İMMATÜR SIĞIR OOSİTLERİNİN VİTRİFİKASYON TEKNİĞİ ile ETİLEN GLİKOL ve DMSO KULLANARAK PAYETLERDE DONDURULMASI

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ İMMATÜR SIĞIR OOSİTLERİNİN VİTRİFİKASYON TEKNİĞİ ile ETİLEN GLİKOL ve DMSO KULLANARAK PAYETLERDE DONDURULMASI Yunus ÇETİN DOĞUM VE JİNEKOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Ayhan BAŞTAN 2004-ANKARA

2 iii ÖNSÖZ Giderek gelişen ve yeni boyutlar kazanan, yardımcı üreme tekniklerine paralel olarak, memeli oositlerini in vitro ortamda uzun süreli saklama ihtiyacı ortaya çıkmıştır. Bu ihtiyaca cevap vermek amacıyla, değişik tekniklerle oositler dondurularak saklanmaya çalışılmıştır. Bu çalışmada, özellikle oosit dondurmada ümit verici sonuçlar veren ve halen geliştirilmekte olan vitrifikasyon tekniği kullanılmıştır. Sunulan çalışmayla, gelecek vaat eden ancak zorluklarla karşılaşılan, oosit dondurma konusuna küçük de olsa bir katkı yapıldığı inancındayız. Doktoramın ve tez çalışmamın her aşamasında yardımlarını esirgemeyen danışman hocam Prof. Dr. Ayhan BAŞTAN a, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Doğum ve Jinekoloji Anabilim Dalı nın öğretim üyesi ve yardımcılarına, malzeme teminindeki yardımlarından dolayı Prof. Dr. Selim ASLAN a, oositlerin boyanması konusundaki katkılarından ötürü Prof. Dr. Hikmet ALTUNAY a, ovaryumların toplanması ve laboratuvar çalışmasındaki işbirliği nedeniyle çalışma arkadaşım Araş. Gör. H. Ceyhun MACUN a, medyumların hazırlanmasındaki desteğinden dolayı meslektaşım Dr. Musa ALKAN a, beni yetiştirerek bugünlere gelmemi sağlayan aileme ve bana her koşulda destek olan eşime teşekkürü bir borç bilirim.

3 iv İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay...ii Önsöz...iii İçindekiler...iv Simgeler ve Kısaltmalar...vi Şekiller...viii Çizelgeler...viii 1. GİRİŞ Tarihçe Oosit Dondurmanın Önemi Dondurmada Kullanılan Malzemeler Oosit Dondurmada Kullanılan Taşıyıcı Kaplar Dondurmada Kullanılan Medyum Katkı Maddeleri Oosit Dondurmada Kullanılan Kryoprotektan Özellikteki Maddeler İn Vitro Oosit Toplama Teknikleri Aspirasyon Tekniği Follikül Diseksiyonu Ovaryum Dilimleme Tekniği İn Vitro Oosit Maturasyonu Oositlerde Maturasyon Kriterleri İmmatür ve Matür Oositlerin Kryobiyolojik Özellikleri Oositlerde Soğuğa Karşı Duyarlılık Oositlerde Dondurma-Çözdürme Sonucu Oluşan Hasarlar Oosit Dondurma Teknikleri Klasik Yavaş Dondurma Ultra Hızlı Dondurma ve Vitrifikasyon Oosit Boyama Teknikleri GEREÇ ve YÖNTEM Ovaryumların Toplanması ve Taşınması Follikül Aspirasyonu ve Oositlerin Seleksiyonu Deney Düzeneği...32

4 v Medyumların Hazırlanması Vitrifikasyon Medyumları Çözdürme Medyumları Maturasyon Medyumu Fiksasyon Solüsyonları Oositlerin Vitrifikasyonu Payetlerin Çözdürülmesi İn Vitro Maturasyon Maturasyon Kriterlerinin Değerlendirilmesi Kumulus Ekspansiyonunun Değerlendirilmesi Kutup Hücresinin Belirlenmesi Oositlerin Fiksasyonu ve Boyanması İstatistiksel Analiz BULGULAR Vitrifikasyon ve Çözdürme Sonrası Elde Edilen Bulgular Maturasyon Sonrası Bulgular Çekirdek Maturasyonu Bulguları TARTIŞMA SONUÇ...56 ÖZET...58 SUMMARY...60 KAYNAKLAR...62

5 vi SİMGELER VE KISALTMALAR % ± C µg µm < > ark. ATP BCB BSA cfda cm CO 2 dk DMSO DNA DPBS EG EGTA FCS FDA Fiks1 Fiks2 G GL gr GV GVBD Yüzde Standart sapma Santigrat derece Mikrogram Mikrometre Küçüktür Büyüktür Arkadaşları Adenozin trifosfat Brilliant Cresyl Blue Bovine Serum Albumin (sığır serum albumini) Carboxylfluorescein diacetate Santimetre Karbondioksit Dakika Dimetil sülfoksid Deoksiribonükleik asit Dulbecco nun PBS Etilen glikol Etilen glikol tetraasetik asit Fetal calf serum (fötal buzağı serumu) Fluorescein diacetate Fiksasyon 1 Fiksasyon 2 Gauge Gliserol Gram Germinal vezikül Germinal vezikül break down (germinal vezikülün yıkımlanması)

6 vii HEPES Hidroksietil piperazine-n-2-ethanesulfonik asit ICSI İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu IU İnternational ünite IVF İn vitro fertilization kg Kilogram KH Kutup hücresi KH- Kutup hücresi negatif KH+ Kutup hücresi pozitif KOK Kumulus oosit kompleks M Molar M I Metafaz 1 M II Metafaz 2 MDS Mikro damlacık ml Mililitre mm Milimetre mosm Miliosmolar Na Sodyum NaCl Sodyum Klorür -OH Hidroksil OPS Open Pulled Straw (Modifiye payet) PBS Fosfat tamponlu tuz solüsyonu ph Asidite değeri PROH Propilen glikol PVA Polivinil alkol s Saniye SSV Solid sürface vitrification (Katı yüzey vitrfikasyonu) TCM Tissue Culture Medium (Dokul kültür medyumu) Vit1 Vitrifikasyon 1 Vit2 Vitrfikasyon 2 ZP Zona pellusida

7 viii ŞEKİLLER Şekil 2.1. Sıvı azota atılamaya hazır bir payetin görünümü Şekil 3.1. Kumulus ekspansiyonu gösteren KOK lar (X40) ve 1. kutup hücresini atmış, matür oositler (X50) Şekil 3.2. Gruplarda maturasyon sonrası, kumulus ekspansiyonu dağılım grafiği Şekil 3.3. A) Zona kırılması sonucunda sitoplazmasını kaybetmiş bir oosit (X400), B (X200) ve C) zonası kırılan oositler (oklar) (X400) Şekil 3.4. A) Dejenere iki oosit (X50). B) Zonası hasar görmesine karşın kutup hücresini atmış oosit (X100). C) Sağlıklı matür oositler (X50) Şekil 3.5. Gruplarda maturasyon sonrası, kutup hücresi ve dejenerasyon oranları Şekil 3.6. Boyama sonrası oositlerin görünümü. A) GV aşamasında oosit (X200). B) GVBD-MI döneminde oosit kromozom yoğunlaşması (büyük ok) ve oositin etrafında kumulus hücreleri (küçük oklar) (X400). C) M II dönemindeki bir oositte maternal (ok başı) ve kutup hücresi kromozomları (büyük ok) (X400). D) Kesin olarak genetik materyali tanımlanamayan oosit (X400) ÇİZELGELER Çizelge 1.1.Soğutma veya dondurmaya ilişkin sistemlerde meydana gelen hasarlar (Shaw ve ark., 2000) Çizelge 1.2. Dondurma sırasında ortaya çıkması muhtemel hasarların karşılaştırılması (Vajta, 1999) Çizelge 3.1. Gruplarda kullanılan ovaryum ve oosit sayıları Çizelge 3.2. Gruplarda maturasyon sonrası, kumulus ekspansiyonu ve kutup hücresine ilişkin bulgular. Farklı harflere sahip satırlar istatistiki açıdan önemli derecede (p<0,001) faklıdır Çizelge 3.3. Gruplarda boyama sonrası oositlerin çekirdek maturasyonu bulguları. Farklı harflere sahip satırlar istatistiki olarak önemli derecede (p<0,001) farklıdır... 46

8 1 1. GİRİŞ İn vitro maturasyon, fertilizasyon ve kültür gibi teknolojilerin hızlı bir şekilde gelişmesi sonucu, memeli oositlerine duyulan ihtiyaç artmıştır. İstenilen zamanda oosit bulabilmenin en kolay yolu, oositlerin çok düşük sıcaklıklarda saklanmasıdır. Oositlerin dondurulması, insan hekimliğinde de büyük ilgi görmüştür ve bu konuda birçok bilim adamı çalışmalar yapmış ve de yapmaktadır. Bu ilginin en büyük sebebi, bu teknik ile oosit bankalarının kurulabilecek olmasıdır. Böylece değişik nedenlerden ötürü infertilite riski taşıyan hastaların, oositleri burada saklanabilecektir. Avusturya, Almanya, İsviçre, Danimarka ve İsveç gibi birçok Avrupa ülkesinde embriyo dondurma yasaklanmış ya da sınırlandırılmıştır (Cha ve ark., 2000; Bahadur, 2002). Oysa oosit dondurma tekniğinde, bu gibi yasal ve etik sorunlar söz konusu değildir. Dondurulmuş sığır oositlerinin sürekli elde mevcut olması, in vitro fertilizasyon ve bununla ilgili teknolojilerde büyük bir esneklik sağlamaktadır (Saunders ve Parks, 1999). Bu avantajlarına karşın dondurma sonrasında gelişim potansiyelinde meydana gelen azalmalar, memeli oositlerinin dondurulmasını güçleştirmektedir Tarihçe Chris Polge tarafından 1948 yılında kryoprotektan olarak gliserolün (GL) tesadüfi keşfinden sonra, gametlerin dondurularak saklanması konusunda büyük ilerlemeler sağlanmıştır (Pegg, 2002). Oositlerin dondurulması üzerine ilk çalışmalar, fare ve hamster oositlerinin dondurulmasıyla başlamıştır (Martino ve ark., 1996). Rall (1992) ın bildirdiğine göre, 1977 yılında Whittingham ve ark. geleneksel dondurma yöntemleri ile dondurdukları fare oositlerinin %6 14 ünden gebelik elde etmişlerdir. Vitrifikasyon tekniği ise ilk olarak Rall ve Fahy (1985) tarafından fare embriyolarının dondurulmasında kullanılmıştır. Nakagata (1989), Miyake ve ark., (1993) fare oositlerini

9 2 vitrifikasyon tekniği ile dondurmayı başarmışlardır. Bu çalışmalara paralel olarak oositlerde dondurmaya ilişkin ortaya çıkan hasarları inceleyen çalışmalar da yapılmıştır (Subramaniam ve ark., 1990). Dondurulan insan oositleri kullanılarak in vitro fertilizasyon (IVF) sonrası ilk bebek, Chen (1986) tarafından elde edilmiştir. İlk olarak 1991 de Lim metafaz II dönemindeki sığır oositlerini dondurup çözdürmüş ve blastosist aşamasına kadar kültüre etmeyi başarmıştır (Lim ve ark. 1999). Dondurulan oositlerden, ilk canlı buzağılar ise Fuku ve ark. (1992) tarafından elde edilmiştir Oosit Dondurmanın Önemi Günümüzde sığır embriyoları, klasik dondurma teknikleri ile başarılı şekilde dondurulabilmektedir. Ancak dondurulan embriyolar, gen kaynaklarının saf olarak korunmasına imkan vermemektedir. Bunun yerine gen kaynaklarını korumak, genetik değerliliğe sahip hayvanları, daha verimli değerlendirmek, bunlar üzerinde yapılacak olan çalışmalara geniş bir açı kazandırmak için oositlerin dondurulması daha uygun olabilmektedir. İn vitro çalışmalar için memeli oositlerinin temel kaynağı mezbahalar olmaktadır. Ancak bu mezbaha materyalinden elde edilen oositlerin yaşam sürelerinin sınırlı olması araştırmaları güçleştirmektedir. Memeli oositleri, kısa bir ömre sahiptirler ve fertilize olmadıkları sürece dejenere olurlar (Paytner, 2000). Oositlerin düşük sıcaklıklarda saklanması, ticari kullanımı yanında araştırmalar için de oosit teminini kolaylaştıracaktır. Beklenmeyen nedenlerden dolayı ölen hayvanların ovaryumlarından elde edilen oositler de oosit bankalarında saklanabilmektedir. Sayıları çok azalmış olan türlerde ölen dişilerin oositlerinin dondurulması, kalan popülasyonun genetik farklılığının korunmasında çok faydalı bulunmaktadır (Ballou, 1992). Deneysel araştırmalar için (örneğin sibling test) aynı bireyin oositlerinin kullanılması çalışmanın güvenirliliği açısından daha yararlı olabilmektedir. Ayrıca dondurulan oositlerin çekirdek transferi gibi teknolojilere de kolaylık sağladığı bildirilmektedir (Ito ve ark., 1999). Ancak dondurulan oositlerden düşük oranlarda embriyo elde edilebilmesi nedeniyle, bu yöntem şimdiye kadar

10 3 pratik olarak kullanım alanı bulamamıştır. Tekniğin pratiğe aktarılabilmesi, üzerinde yapılacak olan araştırmalarla başarı oranlarının artırılmasına bağlı görülmektedir. Bugün beşeri hekimlikte de bazı ahlaksal ve etik nedenlerden dolayı embriyo dondurma yerine oositlerin dondurulması tercih edilmektedir. Kadınlarda Turner sendromu gibi genetik hastalıklar, kemoterapi veya radyoterapi, kist veya endometriozis gibi tekrarlayan hastalıklar, endometriozisin tedavisi için ovaryumların alınması, ovaryum ağrısı veya genital organ kanserleri gibi erken yaşta infertiliteye neden olan hastalıklarda fertilitenin devamı için oosit dondurulması, yeni ufuklar açmıştır (Wood ve ark., 1997; Porcu ve ark., 2000) Dondurmada Kullanılan Malzemeler Oosit Dondurmada Kullanılan Taşıyıcı Kaplar Oositlerin dondurulmasında 0,25 ml lik payetler kullanılabilmektedir. Payetlerde olabilecek muhtemel toksik maddeler, dondurma işleminden önce, payet içlerinin medyumlarla yıkanması ile giderilebilmektedir. Plastik payetler kolay maniple edilebilmeleri, ucuz olmaları ve kolay bulunabilmeleri nedeniyle, çok sayıda araştırmada tercih edilmektedir. Vitrifikasyon tekniğinde sıcaklığın ani düşürülmesi çok önemlidir. Bunun başlıca iki sebebi bulunmaktadır. Birincisi soğuma hızı yüksek olursa, vitrifikasyon için gereken kryoprotektan miktarı azalmakta, böylece toksik hasar riski düşmektedir. İkincisi ise sıcaklık düşüşü ani olduğunda, soğuğa duyarlı olan biyolojik yapıların zarar gördüğü, sıcaklık dereceleri (-5 C ila +15 C arası) hızla geçilebilmektedir. Bu amaçla dondurma tüpleri ve klasik payetler yetersiz kalabilmektedir. Bunlar sadece 40 C/s lik bir soğuma oranı sağlamaktadırlar. Elektron mikroskobu ızgaraları (Martino ve ark., 1996; Park

11 4 ve ark., 1999), naylon taşıyıcılar (Matsumo ve ark., 2001; Mavrides ve Morroll, 2002) gibi farklı kaplar yaklaşık 250 C/s lik soğuma oranı sağlayabilmektedirler. Klasik 0,25 ml lik payetlerin ısıtılıp, çekilerek uzatılması suretiyle elde edilen modifiye payetlerde, payetin hem hacmi küçülmekte hem de çeperi incelmektedir. Bu şekilde elde edilen payetlere OPS (Open Pulled Straw) denmektedir. Modifiye payetler (OPS gibi) yaklaşık 300 C/s lik soğuma oranı sağlayabilmektedir. Ancak, bu teknikte payetin iki ucu açık olduğundan dondurulan materyalin kontaminasyon riski bulunmaktadır (Vajta ve ark., 1998; Vajta, 1999). Hurtt ve ark. (2000), immatür ve matür at, sığır oositlerinin vitrifikasyonunda OPS payetlerin başarıyla kullanılabileceğini bildirmektedirler Dondurmada Kullanılan Medyum Katkı Maddeleri Dondurma medyumlarında, serum ve sığır serum albümini, yüzey gerilimini düşürme ve koruyucu özelliklerinden ötürü yaygın olarak kullanılmaktadır. Fötal buzağı serumu (FCS) ve sığır serum albümininin (BSA) zona pellusidayı koruduğu bildirilmektedir (Paytner, 2000). Dondurma medyumunda proteinler (serumlar, BSA, makromoleküller) sürfaktan etkilerinden dolayı da kullanılmaktadır. Serumların düşürdüğü yüzey gerilimi, oositlerin birbirine, payetin duvarına ya da solüsyonun yüzeyine yapışmasına engel olmaktadır. Proteinler hücre membranlarını da stabilize ederek, dondurma sırasında zarar görmelerine engel olmaktadır. Fötal buzağı serumu ve BSA gibi biyolojik proteinler dondurma medyumlarında vazgeçilmez katkı maddeleri olarak kullanılmaktadırlar (Palasz ve ark., 1993). Cooper ve ark., (1996) dondurma medyumunda kullanılan protein kaynağının, fare oositlerinin canlılığına etkisini araştırmak amacıyla yaptıkları çalışmada, BSA nın FCS ye göre daha iyi sonuçlar verdiğini, ancak ortaya çıkan farkın istatistiki olarak önemli olmadığını belirtmişlerdir.

12 5 Serum toplama ve işleme metotlarındaki ilerlemelere rağmen, bazı virüsler serumlarda canlılığını muhafaza edebilmektedir. Embriyo transferi yapılan alıcılarda ortaya çıkan, sığır viral diare vakalarının büyük kısmı dondurma ve taşıma medyumlarında kullanılan serumdan kaynaklanmaktadır. Bu kontaminasyon risklerini ortadan kaldırmak amacıyla serumların yerine polivinilalkol (PVA), polivinilpirrolidon ve sodyum hyaluronat gibi maddeler denenmiştir (Palazs ve Mapletoft, 1996). Yüksek molekül ağırlıklı, büyük moleküllü bir mukopolisakkarit olan sodyum hyaluronat embriyo dondurma çalışmalarında serum katkısı yerine kullanılmıştır (Palazs ve ark.,1993). Araştırıcılar olumlu özelliklerinden dolayı, serumların yerine bu maddelerin kullanılabileceğini, ancak sürfaktan özelliği olmadığından dolayı manipülasyon güçlükleri olduğunu bildirmişlerdir. Vitrifikasyonda kullanılan medyumların vitrifikasyon özelliklerini geliştirmek amacıyla ficoll, PVA, BSA gibi maddeler denenmiştir (Checura ve Seidel, 2002). Wowk ve ark. (2000), küçük konsantrasyonlardaki polivinilalkolün soğutma ve çözdürme sırasında vitrifikasyon solüsyonlarında, buz oluşumunu engellediğini bildirmiştir. Asada ve ark. (2002) da %0,1 oranında kullanılan PVA nın, etilen glikol (EG) bazlı vitrifikasyon solüsyonlarında kullanılabileceğini ifade etmektedirler. Düşük molekül ağırlıklı ve vinil asetat kapsayan PVA, daha etkin olmasına ilaveten solüsyonun viskozitesinin de azaltmaktadır. Ancak araştırıcılar bu etkinin ortaya çıkabilmesi için düşük molekül ağırlıklı PVA nın %0,001 gibi çok düşük konsantrasyonlarda kullanılması gerektiğini bildirmişlerdir (Wowk ve ark., 2000) Oosit Dondurmada Kullanılan Kryoprotektan Özellikteki Maddeler Kryoprotektanların koruyucu etkileri, suyla hidrojen bağları oluşturarak, buz kristallerinin boyutlarını küçültmeleriyle ortaya çıkmaktadır. Gliserol ve propanediol, bu işi hidroksil grupları ile (-OH) yaparken dimetil sülfoksit (DMSO) oksijen atomu sayesinde yapmaktadır. Kryoprotektanlar medyumun

13 6 donmadan kalan kısmındaki elektrolit konsantrasyonunu da azaltarak koruyucu etki göstermektedirler (Porcu, 2001). Kryoprotektanlar, genelde intraselüler ve ekstraselüler olmak üzere iki grupta incelenmektedirler. İntraselüler kryoprotektanlardan en yaygın kullanılanları DMSO, GL, EG ve propilen glikoldür (PROH). Bu kryoprotektanların molekül ağırlıkları sırasıyla 78,13, 92,10, 62,07, 76,10 gramdır (Palasz ve Mapletoft, 1996). Ekstraselüler kryoprotektanlar büyük moleküllerdir. Vitrifikasyonu kolaylaştırmak ve toksik hasarı azaltmak amacıyla mono ve disakkaridler (glukoz, galaktoz, sükroz, trehaloz gibi), BSA, polivinilpirrolidon, dekstran ve fikol gibi oositin içine giremeyen bileşikler de kullanılmaktadır. Genel olarak dondurma medyumunda tek bir kryoprotektan yerine kombine kryoprotektanların kullanımının daha başarılı olacağı ileri sürülmektedir (Vajta, 1999). Disakkaridler gibi, hücre dışı kryoprotektanlar dondurma sırasında hücre içindeki suyu hücre dışına çekerek, öldürücü olan hücre içi buz oluşumunu azaltmaktadırlar. Çözdürme sonrasında da kryoprotektanın uzaklaştırılması basamaklarında dehidre hücreye suyun aniden girmesi sonucunda oluşabilecek ozmotik stresi önlemektedirler. Bunlara ilave olarak karbonhidratların membran stabilize edici etkisi olduğu da bildirilmektedir (Arav ve ark., 1993). Klasik kryoprotektanlar dışında antifreeze proteinler, betahidroksi bütilen, etilen glikol tetra asetik asit (EGTA) veya cytochalasin B gibi kimyasal bileşiklerin de soğuktan koruyucu özellikleri araştırılmıştır. İmmatür ve matür oositlerin dondurma öncesi EGTA veya cytochalasin B ile muamele edilmesinin hücre membranını ve sitoskeletal elementleri stabilize ederek, yarar sağladığı bildirilmektedir (Younis ve ark., 1997; Zeron ve ark., 1999). Arav ve ark. (1993) antifreeze proteinler olarak bilinen, bazı bileşiklerin etkilerini domuz oositleri üzerinde inceleyerek, bu proteinlerin farklı tiplerinin

14 7 benzer etkilere sahip olduğunu ve yararlı olabileceklerini bildirmişlerdir. Antifreeze proteinlerin araştırmalarda kullanılmasının üç ana nedeni bulunmaktadır. Bu proteinler 0 ºC altındaki sıcaklıklarda buz oluşumunu engelleyebilirler, çözdürme sırasında kristalizasyonu durdurabilirler ve düşük ısılarda plazma membranını koruyucu özellikleri de vardır. Ancak etkilerinin tartışmalı olduğu da bildirilmektedir (Wang, 2000). O Neil ve ark. (1998), antifreeze proteinlerin, matür fare oositlerinin vitrifikasyonuna etkilerini araştırmıştır. Ancak araştırmacılar bu proteinlerin çok başarılı sonuçlar vermediğini ifade etmişlerdir. Kryoprotektanlar, dondurma sırasında vazgeçilmez bileşikler olmalarına rağmen, oositler üzerine zararlı etkileri de bulunabilmektedir. Fare oositleri üzerinde yapılan bir araştırmada (Trounson ve Kirby, 1989) DMSO nun 4-37 C lik sıcaklıklarda kullanıldığında iğ ipliklerinin dağılmasına ve pericentrioler materyalin yer değiştirmesine neden olduğu bildirilmektedir. Ayrıca DMSO kullanarak fare oositleri vitrifiye edildiğinde çözdürme sonrası aneuploidi olgularının arttığı bildirilmiştir. Dimetil sülfoksit kullanarak yapılan dondurmalardan sonra meydana gelen fertilizasyon oranlarındaki düşmelerin DMSO nun, kromozom yoğunlaşması ve fertilizasyon için gerekli olan mikrotubüller üzerindeki olumsuz etkilerinden kaynaklanabileceği bildirilmiştir (Trounson ve Kirby, 1989). Ullah ve ark. (1997) kryoprotektanın oosit gelişimi üzerine etkilerini araştırdıkları bir çalışmada %10 oranında kullanılan EG ye 10 veya 20 dk maruz bırakmanın, daha sonraki gelişim basamaklarını önemli derecede etkilemediğini belirtmektedirler. Ancak konsantrasyon %20 ye çıktığında uygulama süresine bakılmaksızın fertilizasyon sonrası blastosist dönemine ulaşan oosit sayısı azalmaktadır. Etilen glikol yüksek permeabilitesi ve düşük sitotoksisitesi nedeniyle immatür insan, sığır ve at oositlerinin vitrifikasyonu için uygun bulunmaktadır (Cha ve ark.,2000; Hurtt ve ark, 2000). Araştırıcılar kullanılan kryoprotektanın M II döneminde dondurulan sığır oositlerinde gelişimsel kapasiteyi etkileyen

15 8 faktörlerden birisi olduğunu belirtmektedirler. Bu amaçla PROH un, GL ve DMSO ya göre daha etkili olduğu ileri sürülmektedir (Lim ve ark., 1999) İn Vitro Oosit Toplama Teknikleri Sığır oositlerinin ovaryumlardan toplanması amacıyla aspirasyon, follikül diseksiyonu ve ovaryum dilimleme olmak üzere başlıca 3 ana teknik kullanılmaktadır (Duran, 2000) Aspirasyon Tekniği Sığır oositlerinin toplanmasında, veziküler folliküllerin aspirasyonu yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu amaçla özel olarak yapılmış aspiratörler kullanılabileceği gibi, 5-10 ml lik enjektörlerin ucuna takılmış 18 G lik iğneler de kullanılabilmektedir. Bu teknik uygulaması pratik olmakla birlikte, folliküllerin sadece %30 60 ından oosit elde etmek mümkün olmaktadır. Oysa daha zaman alıcı olan follikül diseksiyon tekniğinde, bu oran %100 e kadar ulaşmaktadır. Ayrıca aspirasyon yöntemi ile toplanan oositlerin yaklaşık olarak %43 ü morfolojik olarak normal olmaktadır. Bu teknikte ovaryum başına elde edilen kullanılabilir kalitedeki oosit sayısı, 5-8 adet olduğu bildirilmektedir. Dezavantajlarına rağmen, pratik olması ve çok sayıda ovaryumun işlenebilmesine olanak vermesi nedeniyle, aspirasyon yöntemi tercih edilmektedir. Araştırmacılar, çok sayıda ovaryumun işlenmesinin önemli olduğu ticari embriyo üretimi yapılan laboratuarlarda, aspirasyon tekniğini oosit kalitesinin önemli olduğu durumlarda ise diseksiyon yöntemini önermektedirler (Gordon, 1994) Follikül Diseksiyonu Veziküler folliküllerin (2-8 mm) diseksiyonunu takiben, parçalayarak oosit toplanması, öncelikle koyunlarda kullanılmış bir tekniktir. Bu teknikte

16 9 öncelikle oositi çevreleyen kumulus hücrelerine zarar vermeden oosit elde edilmesi amaçlanmaktadır. En büyük avantajı atretik ve atretik olmayan folliküllerin belirlenebilmesidir. Follikülün homojen olarak saydam ve açık renkte olması, damarlaşmanın iyi, stratum granulozum tabakasının düzenli oluşu, follikülün atretik olmadığını göstermektedir. Diğer taraftan, atretik folliküllerin damarlaşması zayıftır ve donuk gri renktedirler. Diseksiyon tekniğinde aspirasyonda olduğu gibi, oositi çevreleyen kumulus hücrelerine zarar verilmediği için, fazla sayıda kaliteli oosit elde etmek mümkün olmaktadır. Ayrıca, kaliteli oositlere ait kumulus oophorus follikül duvarına sıkıca bağlandığı için, bunlar aspirasyonla her zaman alınamamaktadır (Gordon, 1994) Ovaryum Dilimleme Tekniği Ovaryum dilimleme tekniği direkt olarak uygulanabildiği gibi, aspirasyon sonrası da yapılabilmektedir. Ovaryum başına arasında oosit elde etmek mümkün olmaktadır. Özellikle koyun - keçi gibi küçük ovaryumlu hayvanlarda, ovaryum yüzeyinin dilimlenmesi iyi sonuçlar vermektedir. Bu teknikte, çok sayıda oosit elde edilmekle birlikte, mayotik olarak yetersiz oositler de toplanabilmektedir. Çok sayıda ovaryumun işlenmesi için uygun olmamakla birlikte, az sayıdaki ovaryum için önerilmektedir (Duran, 2000) İn Vitro Oosit Maturasyonu Maturasyon sırasında oosit çekirdeği, diploid kromozom sayısını azaltarak haploid yapmak amacıyla bir dizi bölünmeye girmektedir. Bu çekirdek maturasyonu, genetik materyali çevreleyen bir zar olan, germinal vezikülün gözden kaybolması (GVBD) ve kromozomların yoğunlaşması ile başlamaktadır. Sığır, koyun ve domuz oositlerinde mayozun yeniden başlaması ve kromatin yoğunlaşması için aktif olarak protein sentezi gerekmekte iken, rodent ve tavşanlarda, böyle bir zorunluluk

17 10 bulunmamaktadır. Tam olarak gelişmiş rodent ve tavşan oositleri GVBD, kromatinin yoğunlaşması için gereken bütün proteinlere sahiptirler. Germinal vezikülün yıkımlanması ile birlikte kromozomlar yoğunlaşarak sıkı bir yapı oluştururlar. Primer oositler birbirini takip eden iki mayotik bölünmeye girerler. Diploid kromozom çiftleri sitoplazmada serbest bulunurken, ekvatoral düzlem üzerinde dizilerek metafaz I safhasına geçerler. İlk bölünmeyi takiben iki hücre oluşur. Bunlardan bir tanesi, tam bir sitoplazmaya sahip iken, ikinci hücrede neredeyse hiç sitoplazma yoktur. Bu küçük hücreye, kutup hücresi ismi verilmektedir. Kutup hücresinde kromozomlara ilaveten, çeşitli sitoplazmik organeller de bulunmaktadır. İlk bölünmeyi tamamlayan oosit sekonder oosit adını alır ve diploid kromozom sayısına sahiptir. Birinci bölünmeden sonra, ikinci bölünme başlar ve metafaz II safhasına kadar ilerler. Bu safhada duran bölünme, oosite spermin penetrasyonu ile yeniden başlamaktadır. İkinci mayotik bölünmenin tamamlanması ile perivitellin boşluğa ikinci kutup hücresi atılır ve kromozom sayısı haploid sayıya (n=30) düşer (Greve ve ark., 1993; Gordon, 1994). Sığır oositlerinin gelişim kapasitesini etkileyen birçok faktör bulunmaktadır. Oositlerin toplandığı hayvanın yaşı (Paz ve ark., 2001), ırkı, beslenmesi (Kendrick, 1997; Sinclair ve ark., 2000), follikül çapı (Duran, 2000), seksüel siklus dönemi (Wit ve ark., 2000), mevsim (Katanani ve ark., 2002), kumulus oosit kompleksinin morfolojik özellikleri (Sylvie ve Panich, 2002) gibi faktörler örnek olarak verilebilir. Gelişme yeteneğine sahip oositleri belirlemenin en basit yollarından birisi, kumulus yapısının değerlendirilmesidir. Kumulus hücreleri farklı fonksiyonlara sahip granuloza hücrelerinin bir alt kümesidir. Oositin gelişmesi sırasında besin desteği, zona pellusidanın oluşturulmasına katılma, çeşitli proteinlerin sentezlenmesi gibi görevleri bulunmaktadır. Kumulus hücrelerinin zona pellusida ile temas halindeki bölümü corona radiata olarak adlandırılır ve oosit ile yakın sitoplazmik bağlantılar içindedirler. Yapılan çalışmalar sıkı ve kalın bir kumulus katı ile çevrili oositlerin daha yüksek gelişim potansiyeline sahip olduklarını göstermiştir (Gordon, 1994; Sirard ve Blondin, 1996). Pujol ve ark.

18 11 (2004), geleneksel değerlendirme teknikleri yanında glukoz-6-fosfat dehidrojenaz aktivitesini belirleyen brilliant cresyl blue (BCB) boyası kullanarak da gelişim yeteneğine sahip oositlerin seçilebileceğini bildirmişlerdir. Kumulus hücrelerinin, sun i olarak uzaklaştırılması oositlerin maturasyon oranlarını düşürmektedir (Sirard ve Blondin, 1996). Ayrıca kumulus hücrelerinin sitoplazmik maturasyona katkı yaptıkları bildirilmektedir (Hassan, 2001). Fertilizasyon öncesi kumulus hücrelerinden tamamen arındırılan oositlerde fertilizasyon sonrası erken bölünme oranları düşmektedir (Fatehi ve ark., 2002). Araştırmacılar oosit çapı ile kumulus oosit kompleks (KOK) kalitesi arasında yakın bir ilişki bulunduğunu bildirmektedirler. Kumulus oosit kompleksinde atrezi arttıkça oositin çapı da büyümektedir. Ancak atrezi belli bir noktaya ulaştığında oosit büzüşmekte ve çapı daralmaktadır (Wit ve Kruip, 2001). Bu araştırmacılar (Wit ve Kruip, 2001) KOK un atrezi belirtileri göstermesinin, uzun bir süreçte kazanılan maturasyon, fertilizasyon ve embriyo olabilme yeteneklerinin bir sonucu olduğunu düşünmektedirler. Goesseels ve Panich (2002), erken atrezi belirtileri gösteren oositlerin daha yüksek embriyo oluşturma yeteneğine sahip olduğunu belirtmektedirler. Yapılan çalışmalar 3-4 mm çaptaki folliküllerin gelişim yeteneklerini kazandıkları ve follikül çapı büyüdükçe oositin ileriki gelişim basamaklarına geçme yeteneğinin arttığını göstermektedir. Ayrıca follikül sağlığının da içindeki oositi yakından etkilediği bilinmektedir. Follikülün atrezi olması, oositin de dejenerasyonuna neden olmaktadır (Lonergan ve ark., 1994; Sirard ve Blondin, 1996). Ancak atrezinin başlarındaki folliküllerden elde edilen oositlerde, yüksek gelişim potansiyellerine sahip olabilmektedirler (Mayes ve Sirard, 2001; Wit ve Kruip, 2001). Gordon (1994), in vivo maturasyon sonrası, sığır oositlerinin tam olarak genişlemiş ve dejenerasyon göstermeyen bir kumulus katına sahip olmaları gerektiğini bildirmişlerdir. Aynı zamanda homojen olarak

19 12 granülasyon gösteren bir sitoplazma ve küçük perivitellin boşluk olması gerekmektedir. Bu özellikleri gösteren oositlerin fertilizasyon kapasitelerinin yüksek olduğu bildirilmiştir. İn vitro maturasyonda kullanılan medyum sadece M II dönemine gelen oosit sayısını değil, fertilizasyon ve ileriki gelişim basamaklarına geçen oosit sayısını da etkilemektedir. Sığır oositlerinin in vitro maturasyonunda en yaygın olarak kullanılan medyum TCM 199 medyumudur. Bu medyum Earl ün tuzlarını içerir ve sodyum bikarbonat ile tamponlanmıştır (Gordon, 1994). Memeli oositlerinin kendi ortamlarında alındıktan sonra maturasyonlarını tamamlamaları için farklı serumların ya da BSA gibi protein kaynağının kültür medyumuna katılmış olması gerekmektedir (Mingoti ve ark., 1995; Chanson ve ark., 2001). Kültür ortamına katılan serum (Ocana ve ark., 1999a) ve hormonların (Ocana ve ark., 1999b) maturasyon oranlarını artırdıkları ve embriyonik gelişimi destekledikleri saptanmıştır. Ayrıca kültür ortamına bakteriyel kontaminasyonlardan korunmak amacıyla penisilin, streptomisin, gentamisin gibi antibiyotikler de ilave edilebilmektedir (Shirazi, 2003) Oositlerde Maturasyon Kriterleri Oositlerde maturasyon nükleer maturasyon ve sitoplazmik maturasyon olmak üzere iki basamakta incelenmektedir. Sitoplazmik maturasyon oositin germinal vezikül (GV) aşamasından M II aşamasına kadar geçen süreçteki değişiklikleri ve oositin gelişimsel kapasiteyi kazanmasını ifade etmektedir. Çekirdek maturasyonu ise GV aşamasındaki oositin metafaz II dönemine ulaşması anlamına gelmektedir. İn vitro maturasyon sırasında sığır oositlerinde kumulus hücreleri genişlemekte, perivitellin boşluk meydana gelmekte ve ilk kutup hücresinin bu boşluğa atılımı gerçekleşmektedir (Gordon, 1994). Mayes (2002) sitoplazmik maturasyonun indirekt morfolojik kriteri olarak, anılan özelliklerin kullanılabileceğini bildirmiştir. İnsanlarda yapılan IVF çalışmalarında genellikle kumulus ekspansiyonu oosit

20 13 maturasyonunun bir göstergesi olarak kabul edilmektedir. Ancak kumulus ekspansiyonu maturasyondan bağımsız olarak da meydana gelebilmektedir. Boyama ile yapılan değerlendirmelerde kromozomal durumu M II yi gösteren oositlerin yalnızca %50 sinde kutup hücresinin belirlenebildiği bildirilmektedir. Dolayısıyla kutup hücresinin atılmaması nükleer maturasyonun meydana gelmediğini göstermemektedir. Ancak çekirdek maturasyonunu daha doğru bir biçimde saptamak amacıyla boyama tekniklerinden yararlanılabilmektedir (Gordon, 1994). Xu ve ark. (1986), maturasyonun tek gerçek güvenilir kriterinin, canlı bir yavrunun doğumu olduğunu bildirmektedirler İmmatür ve Matür Oositlerin Kryobiyolojik Özellikleri Genel bir kural olarak, tek bir hücrenin dondurulması, hücre kitlelerinin dondurulmasına göre daha başarılı olmaktaysa da memeli oositleri için bu durum geçerli değildir (Özkavukçu ve Erdemli, 2002). Memeli oositleri, dondurulmaya karşı zigot ve embriyo dönemine göre duyarlı bulunmaktadır (Vajta,1999). Oosit veya embriyoların büyüklüğü, şekli, geçirgenliği, kalitesi, ait olduğu tür ve gelişim dönemi başarılı bir dondurma için önemli özelliklerdir. Matür bir oosit en büyük (yaklaşık 130 µm çapında) memeli hücrelerinden birisidir (Paytner, 2000). Evcil memelilerde erkek gametlerinin boyutları dişilerinkine göre daha küçük olduğundan, başarıyla dondurulabilmektedir. Benzer şekilde fare oositlerinin insan ve tavşan oositlerine göre küçük olması dondurma çözdürme sonrasında yüksek canlılık oranları elde edilmesine olanak tanımaktadır (Porcu, 2001). Oosit, tek bir hücre olduğundan çevre değişikliklerine, çok hücreli implantasyon öncesi embriyolara göre daha hassastır (Im ve ark., 1997). Bu hassasiyetin diğer sebepleri şu şekilde sıralanabilmektedir; Yüksek hacim/yüzey oranı nedeniyle hücrenin bir kısmında yüksek kryoprotektan konsantrasyonu, toksik hasara neden olurken, diğer tarafta