in VITRO FERTILIZASYONDA LABORATUVAR

Transkript

1 YÜCEllLGİN in VITRO FERTILIZASYONDA LABORATUVAR Doç. Dr. M. Soit YÜCEBİLGİN('") in vitro fertilizosyon ve embryo transfer programlarında başarıyı etkileyen en önemli faktörlerden biri laboratuvardır. Her ne kadar IVF-ET programlarında standart bir protokol yok ise -de vede laboratuvarlar kendi ihtiyaçlarına göre protokollarını tesbit etselerde, burada temel ihtiyaç ve prensiplerden söz edilecektir. Laboratuvar Düzeni: Embryo laboratuvarı prensip olarak follikül ospirasyonu ve embiryo transferinin yapıldığı müdahale odasının hemen yanında olmalıdır. Böylece follikül aspirasyonu yapan doktorun aspirosyon sıvısı içinde oosit olup olmadığı konusunda haberi olacak ve follikülü yıkayıp yıkamaması konusunda karar ver-... k.. kt E" ık. mesı mum un o aca ır. -~ger ı _ aspıre edilen sıvı berrak ise, çok az veya hiç granüloza hücresi içermiyor ise müdahaleyi yapan doktor follikülün dejenere veya atretik follikül olduğuna karar verecek vede follikülü daha fazla yıkayarak vakit kayıp etmeyecektir. Yine IVF-ET de pre-embiryo ve kültür sistemlerini toksik etki yapan maddelerin tesbiti ve hazırlanan 'kültür sistemlerinin kalite kontrolü amacı ile programı uygulayan merkezlerde hayvan laboratuvarlarının bulunması daima tercih edilen bir husustur. Embiryo laboratuvarlarına komşu bir laboratuvarda ise semenin hazırlanması için gerekli alet ve donanım mevcut olmalıdır. IVF-ET programını uygulayan merkezlerde nihayet cam ve diğer malzemelerinin usulüne uygun yıkanması ve saklanması için embiryo laboratuvarının yakınında bir yer temin edilmelidir. IVF-ET Laboratuvarmda Kullanılan Cihazlar ve Malzemeler: Laminar Flow Hood: İnsan oositi ve embi ıyosu ile ilgili tüm manipülasyonlar, me- : Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Kadın Hesi ve Doğum Ana Bilim Dalı. -i

2 -. ZEYNEP KAMiL TIP IULTIN Cilt: 23 Sayu diumların ve semenin hazırlanması mikrobiyolojik kontaminasyon şansını azaltmak amacı ile havanın filitrasyonunu sağlayan horizontal tip laminar flow hood'un altında_ yapılmalıdır. Laminor flow hood'lar, kullanılmadığı zaman germicidal etkiyi sağlamak üzere açılan ultarviyole lambası içermelidir. Hood'un içindeki çalışma alanı ise% 70'ik alkol ile silinmelidir. lnkobatör: Günümüzde IVF-ET laboratuvarlarında iki ayrı gaz atmosferi kullanılmaktadır{% 5 C02, % 5 02, % 90 N2 veya hava içinde% 5 C02). Yapılan çalışmalarda, bu iki ayrı inkübatörün fertilizasyon üzerine etkisi açısından birbirine üstünlüğü tesbit edilememiştir. Embiryonun gelişmesi için inkübatö_rlerde istenen ısı 37 C'dır. Her ne kadar sıcaklıkta hafif artış (37,3 C), embiryo gelişme hızında orta derecede artış yapsada bunun gebelik oranı üzerine önemli etkisi tesbit edilememiştir. Mikroskoplar: IVF-ET laboratuvarında üç ayrı tip mikroskop mevcut olmalıdır. Bunlar; semenin sayımı ve motilite tesbiti için ışık mikroskobu, follikol sıvısı alınır alınmaz oositin tesbiti, manipülasyonu ve katetere çekilmesi sırasında kullanılan stereoskopik (diseksiyon) mikroskop vede oositin morfolojik olarak matürosyon tayini amacı ile kullanılan inverted mikroskop olarak sıralanobilinir. Bu mikroskobların tablalarının ısıtıcılı olması tercih edilir. Su: IVF-ET laboratuvarlannda mediumların hazırlanmasında 2-5 kez distile edilmiş, deionize sular kullanılmaktadır. Günümüzde high-pressure liquid chromatography grade water (HPL-C) özellikle endüstri merkezlerinin yoğun olmasına bağlı olarak organik artıkların fazla olduğu büyük illerdeki merkezlerde tercih edilmelidir. HPL-C'yi ticari olarak bir litrelik şişelerde temin etmek mümkündür. Diğer Malzeme ve Cihazlar: Osmometre: Hazırlanan mediumların ozmolaritesi kontrol edilerek mosm/kg' ayarlanır. ph metre: Mediumların ph'ı % 5 CO 2 ortamında olacak şekilde ayarlanır. Santrifüj: Semenin hazırlanmasında kullanılmak üzere takometresi olan ve düşük devire. ayarlanabilen (250 g-425 g} santrifüje ihtiyaç vardır. Hassas Terazi: Mediumların hazırlanmasında kullanılmak üzere noktadan sonraki 3 digiti ölçecek hassasiyette olmalıdır. Bu:zdolabl/Deep Freeze: Besi yeri ve hazırlanan mediumları saklamak için kullanılır. Malcler Cell Couting Chamber: Semenin sayımı ve motilite tayininde kullanılır. Sarf Malzemesi: Besi yerleri (sıklıkla Ham's F- O, Hepes, Dulbecco's phospha~ te buffered seline), tüpler ve petri kaplan {falcon malzeme, polysteren'den), kateter~ ler (teflon'dan}, pastör pipetler vb. 2

3 YÜCEi İLGİN Madiumların Hcmrlanması: IVF-ET de tuzları, vitaminleri, kofaktörleri ve aminoasitleri içeren Ham's F- O' dan, basit dengeli tuz solüsyonlarına kadar birseri medium embiryo kültürü için kullanılmaktadır. Son zamanlarda Human Tubal Fluid de embirk u.. ltü ru... yo ıçın. k. u il om maya b. aş anmış t ır. Ancak bunların hiçbirin diğerine önemli bir avantajı tesbit edilememiştir. Günümüzde çoğu IVF-ET merkezlerinde laboratuvarda hazırlanan mediumları aşağıdaki şekilde özerlemek mümkündür. tbn's F- O: Toz halinde temin edilir. İçine streptomisin sülfat, sodium Perıisillin G, kalsium laktat, sodium bikarbonat eklenir. Bu ortamın dengelenmemiş ph'ı, 7.8 dir. lnkübatörde ise% 5 CO 2 altında dengelenmiş ph'ı 7.4 tür. Osmolaritesi ise MOsm/kg olarak ayarlanmalıdır. Bu medium hazırlandıktan sonra 0.20 um delikli filitrelerden geçirilir. lsı ile inaktive edilmiş fetal kord kanı: Fetal kord kanı 0-20 dakika yüksek hızda santrifüj edilir. Süpernatant 56 C da saat inaktive edilir um ik filitrelerden geçirilir. Dondurularak ay saklanabilir. Dulbecco s Phosphate Bu~ered Saline: Toz halinde temin edilir. içine benzylpenisillin G, streptomisin sülfat, Ca Cl 2 eklenir. Bu ortamın ph 7.4 tür. Osmolaritesi ise mosm/kg olarak ayarlanmalıdır. Bu ortam hazırlandıktan sonra 0,20 um lik filitrelerden geçirilir. Yıkama mediumu olarak kullanılan bu mediuma % 7.5 yukardaki şekilde inaktive edilmiş fetal kord serumu ve O U/ml oranında heparin eklenir. lnseminasyon mediumu: Yukarıdaki şekilde hazırlanmış Ham's f-0 0 % 7.5 nispetinde yukardaki şekilde inaktive edilmiş fetal kord serumu kahlarak elde edilir. Kül.lü.. _r med..._ıumu:. y ua~.a k d k' ı şeı. k'ld e h azırlonmış Hom's F- O içine inaktive edilmiş fetal kord serumu % 5 nisbetinde kahlır. Kültür mediumu kullanılmadan önce 2-24 saat inkübe edilmelidir. ha Transfer mediumu: Yukardaki şekilde zırlanmış Ham's F- O içine inaktive edilmiş fetal kord serumu % 50 nisbetinde kahlır. IVF-ET'de Telcnik: IVF-ET Merkezlerinde laboratuvarın görevi follikülün transvajinal ultrasonografik veya laparoskopik ponksiyonu ile başlar. Aspire edilen follikül sıvısı stereo mikroskop altında incelenerek oosit tesbit edilir. Oosit pastör pipet ile alınarak inverted mikroskop altında Tablo l deki kriterler gözönünde tutularak hücresel morfoloji ve nükleer morfolojiye göre maturasyon tayinine tabi tutulur. Oosit matürasyon derecesine göre yukarıdaki kriterler gözönünde tutularak üç grupta toplanabilir; - Matür veya preovulatuvar oosit (poslmatür oositte pu grup içinde mütalaa edilebilinir), 2- lmmatür veya olgunlaşmamış oosit, 3- Dejenere et. veya atr. k ı oosıt ( zonası parça a nmı ş oo - sirlerde bu grup içinde mütalaa edilebilinır. Oo sı t ın ma tü' rasyon tesb'f. u yapup,. ınsemınasyon mediumu içine alınıp, inkübatöre. konulmasından sonra sıra semenin steril

4 ZEYNEP KAMİL np BÜLTENİ Cilt: 23 Sayn Tablo - Oosit malurosyonvnvn tayini - HOcrasal Morfoloii a- Matüre oosit (preovvlatuvar} yuvarlak ve düzgün ooplazma, aok renkli hücre, homojen granülerite ışınsal corona radiata ince bir mukopolisokkarid kirlesi içinde expanse cumulus hücreleri b- lmmatüre oosit düzgünlüğü bozulmuş ooplazma, santrolize koyuluk compact corona yoğun cumulus 2.. NOclear Morfoloii a- Metafaz - il: perivitel/ine arollkta birinci polar cisim b- Metafaz - /: polar cisim yok, germinal vezikül yok. c- Profaz - /: germinal vezikül mevcvt. şartlarda verilmesini ve likefakslyonu müteakiben Makler Cell Counting Chamber'de temel analizine gelir. Semen, normospermik olgularda Tablo - 2'deki gibi, subnormal olgularda ise tablo-3 teki modifikasyonlar yapılarak hazırlanır. İki kez yıkanmış ve swim-up tekniği ile hazırlanmış semen tekrar Makler Cell Coun!ing Chamber de analize tabi tutulur. ideal olarak swim-up tekniği ile 5-5 milyon motil sperm/ml'de elde edilmeye çalışılır. Nükleer matürasyona göre inseminasyon zamanının tayini Tablo - 4'e göre yapılır. Normospermik olgularda oositin içinde bulunduğu inseminasyon mediumunun mililitresi başına motil sperm Tablo -2 Normospermik olgularda swim - up tekniği (sayı 20 x 0 6 /mi, hareket % 30, morfoloji % 4 normal ise} -- Olguların steril olarak semen vermesi istenir, -- Likefaksiyonu takiben temel semen analizi Makler cell counting chomber kulla~ narak yapılır. -- A tüp alınır. Her bir tübe 0.25 mi semen + o.5 mi. Ham's F- O + % 7.5 humon fetal kord serumu konarak 427 x g de O dk santrifüj edilir. -- Supernatant atılır mi inseminasyon mediumu konup tekrar santrifüj yapılıp, supernatant atılır. -- Pellet yerinden oynatılmadan 0.5 mi inseminasyon ortamı tüplere eklenir. -- Tüpler 37 C da, % 5 CO 2 de st inkübe edilir. -- Süpernatanrlor toplanır. -- Makler chamber ında sayım yapılır. konur iken, male faktörü olan olgularda bu sayı bir milyon motil sperme kadar çıkarılabilir. lnseminasyondan 2-8 saat sonra pronükleuslar aranara~ fertilizasyonun olup olmadığı araştırılır. iki pronükleusunu görülmesi halinde normal fertilizasyonun olduğuna karar verilir ve zigot inseminasyon ortamından kültür ortamına geçirilir. Pronükleusların görülmemesi halinde ise oositin fertilize olmadığına kanaat getirilip, reinsemine etme yoluna gidilebilinir. Bu amaçla gerektiğinde hastadan steril semen vermesi istenir. İkiden fazla sayıda pronükleus görülmesi halinde ise poliploi- 4

5 YÜCEBİLGiN Tablo ~ 3 Sub-normal olgularda swimup tekniğinde yapılacak modifikasyonlar (o/igospermi, osthenospetmi, terotospermi de) -- tüp sayısı 8-6 tüpe kadar orttırılabilinir -- pellet üzerine konan medium miktarı O _. mi' ye k a d ar eza - it ı -a b ı ı ınır. -- mikro dish ler kullanılabilinir ~~- Tablo.. 4 İnseminasyon zaman tablosu M- : Oosit alınımından 3-5 st. sonra M- : Birinci polar cisim gözleninceye kadar oosit 3 st. te bir kontrol edilir. Polor cismin tespitinden 2-3 saat sonra insemine edilir. P- : Birinci polar cisim gözlendikten 2-3 st. sonra Vf!'/a standart olarak oosit alınımından 29 saat sonra. Dej : İnsemine edilmez. Fr. Z. : insemine edilmez. dpden söz edilir. Poliploidi fertilizasyon olup olmadığının kontrolünün yapıldığı post inseminasyon 2- S'inci saate yakalanamaz ise hücrenin bundn sonraki bölünmesi normal fertilize olmuş oositten farklı olmadığından transfer edilmesi söz konusu olacak ve çoğunlukla görüldüğü üzere gebelik aborh.ıs ile sonlanacaktır. Bu durum bozuk fertilizasyona uğramış bu oosit ile beraber transfer edilen sağlıklı fertilize olmuş oosi~erinde düşüğüne neden olacaktır. - Post inseminasyon 36~.45'inci saatte bölünmenin değerlendirilmesi amacı ile preembiryo içeren tüpler inkübatörden çıkarılarak, hücreler mikroskop altında incelenir ve transferi yapılacak simetrik bölünmüş, 2-8 hücreli döneme gelmiş 3-4 hücre ayrılarak aynı petri kabı içine alınır. Post inseminasyon saatte hasta artık intrauterin transfer kademesine ulaşmıştır. Pre-embiryoların transfer koteterine çekilmesi sıklıkla aşağıdaki şekilde yapılır. 20 ul transfer mediumu-hava-30 ul transfer mediumu + pre-embiryolar-hava-20 ul transfer mediumu. Hastanın uterusu antevert antefleks ise diz dirsek pozisyonunda, retrovert retroaeks ise litotomi pozisyonunda, yaklaşık fundusun 0,5 cm. o it ına kd-ktate a ar a r so ki u ora k't ın rauterın -. transfer yapılır. Transferden sonra hastalar yaklaşık dört saat kadar yatırılır. IVF ET programında transfer aşaması ile embi ryo laboratuvarımn görevi tamamlanmış olur. IVF-ET Laboratuvan ile İlgili DiQer Hususlar: IVF-ET programında sterilite ile ilgili önemli hususlar Tablo - 5'de, preembiryo ve kültür sistemlerine taksit etki yapan maddeler ise Tablo - 6'da gösterilmiştir.

6 ZliYNIP KAMİL TIP BÜLTENİ Ciltı 23 Sayı: Tablo 5: IVF - ET programmda steri/ite -- Çalışırken kep, maske, galoş ve ameliyathane kıyafeti kullanma. -- Ellerin antiseptikler ile çalışmaya başlamadan önce yıkanması. -- Laminer flow bench kullanarak çalışma alanındaki havanın steril edilmesi u'luk pore ihtiva eden filitreler kullanarak besi yerinin steril edilmesi. -- Oositin mikromanupulasyonu ve kültür mediumlarının hazırlanmasında steril devranı iması.. -- İnkübatorün sterilizasyonu. -- Semen in steril alınması ve hazırlanması. Tablo 6. IVF-ET'de pre embiryo ve kültür sistemlerine toksik etki yapan maddeler Yapışkan ihtiva eden maddeler (öm: flaster) Yıkanmamış eldivenler ve talk pudrası Gaz sterilize edilmiş aletler Kapalı alanlarda ortaya çıkan gaz retansiyonu Koku salan her türlü ürün (örn: boya) Eski ponksiyon iğneleri ve laparoskopi kanülleri. Blonkstein J. Mashioc:h S, Lunenfeld B: Ovulation induction and in vitro fertilization. Chop. 9, poge: 55 20, Yeor Book Medical Publishers, Chicogo, London, Dandekor PV, Quigley M M: Laborotoıy setup for humon in vitro Fertilization. Fertil ond steril, 42 ( ): -, Gorcio J. E: Conceptus transfer in: in vitro Fertilizotion, Ed. Howord W Jones Jr et ol., page: , Williams and Wilkins, Norfolk, Jones H W, Ac:osto A A et ol: On the transfer of conceptus from ooqtes fertilized in vitro. Fertil and steril, 39 (2): , Lopata A, Leung P C: The fertilizobility of humon oocytes ot different sto9es of meiotic maturotion. in: in Vitro Fertilizotion ond Other Assisted Reproducti-. on. Ed. Howard W. Jones Jr., poge: , The New York Academy of Sc:iences, New York, Marrs R P: Loboratory conditions for humon in vitro Fertilizotion procedures. Clin Obs. ond Gynec., 29 ( ): 80-89, Mc:dowell J S: Preporation of spermoto.zoo for insemination in vitro. in: in vitro fertilization., Ed. Ho ward W. Jones Jr et al., poge: 62 67, Willioms ond Wilkins, Norfolk, T rounson: A: in vitro fertilization ond embryo preservotion. in: in Vitro Fertilization and Embryo T ronsfer, Ed. Alon T rounson., Cari Wood, poge: -30, Churc:hill Livingstone, New York, Veec:k L L, Maloney M: lnseminotion ond fertilization. in: in Vitro Fertilizotion. Ed. Howard W. Jones Jr et ol., page: , Williams ond Wılkins, Norfolk, 986. SUMMARY LABORATORY SETUP FOR HUMAN in VITRO FER TIUZATION Althou9h in IVF-ET Laborotories these is no stondordized protocol and every program require to deve lop it's own unique loborotoıy protocols, the intent 6

7 YÜCEIİLGİN of this ortide is to describe the bosic and minimum requirements for the physicol orrongement of the lo boratories, equipment ond supplies, os well as o brief description of loborotoıy procedures and general suggestions such as toxicity ond sterility. in condusion we can soy thot meticulous ottention to oll ospeds of the laborotory procedures will result in the potient s having the best possible chance to obtoin pregnoncy. 7