Dokuda saptanmaya çalışılan protein antijen,bu proteinin saptanması için yararlanılan protein ise antikordur.işaretlenmeye çalışılan proteinin tam

Transkript

1 Doç.Dr.Engin DEVECİ

2 İmmunohistokimya: Hücre ve doku içinde bulunan bazı enzimlerin ya da makromoleküllerin lokalizasyonlarını incelemeye yardımcı olur. Sistem incelenecek olan bir makromeleküle karşı geliştirilmiş olan bir antikorun ortaya konulmasıdır.

3 Dokuda saptanmaya çalışılan protein antijen,bu proteinin saptanması için yararlanılan protein ise antikordur.işaretlenmeye çalışılan proteinin tam olarak dokunun neresinde olduğunu gösterebilen avantajlı bir yöntemdir. Poliklonal ve monoklonal olmak üzere iki antikor kullanılır.poliklonal antikorlar, bir hayvanı bir antijen ile immunize ederek üretilen antikorlardır.bir hayvan cinsinden örneğin bir sıçandan alınan bir antijen başka bir hayvan cinsine (tavşan )enjekte edildiğinde yabancı bir madde olarak algılandığından dolayı B lenfositler tarafından verilen antijene karşı antikor üretilir.üretilen bu poliklonal antikorlar kandan izole edilip saflaştırılır. Bu antikor artık sıçan dokularında veya hücrelerindeki proteini bağlayarak işaretleyebilir. Monoklonal antikorlar ise tek bir B lenfosit grubunun ürettiği antikorlardır.bu hücre kolonları tek bir antikor üreten plazma hücrelerinden gelişen bir tümor olan çok yönlü myelomdan gelişir.

4 Hücre yada dokunun belirlenmesi, Antijenin saptanması, Fiksasyonun saptanması, Yöntemin saptanması, Uygun antikorların hazır bulundurulması.

5 Direkt Yöntem İndirekt Yöntem Çözünebilir Enzim İmmun kompleks yöntemi Avidin-Biotin Yöntemi

6 Direkt yöntem Dokudaki antijene direkt olarak işaretlenmiş primer antikor bağlanır.genellikle primer antikora bağlanan işaretleyiciler peroksidaz,alkalen fosfataz,gibi enzimler veya florokromlardır.işaretleyici olarak enzim kullanıldığında kromojen substrat uygulanarak görüntü elde edilir.(böbrek ve deri biopsileri )

7 Bu yöntemde dokudaki antijene önce işaretli olmayan primer antikor bağlanır. Ardından işaretlenmiş ikinci (sekonder) antikor primere bağlanır. İşaretleyici olarak enzim kullanıldığında kromojen substrat uygulanarak ışık mikroskobunda görüntü elde edilir

8 Fluorochrome-conjugated Primary Antibody Antigen expressing Cell

9 Fluorochrome-conjugated Secondary Antibody (anti species X) Primary Antibody (from species X) Antigen expressing Cell

10 Primer antikor,bağlayıcı (sekonder)antikor ve çözünebilir bir enzim antienzim kompleksinden oluşan üç aşamalı bir yöntemdir.primer antikor ve enzimantienzim kompleksi aynı hayvandan elde edilir.ve her ikisini tanıyan sekonder antikora bağlanır.bu teknikle en yaygın kullanılan kompleksler peroksidaz-antiperoksidaz (PAP)ve alkalen fosfataz- antialkalen fosfataz (APAAP)kompleksleridir.

11 Avidin vitamin olan biotine affinitesi çok yüksektir. İkisi arasında irreversibl bağlanma olur.avidin-biotin yönteminde önceleri yumurta akından elde edilen avidin kullanılırken günümüzde Streptomyces avidinii mikroorganizmasından izole edilen streptavidin tercih edilmektedir.primer antikora,biotinlenmiş sekonder antikor bağlanır Fluorochrome-conjugated Streptavidin Biotinylated Secondary Antibody (anti species X) Primary Antibody (from species X) Antigen expressing Cell

12

13 13

14 14

15 15

16 Morfolojiyi iyi korumalı İmmun reaktiviteyi bozmamalı Antijenik diffuzyon ve antijenin yer değiştirmesine neden olmamalı Antiserum,substrat v.b ile reaksiyona girmemeli

17 Çapraz bağlar oluşturan fiksatifler,dokudaki proteinlerle çapraz bağlar oluşturarak etki ederler.en önemli fiksatif formalindir. Koagülatif fiksatifler,dokuyu dehidrate ederek etki gösterirler.etanol en çok kullanılan Koagülatif fiksatiflerdir.

18 Jelatinli lam ya da kaplı lamlar, Antikor dilüsyonu, Tamponlar, Sıvı Azot.

19 19

20

21 Doku küçültülür. Sıvı azot içinde dondurulur. -20C o de 1-2 gün saklanır. Kriyostat da 5-7µm kalınlığında kesitler alındıktan sonra, jelatin kaplı lam üzerine alınır.

22 Oda ısısında kurutulur. Slikajel ile sıkıca kapalı kutularda 1-2 gün saklanır. Saf asetonda fiksasyon yapılır. +4 o C de 5-10 dakika Hemen boyanmayacaksa aluminyum folyoya sarılarak -20C o de 1-2 ay saklayacak zaman kazanılır.

23 Şayet direk boyamaya geçilecek ise bu durumda 1 saat kadar vantilatörün altında kurutulur. Bu sırada lamların üzeri yazılır. Dakopen ile kesitlerin etrafı çizilir. Primer antikor sulandırılır.

24 Kesitler nemli kutuya yerleştirilir. Primer antikor damlatılır, 1 saat inkübe edilir. 3x10 dakika PBS (Phosphate Buffer Saline) solüsyonuyla yıkanır. Sekonder antikor damlatılır. Yarım saat inkübe edilir.

25 3x10 dakika PBS solüsyonuyla tekrar yıkanır. Kromojen olarak DAB(3,3'diaminobenzidine) hazırlanır. Kesitlere damlatılır ve 2-10 dakika inkübe edilir. 3x10 dakika PBS solüsyonuyla yıkanır.

26 Daha sonra %0.09 NaCl ile yıkanır. Bakır sülfat içinde 15 dakika bekletilir. Hematoksilen ile çekirdek boyaması yapılır. Dereceli alkollerden geçirilerek dehidrate edilir. Xylolde şeffaflandırılır. Entelan ile kapatılır.

27

28 D2-40 Akc-Adeno D2-40 Mezotelyoma 28

29 Sekonder antikor uygulama işlemine kadar yapılan tüm basamaklar aynen uygulanır. Sekonder antikora floresan bir madde bağlıdır. Sekonder antikor dokunun üzerine damlatılır. Daha sonra çekirdek boyası olarak propidyum iyodid damlatılır.

30 Kesitin üzerine su bazlı kapatma maddesi damlatılarak lamel ile kapatılır. Hemen Floresan Mikroskopta incelenir. Daha sonra incelenecek ise derin dondurucuda saklanır.

31

32 İmmunohistokimya için kesitlerin hazırlanması İmmun Boyama 1-Kesit alma 2-Deparafinizasyon 3-Dehidratasyon 4-Yıkama 1-Antijen Maskesinin Kaldırılması, 2-Blokaj 3-Primer Antikor 4-Sekonder Antikor 5-Kromojen 6-Çekirdek Boyaması 7-Dehidratasyon ve Şeffaflandırma 8-Kapama

33 1Kesit Alma 5-7µm kalınlığında kesit,40c o deki su banyosundan lama alınır. Kesitler oda ısısında 1-2 saat bekletildikten sonra 40 o C- 60 o C de ayarlanmış etüvde bir gece bekletilir.

34 İmmunohistokimya için kesitlerin hazırlanması; 2Deparafinizasyon Klasik yöntemlerle kesitler deparafinize edilir. Kesitler bir gece etüvde bekletilirler. Sonraki gün etüvden çıkarılıp oda ısısında soğumaları beklenir. 3x5 dakika xylol den geçirilir.

35 3 Dehidratasyon Dereceli etanollerden sırayla geçirilir. %100 etanol 5 dakika %96 etanol 5 dakika %80 etanol 5 dakika %70 etanol 5 dakika

36 4 Yıkama PBS(7.4 Ph) veya TBS 3x10 dakika yıkanır. Kesitler yıkandıktan sonra etrafı dakopenle çizilir.

37 1 Antijen Maskesinin Kaldırılması Özellikle parafin kesitlerde antijenik bölgelerin açığa çıkarılabilmesi için antijen maskesinin kaldırılması gerekir. İki temel yöntem vardır. I)Fiziksel Yöntem II)Kimyasal yöntem

38 I-Fiziksel Yöntem; Çeşitli Solüsyonlar Sitrat Tampon Solüsyonu(Ph:6.0) TRİS-EDTA Solüsyonu(Ph:9.0) EDTA solüsyonu (Ph:8.0) Mikrodalga Fırın, Otoklav,Düdüklü tencere, Buhar Banyosu,Su banyosu o C de dakika uygulanır.

39 II-Kimyasal Yöntem; Bu yöntemde, proteaz grubu enzimler kullanılır. Kullanılan enzimler; Proteinaz K, Tripsin, Pepsin, 37 o C de dakika nemli kutuda inkübe edilir.

40 2 Blokaj Non-spesifik antijenik bölgeleri bloke etmek için. Endojen Peroksit Blokajı PBS de %3 lük H 2 O 2 10 dakika oda ısısında

41 2 Blokaj 3x5 dakika tamponla yıkama Normal Serum Blokaj solüsyonu (sekonder antikorun elde edildiği türden (hayvandan)serum 1-10% normal serum,0.25%bovine serum albumin,pbs de Ph:7.4

42 2 Blokaj Kullanılan yönteme ve dokuya bağlı olarak ikinci bir bloke edici ajan kullanılabilir. Karaciğer,böbrek ve ince barsak gibi biotin ve avidinden zengin dokularda biotinli sekonder bir antikor kullanılacaksa endojen avidin ve biotini bloke etmek gerekir. Bu durumda Biotin ve Avidin blokaj solüsyonu kullanılır.

43 Biotin-Avidin Blokaj Solüsyonu; PBS de Avidin %0.001 PBS de Biotin %0.001 Hazırlandıktan sonra 4 o C de saklanabilir. Kesitler,her bir solüsyonla dakika inkübe edilir. Arada PBS ile yıkama yapılır. Primer antikor basamağından önce uygulanır.

44 3Primer Antikor Kesitlerin üzerine uygun dilüsyonda hazırlanmış primer antikordan 1-2 damla damlatılır. Kapalı nemli kutularda inkübasyona bırakılır. --- Oda ısısında 1 saat o C de saat. İnkubasyon süresi sonunda 3x5-10 dakika tamponla yıkanır.

45 4 Sekonder Antikor Kesitlerin üzerine uygun dilüsyonda hazırlanmış sekonder antikordan 1-2 damla damlatılır. Kapalı nemli kutuda, Oda ısısında dakika inkubasyona bırakılır. İnkubasyon sonunda 3X5-10 dakika tamponla yıkanır

46 5 Kromojen Kesitler taze hazırlanmış *DAB/H 2 O 2 solüsyonlarında 2-10 dakika tutulur. Süre mikroskop altında kontrol edilerek ayarlanır. Reaksiyon PBS ile yıkanarak sonlandırılır.

47 Çekirdek Boyama Mayer hematoksileni