırık kaynamasına benzer sıra ile; hematom, inflamasyon, dokunun revaskülarizasyonu (yeniden damarlanması) ve greftin lokal doku ile yer değiştirmesi ve yeniden yapılanması (remodelizasyonu) aşamalarından geçer (Şekil 4)(Tablo 1). a. b. c. Şekil 4: : Fare tibia kırığı modelinde kırık iyileşme fazları a) inflamasyon fazı b)revaskülarizasyon ve kallus oluşumu c) Remodelizasyon fazı (38) 9

19 Tablo 1. Greft iyileşme aşamaları (30) Aşamalar 1.İnflamasyon 2.Osteoblast farklılaşması 3.Osteoindüksiyon 4.Osteokondüksiyon 5.Remodelizasyon Aktivite Nekrotik debris kemotaksisi stimule eder Prekürsörler tarafından (Mezenkimal kök h.) Osteoblast aktivasyonu Kemik çatı üzerine yeni kemik oluşumu Yıllar sürer Greft materyalinin iyileşmesi, süre ve içerik bakımından greft tipine göre farklılık gösterir. Alıcı yataktaki vasküler destek ve greftteki hücrelerin sağ kalım oranı greft iyileşmesine doğrudan etki eder. Morfolojik olarak kortikal kemik, Haversian ve Volkmann kanallarının etrafındaki sıkı yapıda sirküler, paralel ve interstisyel kemik lamellalarından oluşur. Kansellöz kemik ise pöröz yapıdadır ve çubuk, plaka ve yay görünümlü trabekül denilen bir kafesle çevrili olarak izlenir. Bu yapının içinde de kemik iliği bulunur. Kansellöz kemikte alıcı yataktan hücre ve damarların ulaşabilmesi için kortikal kemiğe göre daha geniş bir yüzey alanı vardır. Vasküler desteğin greft içinde organize olması kortikal kemiğe göre % 30 daha hızlı şekilde gerçekleşir. (39) Barth (40) 1895 yılında kemik greftlerinin iyileşmesininde creeping substitution (adım adım yerdeğiştirme) tanımı kullanmıştır. Bu tanıma göre, kansellöz kemik grefti kullanıldığında, hemoraji ve enflamasyon evreleri sonrasında osteokondüktif trabeküller yeni kemik oluşumunu için çatı olarak görev yapar. Trabeküller içerisinde yeni kan damarları oluşur. Allogreftteki nekrotik kemik osteoklastlar yardımıyla rezorbe olur. Mezenkimal kök hücrelerden farklılaşan osteoblastlar allogreftteki nekrotik kemik üzerine yeni kemik oluşumu sağlar. Bu sürece creeping substitution denir. Cerrahi prosedürde kortikal kemik grefti kullanıldığında bu inkorporasyon süreci kansellöz grefttekine benzemekle beraber daha yavaş ilerlemektedir. Yüksek kemik yoğunluğu anjiogenezi kısıtlar. İlk önce osteoklastlar bu bölgeye yerleşip kortikal kemikte kanallar açarlar. Bu resorbrsiyon sürece hızlıdır ve osteliz nedeniyle greftte zayıflamaya neden olur. Bu dönemde klinik kırıklar yaşanabilir. Bu sürece reverse creeping substitution (ters adım adım yerdeğiştirme) denir. (41) Vasküler olmayan otojen veya allojen kemik greftlerinde, kemik rejenerasyonunun ilk fazı sırasında birkaç hafta boyunca greft içerisindeki transplante 10

20 edilen hücreler prolifere olurlar ve yeni osteoid oluştururlar. Greft içerisindeki hücrelerin beslenmesi ilk 3-5 gün boyunca plazmotik difüzyon ile gerçekleşir. Beşinci günden itibaren çevreleyen yumuşak doku ve kemikten, greft içine kapiller büyüme gerçekleşir. Vaskülarize olmayan kemik greftleri kansellöz, kotikokansellöz veya kortikal olabilir. Greftlerin iyileşmesi de bu greft türüne göre farklılık göstermektedir. Şekil 5: Kemik grefti inkorporasyonunu etkileyen majör faktörler (30) Kansellöz kemik greftlerinde, cerrahi travmayı takiben greft içerisinde ve çevresinde hemoraji oluşur. Dokudan ve kanın hücresel komponentlerinden çeşitli mediatörler salınır. Bu mediatörler inflamatuar hücrelerin, fagositlerin ve mezenşimal pluripotent hücrelerin kemotaksis yoluyla migrasyonunu stimule ederler. Uyarının tipine göre mezenşimal hücreler; endotelyal hücrelere, fibroblastlara ve osteoblastlara farklılaşarak ve prolifere olarak yeni kan damarlarının ve konnektif dokuların oluşmasını sağlar (Şekil 6). Greftteki ve alıcı yataktaki damarların uç uca anastomozu sonucu, greftlemeden sonraki birkaç saat içinde revaskülarizasyon oluşabilir. Kansellöz kemik greftinin revaskülarizasyonunun tamamlanması birkaç hafta içinde gerçekleşir. Kortikal kemik greftinden farklı olarak osteoklastların neden olduğu rezorbsiyon olmaksızın kemik formasyonu oluşur. Kansellöz otogreftlerdeki hücrelerin çoğunluğu 11

21 özellikle de trabeküler boşluklardaki hücreler, greftleme sonrasında ölmelerine rağmen yüzeydeki osteoblastlar hayatta kalır ve yeni kemik oluşturmaya başlarlar. Kansellöz kemik poroz yapıda olduğu için alıcı sahadaki damarlar, osteoblastlar ve osteoblast öncüleri greftte periferden merkeze doğru ilerlerler. Damarların invazyonu ile birlikte osteoblastlar ölü trabeküllerin kenarlarında dizilirler ve osteoid yapmaya başlarlar ve ölü kemiğin merkezine kadar osteoid ile kaplarlar. Daha sonra bu doku mineralize olur ve immatür kemik oluşur. Son yeniden şekillenme aşamasında yeni oluşan immatür kemik ve nekrotik kemik osteoklastlar tarafından rezorbe edilir ve olgun lameller kemik ile yer değiştirir. Bu süreç yaklaşık 6 ay ile 1 yıl arasında tamamlanır. (21) Mezenkimal hücre Pre-osteoblast Olgun Osteosit Osteosit Şekil 6: Mezenkimal kök hücrelerden osteoblast farklılaşması (42) Kortikal kemik avaskülerdir ve üzerinde çok az sayıda yaşayan hücre barındırır. Greftin başlangıç iyileşme fazı, kansellöz kemik grefti ile aynıdır. En önemli fark revaskülarizasyon derecesindedir. Kortikal kemik greftlerinde revaskülarizasyon süresi iki kat daha uzun sürer. Revaskülarizasyon yaklaşık 2 ayda tamamlanır. Bu fark 2 greft arasındaki yapısal farktan kaynaklanmaktadır. Kortikal kemikte ilk aşamada vasküler penetrasyon osteoklastik aktiviteyi takiben, önceden varolan Haversian ve Volkmann kanallarına doğru olur. Haversian kanalları rezorbsiyonla birlikte genişlerken yeni kemik apozisyonu başlar. (39) Serbest vaskülarize ve pediküllü greftler gibi internal vasküler desteğe sahip greftlerde ise, beslenememe sonucu nekrotik kemik oluşmaz ve greftin alıcı sahayla birleşmesi çok daha kısa sürede gerçekleşir. Greftin iyileşmesi, kırık iyileşmesindekine benzer şekilde gerçekleşecektir. (39) Kemik greftlerinin, 3 temel biyolojik özellikleri vardır. Bunlar; osteogenez, osteoindüksiyon ve osteokondüksiyondur. 12

22 Osteogenez Greft materyali içindeki hücresel elemanların, transplantasyon sonrasıı hayatta kalarak, nakledilen alanda yeni kemik oluşturabilmesidir. Yeni kemik dokusuu ortaya çıkabilmesi için öncelikle kemiğii meydana getirebilecek yeterli sayıda "osteojenik progenitor hücreler" ortamda bulunmalıdır. Osteojenik özelliğe sahipp tek greft materyali otojen kemiktir (43) (Tablo 2). Bunun yanında, vasküler desteğe d sahip olmayan serbest otojen greftlerin 5 gün içinde osteojenik özelliklerini kaybettiklerini, bu sonunda osteoindüktif ve osteokondüktif etkilerini devam ettirdiklerini çalışmalar da mevcuttur.. (44) sürenin belirten Tablo 2 : Otogreft ve allogreftlerin özellikler ri (30) Kemik Grefti Yapısal Osteo- Osteo- Osteogenez güçç kondüksiyon indüksiyon Otogreft Kansellöz (-) Kortikal Allogreft Kansellöz Donmuş (-) ++ + (-) Donmuş-kuru. (-) ++ + (-) Kortikal Donmuş (-)) (-) Donmuş-kuru (-)) (-) Osteogenetik açıdan en etkili greft tipi yüksek konsantrasyonda kemik hücreleri taşımasındann dolayı kansellöz kemiktir. Bu formunun kemik hücrelerinin bulunmadığı cilt altı dokusu gibi bir bölgeyee yerleştirildiğinde kemik formasyonu oluşturduğu gösterilmiştir r. (16) Osteoindüksiyon Osteoindüksiyonn öncül, farklılaşmamış, pluripotent hücrelerinn uyarılması sonucu kemik üreten hücrelerin oluşması anlamınaa gelir. Osteoindüksiyon, canlı kemikte 13

23 bulunan büyüme faktörleri aracılığıyla farklılaşmamış immatür hücrelerin osteoblastlara veya kondroblastlara dönüşerek osteogenezin gerçekleştirilmesi şeklinde gerçekleşir. Bu olay, kemik matriksinden çıkan bir veya daha fazla indüksiyon ajanının etkisi sonucu oluşur. Kemik bütünlüğünün bozulduğu durumlarda iyileşme büyük oranda osteoindüksiyon yoluyla progenitor hücreler uyarılarak gerçekleşir. Geçmişte yapılan çalışmalarda, osteoindüktif etkiyi göstermek için kas dokusu gibi heterotopik bir alanda stimulus sonucu kemik oluşumu gözlenerek indüktif potansiyel belirlenmiştir. Kemik dokusu gibi ortotopik bir alandaysa gerçekleşen olayın osteokondüksiyon veya osteoindüksiyondan hangisi olduğunun ayrımını yapmak güçtür. (45) Osteoindüksiyona dair yapılan sonraki çalışmalarda Urist ve ark. (45) çözünür bir glikoprotein olan BMP yi izole etmişlerdir. BMP nin transforme edici büyüme faktör (TGF) -β ailesine ait bir büyüme faktörü olduğunu ve indüktif bir ajan olduğunu tanımlamışlardır (Şekil 7). Ayrıca BMP nin en az 15 farklı tipinin bulunduğunu ve bunlardan BMP-2 ve BMP-7 nin önemli olduğunu göstermişlerdir. (45) Günümüzde BMP nin osteoindüktif etkili bir materyal olduğu ve kıkırdak formasyonu ve sonrasında enkondral kemikleşme oluşumu ile yeni kemik formasyonunu indüklediği kabul edilmiştir. BMP, travmayı takiben veya yeniden şekillenme süreci sırasında doğal olarak salınır ve osteoindüktif ajan olarak görev yapar. (46) Çoğu BMP (BMP3 hariç) Pluripotent Osteoprogenitor Osteoblastik Osteosit Şekil 7: BMP nin mezenkimal kök hücrelerden osteoblast öncülleri ve osteoblast farklılaşmasına etkileri gösterilmiştir. BMP-2, 6, ve 9 osteoblast farklılaşmasında en önemli rolü oynadığı düşünülmüştür. Ancak tüm BMP ler mezenkimal kök hücrelerinen osteogenezin indüklemesinde etkinliği vardır. Bu sinyal yolunu anlamak, BMP lerin klinik uygulamalarının önünü açacaktır. (47) Osteokondüksiyon Alıcı kemikten vasküler ve perivasküler yapıların grefte ilerlemesi için greftin çatı görevi üstlenerek yüzeyinde yeni kemik oluşumunu destekleyebilmesidir. Osteokondüktif özelliğe sahip materyaller matriks oluşturarak osteogeneze rehberlik 14

24 ederler. (45) Yerleştirilen greft, direk olarak kemik oluşumuna katkı sağlamaz ancak rehberlik görevi üstlenir. Osteokondüktif materyaller cilt altı gibi ektopik alanlara yerleştirilir ise osteoindüksiyondakinden farklı olarak kemik oluşumu gerçekleşmez ve greft ya değişmeden kalır ya da rezorbe olur. (16) Osteokondüktif iyileşmeye yol açan greftlere örnek olarak alloplastik greftler ve hayvan kemiklerinin inorganik kısmından üretilen ksenogreftler gösterilebilir. (48) 2.4. Kırık İyileşmesinde Düşük Yoğunlukta Ultrason Uygulaması Ultrason, dokuların içerisinden akustik dalgalar halinde iletilen bir çeşit mekanik enerjidir. Tıp alanında kullanımı 20. yüzyılın başlarında başlamıştır. Tıpta teşhis ve tedavi amacıyla yaygın olarak kullanılmaktadır Tarihsel Gelişim Ultrasonun keşfi 1880 yılında Jacques ve Piere Curie Kardeşlerin çalışmaları sırasında bazı kristallerin belli açılardan baskıya maruz bırakıldıklarında elektrik yaydıklarını görmeleri ile gerçekleşmiştir. (49) Curie kardeşler, kristaller üzerine rezonans frekanslarında alternatif akım gönderdiklerinde maddelerin yüksek frekanslarda ses dalgaları yaydıklarını bulmuşlardır. Birinci dünya savaşının ilk yıllarında Fransız Paul Langevin bu prensibi denizaltılarda detektör amaçlı kullanmıştır. (50) Ultrasonun biyolojik etkileri ilk defa o yıllarda görülmüştür. Detektör çevresinde balıkların öldükleri ayrıca detektörü kumanda eden kişilerin ellerinde ciddi ağrılar tespit edilmiştir. Ultrasonun tıp alanında ilk kullanımı 1939 yılında Pohlman ve ark. (51) tarafından gerçekleştirilmiştir (Şekil 8). Araştırmacılar, sırt ağrısı, nevralji ve kas ağrısı çeken hastalarında ultrason uygulamışlar ve hastaların ağrılarında azalma olduğunu bildirmişlerdir. Yazarlar 800 kilohertz (khz) frekansında santimetre kareye 4 5 Watt (W) yoğunlukta olacak şekilde 10 gün boyunca günde 10 dakika ultrason uygulamışlardır. Bu doz, dokularda belli derecede ısı artışı meydana getirse de dokuda ısısal hasar oluşturmayacak düzeyde bir doz olarak kabul edilmektedir li yıllara kadar ultrason uygulaması birçok hastalığın tedavisinde kullanılmıştır. Ancak o dönemde genel kanı, kemik dokusunun ultrason enerjisinden zarar göreceği bu nedenle kemik dokunun ultrason dalgalarından uzak tutulması gerektiği yönünde idi. 15

25 Halsscheidt et al yılında alt dudağında lezyon tedavisi amaçlı ultrason uyguladıkları bir hastada alveoler kemikte osteomiyelit geliştiğini rapor etmişlerdir. (52) Şekil 8: : Pohlman ve ark. tarafından geliştirilen ultrasonik dalgalar yayabilen cihaz Ultrason uygulamasının kemik doku iyileşmesi üzerine etkilerinin incelendiği ilk çalışma 1950 yılında Maintz (53) tarafından yayınlanmıştır. Çalışma bu alanda bir dönüm noktası olma özelliği taşımaktadır; bu çalışmada ilk defa ultrasonun kemik üzerine zararlı etkileri değil de iyileştirici etkisi ortaya konmuştur. Araştırmacı, çalışmada üç aylık tavşanlarda radius kemiklerinde bilateral osteotomi yaparak deney grubundaki tavşanlara 800 khz frekansta 0,5, 1,0, 1,5 ya da 2,5 W/cm2 yoğunlukta ultrason uygulamıştır. Maintz, histolojik ve radyolojik incelemeler sonunda ultrason uygulamasının yüksek dozlarda kemikte termal hasar yarattığını düşük dozlarında periosteal alanlarda yeni kemik yapımını sağladığını bildirmiştir. (53) 1952 yılında İtalyan araştırmacılar Corradi ve Cozzolino tavşan radial kemik kırıklarında yaptıkları plasebo kontrollü çalışmada ultrason uygulamasının kırık sahasında kemik kallusun oluşumunu stimule ettiğini göstermişlerdir. (54) Bu çalışmadan yola çıkarak aynı yazarlar bir yıl sonra uygulamayı klinik olarak denemişler; 8 hastada güvenilir şekilde periosteal kallus artışı sağlandığını bildirmişlerdir. (54) Ultrasonun kemikte yarattığı ısısal zararın azaltılması için Shiro (55), ultrason yoğunluğunun azaltılması ve kesikli şekilde uygulanmasını gündeme getirmiştir. Araştırmacı, genç tavşanlarda tibia kemiklerine 0,2 W/cm2 yoğunlukta kesikli ultrason uygulamış ve deney grubundaki hayvanlarda artmış osteoblastik-kondroblastik aktivite 16

26 gözlemlediğini bildirmiştir. Shiro nun yayınından yaklaşık 20 sene sonra Dyson ve Brookes (56) ratlarda yaptıkları bilateral fibula osteotomisi sonrası, tek tarafa 500 miliwatt/cm2 yoğunlukta kesikli ultrason tedavisi uygulamışlar ve ultrason uygulanmayan tarafa göre kırık iyileşmesinde artış olduğunu göstermişlerdir. Yazarlar ultrason etkinliğinin, en çok kırık iyileşmesinin erken döneminde ortaya çıktığını bildirmişlerdir. Aynı yıl Brezilyalı iki araştırmacı Xavier ve Duarte (57), 26 adet kaynamamış ekstremite kemik kırığı hastasına daha düşük yoğunluktaki (30 mw/cm2) ultrasonu günlük 20 dakikalık süre ile uygulamışlar ve %70 oranında iyileşme sağlandığını bildirmişlerdir. Duarte (1), bu çalışmanın sonuçları ile aynı dozdaki düşük yoğunlukta kesikli ultrason (DYKU) uygulamasını tavşanlarda yaptığı fibula osteotomisi ve fibulada hazırlanan kavitedeki kemikleşmeye etkilerini histolojik ve radyolojik yöntemlerle incelemiştir. Araştırmacı DYKU tedavisinin osteotomi bölgelerinde kontrol grubuna nazaran kortikal kemikte %28 oranında artmış kemikleşme bildirmiştir. Reuter ve ark. (58) kesikli olmayan 100 mw/cm2 yoğunluğunda 2 günde bir ve tedavi günü 6 saatte bir uygulanan 2 dakikalık ultrasonun tavşan tibia osteotomisinde kırık iyileşmesini arttırdığını bildirmişlerdir. Pilla ve ark. (59) 1990 yılında plasebo kontrollü çalışmalarında 139 tavşanda tibia kemiklerinde orta kısımda osteotomi yapmışlar ve deney tarafı tibialara günde 20 dakika süren DYKU (1,5 Mhz sinüs dalgalı, 200 μsn boyunca ileti, 200 khz frekans aralığı, 30 mw/cm2 yoğunlukta) uygulamışlardır. Mekanik ve histolojik değerlendirmeler 14. günden başlayıp 28. güne kadar gerçekleştirilmiştir. Araştırmacılar DYKU uygulanan tibiaların 17. günde osteotomi yapılmamış tibiaların mekanik direncini kazandığını, kontrol tibiaların sağlam tibiaların direncini ancak 28. günde kazandığını, 28. günde iki grup arasında kemikleşme miktarı bakımından gruplar arasında anlamlı bir fark tespit edilmediğini bildirmişlerdir. Wang ve ark. (60) bundan dört yıl sonra yayınlanan makalelerinde, DYKU nun en etkin dozunun bulmak için ratlarda bilateral kapalı femur kırığı oluşturmuşlar ve deney grubundaki hayvanlara 1 khz atım aralığı frekansında, 30 mw/cm2 yoğunluğunda DYKU 0,5 ya da 1,5 MHz lik operasyon frekansında iletilmişlerdir. Araştırmacılar 21. günde uygulanan mekanik testlerde 0,5 Mhz frekansında torsiyonel sertlik (stiffness) değeri kontrol grubuna nazaran %32 lik bir artış gösterdiğini, 1,5 MHz frekansında %67 lik artış sağlandığını 17

27 rapor etmişlerdir. Araştırma sonucunda 1,5 MHz frekansındaki %67 lik artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Jingushi ve ark. (61)( kırık iyileşmesi esnasında ultrason sinyallerine karşı verilen biyolojik cevabın niteliğini araştırmışlardır. Bu amaç ilee ratlarda oluşturdukları femur kırıklarında endokondral DYKU un etkilerini ölçmüşlerdir. Araştırmacılar,, DYKU un tüm kemikleşme aşamalarında etkin olduğunu, kemik mineral içeriğinde, kemik mineral densitesinde, maksimum tork ve maksimum torsiyonel sertlik (stiffness) değerlerinde artış sağlandığını rapor etmişlerdir. Yazarlar aynı zamanda 200 μsn lik ileti genişliğinin 100 veya 400 μsn likk ileti genişliğine nazaran, ayrıca 1 khz lik atım frekansının 2 khz lik frekansa nazaran daha etkin olduğunu bildirmişlerdir yılındaki Dünya Biyomekanik Kongresindee sunulan bu rapordan sonra DYKU uygulaması için uygun atım frekansı 1 khz, atım süresi ise 2000 μsn olarak kabul edilmiştir (Şekil 9). Düşük bas notalarr Hayvanlar Tedavi &Hasar Tanısal İnfrasonikk Duyulabilir aralık Ultrasonik Şekil 9: : : Duyulabilir,, tanısal ve tedavi edici ses dalgası aralıkları DYKU uygulamasının kırık iyileşmesinin hangi döneminde etkin olduğunu anlamak için Azuma ve ark. (62) ratlarda bilateral femurr osteotomisi uygulamışlardır. Araştırmacılar, DYKU uygulama dönemlerinee göre hayvanları 4 gruba ayrılmışlar; 1. gruba 1 8 günler arası, 2. gruba 9 16 günler arası, 3. gruba günler arası ve son gruba 1 24 günler arasıı DYKU uygulanmışlar ve tüm hayvanları h 25. günde sakrifiye s etmişlerdir. Histolojik, mekanik ve radyolojik testler sonucunda tüm gruplarda kaynamanın sağlandığıı ve kontrol taraflarına göre kemikleşmede artış olduğu gözlenmiştir. Azuma et al ın bu çalışması DYKU un kırık iyileşmesinin tüm fazlarında etkin olduğunu göstermiştir. 18

28 Kemik İyileşmesindeki Etki Mekanizmaları Kırık iyileşmesinin karmaşık yapısı ve ultrasonun dokularda yarattığı çok yönlü etkilere rağmen ultrasonun canlı dokulara olan etkileri konusuna günümüzde birçok şey bilinmektedir. Ultrason enerjisinin fiziksel ve piezoelektriksel etkilerinin kombinasyonu, dokularda hücresel düzeyde yanıt yaratır Fiziksel Etkiler Ultrason dalgaları doku içerisinde ilerlerken, hücre içi ve dışı sıvılar ve hücre membranları dahil olmak üzere tüm doku komponentlerinde titreşimler yaratırlar. Örnek olarak 1,5 MHz frekansında 150 mw/cm2 yoğunluğundaki ultrason doku içerisinde 4,6 cm/sn sürat ile ilerler ve partiküllerde 4,6 nm yer değiştirmesine sebep olurlar. Partiküller saniyede 1,5 milyon kez yönlerini değiştirecek şekilde titreşirler (63). Dokularda oluşturduğu bu yüksek miktardaki titreşimler nedeni ile ultrason tedavisi dokularda bir çeşit mikro doku masajı yapar. Titreşimler sonucu dokularda meydana gelen değişiklikler ısısal ya da ısısal olmayan değişiklikler olarak sınıflandırılabilir (56). Dokularca absorbe edilen enerji miktarı ısısal artışın da miktarını belirler. Kemik iyileşmesinde ultrasonun ısısal olmayan (non-termal) etkileri rol oynar. Ultrasonun yarattığı ısısal olmayan etkiler arasında stabil kavitasyon, mikro düzeyde akıcılık (microstreaming), akustik akıcılık (acustic streaming) ve hücre membranına doğrudan etkiler olarak sayılabilir. Stabil kavitasyon, ultrason enerjisine bağlı sıvılar içerisinde gaz kabarcıklarının oluşmasını ifade eder. Bu kabarcıklar dalgaların tipine göre farklı büyüklükte ve şekilde olabilirler ve titreşimler ile beraber sıvılarda lokal hareketlerin oluşmasına sebep olur. Sıvılar içerisindeki bu hareketlenmelere microstreaming adı verilir (56). Haar ve ark. (64) 1,5 MHz frekansında 150 mw/cm2 yoğunluğundaki ultrasonun domuzların vücut sıvılarında 10μm den daha büyük kabarcıkların oluşturduğunu göstermişlerdir. Akustik akıcılık, ultrasonik alandaki kinetik enerjinin sıvılar tarafından absorbe edilmesini ve sıvıların dalgasal olarak hareket etmesini ifade eder. Bu mekanizma, hücre içindeki ve dışındaki iyon ve metabolitlerin hareketleri ve transferlerini sağlar. Hücreler arası sıvı ve iyon akımlarındaki artışlar, hücre membranlarının geçirgenliklerinde farklılıkların meydana getirerek membranın elektrofizyolojik özelliklerinde değişikliklere neden olur. Dinno ve ark. (65) kurbağa derilerine 1 Mhz frekansında sürekli akımda ultrason uygulamışlar ve epidermisin tabakaları arasındaki 19

29 elektrik ve potansiyelinde artış, iyon iletkenliğinde % arasında artış sağladığını bildirmişlerdir. Araştırmacılar sonuç olarak ultrason uygulamasının Sodyum-Potasyum kanallarında kullanılan ATP ihtiyacını azalttığını bildirmişlerdir Piezoelektrik Etki Piezo kelimesi Yunancada baskı anlamına gelmektedir. Kemik dokusu üzerine yük uygulandığı zaman elektrik potansiyelinde artış meydana gelmekte ve bu etki de piezoelektrik etki olarak adlandırtmaktadır (66). Piezoelektrik etki, kemik yapımı ve yıkımı için düzenleyici rol oynamaktadır ve Wolf kanunlarında ifade edilen kemik üzerine gelen yüklere ve fonksiyona göre yeniden şekillenir ifadesi için açıklık getirmektedir. Ultrason uygulamasının kemikte piezoelektrik etki yarattığı ilk defa Behari ve Singh (67) tarafından dile getirilmiştir. Yazarlar in vivo olarak kemik üzerine 1.27 MHz frekansında ultrason uygulamışlar ve elektrik potansiyelde artış olduğunu bildirmişlerdir yılında Klug (68), 3 haftalık tavşan tibia kırığında 800 KHz frekansında ve 100 mw/cm2 yoğunlunda ultrason uygulamasının kallus dokusu potansiyelinde 0,9 mv luk artış sağladığını bildirmişlerdir. Ancak, ultrasonun potansiyel elektrikte meydana getirdiği bu değişiklik miktarı, kas aktivitesinin kemikte oluşturduğu 100 mv a kadar çıkan potansiyel artışı göz önüne alındığı zaman oldukça düşük bir artıştır. Bu nedenle piezoelektrik etkinin kırık iyileşmesinde oynadığı rol daha detaylı bir şekilde araştırılmalıdır Biyolojik Etki Ultrason un kırık iyileşmesinde meydana getirdiği biyolojik değişikliler, birçok in vitro ve in vivo çalışmada araştırılmıştır. Chapman ve ark. nın (69) çalışması bu çalışmaların ilk örneklerindendir yılında yayınlanan çalışmada araştırmacılar, ultrason uygulamasının rat timus hücrelerinde potasyum iyonlarının hücreden giriş ve çıkışlarını değiştirdiğini ve hücre içerisindeki iyon konsantrasyonunu azalttığını bildirmişlerdir. Ryaby ve ark. (70) kemik ve kıkırdak hücre kültürlerinde kalsiyum iyonlarının birbirleri ile bağ yapma miktarını arttırdığını ve osteoblast hücrelerinde adenilat siklaz aktivitesinde artış ve TGF-β sentezinde artış sağladığını rapor etmişlerdir. Parvizi ve ark. (71) ultrasonun 50 mw/cm2 dozunda kondrositlerde hücre içi kalsiyum salınımında ve proteoglikan sentezinde artış sağladığını bildirmişlerdir. Kobubu ve ark. (72) fare osteoblastlarında 30 mw/cm2 yoğunlunda ultrason uygulamasının prostaglandin-e2 sentezinde artış sağladığını bildirmiş ve ultrasonun 20

30 kırık iyileşmesine olan etkisinin mekanik yüklerin yarattığı stimulusa benzer olduğunu söylemişlerdir. Ito ve ark. (73) 2000 yılında yayınlanan çalışmalarında insan osteoblastik ve endotel hücrelerinden üretilen hücre kültüründe ultrason uygulamasının PDGF salınımında artış sağladığını bildirmişlerdir. Hücresel düzeyde ultrason uygulaması ile meydana gelen bu değişikliklerin görülmesi, genlerin kırık iyileşmesi üzerine olan etkilerinin araştırıldığı çalışmaların yapılmasını gündeme getirmiştir. Wu ve ark. (74) bu hipotezden yola çıkarak kondrosit kültürüne ultrason uygulamışlar ve uygulamanın agregan genlerin kodlamasın artış sağladığını bildirmişlerdir. Agregan genler kırık iyileşmesinin erken döneminde faaliyet gösterirler ve kollajen sentezinde kritik rol oynarlar. Parvizi ve ark nın (71) çalışması ile birlikte bu sonuçlar DYKU nun endokondral kemikleşmeyi arttırıcı etkisini açıklamaktadır. Yang ve ark. (75) ultrason uygulaması ile agregan genlerin ilgisini in vivo çalışmalarında araştırmışlardır. Yazarlar ratlarda bilateral femur kırığı oluşturmuşlar ve deney grubundaki hayvanlara 50 ya da 100 mw/cm2 yoğunluğunda kesikli ultrason uygulamışlardır. Araştırmacılar uygulama sonucu kemiklerin mekanik dirençleri artarken 7. günde agregan genlerin anlamlı şekilde arttığın bildirmişlerdir. Her hayvanın kendisinin kontrolü olması bakımından çalışma önemli bir çalışmadır ve yazarlar agregan genler ile iyileşmekte olan kemiklerin mekanik özellikleri arasındaki ilişkiyi ortaya çıkartmışlardır. Hücresel mekanizmalarda meydana gelen değişikliler ve kırık iyileşmesinin erken dönemde rol oynayan genlerdeki artışların dışında DYKU damarsal yapıların şekillenmesini de etkilemektedir. Rawool ve ark. (76) köpek ulna kemiklerinde yapılan osteotomi sonrası 10 gün boyunca uygulanan DYKU nun, sahada vaskularite artışı sağladığını bildirmişlerdir. Yazarlar çalışmaya başlarken kan akımındaki artışın sadece DYKU uygulaması esnasında olacağını öne sürerken, uygulama bitirildikten sonra deney grubunda kan akımındaki artışın kontrol grubuna nazaran fazla olmasının gözlenmesi üzerine DYKU uygulamasının damarlanmada artış sağladığını belirtmişlerdir. Damarlanmadaki artış kırık iyileşmesinin hızlanması için kritik değer taşımaktadır. Bilindiği üzere kırık iyileşmesinin inflamatuar fazında temel olarak yaralanmış bölgeye kan akımının ulaşması sağlanmaktadır. DYKU uygulaması kapillerdeki genişlemeyi sağlaması ve yeni damarların oluşumunu hızlandırması ile kırık iyileşmesinin erken dönemlerinde etkinlik göstermektedir. 21

31 Ultrasonun yukarıda anlatılan etkileri genellikle endokondral kemikleşmeyi hızlandırıcı etkilerdir. Genel kanı olarak DYKU uygulamasının endokondral kemikleşmeyi hızlandırdığı düşünülmektedir. Bununla birlikte, Kristiansen ve ark. (3) klinik çalışmalarında DYKU nun intramembranöz yolla iyileştiği düşünülen radius kemiklerinde de kırıkların iyileşmesini hızlandırdığını göstermişlerdir. Bu nedenle DYKU nun intramembranöz kemikleşmede de etkinliğinin olduğu varsayılmaktadır. Bu varsayım çene-yüz kemikleri iyileşmesinde hem endokondral hem de intramembranöz kemikleşmenin rol oynaması nedeni ile önemlidir. Sonuç olarak, ultrasonun kırık iyileşmesi mekanizmasında yarattığı fiziksel, piezoelektrik ve biyolojik etkiler rol oynamaktadır ve bu süreç iyileşmenin farklı fazlarında farklı hücre tiplerini ilgilendiren çok basamaklı bir olaylar dizisi şeklinde gerçekleşmektedir. 22

32 3.GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Gereç ve Yöntem Çalışma için gerekli izinler T.C. Çukurova Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulundan alındı. Çalışma, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Deneysel Tıp Araştırma ve Uygulama Merkezinde (ÇÜTF- DETAUM) yapıldı. Çalışmamızda 24 adet gr ağırlığında (Şekil 10) yetişkin Yeni Zellanda cinsi tavşan kullanıldı. Sekizer tavşanlık 3 grup oluşturuldu. Birinci grup femur allogrefti kaynağı olan tavşan grubu, ikinci grup DYKU uygulanacak olan çalışma grubu, 3. grup ise kontrol grubu olarak düzenlendi. Şekil 10: Tavşanların ağırlıklarının ölçülmesi 3.2. Femur Allogreftlerinin Alınması ve Saklanması Birinci gruptaki 8 adet tavşan her iki ekstremitesinden toplam 16 adet femur allogrefti elde edilmesi planlandı. Bunun için tavşanlara, operasyon önce profilaksi 23

33 amaçlı İV 50 mg/kg tek doz sefazolin sodyum (Sefazol, Mustafa Nevzat İlaç Sanayi, İstanbul) uygulandı. Ketamin hidroklorür (40 mg/kg, İM, Ketalar, Eczacıbaşı İlaç Sanayi ve Ticaret A.S. İstanbul) ve ksilazin hidroklorür (5 mg/kg, İM, Rompun, Bayer Türk Kimya Sanayi, İstanbul) verilerek genel anestezi uygulandı. Anestezi sonrası denekler ameliyat masasına uygun pozisyonda yatırıldı. Operasyon sahası traş edildikten sonra, povidon iyot scrub (Poviidoex Koçak Farma İlaç ve Kimya Sanayi, İstanbul) solüsyonu ile temizlendi. %10 luk povidon iyot (Batticon Adeka İlaç Sanayi ve Ticaret A.Ş. Samsun) ile solüsyonu ile boyandı. Tavşanın ilk önce sağ uyluk lateralden longutudinal insizyon ile girildi. Cilt altı ve tensor fasia lata geçildi. Vastus lateralis kası ile lateral intermüsküler septum arasından geçilerek femura ulaşıldı (Şekil 11). Periost sıyrıldıktan sonra femur, proksimalde subtrokanterik bölgeden ve distalde suprakondiler bölgeden bataryalı mini kemik testeresi yardımıyla osteotomize edilerek serbestleştirildi (Şekil 12). Alınan femur grefti, üzerinde hiç yumuşak doku kalmayacak şekilde debride edildikten sonra antibiyotikli solüsyon (100 cc serum fizyolojik içine 5 gram ampsilin, 200 mg gentamisin sülfat) yıkandı. Hızlıca steril poşetin içine yerleştirildikten sonra yine daha önceden steril edilmiş plastik şişeye yerleştirildi. Plastik şişe tekrar steril poşete koyuldu (Şekil 13). Daha sonra -80 derecede saklanmak üzere uygun kutuda buzdolabına koyuldu. Ekstremitedeki insizyon alanı yıkama yapıldıktan sonra, uygun şekilde kapatıldı. Aynı işlemler sol ekstremiteden femur allogrefti alınırken de uygulandı. Böylelikle, 8 tavşandan, 16 adet femur allogrefti elde edilmiş oldu. Operasyon sonrası, allogreft alınan tavşanlara intrakardiyak yüksek doz ( mg/kg) tiopental sodyum (Pentothal sodium, Abbott, İtalya) verilerek ötenazi uygulandı. Lateral intermusküler septum Vastus lateralis Şekil 11: Femura lateralden yaklaşım. Vastus lateralis kası ile intermuskuler septum arasından girilir. 24

34 a b c d Şekil 12: : a) Verici tavşanın hazırlanması b) ) Tavşanın sol uyluğuna yapılacak insizyonn c) Vastus lateralis ve intermusküler septum arasından femura ulaşılması d) Femurun testere yardımıyla y osteotomize edilmesi 25

35 a b c d e Şekil 13: a) Alınan femur greftinin boyunun ölçülmesi b) Greftin saklandığı materyaller c) Greftin steril poşete yerleştirilmesi d) Steril plastik şişeye yerleştirme e) Plastik şişenin steril poşete koyulması 3.3. Allogretlerin Çalışma ve Kontrol Grubuna Nakli Alınan femur allogreftleri steril paketlerde -80 derece sıcaklıktaki dolapta (DF 590, Nüve ) 4 hafta saklandı. 4 hafta sonunda allogreftler, nakil öncesi sıcak serum fizyolojik içerisinde bekletilerek buzun çözülmesi sağlandı. Çalışma ve kontrol grubundaki tavşanlar standart asepsi tekniği ile genel anestezi altında hazırlandı. Tavşanların sağ femurlarına daha önce tariflenen cerrahi teknik ile ulaşıldı. Femur orta cisimlerinde, bataryalı kemik testeresi yardımıyla osteotomi yapılarak yaklaşık 15 mm kemik defekti oluşuturuldu. Oluşturulan defekt alanlarına, proksimal ve distalde boyutu uyumlu olacak şekilde taze donmuş allogreft hazırlanarak yerleştirildi ve 2 adet 1,5 mm eninde kirshner teli ile intramedüller olarak tespit edildi (Şekil 14, 15). Daha sonra yıkama yapılarak, katmanlar emilebilir sütürler yardımıyla usulüne uygun kapatıldı. Böylece toplamda 16 adet tavşana allogreft uygulanmış oldu. 26

36 Şekil 14: Femur allogreftlerinin yerleştirilmesi Şekil 15: Femur allogreftlerinin radyolojik görüntüsü 27

37 3.4. Çalışma Grubuna Düşük Yoğunluklu Kesikli Ultrason Uygulaması Çalışma ve kontrol grubundaki tavşanlar, çalışma süresince, 22 santigrad derece ( C) sıcaklıkta, 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık ortam sağlanarak, her kafeste tek tavşan kalacak şekilde takip edildiler. Tavşanlara limitsiz musluk suyu ve standart kemirgen yemi verildi. Her iki gruba, ilk üç gün boyunca analjezi amaçlı oral ketoprofenid (2 mg/kg/gün, Profenid Sanofi Aventis) ve oral ampisilin (25 mg/kg/gün, Ampisina, Mustafa Nevzat), metranidazol (30 mg/kg/gün, Flagyl, Sanofi Aventis) proflaksisi verildi. Çalışma grubundaki tavşanlar için, özel kutular hazırlandı (Şekil 16). Sağ uylukta nakil yapılan alanlara denk gelmek üzere kutulara oval delikler açıldı. Çalışma grubundaki tavşanlar, ameliyattan 2 gün sonra başlamak üzere hazırlanan kutulara yerleştirildi ve 8 hafta boyunca haftada 6 gün, günlük 20 dakika düşük yoğunluklu kesikli ultrason (200 μsn aralıklarla 1.5 mhz sinüs dalgalı, atım frekansı 1 khz, yoğunluğu 30 mw/cm2) (Exogen, Smith&Nephew, Memphis, TN, ABD) uygulandı. Bu süreçte, kontrol grubuna herhangi bir işlem uygulanmadı. Takiplerde çalışma grubunda 1 tavşanda ameliyat sonrası 5. günde proksimal tel giriş yerinde pürülan akıntı olması üzerine anestezi altında debritman uygulandı. Debritman sonrası 2. gün ultrason uygulamasına devam edildi. Ayrıca kontrol grubunda 1 tavşanda ameliyat sonrası 15. gün proksimal tel giriş yerinde pürülan akıntı meydana geldi. Ona da anestezi altında debritman uygulandı. Her iki tavşana da debritman sonrası 3 gün oral sefazolin verildi. Takiplerinde enfeksiyon nüksü gözlenmedi. Şekil 16: Çalışma grubundaki tavşanlara DYKU uygulaması 28