ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ LAKTOBASİLLUS VE BİFİDOBAKTERLERDE BAZI PROBİYOTİK ÖZELLİKLERİN BELİRLENMESİ.

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ LAKTOBASİLLUS VE BİFİDOBAKTERLERDE BAZI PROBİYOTİK ÖZELLİKLERİN BELİRLENMESİ İbrahim ÇAKIR GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ANKARA 2003 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Doktora Tezi LAKTOBASİLLUS VE BİFİDOBAKTERLERDE BAZI PROBİYOTİK ÖZELLİKLERİN BELİRLENMESİ İbrahim ÇAKIR Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. M. Lütfü ÇAKMAKÇI Bu çalışmada, fermente gıda maddeleri, yeni doğan bebekler ve et tavuklarının körbağırsak florası gibi yerel kaynaklar ile ticarî probiyotik preparatlarından izole edilen laktik asit bakterilerinin bazı probiyotik özellikleri belirlenmiş, genel ve özel hedefli 16S rrna primerleri ile dizi analizleri sonucu kesin tanıları yapılmıştır. Bu amaç için 110 adet yerel ve 104 adet ticarî izolat ile çalışmalara başlanmış, önce morfolojik ve biyokimyasal testlerle ön tanımlanmaları yapılan suşların L. monocytogenes, E coli O157: H7, Salmonella spp., Enterobacter sp. BF2, Leuconostoc sp. K2, L. helveticus ve L. plantarum un da aralarında bulunduğu bir grup mikroorganizmaya karşı antimikrobiyel aktiviteleri incelenmiş ve antimikrobiyel aktivitenin kaynağı tespit edilmiştir. Sonra bu mikroorganizmaların ph 2,5, ph 3,0, %0,3 safra tuzu, % 0,5 safra tuzu ile ph 2,5 + %0,3 safra tuzu ve ph 3,0 + %0,5 safra tuzu ortamlarında gelişme durumları incelenmiştir. Çalışmanın son aşamasında, antimikrobiyel aktivite gösteren suşlarla, asit ve safra tuzlarına karşı dayanıklı olan suşlardan seçilen 87 adet izolatın 16S rrna dizi analizi yöntemi ile kesin tanıları yapılmıştır. Araştırma sonuçlarına göre, E. faecium B20, P. acidilactici S1, L. helveticus S57 ve L. reuteri T17 yerel suşları ile L. plantarum AS2, L. acidophilus DC1, L. pontis H3, L. reuteri PBC2 ticarî izolatlarının indikatör mikroorganizmalara karşı antimikrobiyel aktivite gösterdiği tespit edilmiştir. S1, T17 ve DC1 suşlarının gösterdiği antimikrobiyel aktivitenin de bakteriyosin üretiminden kaynaklandığı gösterilmiştir. Asitlik ve safra tuzlarına direç bakımından ise; P. acidilactici S1, S. salivarius subsp. thermophilus FYC1 in asitliğe, B. longum PBC1 ve L. rhamnosus UCP1 in safra tuzlarına, C. glutamicum R17 ve L. rhamnosus UCP1 in ise hem asitlik hem de safra tuzlarına karşı dirençli oldukları belirlenmiştir. Araştırma sonuçlarına göre kesin tanısı yapılan 87 adet suşun 48 farklı türe dahil olduğu tespit edilmiştir. Araştırmada ayrıca, ticarî olarak satılan preparatların etiketinde belirtilen sayıda ve türde mikroorganizmayı içermediği, hatta bazı preparatlarda örneğin E. faecalis gibi, insan tüketimi amacıyla kullanılamayan türlerin dahi bulunduğu saptanmıştır. 2003, 84 sayfa ANAHTAR KELİMELER: Probiyotik, antimikrobiyel aktvite, asit ve safra tuzlarına direnç, tanımlama, 16S rrna i

3 ABSTRACT Ph.D. Thesis DETERMINATION OF SOME PROBIOTIC PROPERTIES ON LACTOBACILLI AND BIFIDOBACTERIA İbrahim ÇAKIR Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisior: Prof. Dr. M. Lütfü ÇAKMAKÇI In this study, probiotic properties of lactic acid bacteria, isolated from infants, the cecum of broiler chicken, and commercial dietary supplements were investigated and the isolates were genotypically identified using primers both universal and specific to 16S rrna. For this purpose, a total of 224 cultures (104 of which isolated from commercial sources and 110 came from non-commercial sources) were included in the study. Morphological and biochemical tests were conducted to identify the strains and their antimicrobial activities against certain food pathogens and spoilage microorganisms such as L. monocytogenes, E. coli O157:H7, Salmonella spp., Enterobacter sp. BF2, Leuconostoc sp. K2 and also L. helveticus, L. plantarum and the origin of antimicrobial resistance were investigated. Furthermore, the strains ability to grow in the presence of low ph and bile salts medium (ph 2,5, and 3,0; 0,3% and 0,5% bile salt; in combination ph 2,5 + 0,3% bile salt; ph 3,0 + 0,5% bile salt) were examined. Eighty seven strains were determined to grow under the above conditions; therefore, this subgroup was included in the genotypic identification using the primers targeted to 16S rrna and universal one. It was demonstrated that E. faecium B20, P. acidilactici S1, L. helveticus S57, L. reuteri T17 (non-commercial sources) and L. plantarum AS2, L. acidophilus DC1, L. pontis H3, L. reuteri PBC2 (commercial sources) exhibit antimicrobial activity against indicator pathogens. It was also demonstrated that the antimicrobial activity of S1, T17 and DC1 strains comes from bacteriocin production. P. acidilactici S1, and S. salivarius subsp. thermophilus FYC1 growth was not adversely affected by acidity, B. longum PBC1 and L. rhamnosus UCP1 were capable of growing in bile salt conditions and finally C. glutamicum R17 and L. rhamnosus UCP1 could grow well both in acidity and bile salt conditions. The genotypic identification showed that the 87 isolates belong to 48 different species. Our findings indicated that the information presented on the label of some commercial supplements in terms of number and the species of probiotic microorganisms is incomplete or misleading and some other supplements were found to contain species of bacteria i.e. E. faecalis that were not approved for human consumption. 2003, 84 pages Key Words: Probiotic, antimicrobial activity, acid and bile tolerance, identification, 16S rrna ii

4 TEŞEKKÜR Tezimin her aşamasında büyük desteğini gördüğüm Sayın Hocam Prof. Dr. M. Lütfü ÇAKMAKÇI (Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi) ya, çalışma boyunca önemli katkılarda bulunan Tez İzleme Komitesinin değerli üyeleri Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN (Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi) ve Prof. Dr. Aynur Gül KARAHAN (Süleyman Demirel Üniversitesi Ziraat Fakültesi) a, araştırmanın önemli bir bölümünü laboratuvarlarında gerçekleştirme olanağı bulduğum Assist. Prof. Dr. Randy W. WOROBO (Cornell University, Department of Food Science and Technology NY, USA) ya ve ekibine, çalışma süresince her zaman büyük destek ve teşviklerini gördüğüm Mikrobiyoloji Birimi öğretim üyeleri, yardımcıları ve çalışanlarına, araştırmalarımda her türlü desteğini hep yanımda hissetmemi sağlayan, eşim M. Ülkü ÇAKIR (Toprak Mahsülleri Ofisi Genel Müdürlüğü) a en içten teşekkürlerimi sunarım. İbrahim ÇAKIR Ankara, Mart 2003 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR...iii SİMGELER DİZİNİ...vi ŞEKİLLER DİZİNİ...vii ÇİZELGELER DİZİNİ...viii 1. GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER Probiyotiklerin Tanımı ve Tarihçesi Probiyotik Etkinin Bilimsel Temeli ve Mekanizması Probiyotiklerin Sağlık ve Hastalıktaki Rolü Tedavi edici etki Kanser İmmün fonksiyonları Diyare Serum kolesterol düzeyi Sağlık üzerine olan diğer etkiler Potansiyel Probiyotik Mikroorganizmalar ve Ürünler Probiyotiklerin Güvenilirlik Kriterleri Probiyotik Mikroorganizma Seçim Kriterleri Antimikrobiyel aktivite Asitlik ve safra tuzlarına direnç Probiyotiklerin 16S rrna Dizi Analizi Yöntemi ile Tanımlanması MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Mikroorganizmaların İzolasyonu, Tanımlanması ve Muhafazası Antimikrobiyel Aktivite Denemeleri Asit ve Safra Tuzlarına Direnç Denemeleri S rrna Dizi Analizi Yöntemi ile Tanımlama DNA nın izolasyonu ve agaroz jelde analizi DNA nın PCR da çoğaltılması ve PCR ürünlerinin saflaştırılması DNA dizi analizi BLAST tarama ARAŞTIRMA BULGULARI Yerel ve Ticarî Suşların İzolasyonu Antimikrobiyel Aktivite Denemeleri Asit ve Safra Tuzlarına Karşı Direnç Denemeleri DNA İzolasyon Sonuçları DNA nın PCR da Çoğaltılması ve 16S rrna Dizi Analizi Sonuçları TARTIŞMA ve SONUÇ...57 KAYNAKLAR...64 EKLER...74 Ek Ek Ek iv

6 Ek Ek Ek Ek ÖZGEÇMİŞ...84 v

7 SİMGELER DİZİNİ A APS bç CTAB datp dctp ddntp dgtp dntp dttp DNA EDTA OD PCR RNA rdna rrna SDS TEMED Absorbans Amonyum rersülfat Baz çifti Heksadesiltrimetil amonyum bromid Deoksiadenin trifosfat Deoksisitozin trifosfat Dideoksinükleotid trifosfat Deoksiguanin trifosfat Deoksinükleotid trifosfat Deoksitimin trifosfat Deoksiribonükleik asit Etilen diamin tetra-asetik asit Optik yoğunluk Polimeraz zincir reaksiyonu Ribonükleik asit Ribozomal DNA Ribozomal RNA Sodyum dodesil sülfat Tetra etil metilen diamin vi

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1. İntestinal sistemin florasını etkileyen faktörler... 5 Şekil 2.2. rrna operonlarının şematik görüntüsü Şekil 3.1. Araştırmada kullanılan ticarî probiyotik preparatlarından bazıları Şekil 4.1. S1, T17 ve DC1 kültürlerinin L. monocytogenes i inhibisyonu Şekil 4.2. S1, T17 ve DC1 süpernatantlarının L. monocytogenes ve Leuconostoc sp. K2 yi inhibisyonu Şekil 4.3. S1, T17 ve DC1 in bakteriyosin üretiminden kaynaklanan inhibisyon etkisi Şekil 4.4. Yerel suşlardan (1-10) izole edilen DNA ların agaroz jeldeki görüntüleri Şekil 4.5. Yerel suşlardan (11-21) izole edilen DNA ların agaroz jeldeki görüntüleri.. 45 Şekil 4.6. Yerel suşlardan (22-28) izole edilen DNA ların agaroz jeldeki görüntüleri.. 45 Şekil 4.7. Yerel suşlardan (29-37, 43) izole edilen DNA ların agaroz jeldeki görüntüleri Şekil 4.8. Yerel suşlardan (38-42) izole edilen DNA ların agaroz jeldeki görüntüleri.. 46 Şekil 4.9. Ticarî suşlardan (1-18) izole edilen DNA ların agaroz jeldeki görüntüleri Şekil Ticarî suşlardan (21-27) izole edilen DNA ların agaroz jeldeki görüntüleri 47 Şekil Ticarî suşlardan (28-38) izole edilen DNA ların agaroz jeldeki görüntüleri 48 Şekil Ticarî suşlardan (35-44, 19-20) izole edilen DNA ların agaroz jeldeki görüntüleri Şekil Yerel suşların (1-15) PCR ürünlerinin agaroz jeldeki görüntüleri Şekil Yerel suşların (21-22) PCR ürünlerinin agaroz jeldeki görüntüleri Şekil Yerel suşların (11-25) PCR ürünlerinin agaroz jeldeki görüntüleri Şekil Yerel suşların (26-43) PCR ürünlerinin agaroz jeldeki görüntüleri Şekil Ticarî suşların (1-19) PCR ürünlerinin agaroz jeldeki görüntüleri Şekil Ticarî suşların (20-38) PCR ürünlerinin agaroz jeldeki görüntüleri Şekil Ticarî suşların (39-44) PCR ürünlerinin agaroz jeldeki görüntüleri vii

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1. Probiyotik üretiminde kullanılan bazı mikroorganizmalar... 4 Çizelge 2.2. Sindirim sisteminde yaygın olarak bulunan mikroorganizmalar... 5 Çizelge 2.3. Probiyotiklerin potansiyel etki mekanizmalarının temeli...8 Çizelge 2.4. Ticarî probiyotik kültürleri ve satan firmalar...13 Çizelge 2.5. Ticarî probiyotik preparatları ve bunlar hakkında bazı bilgiler...14 Çizelge 2.6. Probiyotik seçim kriterleri Çizelge 2.7. Laktobasillus türlerinin 16S rrna larına göre gruplandırılması...23 Çizelge 3.1. Ticarî probiyotik suşları ve preparatlara ait bilgiler...26 Çizelge 3.2. İndikatör mikroorganizmalar, besiyerleri ve inkübasyon koşulları...28 Çizelge 4.1. Klâsik yöntemle tanımlanan kültürlerin türlere göre dağılımı...35 Çizelge 4.2. Ticarî preparatlardaki canlı mikroorganizma kayıpları...36 Çizelge 4.3. Antimikrobiyel aktivite gösteren kültürlerin inhibisyon zon çapları...37 Çizelge 4.4. Asitlik ve safra tuzlarına dirençli yerel suşlar ve direnç düzeyleri...41 Çizelge 4.5. Asitlik ve safra tuzlarına dirençli ticarî suşlar ve direnç düzeyleri...42 Çizelge 4.6. Seçilen suşların asitlik ve safra tuzlarındaki gelişme durumları...43 Çizelge 4.7. Yerel suşların 16S rrna sonuçlarına göre ve daha önceki tanıları...54 Çizelge 4.8. Ticarî suşların 16S rrna sonuçlarına göre ve etiketinde belirtilen tanıları...55 viii

10 1. GİRİŞ İnsanların ve sıcak kanlı hayvanların bağırsak sistemleri 500 farklı mikroorganizma türünün bir arada yaşadığı kompleks bir ekosistemdir. Bu ekosistemde bulunan mikrorganizmalar normal flora olarak tanımlanmakta olup, temelde yararlı ve zararlı olarak iki gruba ayrılmaktadır. Sağlıklı bir konakçının normal florasında bu gruplar dinamik bir denge halindedir. İntestinal ekosistemin fizyolojik dengesi hastalık, yaşlılık, stres, antibiyotik kullanımı, diyet alışkanlıklarının değiştirilmesi ve iklim koşullarında meydana gelen değişmeler nedeniyle zararlı mikroorganizmalar lehine bozulabilmektedir. Bu durumda bozulan denge etkili ve yararlı mikroorganizmalarla desteklenmelidir. İntestinal sistemde bulunan faydalı mikroorganizmaların gıdaların sindirimine yardımcı olmak, canlıyı patojen mikroorganizmalardan korumak ve canlının savunma mekanizmasını desteklemek gibi işlevleri vardır. Bu bağlamda, bağırsak florasını düzenleyerek konakçı sağlığı üzerinde faydalı etkileri olan mikroorganizmalar probiyotik olarak tanımlanmaktadır. Bunlardan en önemlileri Lactobacillus, Enterococcus ve Bifidobacterium cinsine ait türlerdir (Salminen vd 1998, Salminen 1999, Klaenhammer 2000). Probiyotik özellik taşıyan mikroorganizmaların insan sağlığı üzerindeki olumlu etkileri ilk defa 1908 yılında, Nobel ödüllü Rus araştırmacı Elie Metchnikoff tarafından ortaya atılmıştır. Metchnikoff, Bulgar çiftçilerin fermente süt ürünleri tüketimi sonucu daha sağlıklı ve uzun ömürlü olduklarını, bunun nedeninin ise bu ürünlerde bulunan çubuk şeklindeki bakterilerin (Lactobacillus spp.) bağırsaktaki mikroflorayı olumlu yönde etkilemesi ve toksik mikrobiyel aktiviteyi azaltması olduğunu belirtmiştir. Fermente gıdalarla sağlıklı yaşam arasındaki bu bağlantı bugün de geçerliliğini korumaktadır. Fermente ürünler üzerine yapılan araştırmaların başlangıcı çok eskilere dayanmakla birlikte, probiyotikler konusunda yapılan çalışmalar ancak son yılda hız kazanmıştır (Kalantzopoulos 1997, Saxelin vd 1999, Çakır vd 2001). Probiyotik içerikli ürünler özellikle Japonya, Uzakdoğu ülkeleri ve Avrupa Birliğine üye olan ülkelerde yaygın olarak kullanılmaktadır (Lee vd 1999). Amerika Birleşik Devletleri nde ise son yıllarda probiyotik ürünlere olan ilgi giderek artış göstermiş olup, sağlıklı gıda tüketimi bilincinin gelişmesi sonucu ortaya çıkan tüketici talebi gıda endüstrisinin fonksiyonel gıdalara dolayısıyla probiyotik ürünlere olan ilgisini arttırmıştır (Sönmez vd 1999). Probiyotik mikroorganizmalar patojenlerin üretmiş oldukları zararlı metabolitlerin temizlenmesini sağlayarak diyareyi önlemekte veya azaltmaktadır. Bunun için probiyotik mikroorganizmalar yeterli miktarlarda canlı olarak bağırsak sistemine ulaşmalı ve orada yerleşmelidir. Klâsik yoğurt fermentasyonunda kullanılan mikroorganizmaların bağırsaklara tutunma ve kolonize olma özellikleri yoktur. Bu 1

11 nedenle starter bakterileri tek başlarına probiyotik mikroorganizma olarak nitelendirilememektedir. Probiyotiklerin bağırsak mukozasına yerleşerek tutunma bölgelerini işgal etmesi patojenlerin gelip buraya yerleşmelerini engellemektedir. Probiyotiklerin diğer bilinen faydalı etkileri; kandaki kolesterol oranını düşürücü etki göstermeleri, bağışıklık sistemini güçlendirerek hastalıklara direnç kazandırılması, karsinojenlerin parçalanarak kanser yapıcı etkilerinin giderilmesi ve belki de en önemlisi laktoz intoleransı olan insanların laktoz sindirimine katkıda bulunarak süt tüketimini sağlamaları olarak sıralanabilir (Klaenhammer 1998, Sanders 1999, Çakır vd 2001, Kaur vd 2002). Probiyotik üretiminde kullanılan mikroorganizmalar FDA tarafından GRAS (generally recognised as safe) olarak tanımlanmış mikroorganizmalardır (Lee vd 1999). Laktik asit bakterileri bu özellikleri nedeniyle fermente süt ürünlerinin üretiminde uzun yıllardan beri güvenle kullanılmaktadır. Probiyotik olarak kullanılacak mikroorganizmaların da konakçı sağlığına zarar verecek hiçbir yan etkisi olmamalıdır. Bu nedenle probiyotik üretiminde kullanılacak mikroorganizmaların kesin tanısının yapılmış olması gerekmektedir (Salminen ve vonwright 1998). Özellikle bağışıklık sistemi daha zayıf olan yaşlılarda ve çocuklarda, kullanımının sakıncalı olmadığı tam olarak kanıtlanmadan, hiçbir mikroorganizmanın probiyotik üretiminde kullanılmaması gerektiği vurgulanmaktadır (Murray 1998, Sanders 1999, Rolfe 2000). Ağız yoluyla alınan probiyotiklerin beklenen yararlı etkiyi gösterebilmeleri için canlı olarak ve çok sayıda bağırsak sistemine ulaşmaları gerekmektedir. Bu nedenle kullanılan suşların mide asitliğine ve safra tuzlarına karşı dirençli olmaları istenmektedir. Bu özellik aynı zamanda probiyotik mikroorganizma seçiminin en temel kriterlerinden birisidir. Bunun yanında patojenlerle mücadele açısından bakteriyosin veya bakteriyosin benzeri antimikrobiyel bileşiklerin üretimi de çok önemli bir kriterdir. Bu araştırmada toplam 110 adet doğal ve 104 adet ticarî olmak üzere toplam 214 adet bakteri suşu ile çalışılmıştır. Araştırmada kullanılan doğal suşlar et tavuklarının körbağırsak florası, yeni doğmuş bebek dışkısı ve fermente süt ürünlerinden izole edilmiştir. Ticarî suşların izolasyonu için 11 farklı firmanın üretmiş olduğu kapsül veya tablet şeklindeki preparatlar kullanılmış, ancak bunların bir tanesinden hiçbir izolasyon gerçekleştirilememiştir. Bu çalışmada saf kültür şeklinde izole edilen kültürlerin probiyotik özellikler açısından öncelikle E. coli O157:H7, Salmonella spp. (Hortford, Typhimurium, Rubislaw), Listeria monocytogenes, Leuconostoc sp. K2, Enterobacter sp. BF2, L. plantarum, ve L. helveticus a karşı antimikrobiyel aktivite testleri yapılmış, daha sonra aktivitenin bakteriyosin üretiminden kaynaklanıp kaynaklanmadığı tespit edilmiştir. Araştırmada ayrıca, bakterilerin mide asitliğine ve intestinal sistemdeki safra tuzlarına karşı dirençleri tespit edilmiştir. Bütün bu özellikler açısından üstün olan suşların kesin tanıları 16S rrna dizi analizi yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. 2

12 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1. Probiyotiklerin Tanımı ve Tarihçesi Probiyotik kelimesi Yunanca kökenli olup yaşam için anlamına gelmektedir. Probiyotik terimi ilk defa 1965 yılında, Lilly ve Stillwell adlı araştırıcılar tarafından, diğer mikroorganizmaların gelişimini destekleyen maddeleri tanımlamak için kullanılmıştır (Lee vd 1999, Armbrecht 2002). Bu tarihten günümüze kadar probiyotik kelimesi, etki mekanizmalarına ve insan sağlığı üzerindeki olumlu etkilerine bağlı olarak çok değişik anlamlarda kullanılmıştır. Başlangıçta, protozoonlar tarafından üretilen ve diğer mikroorganizmaların gelişimini destekleyen maddeler için kullanılmış olan probiyotik teriminin anlamı, 1970 li yılların başlarında genişletilerek mikrobiyel gelişmeyi destekleyen doku ekstraktları için de kullanılmaya başlamıştır yılında Parker probiyotik kelimesinin tanımını; intestinal sistemin mikrobiyel dengesine katkıda bulunan madde ve organizmalar olarak, bugünkü kullanımına en yakın anlamda geliştirmiştir. Bugün kullandığımız tanım Fuller (1989) tarafından geliştirilmiş olup probiyotik terimi; intestinal sistemin mikrobiyel dengesini geliştirerek konakçı hayvanın sağlığı üzerinde yararlı etkileri olan canlı mikrobiyel yem destekleyicisi anlamında kullanılmıştır. Daha sonra bu tanım gıda ve yemlerde kullanılan tekli ve çoklu kültürleri kapsayacak şekilde genişletilmiştir (Havenaar ve Huis In't Veld 1992). Probiyotik kelimesinin tanımına Avrupalı bilim insanları son şeklini vermiş olup, insan ve hayvan beslemede kullanılan probiyotikleri; vücuda alındığında konakçının gastrointestinal mikroflorasına olumlu etkileri olan canlı mikroorganizmalar olarak tanımlamışlardır (Kneifel vd 1999). Probiyotik ürün denildiğinde ise; içerisinde konakçı sağlığı üzerine olumlu etkileri olan mikroorganizmaları içeren, çeşitli enzim, vitamin ve aroma bileşenleri ile desteklenerek direkt kapsül veya tablet haline getirilmiş diyet destekleyiciler anlaşılmaktadır. Bu tablet veya kapsüller farmasötikaller olarak da bilinmekte olup, hastalıkların tedavisinde ilaç yerine kesinlikle kullanılamamakta, sadece sağlık destekleyici ürünler olarak satılmaktadır. Bu preparatlar dondurarak kurutulmuş bakteri kültürlerinin kapsül veya tablet haline getirilmesi ile hazırlanmış olup; bazı hepatik hastalıklar, kabızlık ve antibiyotik tedavisi sonucu ortaya çıkan diyare gibi gastrointestinal düzensizliklerin önlenmesinde kullanılmaktadır (Ouwehand vd 1999, Rolfe 2000, Yücecan 2002). Ticarî bir ürün olarak probiyotiklerin çiftlik hayvanlarının yemlerinde kullanımı, gıdaların bileşiminde veya diyet destekleyici preparatlar olarak kullanımından daha öncelere dayanmaktadır yılında domuz yemlerinde büyümeyi teşvik etmek amacıyla L. acidophilus kullanılmış ve başarılı sonuçlar alınmıştır. Bu tarihten bir yıl sonra, Swann Komitesi antibiyotiklerin tedavi amacıyla kullanımının sınırlandırılmasını tavsiye etmiştir (Fuller 1999). Antibiyotik kullanımına karşı olan tepkiler, diyare gibi antibiyotik kullanımının yan etkilerinden kaynaklanmaktadır (Mitsuoka 1996, Fuller 1999, Gomes ve Malcata 1999). Antibiyotiklere karşı en büyük tepkiler özellikle gıda 3

13 katkı maddeleri karşıtlarından gelmiştir. Bu tepkilerin temel nedeni, antibiyotiklerin dolaylı yollardan da olsa gıda zincirine yabancı madde olarak katılıyor olmasıdır. Antibiyotiklerin bu dezavantajlarına karşın probiyotikler, uzun yıllardır ve hiçbir yan etkisi olmaksızın gıdaların bileşiminde ve sağlıklı bireylerin intestinal sisteminde bulunuyor olması nedeniyle de kabul görmektedir (Tannock 1997, Fuller 1999). Gerek insan beslenmesinde gerekse hayvan yemi üretiminde kullanılan probiyotik mikroorganizmalar Çizelge 2.1 de verilmiştir. Çizelge 2.1. Probiyotik üretiminde kullanılan bazı mikroorganizmalar İnsanlar için kullanılanlar Hayvan beslemede kullanılanlar L. acidophilus L. acidophilus Bacillus mesentericus L. casei Shirota L. casei B. licheniformis L. delbrueckii subsp. bulgaricus L. delbrueckii subsp. B. subtilis bulgaricus L. johnsonii L. plantarum B. natto L. reuteri L. reuteri B. toyoi L. rhamnosus L. fermentum Pediococcus pentosaceus Bifidobacterium adolescentis L. brevis Aspergillus oryzae B. bifidum L. helveticus Candida pintolopesii B. breve B. bifidum Saccharomyces cerevisiae B. longum B. brevis Torulopsis spp. B. infantis B. pseudolongum Pediococcus acidilactici S. salivarius subsp. thermophilus B. thermophilus Saccharomyces boulardii Enterococcus faecium 2.2. Probiyotik Etkinin Bilimsel Temeli ve Mekanizması Deri, ağız boşluğu, gastrointestinal ve ürogenital sistemler başta olmak üzere insan vücudu, yüzlerce mikroorganizmanın yaşadığı dinamik bir ekosistemdir. İnsan vücudundaki toplam bakteriyel populasyonun yaklaşık düzeyinde olduğu tahmin edilmektedir (Yücecan 2002). Sindirim sisteminde bulunan mikroorganizma çeşitleri Çizelge 2.2. de verilmiştir. Vücudumuzdaki toplam hücre sayısı ile kıyaslandığında, bakteri sayısının 10 kat daha fazla olduğu görülmektedir (Salminen 1999). Mikroorganizmalardan arındırılmış (gnotobiotic) denek hayvanları ile yapılan çalışmalar mikrobiyel kolonizasyonun yaşam için zorunlu bir gereksinim olmadığını göstermiştir. Hatta mikrobiyel kolonizasyon, bazı mikrobiyel metabolitlerin toksik, karsinojenik ve mutajenik potansiyelleri nedeni ile olumsuz etkilere bile neden olabilmektedir. Bununla birlikte gnotobiyotiklerin, doğal koşullarda yetiştirilen denek hayvanlarına göre infeksiyonlara karşı daha duyarlı oldukları da bilinen bir gerçektir. Buradan hareketle yetersiz bağışıklık sonucu zararlı mikroorganizmaların intestinal sistemde hiçbir direnç olmaksızın kolayca kolonize olabilecekleri düşünülmektedir. Doğal koşullarda yetiştirilmiş denek hayvanları ile gnotobiyotikler arasındaki farklılıklar, mikrobiyel kolonizasyonun konakçı sağlığı açısından çok önemli olduğu fikrinin temelini oluşturmaktadır (Mattila-Sandholm vd 1999, Salminen 1999). 4

14 Çizelge 2.2. Sindirim sisteminde yaygın olarak bulunan mikroorganizmalar Sindirim sistemi bölgesi Ağız boşluğu Yutak Mide Duodenum Jejunum İnce bağırsak Kör bağırsak Kalın bağırsak Anüs Baskın flora Lactobacillus, Bacteroides, Veillonella, Fusobacterium Lactobacillus, Bacteroides, Veillonella, Fusobacterium Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Fusobacterium Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Veillonella, Eubacterium Enterococcus, Lactobacillus, Veillonella, Eubacterium Enterococcus, Lactobacillus, Veillonella, Eubacterium Peptostreptococcus, Bifidobacterium, Bacteroides, E. coli, Eubacterium, Clostridium, Lactobacillus, Fusobacterium Peptostreptococcus, Bifidobacterium, Bacteroides, E. coli, Eubacterium, Clostridium, Lactobacillus, Fusobacterium Peptostreptococcus, Bifidobacterium, Bacteroides, E. coli, Eubacterium, Clostridium, Lactobacillus, Fusobacterium İntestinal ekosistemin fizyolojik dengesi hastalık, yaşlılık, stres, antibiyotik veya ilaç kullanımı, diyet alışkanlıklarının değiştirilmesi, iklim koşullarında meydana gelen değişmeler ve çevresel toksik maddeler gibi faktörlerden direkt veya dolaylı olarak etkilenebilmektedir (Şekil 2.1) (Cedgård 2000). Diyet İklim Stres Çevre Antibiyotik ve ilaçlar Mikroorganizmalar Antibiyotik ve ilaç Besinlerin emilimi Gastrointestinal fonksiyon İntestinal ekosistemin Hastalık Alerji Bağışıklık sistemi Yaşlanma Şekil 2.1. İntestinal sistemin florasını etkileyen faktörler İntestinal sistemin dengesinde meydana gelen bu düzensizlikler disbiosis olarak adlandırılmaktadır. Disbiosisin tersi bir durum olarak, intestinal sistemde bulunan faydalı mikroorganizmaların sistemin fizyolojik dengesine olumlu yönde katkıda bulunmasına probiosis, bu mikroorganizmalara da probiyotik mikroorganizmalar denilmektedir. Konakçının yaşantısı esnasında karşılaştığı şartlar ve buna bağlı olarak hormonal sisteminde meydana gelen değişiklikler de disbiosisi meydana getiren en önemli etmenlerden birisidir. Tedavi amacıyla alınan ilaçların birçoğu faydalı floranın 5

15 inhibisyonuna neden olmaktadır. Disbiosise neden olan etmenlerden bir diğeri de iklim koşullarında meydana gelen değişmelerdir. Seyahat esnasında meydana gelen ve seyahat diyaresi olarak bilinen düzensizlik bunun en iyi bilinen örneğidir. Sağlıklı bir yaşam için faydalı etki gösteren mikroorganizmaların intestinal sistemdeki sayısı yeterli değilse mutlaka dışarıdan takviye edilmesi gerekmektedir (Çakır vd 2001). Probiyotiklerin konakçıyı intestinal sistem bozukluklara karşı nasıl koruduğunu açıklamaya çalışan birçok mekanizma bulunmaktadır. Ancak yine de hangi patojenlere karşı hangi probiyotiklerin etkili olduğunun tam olarak belirlenmesi için daha çok çalışmaya gereksinim vardır. Probiyotiklerin muhtemel etki mekanizmaları aşağıda maddeler halinde özetlenmiştir (Goldin ve Gorbach 1984, Salminen 1998, Salminen 1999, Rolfe 2000, Forestier vd 2001, Çakır vd 2002). Bunlar: 1. İnhibe edici maddeler üreterek: Probiyotikler, Gram pozitif ve Gram negatif mikroorganizmalar üzerinde etkili birçok madde üretmektedir. Bunlardan bazıları organik asitler, hidrojen peroksit, bakteriyosin ve bakteriyosin benzeri maddelerdir. 2. Tutunma bölgelerini bloke ederek: Probiyotikler tutunma bölgeleri için patojenlerle rekabete girerek, intestinal sistemde yerleşmelerini engellemektedirler. 3. Besin maddeleri için rekabet: Probiyotikler patojenler için de gerekli olan besin maddelerini tüketerek, onların sistemde uzun süre kalmasını engellemektedirler. Ancak bu mekanizmanın kanıtlanabilmesi için in vivo verilere gereksinim duyulmaktadır. 4. Toksin reseptörlerinin yıkımı: Bu mekanizma hayvanlarda S. boulardii nin intestinal mukozada bulunan Clostridium difficile nin toksin reseptörlerini parçalayarak konakçıyı koruması nedeniyle ortaya atılmıştır (Castagliuola vd 1999). 5. Bağışıklık sistemini güçlendirmesi: Son yıllarda yapılan çalışmalar probiyotiklerin spesifik ve spesifik olmayan bağışıklık sistemini güçlendirerek intestinal hastalıklara karşı konakçıyı koruduğunu ortaya koymuştur (Fukushima vd 1998). Bu mekanizma tam olarak aydınlatılamamış olmasına rağmen spesifik hücre duvarı komponentlerinin veya hücre yüzeylerinin adjuvant etki gösterdiği ve humoral immun yanıtı güçlendirdiği düşünülmektedir Probiyotiklerin Sağlık ve Hastalıktaki Rolü Fermente ürünlerin ve probiyotiklerin çeşitli gastrointestinal hastalıkları önlediği ve tedavi ettiğini açıklayan yüzlerce yayın bulunmaktadır (Karahan ve Çakmakçı 1996, Kailasapathy ve Rybka 1997, Çakır vd 2001, Çakır ve Çakmakçı 2002). Ancak bu yayınlardan sadece birkaç tanesi yeterli sayıda denek kullanılarak, kontrollü ve sonuçları istatistiksel analizlerle elde edilen verilerle kanıtlanmış çalışmalardır. Bu çalışmaların büyük çoğunluğu tam olarak tanımlanamamış suşların kullanıldığı, denek sayısının istatistiksel olarak çok az olduğu, zayıf dizayn edilmiş çalışmalardır. Yararlı 6

16 olsun veya olmasın spesifik bir probiyotik mikroorganizma, cins ve tür düzeyinde doğru olarak tanımlanamadıkça sağlık üzerine olumlu etkisinden söz edilmemelidir (Sanders 1999). Çok sayıdaki ve çeşitli denemeler arasında nadiren de olsa suşa-özgü etkilerden bahsedilmiştir. Bunun aksine immün fonksiyon, anti kanser etki ve diyarenin engellenmesi gibi yararlı etkiler, Lactobacillus, Enterococcus ve Bifidobacterium gibi değişik cinslere özgü farklı kültürler tarafından gösterilmektedir. Etki mekanizmaları daha iyi anlaşıldıkça ve kontrollü çalışmalarla aynı genetik yapıya sahip suşlar arasındaki farklılıklar tam olarak ortaya konuldukça, suşlara özgü tahmin edilen probiyotik etkiler kanıtlanmış olacaktır. Buna ilâveten konakçının fizyolojik koşulları da mikroorganizma suşunun probiyotik etkinliğinde önemli rol oynamaktadır (Karahan ve Çakmakçı 1996, Sönmez vd 1999). Probiyotiklerin hastalıktan koruyucu ve tedavi edici etkileri aşağıda ayrıntılı olarak ele alınmıştır Tedavi edici etki Probiyotiklerin sağlık üzerindeki olumlu etkileri uzun yıllardan beri bilinmektedir. Gıdaların genellikle pastörize edilerek kullanıldığı günümüzde Metchnikoff un 1900 lü yılların başında yoğurt tüketimine sağlık açısından dikkat çekmiş olmasını daha da anlamlı hale getirmektedir. İntestinal floradaki bakterilerin sağlık açısından önemleri günümüzde daha iyi anlaşılmış durumdadır. Bu bağlamda yapılan araştırmalar sağlıklı bir yaşam sürmek, vücut direncini arttırmak, intestinal düzensizliklerle ve hastalıklarla mücadele etmek için probiyotik ürün tüketimini önermektedir (Laurens-Hattingh ve Viljoen 2001). Probiyotik tüketiminin tedaviye olan katkıları ve etki mekanizmalarının temeli Çizelge 2.3 te verilmiştir (Fuller 1989, Sanders 1999, Laurens-Hattingh ve Viljoen 2001) Kanser İnsanlarda görülen kanserlerin nedeni % oranında çevresel faktörlerden kaynaklanmaktadır. Karsinojen maddeler vücut dışında üretilmekte ve ön karsinojen maddeler olarak alındıktan sonra kanser etmeni bileşiklere dönüşmektedir. İntestinal sistemde bulunan bakteriler karsinojenlerin inaktivasyonunda, yayılmasında ve özellikle de nitrozaminlerin ve safra sterollerinin kanser etmeni maddelere dönüşmesinde önemli rol oynarlar. Araştırmalar diyetin bileşiminde bulunan maddelerin de kanser oluşumunu arttırdığını veya azalttığını göstermiştir (Sanders 1999). Probiyotiklerin kanser oluşumu riskini azalttığı ise birçok araştırmacı tarafından ortaya konulmuştur (Aso ve Akazan 1992, Goldin vd 1996, Hirayama ve Rafter 1999, Sanders 1999, Brady vd 2000). Örneğin Aso ve Akazan (1992), çalışmalarında kob/g düzeyinde L. casei toz preparatından bir yıl boyunca günde üç defa tüketen insanlarda mesane kanseri tedavi sürecinin hızlandırıldığını tespit etmişlerdir. Bir başka çalışmada ise L. acidophilus tüketiminin kalınbağırsak kanserini önlediği tespit edilmiştir (Goldin ve Gorbach 1984). Bu çalışmaya sağlıklı bireylerden 21 adet gönüllü katılmış ve L. acidophilus kültürü süt veya yoğurda katılarak (asidofiluslu süt veya yoğurt) deneklere verilmiştir. Araştırmacılar bir aylık uygulama periyodundan sonra dışkıdaki prokarsinojenleri 7

17 karsinojene dönüştüren bakteriyel enzim konsantrasyonunda önemli azalmalar olduğunu bildirmişlerdir. Benzer çalışmalarda L. acidophilus katılmayan sütlerde ise aynı sonuç alınamamıştır (Murray 1998, Gmeiner vd 2000). Çizelge 2.3. Probiyotiklerin potansiyel etki mekanizmalarının temeli Yararlı etki Laktoz sindirimine katkı Enterik patojenlere karşı direnç Bağırsak kanserini önleyici etki İnce bağırsakta aşırı bakteri gelişiminin engellenmesi Bağışıklık sisteminin düzenlenmesi Alerji Kan lipidleri ve kalp hastalıkları Hipertansiyonu önleyici etki Ürogenital enfeksiyonlar Helicobacter pylori nin neden olduğu enfeksiyonlar Hepatik ensefalopati Etkinin mekanizması Bakteriyel laktaz ile laktozun sindirimi - Bağışıklık salgılama etkisi - Kolonizasyon direnci - İntestinal sistemin patojenler için uygun olmayan koşullara değişimi (ph, kısa zincirli yağ asitleri ve bakteriyosinler) - Toksin bağlama bölgelerinin yapısal değişimi - İntestinal flora populasyonları üzerindeki etki - İntestinal mukozada agregasyon oluşturarak patojenlerin bağlanmasını engelleme - İntestinal musin üretimini düzenleyerek patojenlerin epitel hücrelere tutunmasını önlemek - Mutajenleri bağlama - Karsinojenlerin aktivitesini engelleme - Bağırsak mikroorganizmalarının ürettiği karsinojen üreten enzimlerin inhibisyonu - Bağışıklık sistemini güçlendirme (immün yanıt) - İkincil safra tuzu konsantrasyonunu etkileme - İnce bağırsak florasındaki aşırı gelişmiş floranın aktivitesini etkileyerek, toksik metabolitlerin üretimini engelleme - İnce bağırsak koşullarını aşırı gelişen floranın aktivitesi için uygun olmayan hale getirme - Enfeksiyon ve tümör oluşumuna karşı spesifik olmayan savunma mekanizmasını güçlendirme - Antijene özgü immün yanıta yardımcı etki - IgA üretiminin arttırılması - Antijen etkiye sahip maddelerin dolaşım sistemine geçişinin engellenmesi - Kolesterolün bakteri hücresi içinde asimilasyonu - Safra tuzu hidrolazın dekonjugasyonu ile safra tuzlarının atılımını arttırmak - Antioksidasyon etkisi - Peptidazın süt proteinleri üzerine etkisi sonucu oluşan tripeptitler angiotensin 1 enzim dönüşümünü inhibe etmesi - Hücre duvarı komponentlerinin angiotensin 1 enzim inhibitörleri gibi davranması - Ürinar ve vajinal bölge hücrelerine adhesyon - Kolonizasyon direnci - İnhibitör üretimi (H 2 O 2, biyosürfaktant) - H. pylori inhibitörlerinin üretimi (laktik asit vb) - Üreaz üreten bağırsak florasının inhibisyonu Probiyotiklerin kanser oluşum riskini azaltması, kanser oluşum mekanizmalarını baskılamaları ile açıklanmaya çalışılmaktadır. Bu mekanizmalar: Doku kültürü 8

18 hücrelerinde hücre büyümesi ve farklılaşması, hayvanlarda bağırsak dokusu hücrelerinde görülen normalden sapmalar, farelerde tümör oluşumunun (bağırsak, karaciğer, meme) engellenmesi, insanlarda mesane yüzeylerinde oluşan kanserin tekrarlanması, deney hayvanları ve insanların dışkısında bulunan ve prokarsinojenleri karsinojenlere çeviren enzim (nitroredüktaz, β-glukuronidaz, azoredüktaz, 7-αdehidroksilaz, glikokolik asit hidrolaz) aktiviteleri, mutajenik aktivite ve genotoksisite (McConnel ve Tannock 1993, Goldin vd 1996, Rowland vd 1998, Rao vd 1999) olarak sıralanabilir. Özet olarak, probiyotikler bazı karsinojenlerle mücadelede aşağıdaki nedenlerden dolayı başarılı olmaktadırlar. Bu nedenler: 1. Probiyotikler nitrit gibi karsinojen özellik gösterek bazı maddeleri elemine ederler. Bu karsinojenler kürlenmiş ette ve diğer gıdalarda bulunmakta olup, bağırsak sisteminde nitrozaminlere dönüşme potansiyeline sahiptir. Probiyotik laktobasiller nitrat ve nitritleri nitrozaminlere dönüşmeden önce inaktif hale getirmek, 2. Gastrointestinal sistemde bulunan diğer bakteriler tarafından ürettiği prokarsinojenleri karsinojenlere çeviren enzimlerin yapısını değiştirmek ve 3. Tümör oluşum aktivitesini baskılamaktır İmmün fonksiyonları Gastrointestinal sistemin normal florası, konakçının mukozal ve sistemik immünitesini etkilemektedir. Probiyotik mikroorganizmalar sitokin üretimi, tek çekirdekli hücrenin hızlı gelişimi, makrofaj fagositozu ve öldürme etkisi, otoimmünitenin modülasyonu ve bakteriyel ve protozoon patojenlerine karşı bağışıklık gibi immün sistemle çok değişik düzeylerde etkileşim halindedirler. Endotoksik lipopolisakkarit, peptidoglikanlar ve lipotaykoik asitler gibi bakteriyel bileşikler, immün sistemin düzenlenmesini etkileyebilirler. Laktobasiller insan epitel hücrelerine bağlanarak makrofajları aktive edebilirken, yoğurt laktobasilleri kan dolaşımı CD4 + ve CD8 (diferensiasyon kümeleri) T lenfositlerine in vitro olarak bağlanabilmekte ancak B hücrelerine bağlanamamaktadır (Mitsuoka 1996, Fukushima vd 1998, Castagliuola vd 1999, Lee vd 1999, Chin vd 2000). Fang vd (2000) tarafından gerçekleştirilen bir çalışmada, 30 adet sağlıklı gönüllü rastgele seçimle üç gruba bölünmüş ve bu gruplara 7 gün süreyle Lactobacillus GG, Lactococcus lactis ve plasebo (etil selüloz) verilmiştir. Çalışmanın 1., 3. ve 5. günlerinde tüm deneklere enteropatojenik enfeksiyon benzeri olarak, ağızdan etkinliği azaltılmış Salmonella Typhi Ty21a aşısı verilmiştir. Bütün denekler aşıya karşı çok iyi yanıt vermiş fakat değişik deneme grupları arasında IgA, IgG ve IgM salgılayan B lenfosit hücre sayısında bir değişiklik gözlenmemiştir. Lactobacillus GG kombinasyonu ile birlikte uygulanan aşı grubunda spesifik IgA da önemli artış eğilimleri belirlenmiştir. 9

19 L. lactis ile birlikte aşıyı alan deneme grubunda nötrofillerde komponent reseptörlerinin (CR3) ekspresyonu çok yüksek düzeylerde belirlenirken, Lactobacillus GG ve plasebo verilen gruplarda benzer etki görülmemiştir. Bu sonuçlar, probiyotiklerin oral yolla alınan S. Typhi aşısına karşı farklı immün yanıtlar oluşturduğunu ve bu yanıtın probiyotik mikroorganizmanın türüne bağlı olduğunu göstermiştir. Bifidobakterler in vitro koşullarda, yüksek oranlarda IgA oluşumunu teşvik etmektedir. Bir araştırmada, B. animalis, B. longum, B. breve türlerinden B. breve nin tüm suşları ile B. longum izolatlarından bir tanesinin IgA sentezini önemli oranlarda yükselttiği gösterilmiştir (Lee vd 1999) Diyare Çocuklarda ve yetişkinlerde görülen akut diyarenin tedavi edilmesinde ve C. difficile etmeni ile oluşan enfeksiyonların tedavisinde farmasötik probiyotiklerin başarı ile kullanıldıkları gösterilmiştir (McFarland ve Elmer 1997). Enterotoksijenik E. coli en yaygını olmakla birlikte seyahat diyarelerine neden olan çok çeşitli etkenler vardır. Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus ve Saccharomyces gibi bazı probiyotik bakterilerin seyahat diyarelerini engelleme yetenekleri araştırılmıştır (Hilton vd 1997, Karahan ve Çakmakçı 1998, Rolfe 2000). Diğer yandan özellikle gelişmekte olan ülkelerde rotavirüsler bebek hastalıkları ve ölümlerinin en önemli nedeni olarak karşımıza çıkmaktadır. 4-4,5 aylık 74 adet diyareli bebek ile yapılan bir çalışmada rotavirüs enfeksiyonunun tedavisinde Lactobacillus GG kullanımı, plaseboya kıyasla daha iyi sonuç vermiştir (Majamaa vd 1995, Rolfe 2000). Diyare olan bebeklerin yaklaşık %80 inin rotavirüs pozitif olduğu düşünülürse bu sonucun ne kadar önemli olduğu daha iyi anlaşılacaktır. Araştırmalar ayrıca diyareli hastaların iyileşme süresinin Lactobacillus GG kullanımı ile önemli oranda (2,4 günden 1,4 güne) kısaldığını da göstermiştir (Isolauri vd 1995, Lee vd 1999) Serum kolesterol düzeyi Bazı kan lipidlerinin yüksek düzeyleri kardiyovasküler hastalıklar açısından risk faktörüdür. Birçok araştırmacı laktik kültür içeren süt ürünleri ve probiyotiklerin kolesterol düşürücü etkileri olduğunu bildirmiştir (Murray 1998, Taylor ve Williams 1998, Rolfe 2000) den bugüne fermente süt ürünleri tüketiminin kan lipidleri üzerindeki etkisini değerlendiren ve toplam 534 denek ile yapılan çalışmalar sonucunda, 15 ten fazla araştırma yayınlanmıştır. Bu araştırmalar sonucunda kolesterol düşürücü etki istatistiksel olarak önemli bulunmuş ve toplam kolesterolde %2,4-23,2, düşük dansiteli lipoprotein (LDL) kolesterolünde ise %9,0-9,8 oranlarında azalma tespit edilmiştir (Murray 1998, Sanders 1999). Probiyotik bakterilerin serum kolesterolünü düşürücü etkileri ve mekanizması tam olarak açıklanamamıştır. Bir hipoteze göre, L. acidophilus un bazı suşlarının kolesterolü asimile ettikleri ileri sürülmektedir (Gilliand 1990, Rasic vd 1992). Bir başka teoride ise, probiyotik laktobasillerin ve bifidobakterlerin safra tuzlarını serbest asitlere parçalayarak, konjuge safra tuzlarının intestinal sistemden daha hızlı uzaklaştırılmasını sağladıkları varsayılmaktadır. Serbest 10

20 safra tuzları vücuttan atıldığı için, kolesterolden yeni safra asitlerinin sentezi, vücuttaki toplam kolesterol konsantrasyonunu düşürebilmektedir (Vaughan vd 1999, Laurens- Hattingh ve Viljoen 2001). Üçüncü hipotezde ise kolesterolün azalması, probiyotik laktik asit bakterilerinin asit üretimi sonucu düşen ph değerlerinin dekonjuge safra tuzları ile kolesterolün presipitasyonuna neden olduğu yorumu ile açıklanmaktadır (Tahri vd 1996, Kailasapathy ve Rybka 1997, De Boever vd 2000). Rossi vd (1999) ise yaptıkları çalışmada Enterococcus faecium, L. acidophilus, L. jugurti, S. salivarius subsp. thermophilus ve L. delbrueckii subsp. bulgaricus un in vitro koşullarda kolesterolü düşürme ve safra tuzları varlığında gelişebilme yeteneklerini araştırmışlardır. Araştırma sonunda her iki özelliğin de çalışılan türlere bağlı olarak değiştiği tespit edilmiştir. Bu araştırmada ayrıca kültürler tekli veya karışık starterler halinde, kurutulmuş peyniraltı suyu tozu ile desteklenen soya sütüne katılarak ve fermentasyon sonunda fizikokimyasal ve duyusal değerlendirmeye alınmışlardır. Değerlendirme sonunda fermente ürünlerden en beğenilenin E. faecium ile L. jugurti (1:1 oranında) kombinasyonu kullanılarak yapılan fermente ürün olduğu ve bu kültürlerin kolesterolü % 43 oranında düşürdüğü tespit edilmiştir. Diğer yandan Marshal (1996), safra asitlerinin parçalanmasını sitotoksik sekonder metabolitlerin oluşumuna bağlamıştır. Sekonder safra asitleri kanser teşvik edici maddeler olarak bilinmekte ve bu maddelerin aktiviteleri sonucu sağlık riskleri ortaya çıkmaktadır. Bütün bu çalışmaların sonucu olarak probiyotik aktivitenin kolesterol kontrolünde nasıl bir mekanizma ile etkili olduğu hala tartışılmaktadır. Yukarıda açıklanmaya çalışılan mekanizmaların kanıtlanabilmeleri için uzun süreli insan denemelerinin yapılması ve probiyotik etkinin klinik bulgularla ortaya konulması gerekmektedir Sağlık üzerine olan diğer etkiler Probiyotiklerin özellikle Lactobacillus salivarius un, kronik gastrit, peptik ülser ve mide kanseri ile yakından ilgisi olduğu bilinen Helicobacter pylori nin aktivitesini ve kolonizasyonunu engelleme yetenekleri araştırılmıştır. İnsan ve hayvanlarla yapılan deneme sonuçları probiyotiklerin veya probiyotik son ürünlerinin H. pylori enfeksiyonlarını durdurabileceğini göstermiştir (Kabir vd 1997, Aiba vd 1998, Michetti vd 1999, Sanders 1999, McNaught ve MacFie 2001). Hatakka vd (2001) araştırmalarında, uzun süreli probiyotik süt kullanımının gündüz bakım evindeki çocuklarda çok sık görülen solunum yolları ve gastrointestinal enfeksiyonlar üzerindeki etkilerini çift kontrollü denemelerle incelemişlerdir. Araştırmada elde edilen sonuçlara göre L. rhamnosus GG katılarak verilen sütü tüketen 11

21 çocuklarda rotavirustan kaynaklanan diyarenin şiddetinin azaltıldığı, antibiyotik kullanımından kaynaklanan diyarenin ise önemli ölçüde önlendiği tespit edilmiş, ancak solunum yolu enfeksiyonlarının önlenmesinde daha az etkili olduğu belirlenmiştir. Laktobasiller vajina normal florasının en önemli grubunu oluşturmaktadır (Ocaña vd 1999). Bu bakterilerin, üretmiş oldukları bakteriyosin, laktik asit ve hidrojen peroksit ile patojenlerin kolonizasyonuna engel oldukları birçok araştırmacı tarafından vurgulanmıştır (McFarland ve Elmer 1997, Sönmez vd 1999, Reid 2000, Çakır ve Çakmakçı 2002). Yapılan çalışmaların büyük çoğunluğu probiyotik bakterilerin vajina içi uygulamaları şeklinde yapılmış olmasına karşın; ağız yoluyla alınan L. acidophilus içeren ürünlerin Candida albicans enfeksiyonlarının tekrarlanma oranını azalttığı tespit edilmiştir (Shalev vd 1996, Murray 1998). Ürogenital enfeksiyonların önlenmesinde, diyetle birlikte alınan probiyotik ürünlerinin rolünü kanıtlamak için plasebo kontrollü denemeler yapılması gerekmektedir. Probiyotiklerin bütün bu yararlı etkileri arasında laktoz intoleransını düzenleyici etkisi önem taşımaktadır. Laktoz intoleransı probiyotik ürün kullanımı ile tedavi edilebilecek çok önemli bir sağlık sorunudur. Bu sorun laktozun laktaz ile parçalanıp sindirilememesi sonucu ortaya çıkan bir bozukluktur. Cerrahi operasyon, bağırsak düzensizlikleri ve antibiyotik tedavisi gibi faktörler vücudun laktaz üretimini azaltabilmektedir. Laktozu kullanan bakteriler ve oluşturdukları yan ürünler karın krampları, bulantı, diyare ve kusmaya neden olmaktadır. Lactobacillus, Bifidobacterium ve Streptococcus gibi laktaz pozitif probiyotik bakteri türleri, genellikle pastörize süt ürünlerine ilâve edildiklerinde bu ürünlerdeki laktoz sindirimini arttırmaktadırlar (Murray 1998, Sanders 1999, Rolfe 2000). Süt ürünlerine probiyotik bakteri ilâve edilmesinin laktoz intoleransına yararlı etkileri iki olası mekanizma ile açıklanmaya çalışılmaktadır. Bunlardan birincisi, fermentasyon ile süt ürünlerinde bulunan laktozun parçalanması, ikincisi ise laktaz enzimi üreten probiyotiklerin gastrointestinal bölgelerdeki çoğalmasıdır (Karahan ve Çakmakçı 1998, Ouwehand ve Salminen 1998, Rolfe 2000, Çakır ve Çakmakçı 2002) Potansiyel Probiyotik Mikroorganizmalar ve Ürünler Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Saccharomyces, Aspergillus ve Torulopsis cinsine ait türlerdir. Ticarî olarak satılan ve potansiyel oluşutran suşlar Çizelge 2.4 te verilmiştir (Lee vd 1999). Bunlardan Lactobacillus ve Lactococcus cinsleri GRAS olarak kabul edilirken, Streptococcus ve Enterococcus cinsine ait bazı türler güvenilir değildir (Tannock 1999b). Ticarî probiyotik preparatlarında en yaygın olarak kullanılan türler Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium ve Enterococcus cinsine ait laktik asit bakterileridir. Bu mikroorganizmalar gastrointestinal mikroorganizma florasının en önemli grubunu oluşturmaktadır. 12

22 Çizelge 2.4. Ticarî probiyotik kültürleri ve satan firmalar Taksonomik adı Satan firma Bifidobacterium breve Strain Yakult: Yakult, Tokyo, Japonya B. bifidum Strain YIT 4002: Yakult, Tokyo, Japonya Strain A234-4 Japan Bifidus Foundation, Tokyo, Japonya B. infantis Strain ATCC15697: ATCC, Rockville, MD, ABD B. lactis Chr. Hansen Ltd., Hørsholm, Danimarka B. longum Strain F6-1-ES, 69-2bs: Nikken Chemicals, Tokyo, Japonya B. thermophilum Strain P2-91 Lactobacillus acidophilus Strain NCDO1748: National Collection of Dairy Organisms, Reading, İngiltere Strain SBT2062: Snow Brand Milk Products, Kawagoe, Japonya Strain NCFM: GPGurlock, Cincinnati, OH, ABD L. delbrueckii subsp. bulgaricus Strain FW148: Unilever Research Laboratory, Welwyn, İngiltere Commercial Yogurt Starter Culture: Chr. Hansen s Laboratory, Milwaukee, WI, ABD Marshall Products, Madison, WI, ABD L. helveticus - L. casei Strain Shirota: Yakult, Tokyo, Japonya L. fermentum - L. johnsonii Strain LC1: Nestlé Ltd., Vevey, İsviçre L. plantarum Strain ATCC14917: ATCC, Rockville, MD, ABD L. rhamnosus Strain GG: Valio, Helsinki, Finlandiya Strain ATCC53103: ATCC, Rockville, MD, ABD Lactophilus Laboratories Lyocentre, Fransa L. salivarius Strain WB1004: Wakamoto Pharmaceutical, Tokyo, Japonya Enterococcus faecium Streptococcus salivarius subsp. thermophillus Strain SF68: A B Cernel, Engelholm, İsveç Giuliani, Lugano, İsviçre Strain ATCC19258: ATCC, Rockville, MD, ABD Commercial Yogurt Starter Culture: Chr. Hansen s Laboratory, Milwaukee, WI, ABD Marshall Products, Madison, WI, ABD İnsan tüketimi için hazırlanmış çok fazla sayıda ticarî probiyotik preparatı bulunmaktadır. Bunlardan birçoğu farmasötikaller olarak, kapsül, toz, tablet veya sıvı formda satışa sunulmaktadır. Bunlardan yalnızca birkaç tanesinin fonksiyonel gıda bileşeni olarak yararlı etkisi kanıtlanmıştır. Lactobacillus casei Shirota suşu ticarî olarak satışa sunulanlardan en eskisi olup, 1930 yılında Japonya da izole edilmiştir. Ayrıca bu kültür Yakult firması tarafından üretilen probiyotik ürünlerinin temelini oluşturmaktadır (Kneifel vd 1999). Lactobacillus rhamnosus GG ise çok iyi organize edilmiş bir çalışma sonunda, 1985 yılında insan dışkısından izole edilmiştir. Bu kültür üzerinde en çok çalışılan, günümüz probiyotik preparatlarında ve gıdaların bileşiminde yaygın olarak kullanılan ve en az 15 ülkede kullanım hakkı satın alınmış bir suştur. Klinik olarak güvenilir oldukları kanıtlanan diğer ticarî kültürler ise Lactobacillus johnsonii LA1, Lactobacillus acidophilus NCFB 1748, Bifidobacterium longum BB536 ve Bifidobacterium lactis BB12 suşlarıdır. Ticarî kültür ve ürünler hakkında daha ayrıntılı bilgi Çizelge 2.5 te verilmiştir (Lee vd 1999, Çakır ve Çakmakçı 2002). 13

23 Çizelge 2.5. Ticarî probiyotik preparatları ve bunlar hakkında bazı bilgiler Ürün adı Üretici firma Etkin mikroorganizma Ürün formu Ülke Yakult 65 Yakult Honsha L. casei Shirota Fermente sütlü Japonya içecek Sofuhl Yakult Honsha L. casei strain Shirota Fermente süt Japonya S. thermophilus Morinaga Morinaga Milk B. longum Fermente süt Japonya Bifidus Industry L. acidophilus Levenin Wakamoto L. acidophilus Liyofilize toz Japonya Pharmaceutical B. infantis E. faecalis CHAMYTO Nestlé L. johnsonii Fermente sütlü Brezilya L. helveticus içecek Vitagen Malaysia Dairy L. acidophilus Fermente sütlü Malezya, Bio-Grade Industry JALNA Dairy Food L. acidophilus B. bifidum L. casei LC1 Nestlé S. thermophilus L. bulgaricus L. johnsonii içecek Fermente süt Yoğurt, fermente süt Singapur Avusturalya Türkiye, AB ülkeleri Ventrux Acido A B Cernelle S. feacium SF 68 Kapsül İsçeç Biola Tine B. lactis L. acidophilus L. rhamnosus GG Yoğurt, fermente süt Norveç LC1 Nestlé S. thermophilus L. bulgaricus L. acidophilus NCC 208 Lactophilus Erivan Acidophilus Yoghurt Kapsül AB ülkeleri Laboratories L. casei subsp. Liyofilize toz Fransa Lyocentre rhamnosus Erivan Dairy L. acidophilus Fermente süt ABD Classic Flavor Danone L. acidophilus Fermente süt ABD Lactinex Hynson, Westcott L. acidophilus Toz ABD and Dunning L. bulgaricus LGG ConAga L. rhamnosus GG Kapsül ABD Probiotica MacNeil-PPC Inc. L. reuteri Kapsül ABD Dairy Care Plainviev LLC L. acidophilus Kapsül ABD 2.5. Probiyotiklerin Güvenilirlik Kriterleri Günümüzde ticarî probiyotik ürünler hakkındaki mevcut bilgiler bu ürünlerin güvenilir olduklarını göstermektedir (Salminen ve vonwright 1998, Mattila-Sandholm vd 1999). Bununla birlikte, potansiyel yeni cins ve türlerin probiyotik ürün oluşturmak amacıyla seçiminde, Avrupa Birliği tarafından önerilen yeni gıda üretiminde uyulması zorunlu güvenlik kriterlerine dikkat edilmesi gerekmektedir. Probiyotik ürünlerin güvenilirliği, üretilecek olan gıdanın fenotipik ve genotipik özellikleri ile bu mikroorganizmaların gıdalarda kullanımının geçmişi konusunda elde bulunan veriler temel kriterler olarak değerlendirilmektedir. Bu konuda yapılan araştırmalar genetik olarak düzenlenmiş 14