Türk Farmakoloji Derneği Farmakoloji Eğitiminde Kuşaklararası Bilimsel Etkileşme Seminerleri Programı

Transkript

1 Türk Farmakoloji Derneği Farmakoloji Eğitiminde Kuşaklararası Bilimsel Etkileşme Seminerleri Programı Dr. Nejat F. ECZACIBAŞI Toplantısı Mart 2012 Erciyes, Kayseri SEMİNER ÖZETLERİ C.Kemal BUHARALIOĞLU Elif ÇADIRCI H. Burak KANDİLCİ Seyhan ŞAHAN FIRAT Hale TUFAN

2 Türk Farmakoloji Derneği Farmakoloji Eğitiminde Kuşaklararası Bilimsel Etkileşme Seminerleri Programı Dr. Nejat F. Eczacıbaşı Toplantısı, 7-9 Mart 2012, Erciyes, Kayseri 7 Mart 2012, Çarşamba PROGRAM Açılış Prof. Dr. Öner SÜZER TFD Yönetim Kurulu Başkanı Dr. Nejat F. ECZACIBAŞI anısına Dr Suphi AYVAZ Eczacıbaşı Tıp Ödülleri ve Bilimsel Araştırma Destekleri Genel Sekreteri Dalak Tirozin Kinazının Damar Düz Kası ve Endotel Hücrelerinde Anjiyotensin II Aracılıklı İşlevlerinin Araştırılması C. Kemal BUHARALIOĞLU Mersin Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Tartışma Septik Ratlarda Bozulmuş İnflamatuvar Cevap, Organ Hasarı ve Mortalitenin Önlenmesinde Yeni Bir Hedef: Periferik 5HT-7 Reseptörleri Elif ÇADIRCI Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Tartışma 8 Mart 2012, Perşembe Memeli Kardiyomiyositlerinde Na + /H + Değiş-Tokuşcusunun Akut ve Uzun Süreli Hipoksiye Olan Duyarlılığı: ATP ve MikroRNA ların Rolünün İncelenmesi H. Burak KANDİLCİ Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tartışma DOCA-Tuz ile Oluşturulan Hipertansiyona Sitokrom P450 1B1 in Katkısı Seyhan ŞAHAN FIRAT Mersin Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Tartışma Serin/Treonin Kinaz Geni Transfekte Edilmiş Kardiyak Projenitör Hücrelerin Elektrofizyolojik Özellikleri ve Ko-Kültür Ortamında Kardiyak Miyozitler ile İnteraksiyonu Hale TUFAN Tartışma Meslekte 40. yılını dolduran Farmakologlara plaket takdimi R. Kazım TÜRKER Genç Farmakolog Teşvik Ödülü-2011 Ödül Töreni 9 Mart 2012, Cuma Kapanış Toplantının sponsorları Abdi İbrahim İlaç San. ve Tic. A. Ş. (Kurumsal sponsor) Commat Ltd.

3 Dr. Nejat F. Eczacıbaşı Dr Suphi Ayvaz Eczacıbaşı Tıp Ödülleri ve Bilimler Araştırma Destekleri Genel Sekreteri İzmir de 1913 yılında dünyaya gelen Dr. Nejat F. Eczacıbaşı, ilk ve ortaokulu İzmir de, liseyi İstanbul da Robert Kolej de okudu larda Heidelberg Üniversitesi ndeki kimya yükseköğreniminin ardından, Chicago Üniversitesi nde master ve Berlin Üniversitesi nde de doktora yaptı de doktorasını verdikten sonra Kaiser Wilhelm Enstitüsü nde, hormonlar üzerine yaptığı çalışmalar nedeniyle, 1939 da Nobel Ödülü nü kazanan Prof. Butenandt ın yanında, biyokimya alanında iki yıl süreyle araştırmalarda bulundu. Dr. Eczacıbaşı, Türkiye ye dönüşünde, İstanbul da 1942 yılında ilaç ve giderek seramik sağlık gereçleri üretimine başladı. İlk modern Türk ilaç fabrikası olan Eczacıbaşı İlaç tesislerini, 1952 de, Levent te kurdu. Kartal ve Bozüyük teki Eczacıbaşı Seramik tesisleri, Karamürsel deki İpek Kağıt fabrikaları O nun öncülüğünde ortaya çıktı larda, ilaç, yapı ve temizlik kağıtları alanlarında üretimde bulunan bir dizi tesisin yanı sıra, sermaye piyasasından dış ticaret ve bilgi iletime kadar uzanan günümüzde 39 kuruluştan oluşan Eczacıbaşı Topluluğu nun kurucusu ve Onur Başkanı Dr. Nejat F. Eczacıbaşı, sanat ve kültür alanındaki geniş katkılarıyla da tanınmaktaydı. Dr. Eczacıbaşı, TÜSİAD, Türk Eğitim Vakfı ve İzmir Kültür, Sanat ve Eğitim Vakfı nın kuruluşlarında görev aldığı gibi, İstanbul Kültür ve Sanat Vakfı, Ekonomik ve Sosyal Etüdler Konferans Heyeti ile Dr. Nejat F. Eczacıbaşı Vakfı nın kurucusu ve Yönetim Kurulu Başkanı ydı. Dr. Eczacıbaşı nın öncülüğünde 1959 da dönemin anıt hocalarıyla kurulan Eczacıbaşı Bilimsel Araştırma ve Ödül Fonu ise, bugüne kadar tıp, kimya ve eczacılık dallarında 174 bilimsel araştırma projesi için gerekli finansmanı sağlarken, 31 Eczacıbaşı Tıp Bilim Ödülü, 38 Tıp Teşvik Ödülü ile armağanlandırdı. Dr. Nejat F. Eczacıbaşı na, çeşitli alanlardaki üstün katkıları nedeniyle, Türkiye Kızılay Derneği Şeref Madalyası, Federal Almanya Cumhuriyeti Büyük Hizmet Nişanı, İtalyan Hükümeti Cavalliere Officiale Nişanı, Avusturya Hükümeti Büyük Gümüş Onur Nişanı, T.C. Dışişleri Bakanlığı Üstün Hizmet Ödülü ile Boğaziçi Üniversitesi, Orta Doğu Teknik Üniversitesi, İstanbul Üniversitesi ve Hacettepe Üniversitesi nin onursal doktora diplomaları verilmişti. Dr. Eczacıbaşı, anılarını Kuşaktan Kuşağa (1982), görüşlerini ise, dünyadan ayrılışından kısa süre önce bitirdiği İzlenimler, Umutlar (1994) adlı yapıtlarında dile getirdi. İngilizce, Almanca ve Fransızca bilen Dr. Nejat F. Eczacıbaşı, 1946 yılında Beyhan Eczacıbaşı ile evlendi. Oğulları Bülent ve Faruk Eczacıbaşı ndan Emre, Esra, Sinan ve Murat adlarında dört torunu vardır. Dr. Nejat F. Eczacıbaşı 6 Ekim 1993 te Amerika da vefat etti. 1

4 2

5 Dalak Tirozin Kinazının Damar Düz Kası ve Endotel Hücrelerinde Anjiyotensin II Aracılıklı İşlevlerinin Araştırılması C. Kemal BUHARALIOĞLU Mersin Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı, Mersin GİRİŞ VE AMAÇ Renin anjiyotensin sistemi (RAS) kardiyovasküler işlevlerin düzenlenmesinde önemli role sahiptir. Anjiyotensin II, RAS nin biyolojik olarak etkin ve başlıca bileşenidir; damar düz kas (DDK) hücrelerinde kasılmaya neden olmakta ve sodyum ve su homeostazının sürdürülmesine katkıda bulunmaktadır (Navar, 1997; Touyz, 2003). Anjiyotensin II düzeylerinin artması ise hipertansiyon, kalp yetmezliği, ateroskleroz ve damar hasarı sonrası restenoz gelişimine katkıda bulunmaktadır (Rakugi et al., 1994; Feng et al., 2001; Weiss et al., 2001; Kobori et al., 2007). Ayrıca, anjiyotensin II kardiyak miyositler, fibroblastlar ve DDK hücrelerinde büyüme ve enflamasyona neden olmaktadır. DDK hücrelerinde büyüme ve göçten anjiyotensin II ye ait anjiyotensin 1 reseptörleri (AT 1 ) sorumludur. Ayrıca bu etkiye, reaktif oksijen türlerinin oluşumu ve serin treonin ve tirozin kinazların etkinleşmesi katkıda bulunmaktadır. Bunlar, mitojen ile etkinleşen protein kinazlar (mitogen-activated protein kinases; MAPKs) (Touyz and Schiffrin, 2000; Touyz, 2004; Clempus and Griendling, 2006), ekstraselüler sinyal ile düzenlenen kinaz (extracellular signal regulated kinase; ERK1/2), p38 mitojen ile etkinleşen protein kinaz (p38 mitogen-activated protein kinase; p38 MAPK), c-jun N-terminal kinaz (c-jnk) (Servant et al., 1996; Natarajan et al., 1999; Xi et al., 1999; Kyaw et al., 2004; Ohtsu et al., 2005; Lee et al., 2007), fokal adezyon kinaz ailesi, protein tirozin kinaz, prolince zengin tirozin kinaz II (proline-rich tyrosine kinase 2; Pyk2) ve c-src (Eguchi et al., 1998, 1999, 2001; Rocic and Lucchesi, 2001; Touyz et al., 2001; Saito et al., 2002; Kyaw et al., 2004) olarak sıralanabilir. Anjiyotensin II endotel hücrelerinde ise anjiyojeneze neden olmaktadır. Anjiyotensin II düşük konsantrasyonlarda (10 nm) anjiyojenezi stimüle ederken, yüksek konsantrasyonlarda inhibe etmektedir (Weiss et al., 2001). Endotel hücrelerinde VEGF ekspresyonunun anjiyotensin II ile 3 arttığı gösterilmiştir (Carmeliet, 2005, Montezano et al., 2008). Damar endoteli büyüme faktörü (vascular endothelial growth factor; VEGF) nin endotel hücreleri üzerindeki etkileri ise başlıca iki reseptör aracılığı ile ortaya çıkmaktadır: VEGF reseptörü 1 (VEGFR-1; Flt-1) ve VEGFR-2 (Flk-1/KDR) (Chintalgattu et al., 2003). İnsan umbilikal ven endotel hücrelerinde anjiyotensin II ile oluşan proliferasyonun Flt- 1 nötralize edici antikor ile önlendiği bildirilmiştir (Herr et al., 2008). Bir reseptör ile kenetli olmayan tirozin kinaz olan dalak tirozin kinaz (Dtk) nin hematopoietik hücreler dışındaki etkileri yeni anlaşılmaya başlanmıştır. Dtk endotel hücrelerinde eksprese edilmektedir ve bu hücrelerde morfojenez, büyüme ve hayatta kalma (survival) gibi işlevlerdeki rolü gösterilmiştir. Ek olarak, in vivo damar bütünselliğinin sürdürülmesine katkıda bulunmaktadır (Inatome et al., 2001, Yanagi et al., 2001). Ayrıca, Src ailesi tirozin kinazların; Dtk ile asosiye oldukları ve onu etkinleştirdikleri bildirilmiştir (Kurosaki et al., 1994). Daha önce DDK hücreleri ile yaptığımız çalışmalarda, anjiyotensin II nin Dtk yi p38 MAPK ile aktive olan c-src ile etkinleştirerek hipertrofi ve göçe yol açtığını gösterdik (Mugabe et al., 2010, Yaghini et al., 2007). Bu veriler, anjiyotensin II nin epidermal büyüme faktörü reseptörü (epidermal growth factor receptor; EGFR) EGFR transaktivasyonu ve VEGF ekspresyonuna neden olarak Flt-1 veya Flk- 1 aracılığıyla Dtk yı uyarması sonucunda anjiyojenezi başlatabileceğini göstermiştir. Çalışmalarımızda, RAS nin başlıca efektörü anjiyotensin II aracılığı ile DDK hücre göçünde Dtk nin rol alıp almadığı ve bu olayın sinyal ileti mekanizması araştırılmıştır. Endotel hücrelerinde ise anjiyotensin II ile oluşturulan anjiyojenez sürecine, Flt-1 aracılığı ile Dtk etkinleşmesinin katılıp katılmadığı hipotezi test edilmiştir. Bu hipotezi test etmek için Dtk ve EGFR inhibitörlerinin ve Dtk gen sessizleştirilmesinin (gene silencing) etkileri in vitro

6 anjiyojenez modeli olan kapiler tüp oluşumunda (EA.hy926 kullanılarak) ve ex vivo bir model olan sıçan aort halkaları dallanma modelinde araştırılmıştır. GEREÇ VE YÖNTEM Hücre Kültürü Çalışmaları Sıçan Aort Damar Düz Kas Hücre Kültürü Çalışmalarımızdaki tüm deneyler National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Institute of Laboratory Animal Resources, 1996) ile uyumlu olan Institutional Animal Care and Use Committee nin kabul ettiği protokole göre gerçekleştirilmiştir. DDK hücreleri g ağırlığındaki erkek Sprague-Dawley sıçanların (Harlan, Indianapolis, IN) torasik aortlarından izole edilerek kültürü yapılmıştır (Uddin et al., 1998). Bu hücreler 37 C de %5 CO 2 ortamda %10 fetal sığır serumu (fetal bovine serum; FBS) ve %1 penisilin/ streptomisin ve %0.01 amfoterisin-b (Sigma, St. Louis, MO) içeren kültür ortamı Medium M199 ile inkübe edilmiştir. Hücre göçü deneyleri için pasajlardaki DDK hücreleri, farklı maddelerin uygulanmasından önce %0.5 FBS içeren M-199 ile 48 saat inkübe edilmiştir. Tripan mavisini dışarıda bırakma yöntemi ile kimyasal inhibitörler veya plazmitlerle transfeksiyon deneylerinden sonra hücrelerin canlılığında bir değişim olmadığı görülmüştür. Endotel Hücre Kültürü İnsan umbilikal ven endotel hücre kökenli EA.hy926 hücreleri Dr. Cora-Jean S. Edgell (North Carolina Üniversitesi, Chapel Hill, NC) den sağlanmıştır. Bu hücreler %10 fetal sığır serumu (fetal bovine serum; FBS) ve %1 penisilin/streptomisin ve %0.01 amfoterisin-b (Sigma, St. Louis, MO) içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle kültür ortamı (Dulbecco's modified Eagle s medium; DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA) ile 37 C de %5 CO 2 ortamda %90 yoğunluğa ulaşıncaya kadar inkübe edilmiştir. Farklı maddelerin uygulanmasından önce %1 FBS içeren DMEM-199 ile 48 inkübe edilmişlerdir. Hücre Göçü Eseyi (Yara İyileşmesi Yöntemi) DDK hücre kültüründe hücre göçü deneyleri, Waters ve ark. (1999) tanımladığı yara iyileşmesi yöntemi ile yapılmıştır. Bu 4 yöntem kısaca, % yoğunlukta (confluent) DDK hücresi içeren her bir kuyucukta steril pipet ucuyla mm genişliğinde düz bir çizgi şeklinde yara oluşturulmuştur. Hücreler serum içermeyen M199 kültür ortamı ile iki kez yıkanarak görüntüleri Nikon TE300 inverted mikroskop (CoolSnap FX charge-coupled device camera; Roper Scientific, Trenton, NJ ve Optiscan ES102 motorized stage system; Prior Scientific, Rockland, MA ekipmanlarına sahip) kullanılarak MetaMorph Image Analysis programı ile kayıt edilmiştir (0. saat). Hücreler inhibitörler ile 30 dakika inkübe edildikten sonra anjiyotensin II (200 nm), EGF (100 ng/ml) veya taşıyıcıları ile uyarılmış ve 24 saat sonra tekrar görüntüleri alınmıştır. Her bir yara lokalizasyonu için x, y ve z koordinatları belirlenmiş ve göç deneyleri süresince aynı bölgenin fotoğrafları çekilmiştir. Yara alanı ölçümlerinde aynı kuyucuktan 3 alana ait ölçümlerin ortalaması National Institutes of Health ImageJ 1.6 programı kullanılarak hesaplanmıştır. Veriler 0. saatteki alan %100 (kontrol) kabul edilerek ve 0. ve 24. saatte hücrelerin kapladığı alanın farkının oranı olarak gösterilmiştir. Çeşitli uygulamaların hücrelerin kapladığı alan üzerine etkileri ise kontrole göre % değişim (kontrolün yüzdesi) olarak belirtilmiştir. Şekil 1. Yara iyileşmesi yönteminde anjiyotensin II (Ang II) ile oluşturulan hücre göçüne ait mikroskop görüntüsü. DDK Hücrelerinin Plazmitler, RNAi ve Adenovirüs Probları ile Transfeksiyonu Tüm transfeksiyon deneyleri daha önce tanımlanmış olan prosedüre göre gerçekleştirilmiştir (Yaghini et al., 2007). Kısaca, %60-80 yoğunlukta (subconfluent) DDKH boş vektör (empty vector; EV) (paltermax), wild type (WT) ya da dominant negatif (DN) (Y525F/Y526F) Dtk (Dr. H. Band, Harvard Medical School, Boston, MA tarafından sağlanmıştır) ile %2

7 FBS içeren M-199 içerisinde 1 µg plazmide 25 µl transfeksiyon reajanı Effectene (QIAGEN, Valencia, CA) oranında 48 saat süresince inkübe edilmiştir. Diğer bir grup deneyde, subconfluent DDK hücreleri, üretici firmanın belirttiği şekilde, Src RNAi, pozitif kontrol dupleksi (Pos. Dup.) (her biri 100 pmol, TriFECTa kit; Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA) veya taşıyıcıları (vehicle) ile 48 saat transfekte edilmiştir. Diğer deneylerde ise subconfluent DDK hücreleri kısmi etkin (partially active; PA, AxSrcY416F/Y527F), dominant negatif Src mutantı (DN, AxSrc Kinase Dead, Dr. R. Baron, Yale School of Medicine, New Haven, CT tarafından sağlanmıştır) veya boş adenovirüs (empty adenovirus; EV, 10 multiplicity of infection) ile 48 saat transdükte edilmişlerdir. In vitro Anjiyojenez Eseyi: Kapiler Tüp Oluşumu EA.hy926 hücreleri %90 yoğunluğa ulaşınca FBS içermeyen kültür ortamı ile 24 saat inkübe edilmişlerdir. Bazı deneylerde, hücreler farklı kimyasalların ya da nötralize edici antikorun varlığına belirtilen süre boyunca maruz bırakılmışlardır. Tripsinizasyon sonrası hücreler sayılmış ve 4 x10 4 hücre/ml olacak şekilde %1 FBS ve agonistlerin belirtilen derişimlerini içeren DMEM içerisinde tekrar süspande edilmiştir. Hücreler kuyucuklara eklenmeden önce kuyucuklar büyüme faktörü azaltılmış Matrigel (0.1 ml /kuyucuk, BD Biociences, Bedford, MA) ile kaplanmış ve 37 C de 30 dakika beklenilerek polimerize olması sağlanmıştır. Hücre büyümesi ve üç boyutlu hücre organizasyonları 16 saat sonra Olympus CKX41 inverted faz-kontrast mikroskop ve Altra20 CMOS dijital kamera (Olympus America Inc., Melville, NY) ile izlenmiş ve fotoğrafları çekilmiştir. Endotel hücrelerinin oluşturdukları ağ yapılarının uzunlukları ImageJ programı (National Institutes of Health; ile hesaplanmıştır. Sonuçlar her kuyucuktan 3 fotoğrafik alandaki toplam tüp uzunluğunun ortalaması olarak gösterilmiştir. Ex vivo Anjiyojenez Eseyi: Aortik Halka Yöntemi Sprague-Dawley sıçanlarının (4-6 haftalık; Charles Rivers, Wilmington, MA) torasik aortları izole edildikten sonra 1 mm kesitleri Matrigel ile kaplanmış kuyucuklara agonistler ile birlikte eklenmişlerdir. İnhibitörler veya nötralize edici antikorlar agonistlerin eklenmesinden 30 dakika önce eklenmiştir. Bazı deneylerde aort halkalar 20 pmol Dtk sirna (sense; 5 -CAC CAU AAA UUU GCA AGG UC-3, antisense; 5 -GAC CUU GCA AAU UUA UGG UG-3 ; ACC #. NM_012758, IDT, Coralville, IA) veya kontrol plazmidi (sense; 5 -AA UUU AUGGAC GUG GCA CUU-3, antisense; 5 -AA GUG CCA CGU CCA UAA AUU-3 ) ile transfekte edilmiştir. Transfeksiyonlar DharmaFECT 1 transfeksiyon reajanı (Dharmacon Inc., Lafayette, CO) ile gerçekleştirilmiştir. Aort halkalarından endotel hücrelerinin dallanmasını kantitatif olarak belirlemek amacıyla dallanmaların alanı Image J programı ile ölçülmüştür. Tüp oluşumu ve aort dallanması deneylerinde anjiyotensin II, EGF veya VEGF yokluğunda tek başına taşıyıcı %100 olarak kabul edilmiştir. Western Blot Analizi Dtk ve diğer proteinlerin etkinliği; anti-fosfo ve onlara karşılık gelen fosfo olmayan antikorlar kullanılarak fosforile protein/protein düzeyleri Western blot yöntemi ile belirlenmiştir. İnhibitörler ve/veya agonistlerin uygulanmasından sonra kültürü yapılmış DDK hücreleri lizis tamponu içerisinde sonikasyon işleminden sonra santrifüj edilmiş ve Bradford yöntemi kullanılarak eşit miktardaki protein, Sodyum Dodesil Sülfat-Poli Akrilamit Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrılmışlardır. Proteinler nitroselüloz membrana aktarıldıktan sonra %5 yağ içermeyen süt tozu ile bloke edilmiş ve 4 C de primer antikorlar ile (1:500-1:1000) inkübe edilmişlerdir. Daha sonra Tris ile tamponlanmış salin ve Tween 20 (1X) ile yıkanan blot lardaki immünoreaktif proteinler kendilerine karşılık gelen horseradish peroxidase ile konjüge sekonder antikorlar ile (1:1000-1:2000) inkübe edildikten sonra ECL Plus Western Blot Detection kiti kullanılarak görüntülenmiştir. Bantların yoğunluğu ImageJ programı kullanılarak belirlenmiştir. VEGF bantlarının yoğunluğu beta-aktine göre normalize edilmiştir. Diğer protein bantlarının yoğunluğu kendilerine karşılık gelen fosforile olmamış antikor bantlarının yoğunluğuna göre normalize edilmiştir ve 0. zamanda elde edilen değer 1 alınarak katları şeklinde artışlar olarak ifade edilmiştir. 5

8 EA Hücrelerinin Dtk shrna ve kontrol Short Hairpin İnterfering RNA ile transfeksiyonu Dtk shrna ve onun kontrol shrna kodlayan plazmit kiti GeneSuppressorTM (IMG-808) Imgenex (San Diego, CA) den sağlanmıştır. EA.hy926 hücreleri Effectene transfeksiyon reajanı (Qiagen, Valencia, CA) kullanılarak üretici önerisine göre (0.2 g plasmit (10% FBS içeren DMEM içerisinde) için 50 l Effectene 24 saat inkübasyon) geçici transfeksiyon yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. 24 saat sonra Western blot analizi ile Dtk shrna sinin susturucu etkisi doğrulanmıştır. İstatistiksel Analiz Veriler tek yönlü ANOVA ve ardından Newman-Keuls Çoklu Karşılaştırmalar Testi ile analiz edilmiştir. İki grup arasındaki farklılıklar ise unpaired Student's t testi ile belirlenmiştir. En az üç farklı deney sonuçları ortalama ± standart hata (SH) olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel olarak 0.05 den daha küçük P değerleri anlamlı kabul edilmiştir. BULGULAR Şekil 3. Dominant negatif Dtk (DN Syk) plazmitleriyle geçici transfeksiyon anjiyotensin II (Ang II) ile oluşan DDK hücre göçünü inhibe etmektedir. A, Wild type (WT) veya DN Dtk nın Ang II (200 nm) ile uyarılmış DDK hücre göçü üzerine etkisi. * AII yokluğunda elde edilen değere göre, taşıyıcı (Veh) grubunda karşılık gelen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05). B, WT veya DN Dtk ile geçici transfeksiyonunun Ang II (200 nm) ile uyarılmış DDK hücrelerinde fosfo (p)- Dtk, p-src, p-erk1/2 ve p-p38 MAPK protein düzeyleri üzerindeki etkisi. Şekil 2. Piketanol, anjiyotensin II (AngII) ile uyarılan DDK hücre göçünü inhibe etmektedir. A, Dtk inhibitorü piketanol (PIC) ün Ang II (200 nm) ile uyarılmış DDK hücre göçü üzerine etkisi. * AngII yokluğunda elde edilen değere göre ve taşıyıcı (Veh) grubunda karşılık gelen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05). B, Piketanolün Ang II ile uyarılmış sıçan aort DDK hücrelerinde fosfo (p)-dtk (Syk), p-src, p-erk1/2 ve p-p38 MAPK protein düzeyleri üzerindeki etkisi. 6 Şekil 4. Anjiyotensin II (Ang II) ile oluşan DDK hücre göçü c-src bağımlıdır. A, c-src inhibitörü PP2 nin Ang II ile uyarılmış DDK hücre göçü üzerine etkisi. * AII yokluğunda elde edilen değere göre ve taşıyıcı (Veh) grubunda karşılık gelen değere göre istatistiksel (P<0.05). B, PP2 nin Ang II ile uyarılmış DDK hücrelerinde fosfo (p)-tyr (p-egfr), (p)-dtk, p-src, p-erk1/2 ve p-p38 MAPK protein düzeyleri üzerindeki etkisi.

9 Şekil 5. Anjiyotensin II (AngII) ile oluşan DDK hücre göçü p38 MAPK aracılıklıdır. A, p38 MAPK inhibitörü SB (SB) nin Ang II ile uyarılmış DDK hücre göçü üzerine etkisi. * Ang II yokluğunda elde edilen değere göre ve taşıyıcı (Veh) grubunda karşılık gelen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05). B, SB nin Ang II ile uyarılmış DDK hücrelerinde fosfo (p)-tyr (p-egfr), (p)-dtk, p-src, p-erk1/2 ve p-p38 MAPK protein düzeyleri üzerindeki etkisi. Şekil 6. Anjiyotensin II (AngII) ile artan DDK hücre göçü EGFR transaktivasyonu ile etkinleşen c-src bağımlıdır. A, EGFR inhibitörü AG1478 in Ang II ile uyarılmış sıçan aort DDK hücre göçü üzerine etkisi. * Ang II yokluğunda elde edilen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05) B, AG1478 in Ang II ile uyarılmış sıçan aort DDK hücrelerinde fosfo (p)-tyr (p-egfr), (p)- Dtk, p-src, p-erk1/2 ve p-p38 MAPK protein düzeyleri üzerindeki etkisi. 7

10 Şekil 7. Anjiyotensin II (ANG II), EGF ve VEGF EA.hy926 (EA) hücrelerinde tüp oluşumunu ve sıçan aort halkalarında kapiler dallanmayı artırmaktadır. A-E: EA hücreleri (0, 3, 12 ve 24 saat) ve sıçan aort düz kas hücreleleri (A-C) ve sıçan aort halkaları (D-E) ANG II, EGF veya VEGF taşıyıcısı (DMEM) ile 16 saat ve 3 5 gün inkübasyonlarının tüp oluşumu ve aortik dallanma üzerine etkisini gösteren faz-kontrast mikroskop görüntüleri. Tüp oluşumlarının uzunluğu In vitro Anjiyojenez Eseyi nde tanımlandığı gibi ölçülmüştür (B, alt). Aortik dallanmaların uzunluğu Ex vivo Anjiyojenez Eseyi nde tanımlandığı gibi ölçülmüştür (E, alt). ANGII, EGF veya VEGF yokluğunda tek başına taşıyıcı %100 olarak kabul edilerek uygulamaların değerleri normalize edilmiştir. * 0. saatte vehikül ile elde edilen değere göre (B, C ve E, alt) ve vehikül ile elde edilen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05). Büyütme: x 100. Skala: 200 m. Şekil 8. ANG II ile oluşturulan tübülojenez ve sıçan aort dallanması Flt-1 aracılıklı olmasına karşın, bu değişikliklere Flk-1 aracılık etmemektedir. EA.hy926 hücreleri ve sıçan aort halkaları Flt-1 nötralize edici antikoru (Flt-1/Fc; 5 g/ml) veya Flk-1 inhibitörü SU1498 ile inkübe edildikten sonra ANG II ile oluşturulan tüp oluşumu (A) ve aort dallanmasına (B) ait etkinin kantitatif analizi. * ANG II, EGF veya VEGF yokluğunda elde edilen değere göre ve Flt/Fc taşıyıcısı (Vehicle) grubunda karşılık gelen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05). 8

11 Şekil 9. ANG II ile artan VEGF ekspresyonu Flt-1 veya Flk-1 aracılıklı değildir. (A) EA hücrelerinde, farklı sürelerde (0, 0.17, 0.5, 1.4 ve 16 saat) uygulanmış ANG II'nin VEGF ekspresyonuna etkisi. (B) ve (C): EA hücrelerinde ANG II'nin VEGF ekspresyonunu artırıcı etkisine Flt-1 nötralize edici antikoru (Flt-1/Fc, 5 g/ml) (B) veya Flk-1 inhibitörü SU-1498 (10 M) (C) etkisi. * 0. saatteki (A, alt) ve Ang II taşıyıcısı (Vehicle) ile elde edilen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05). 9 Şekil 10. ANG II, EGF ve VEGF ile artan Flt-1 fosforilasyonu Flt-1/Fc ile inhibe olurken SU ile değişmemektedir. VEGF ile artan Flk-1 fosforilasyonu ise SU-1498 inhibe olurken Flt- 1/Fc ile değişmemektedir. (A C): EA hücrelerinde, farklı sürelerde (0, 0.17, 0.5, 1.4 ve 16 saat) uygulanan ANG II (10 nm; A), EGF (10 ng/ml; B) ve VEGF (50 ng/ml; C)'in p-flt-1 ve p-flk-1 üzerine etkisi. (D F): EA hücrelerinde ANG II (10 nm), EGF (30 ng/ml) veya VEGF (50 ng/ml)'in pflt-1 veya p- Flk-1 düzeylerini artırıcı etkisine Flt-1 nötralize edici antikoru (Flt-1/Fc, 5 g/ml) veya Flk-1 inhibitörü SU (10 M) in etkisi. * 0. zamandaki (A, alt) ve ANG II taşıyıcısı (Vehicle) ile elde edilen değere göre ve Flt-1/Fc veya SU-1498 taşıyıcısı grubunda karşılık gelen değere göre (D F, alt) istatistiksel olarak anlamlı farklı (P <0.05).

12 Şekil 11. ANG II, EGF ve VEGF ile başlatılan tüp oluşumu ve aort dallanması EGFR transaktivasyonu ile etkinliği artan Flt-1 uyarılması ile gerçekleşmektedir. (A-B) EA hücreleri ve rat aort halkaları EGFR inhibitörü AG (200 nm)'nin ANG II, EGF veya VEGF ile oluşturulan tüp oluşumu (A) ve aort dallanmasına (B) ait etkisinin kantitatif analizi. ANGII, EGF veya VEGF yokluğunda tek başına taşıyıcı %100 olarak kabul edilmiştir. EA hücrelerinde AG-1478 (200 nm) preinkübasyonunun; ANG II (10 nm; C) veya EGF (30 ng/ml; D) ile artan p-egfr, p-flt-1 ve p-flk-1 seviyeleri üzerine etkisinin Western blot ile analizi. * ANG II, EGF veya VEGF yokluğunda elde edilen değere göre ve AG-1478 taşıyıcısı (Vehicle) grubunda karşılık gelen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P <0.05). Şekil 12. ANG II, EGF ve VEGF dalak tirozin kinazı (Syk) fosforile etmektedir. AII ile dalak tirozin kinazı fosforilasyonu, EGF ve VEGF ile değil, AT 1R aracılıdır. (A C) EA hücrelerinde ANG II (10 nm), EGF (30 ng/ml) veya VEGF (50 ng/ml)'in p-dtk (p-syk) protein düzeyi üzerinde zamana bağımlı etkisi. (D-F) EA hücrelerinde ANG II (10 nm), EGF (30 ng/ml) veya VEGF (50 ng/ml) ile artan p-dtk (p-syk) protein düzeyleri üzerine losartan (10 M) veya PD (1 M) etkisi. * Ang II taşıyıcısı (Vehicle) ile elde edilen değere göre ve losartan taşıyıcısı grubunda karşılık gelen değere göre (D, alt) istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05). 10

13 Şekil 13. ANG II, EGF ve VEGF ile artan tüp oluşumu ve aort dallanması piketanol ile inhibe edilmektedir. (A B) Dtk inhibitörü piketanolün; EA hücrelerinde ve sıçan aort halkalarında ANG II (10 nm), EGF (30 ng/ml) veya VEGF (50 ng/ml) ile oluşturulan tüp oluşumu (A) ve aortik dallanmaya (B) etkisi. (C-E) Piketanolün EA hücrelerinde ANG II (10 nm; C), EGF (30 ng/ml; D) veya VEGF (50 ng/ml; E) ile artan p-flt-1 ve p-dtk seviyelerine etkisinin Western blot analizi. * ANG II, EGF veya VEGF taşıyıcısı (Vehicle) ile elde edilen değere göre ve piketanol taşıyıcısı grubunda karşılık gelen değere göre (C E, alt) istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05). Şekil 14. Dtk (Syk) short hairpin interfering (sh)rna ve Dtk small interfering (si)rna ANG II, EGF ve VEGF ile artan, sırasıyla, tüp oluşumu ve aortik dallanmayı önlemektedir. (A-B) EA hücrelerinde ve sıçan aort halkalarında ANG II (10 nm), EGF (30 ng/ml) veya VEGF (50 ng/ml) ile oluşturulan tüp oluşumu (A) ve aort dallanmasına (B) sıçan Dtk sirna, onun scrambled (SCR) kontrolü veya taşıyıcısının etkisi. (C E) İnsan Dtk shrna, onun kontrol shrna veya taşıyıcısının EA hücrelerinde ANG II (10 nm), EGF (30 ng/ml) veya VEGF (50 ng/ml) artan p-flt-1 seviyesine etkisinin Western blot analizi. * ANG II, EGF veya VEGF vehikülü ile elde edilen değere göre; Syk shrna taşıyıcısı (Vehicle; Veh) grubunda karşılık gelen değere göre (C E, alt) istatistiksel olarak anlamlı farklı (P <0.05). 11

14 Şekil 15. EA hücrelerinde ANG II, EGF ve VEGF ile artan Dtk fosforilasyonuna Flk-1 değil Flt-1 aracılık etmektedir. ANG II ve EGF, ancak VEGF değil, ile artan Dtk fosforilasyonu EGFR aracılıklıdır. (A-C) Flt-1 nötralize edici antikoru (Flt- 1/Fc, 5 g/ml), Flk-1 tirozin kinaz inhibitörü SU-1498 (10 M) veya AG-1478'in EA hücrelerinde ANG II (10 nm; A), EGF (30 ng/ml; B) veya VEGF (50 ng/ml; C) artan p-dtk seviyelerine etkisinin Western blot analizi. * ANG II, EGF veya VEGF taşıyıcısı (Vehicle) ile elde edilen değere göre ve AG-1478 (D F, alt) veya Flt-1/Fc (A C, alt) taşıyıcısı grubunda karşılık gelen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P <0.05). 12 TARTIŞMA ve SONUÇ Dtk'nin Anjiyotensin II ile Oluşturulan Damar Düz Kas Göçüne Katılımı ve Sinyal İletimindeki Yeri Yara iyileşmesi tekniği ile Dtk'nın AII ile oluşturulan DDKH göçüne katkısının araştırıldığı çalışmalarda, bu peptidin DDK hücre göçünü uyarıcı etkisi, Dtk inhibitörü piketanol veya DN Dtk ile transfeksiyon ile geri çevrilirken WT mutant etkisiz kalmıştır. Bu durum, Dtk'nın anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçüne katkıda bulunduğunu göstermektedir. Piketanol ve DN Dtk mutantı, ancak WT Dtk değil, Dtk fosforilasyonunu azaltırken p38 MAPK ve c- Src fosforilasyonunu değiştirmemiştir. Bu veriler, Dtk'nin anjiyotensin II ile oluşturulmuş DDK hücre göçünü uyarırken kullandığı sinyal ileti yolunda; p38 MAPK ve c-src'ın Dtk'nin altında yer aldığını (downstream) göstermektedir. Piketanolün anjoyotensin II ile artan ERK1/2 fosforilasyonunu azaltması; ERK1/2'nin Dtk ile etkinleştirildiğini düşündürmektedir. Ancak, DN Dtk mutantı ile yapılan deneylerde Dtk fosforilasyonunun değişmemesi; piketanolün ERK1/2 etkinliğini özgül olmayan bir mekanizma ile azaltabileceği olasılığını ortaya çıkarmaktadır. c-src inhibitörü PP2 nin, anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçü ve Dtk fosforilasyonunu bloke etmesi; anjiyotensin II ile DDK hücre yara iyileşmesine Dtk'nin c- Src etkinleşmesi ile katıldığını göstermektedir. p38 MAPK inhibitörü SB nın anjiyotensin II ile oluşturulan yara iyileşmesini ve c-src ve Dtk fosforilasyonunu önlemesi; p38 MAPK'nin anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçüne c-src ile etkinleşen Dtk aracılığı ile katılabileceğini düşündürmektedir. c-src'ın anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçüne ERK1/2'yi etkinleştirerek katıldığı bilinmektedir (Kyaw et al., 2004). Bizim çalışmamızda, ERK1/2 inhibitörü PP2; anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücrelerinde yara iyileşmesini bloke etmiştir ve PP2 ERK1/2 fosforilasyonunu azaltmıştır. Ancak, DN Dtk mutantı ERK1/2 fosforilasyonunu değiştirmemiştir. Bu veriler, anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçüne c-src ile uyarılan ERK1/2 Dtk'dan bağımsız olarak katıldığı görüşünü desteklemektedir.

15 EGFR Transaktivasyonunun Anjiyotensin II ile Oluşturulan DDK Hücre Göçüne Katkısı Anjiyotensin II'nin EGFR transaktivasyonu ile ERK1/2 ve p38 MAPK etkinleştirdiği bilinmektedir (Eguchi et al., 1998). Anjiyotensin II ile EGFR transaktivasyonu c- Src aracılığı ile gerçekleşmektedir (Eguchi et al., 1999; Touyz et al., 2002). Bu yüzden, c- Src; Dtk, ERK1/2 ve p38 MAPK'ı EGFR transaktivasyonu ile etkinleştirebilir. c-src inhibitörü PP2 nin anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçü ve EGFR fosforilasyonunu azaltması, ancak piketanol veya DN Dtk mutantının etkisiz olması; p38 MAPK ile etkinleşen c-src ın anjiyotensin II ile oluşturulan EGFR transaktivasyonu ve DDK hücre göçüne Dtk dan bağımsız olarak aracılık ettiğini göstermektedir. Bu görüşü doğrulayan diğer bir veri, c-src RNAi veya DN c-src ın anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçü, c-src, ERK1/2 ve EGFR fosforilasyonunu azaltması ancak p38 MAPK üzerine etkisiz olmasıdır. c-src ın EGFR transaktivasyonu ile anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçünü Dtk den bağımsız olarak gerçekleştirdiği görüşümüzü; EGFR blokörü AG1478 in anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücresinde yara iyileşmesini ve EGFR fosforilasyonunu inhibe etmesi ancak Dtk ve c-src üzerine etkisiz olması bulgusu da desteklemektedir. p38 MAPK inhibitörü SB ın c-src ve EGFR fosforilasyonunu azaltması p38 MAPK ile etkinleşen c-src ın anjiyotensin II aracılı DDK hücre göçünü hem Dtk hem de EGFR transaktivasyonu ile gerçekleştirebileceğini göstermektedir. EGFR transaktivasyonu ile anjiyotensin II aracılıklı ortaya çıkan DDK hücre göçü ERK1/2 ve p38 MAPK aracılı olabilir, çünkü anjiyotensin II nin DDK hücresinde yara iyileştirici etkisi ve ERK1/2 fosforilasyonu, ERK1/2 inhibitörü U0126 ile önlenmektedir. Anjiyotensin II'nin Neden Olduğu Tüp Oluşumu ve Kapiler Dallanma Flt-1 Aracılıklıdır. Anjiyotensin II ile EA hücrelerinde tüp oluşumu ve sıçan aort halkalarında kapiler dallanma AT 1 reseptör blokörü losartan ile önlenirken AT 2 reseptör blokörü PD etkisizdi (veriler sunulmamıştır). Bu durum, daha önce yapılan çalışmalarla uyumlu olarak, anjiyotensin II aracılıklı anjiyojenezin 13 AT 1 reseptörleri aracılığıyla ortaya çıktığını göstermektedir. Anjiyotensin II, EGF ve VEGF; EA hücrelerinde tüp oluşumu ve sıçan aort halkalarındaki dalllanmayı Flt-1 i nötralize edici antikor, Flt-1/Fc, önlerken; Flk-1 blokörü SU-1498 in etkisiz olması; anjiyotensin II, EGF ve VEGF aracılı tüp oluşumu ve aortik dallanmaya Flk-1 değil de Flt-1 in aracılık ettiğini düşündürmektedir. Yüksek konsantrasyonlarda SU-1498 (25 M) in VEGF ile oluşan EA hücrelerindeki tüp oluşumunu önlemesi; VEGF'in diğer iki agonistten farklı olarak, Flk-1 aracılığı ile de tüp oluşumunu uyardığını göstermektedir. Anjiyotensin II ayrıca VEGF ekspresyonunu da uyarmaktadır ve VEGF'nin anjiyojenezi başlıca Flt-1 aracılığıyla uyardığı bildirilmiştir (Chintalgattu et al., 2003). Bu çalışma, anjiyotensin II ile uyarılan anjiyojeneze VEGF'in aracılık edebileceğini düşündürmektedir. Bizim çalışmamızda da, anjiyotensin II VEGF ekspresyonunu ve Flt-1 fosforilasyonunu artırmış ancak Flk-1 fosforilasyonunu etkilememiştir. Elde ettiğimiz veriler, anjiyotensin II ile tüp oluşumunda VEGF'in katılımını tamamen dışarıda bırakamamaktadır. Öte yandan, aşağıdaki bulgulardan dolayı, bu durum olası gözükmemektedir: 1) Anjiyotensin II, EA hücrelerinde 5 dakika içinde Flt-1 fosforilasyonuna neden olmaktadır. Ancak, VEGF ekspresyonu 1 saat içinde hafif bir artış göstermiş ve en yüksek seviyesine 16 saat içinde ulaşmıştır. 2) Anjiyotensin II, Flt-1 fosforilasyonuna neden olurken Flk-1 fosforilasyonunu etkilememiştir. Ancak, VEGF hem Flt-1 hem de Flk-1 fosforilasyonuna neden olmuştur. 3) Yüksek derişimlerde anjiyotensin II (100 nm) VEGF ekspresyonunu artırırken bu derişimde anjiyotensin II'nin tüp oluşumuna etkisi 10 nm ile kıyaslandığında daha az olmuştur (veriler sunulmadı). Anjiyotensin II Aracılı Tübülojenez ve Aortik Dallanma EGFR Transaktivasyonu Aracılıklıdır. Anjiyotensin II'nin DDK hücre proliferasyonu ve göçünü, EGFR transaktivasyonu ile uyardığı (Mugabe et. al., 2010) ve heparin bağlayıcı EGF'in anjiyotensin II ile oluşturulan neovaskülarizasyona katıldığı gösterilmiştir. Bizim aşağıdaki verilerimiz anjiyotensin II aracılıklı tübülojenez ve aortik

16 dallanmanın da EGFR transaktivasyonu aracılıklı olduğunu göstermektedir: 1) EGF, EA hücrelerinde tübülojenezi ve sıçan aort halkalarında dallanmayı artırmaktadır. 2) EGF ve anjiyotensin II EA hücrelerinde EGFR fosforilasyonunu artırmaktadır. 3) EGF ve anjiyotensin II nin bu etkileri EGFR blokörü AG-1478 ile önlenmektedir. Ayrıca, 1) EGF, EA hücrelerinde tübülojenezi ve sıçan aort halkalarında dallanma artışı; VEGF nötralize edici antikor Flt-1/Fc ile önlenirken Flk-1 antagonisti SU-1498 etkisiz kalmıştır. 2) EGF, Flt-1 fosforilasyonunu artırırken, Flk-1 fosforilasyonunu değiştirmemiştir ve Flt-1 fosforilasyonundaki artış Flt-1/Fc ile önlenirken SU-1498 ile değişmemiştir. 3) VEGF ile oluşan tübülojenez ve aortik dallanma ve ayrıca Flt- 1 ve Flk-1 fosforilasyonu EGFR blokörü AG ile bloke olmamamıştır. Tüm bu veriler, anjiyotensin II ile oluşan anjiyojenezin EGFR transaktivasyonu ile Flt-1 fosforilasyonu aracılıklı ve VEGF ekspresyonundan bağımsız bir şekilde geliştiği görüşünü desteklemektedir. Dtk'nin Anjiyojenez Üzerine Etkisi Anjiyotensin II'nin EGFR transaktivasyonu ile anjiyojeneze neden olma mekanizmasını daha fazla aydınlatabilmek için Dtk'nin bu olaydaki rolü araştırılmıştır. Bulgularımıza göre: 1) Anjiyotensin II, EGF ve VEGF Dtk fosforilasyonunu artırmaktadır. 2) Anjiyotensin II nin, ancak EGF ve VEGF in değil, Dtk fosforilasyonunu artırıcı etkisi AT 1 reseptör blokörü losartan ile önlenirken AT 2 reseptör blokörü PD etkisiz kalmıştır. 3) Dtk inhibitörü piketanol anjiyotensin II, EGF ve VEGF ile EA hücrelerinde tüp oluşumunu ve Dtk fosforilasyonunu, ayrıca aort halkalarında kapiler dallanmayı önlemiştir. Bu veriler, Dtk'nın anjiyotensin II ile oluşan anjiyojeneze katkısı olduğunu göstermektedir. EA hücrelerinde insan Dtk shrna, ancak onun kontrol shrna değil, tüp oluşumu ve Dtk fosforilasyonunu azaltması, ayrıca aort halkalarının Dtk sirna'sı ile transfeksiyonu sonucu kapiler dalllanmayı önlemesi de yukarıdaki çıkarımı desteklemektedir. Aşağıdaki verilerimiz anjiyotensin II ile oluşturulan anjiyojenez sürecinin AT 1 reseptörleri aracılığıyla EGFR transaktivasyonuna neden olarak Flt-1 fosforilasyonu ve Dtk etkinleşmesine neden olduğunu göstermektedir: 1) Dtk inhibitorü piketanol ve Dtk shrna, EGF ve VEGF ile oluşturulan tübülojenez ve Dtk fosforilasyonunu önlemiştir. 2) Piketanol ve Dtk sirna, EGF ve VEGF ile uyarılan aort halkalarındaki kapiler dallanmayı inhibe etmiştir. 3) Anjiyotensin II ile artan Dtk fosforilasyonu AT 1 reseptör blokörü losartan ile önlenirken AT 2 reseptör blokörü PD etkisiz kalmıştır. 4) Flt-1/Fc; anjiyotensin II, EGF ve VEGF ile artan Dtk fosforilasyonunu önlerken, SU-1498 etkisizdi. 5) Piketanol veya Syk shrna; EGF ve VEGF ile artan, sırasıyla, EGFR ve Flt-1 fosforilasyonunu ve Flt-1 ve Flk-1 fosforilasyonunu değiştirmemiştir. 6) VEGF ile artan Dtk fosforilasyonu EGFR blokörü AG-1478 ile değiştirmemiştir. Sonuç olarak, bizim çalışmamız anjiyotensin II ile uyarılan anjiyojenez sürecinde (EA hücrelerinde tüp oluşumu ve sıçan aort halkalarında kapiler dallanma) EGFR transaktivasyonu sonucu gerçekleştiğini ve daha sonra Flt-1 fosforile olarak Dtk nin etkinleşmesine yol açtığını ve bu durumun VEGF ekspresyonundan bağımsız olduğunu göstermektedir (Şekil 16). Şekil 16. Anjiyotensin II (ANG II) ile uyarılan anjiyojenez için önerdiğimiz mekanizma. Anjiyotensin II, VEGF ekspresyonundan bağımsız olarak, EGFR transaktivasyonu ile ve ardından Flt-1 fosforilasyonu ve Dtk (Syk) yi etkinleştirilerek anjiyojeneze neden olmaktadır. HB-EGF: heparinbağlayıcı EGF. Destek Bu çalışma National Heart, Lung, and Blood Institute Grant R tarafından desteklenmiştir. C. Kemal Buharalıoğlu, TÜBİTAK tarafından Doktora sonrası araştırma bursuyla desteklenmiştir. 14

17 KAYNAKLAR Carmeliet, P. (2005) Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature 438: Chintalgattu, V., Nair, D.M., Katwa, L.C. (2003) Cardiac myofibroblasts: a novel source of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors Flt-1 and KDR. J Mol Cell Cardiol 35: Clempus, R.E. ve Griendling, K.K. (2006) Reactive oxygen species signaling in vascular smooth muscle cells. Cardiovasc Res 71: Eguchi, S., Dempsey, P.J., Frank, G.D., Motley, E.D., Inagami, T. (2001) Activation of MAP kinases by angiotensin II in vascular smooth muscle cells. Metalloproteasedependent EGF receptor activation is required for activation of ERK and p38 MAP kinase but not JNK. J Biol Chem 276: Eguchi, S., Iwasaki, H., Inagami, T., Numaguchi, K., Yamakawa, T., Motley, E.D., Owada, K.M., Marumo, F., Hirata, Y. (1999) Involvement of PYK2 in angiotensin II signaling of vascular smooth muscle cells. Hypertension 33: Eguchi, S., Numaguchi, K., Iwasaki, H., Matsumoto, T., Yamakawa, T., Utsunomiya, H., Motley, E.D., Kawakatsu, H., Owada, K.M., Hirata, Y., et al. (1998) Calcium-dependent epidermal growth factor receptor transactivation mediates the angiotensin IIinduced mitogen-activated protein kinase activation in vascular smooth muscle cells. J Biol Chem 273: Feng, T.C., Ying, W.Y., Hua, R.J., Ji, Y.Y., de Gasparo, M. (2001) Effect of valsartan and captopril in rabbit carotid injury. Possible involvement of bradykinin in the antiproliferative action of the renin-angiotensin blockade. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst 2: Herr, D., Rodewald, M., Fraser, H.M., Hack, G., Konrad, R., Kreienberg, R., Wulff, C. (2008) Regulation of endothelial proliferation by the renin-angiotensin system in human umbilical vein endothelial cells. Reproduction 136: Kobori, H., Nangaku, M., Navar, L.G., Nishiyama, A. (2007) The intrarenal reninangiotensin system: from physiology to the pathophysiology of hypertension and kidney disease. Pharmacol Rev 59: Kyaw, M., Yoshizumi, M., Tsuchiya, K., Kagami, S., Izawa, Y., Fujita, Y., Ali, N., Kanematsu, Y., Toida, K., Ishimura, K. et al. (2004) Src and Cas are essentially but differentially involved in angiotensin II-stimulated migration of vascular smooth muscle cells via extracellular signalregulated kinase 1/2 and c-jun NH2-terminal kinase activation. Mol Pharmacol 65: Lee, H.M., Lee, C.K., Lee, S.H., Roh, H.Y., Bae, Y.M., Lee, K.Y., Lim, J., Park, P.J., Park, T.K., Lee, Y.L. et al. (2007) p38 mitogen-activated protein kinase contributes to angiotensin IIstimulated migration of rat aortic smooth muscle cells. J Pharmacol Sci 105: Montezano, A.C., Callera, G.E., Yogi, A., He, Y., Tostes, R.C., He, G., Schiffrin, E.L., Touyz, R.M. (2008) Aldosterone and angiotensin II synergistically stimulate migration in vascular smooth muscle cells through c-src-regulated redoxsensitive RhoA pathways. Arterioscler Thromb Vasc Biol 28: Mugabe, B.E., Yaghini, F.A., Song, C.Y., Buharalioglu, C.K., Waters, C.M., Malik, K.U. (2010) Angiotensin II-induced migration of vascular smooth muscle cells is mediated by p38 mitogen-activated protein kinase-activated c-src through spleen tyrosine kinase and epidermal growth factor receptor transactivation. J Pharmacol Exp Ther 332: Nakashima, H., Frank, G.D., Shira, H., Hinoki, A., Higuchi, S., Ohtsu, H., Eguchi, K., Sanjay, A., Reyland, M.E., Dempsey, P.J., Inagami, T., Eguchi, S. (2008) Novel role of protein kinase C-delta Tyr 311 phosphorylation in vascular smooth muscle cell hypertrophy by angiotensin II. Hypertension 51: Natarajan, R., Scott, S., Bai, W., Yerneni, K.K., Nadler, J. (1999) Angiotensin II signaling in vascular smooth muscle cells under high glucose conditions. Hypertension 33: Navar, L.G. (1997) The kidney in blood pressure regulation and development of hypertension. Med Clin North Am 81: Ohtsu, H., Mifune, M., Frank, G.D., Saito, S., Inagami, T., Kim-Mitsuyama, S., Takuwa, Y., Sasaki, T., Rothstein, J.D., Suzuki, H. et al. (2005) Signal-crosstalk between Rho/ROCK and c-jun NH2-terminal kinase mediates migration of vascular smooth muscle cells stimulated by angiotensin II. Arterioscler Thromb Vasc Biol 25:

18 Rakugi, H., Wang, D.S., Dzau, V.J., Pratt, R.E. (1994) Potential importance of tissue angiotensin-converting enzyme inhibition in preventing neointima formation. Circulation 90: Rocic, P. ve Lucchesi, P.A. (2001) Downregulation by antisense oligonucleotides establishes a role for the proline-rich tyrosine kinase PYK2 in angiotensin IIinduced signaling in vascular smooth muscle. J Biol Chem 276: Sada, K., Takano, T., Yanagi, S., Yamamura, H. (2001) Structure and function of Syk proteintyrosine kinase. J Biochem 130: Saito, S., Frank, G.D., Motley, E.D., Dempsey, P.J., Utsunomiya, H., Inagami, T., Eguchi, S. (2002) Metalloprotease inhibitor blocks angiotensin II-induced migration through inhibition of epidermal growth factor receptor transactivation. Biochem Biophys Res Commun 294: Servant, M.J., Giasson, E., Meloche, S. (1996) Inhibition of growth factor-induced protein synthesis by a selective MEK inhibitor in aortic smooth muscle cells. J Biol Chem 271: Touyz, R.M. (2003) The role of angiotensin II in regulating vascular structural and functional changes in hypertension. Curr Hypertens Rep 5: Touyz, R.M. (2004) Reactive oxygen species and angiotensin II signaling in vascular cells implications in cardiovascular disease. Braz J Med Biol Res 37: Touyz, R.M., He, G., Wu, X.H., Park, J.B., Mabrouk, M.E., Schiffrin, E.L. (2001) Src is an important mediator of extracellular signalregulated kinase 1/2-dependent growth signaling by angiotensin II in smooth muscle cells from resistance arteries of hypertensive patients. Hypertension 38: Touyz, R.M., Schiffrin, E.L. (2000) Signal transduction mechanisms mediating the physiological and pathophysiological actions of angiotensin II in vascular smooth muscle cells. Pharmacol Rev 52: Weiss, D., Sorescu, D., Taylor, W.R. (2001) Angiotensin II and atherosclerosis. Am J Cardiol 87: Xi, X.P., Graf, K., Goetze, S., Fleck, E., Hsueh, W.A., Law, R.E. (1999) Central role of the MAPK pathway in ang II-mediated DNA synthesis and migration in rat vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 19: Inatome, R., Yanagi, S., Takano, T., Yamamura, H. (2001) A critical role for Syk in endothelial cell proliferation and migration. Biochem Biophys Res Commun 286: Yaghini, F.A., Li, F., Malik, K.U. (2007) Expression and mechanism of spleen tyrosine kinase activation by angiotensin II and its implication in protein synthesis in rat vascular smooth muscle cells. J Biol Chem 282: Yanagi, S., Inatome, R., Ding, J., Kitaguchi, H., Tybulewicz, V.L., Yamamura, H. (2001) Syk expression in endothelial cells and their morphologic defects in embryonic Syk-deficient mice. Blood 98: * * * * * 16

19 ÖZGEÇMİŞ 1. KİMLİĞİ: Adı, soyadı: Cüneyt Kemal BUHARALIOĞLU Doğum yeri ve tarihi: Ankara, Medeni hali: Bekâr İş adresi: Mersin Üniversitesi Yenişehir Kampüsü Eczacılık Fakültesi, Mersin Telefon: Fax: e-posta: 2. EĞİTİM ÖYKÜSÜ: Ortaöğrenim: Kabataş Erkek Lisesi Lisans: Gazi Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Yüksek Lisans: Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı Doktora: Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı 3. MESLEKİ DENEYİMLERİ: Ar. Gör: Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi ( ) Dr. Ar. Gör.: Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi ( ) Yrd. Doç. Dr.: Mersin Üniversitesi Eczacılık Fakültesi (2003- ) Yrd. Doç. Dr.: T.C. Sağlık Bakanlığı İlaç Eczacılık Genel Müdürlüğü (Yurtiçi görevlendirme; 1 Temmuz -3 Ağustos 2007) 4. YÜKSEK LİSANS TEZİ: Sıçanlarda İndometazinle Oluşturulan Gastrik Mukozal Ülserler Üzerine K + Kanal Açıcılarının Etkileri Danışman: Doç. Dr. Fatma AKAR 5. DOKTORA TEZİ: Sıçan Aortasında Hipertonisitenin Oluşturduğu Kastırıcı Etkiye Aracılık Eden Yolakların İncelenmesi Danışman: Prof. Dr. Fatma AKAR PROJELER: 1. Buharalıoğlu, C.K., Kaçan, M., Gilik, D., Sarı, A.N., Şahan-Fırat, S., Korkmaz, B., Tunçtan, B.; "Sıçanlarda Endotoksin ile Oluşan Hipotansiyona Dalak Tirozin Kinazının Katkısının Araştırılması" Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP-SBE F (MK) YL (17 Eylül Eylül 2012; devam ediyor). 2. Şahan-Fırat, S., Gilik, D., Kaçan, M., Sarı, A.N., Buharalıoğlu, C.K., Korkmaz, B., Tunçtan, B.; "Sıçanlarda Zimosan ile Oluşan Hipotansiyona Dalak Tirozin Kinazının Katkısının Araştırılması" Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP-SBE F (DG) YL (17 Eylül Eylül 2012; devam ediyor). 3. Tunçtan, B., Serin, M.S., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Korkmaz, B., Sarı, A.N., Endotoksemik sıçanlarda dayanıklı 20-HETE analoğu 5,14- HEDGE'nin CYP2C23'e bağımlı renal epoksijenaz ile çözünebilir epoksit hidrolaz ekspresyon ve etkinliği üzerindeki etkisinin proinflamatuvar sitokin oluşumu ve MEK1/ERK1/2/NF- B yoluyla ilişkilendirilerek araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP- ECZ F FB (BT) B, Araştırıcı, (Kasım 2010-Kasım 2012; devam ediyor). 4. Tunçtan, B., Buharalıoğlu, C.K., Serin, M.S., Şahan Fırat, S., Korkmaz, B., Cüez, T., Sari, A.N., Endotoksemik sıçanların kardiyak, renal ve vasküler dokularında nitrik oksit sentaz, siklooksijenaz ve sitokrom P450 4A enzimleri arasındaki etkileşmelerin mekanizmasının moleküler düzeyde araştırılması. TÜBİTAK Projesi, SBAG, Mersin, Proje no: 109S121, Araştırıcı, (Kasım 2009-Kasım 2012; devam ediyor). 5. Tunçtan, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan- Fırat, S., Cüez, T., Sarı A.N., Endotoksemik sıçanlarda NO oluşumundaki artmaya 20-HETE düzeylerinde azalmanın eşlik ettiği hipotansiyona COX-2 Ürünlerinin

20 Katkısının Araştırılması. Novartis Sağlık, Gıda ve Tarım Ürünleri Sanayi ve Ticaret A.Ş., Araştırıcı, (Temmuz 2010; Ocak 2012). 6. Malik, K.U. (Principal Investigator), Eicosanoids-induced vascular growth during injury. National Institute of Health National Heart, Lung, and Blood Institute, University of Tennessee Health Science Center, Grant 5R01HL , Araştırıcı (Temmuz 2007 Haziran 2009). 7. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan-Fırat, S., Endotoksemik sıçanlarda ekstraselüler sinyal ile düzenlenen kinaz 1/2 ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz yolu aracılıklı vasküler hiporeaktivitenin mekanizmalarının araştırılması. TÜBİTAK Projesi, SBAG, Mersin, Proje no: 106S299 (SBAG-3508), Araştırıcı, (Şubat 2007-Şubat 2009). 8. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan-Fırat, S., Demiryürek, A.T., Endotoksemik sıçanlarda mitojen ile aktive edilen protein kinaz kinaz 1/ekstraselüler sinyal ile düzenlenen kinaz 1/2 yolu aracılıklı vasküler hiporeaktivitenin mekanizmalarının araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Doktora Tez Projesi, Mersin, Proje no: BAP SBE EMB (RBK) DR, Araştırıcı, (Kasım 2006-Kasım 2009). 9. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Endotoksin ile oluşan nitrik oksit aracılıklı hipotansiyona sitokrom P450 ve siklooksijenaz-2 ürünlerinin katkısı. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP ECZF EMB (BT) , Araştırıcı, (Kasım 2006-Ağustos 2008). 10. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Doğruer, Z.N., Tamer, L., Buharalıoğlu, C.K., Endotoksin ile oluşan nitrik oksit aracılıklı hipotansiyonda mitojen ile aktive edilen kinaz - ekstraselüler sinyal ile düzenlenen kinaz (ERK1/2) yolunun öneminin araştırılması, Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje no: BAP ECZF EMB (BT) , Araştırıcı, (Haziran 2005-Aralık 2006). 11. Buharalıoğlu, C.K., Tunçtan, B., Özveren, E., Korkmaz, B., Atik, U., 18 Sitozolik fosfolipaz A 2 enziminin sepsis patojenezindeki rolü ve farmakolojik inhibisyonunun öneminin araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje no: BAP ECZ F EMB (KB) , Proje Yöneticisi, ( ). 12. Buharalıoğlu, C.K., Özbaşoğlu, O., Tunçtan, B., Korkmaz, B., Şahan-Fırat, S., Yalçın, A., Endotoksin ile oluşturulan inflamatuvar hiperaljezide talidomidin etkilerinin incelenmesi. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Yüksek Lisans Tez Projesi, Mersin, Proje No: BAP SBE EMB (OÖ) YL, Proje Yöneticisi, ( ). (2007 yılında TÜBİTAK 2219 Yurt Dışı Bursu kapsamında post-doc olarak ABD de bulunmam nedeniyle Proje Yöneticiliği Prof. Dr. Bahar TUNÇTAN a devredilmiştir.) 13. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Özveren, E., Buharalıoğlu, C.K., Endotoksin ile oluşan vasküler hiporeaktivitede G proteini ile kenetli alfa-adrenerjik reseptör/mitojen ile aktive edilen kinazlar yolu ile sitozolik fosfolipaz A 2 ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz enzimleri arasındaki ilişkinin mekanizmalarının sıçan aortunda araştırılması, Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje no: BAP SBE EMB (RBK) YL, Araştırıcı, (Haziran 2003-Haziran 2004). 14. Tunçtan, B., Özveren, E., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., G proteini ile kenetli reseptörler ile ilişkili sinyal ileti yolunda endotoksin ile sıçan mezenterik arterinde oluşan değişikliklerin mekanizmalarının araştırılması, Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje no: BAP ECZ F MB (BT) 2002, Araştırıcı, (Ocak 2003-Haziran 2004). 15. Tunçtan, B., Buharalıoğlu, C.K., Özveren, E., Korkmaz, B., Tamer, L., Atik, U., Endotoksin ile oluşturulan inflamatuvar hiperaljezide NF -B, nitrik oksit sentaz, siklooksijenaz ve poliadpriboz sentazın rolü, Novartis Sağlık, Gıda ve Tarım Ürünleri Sanayi ve Ticaret A.Ş., Mersin, Araştırıcı, (Eylül 2002-Aralık 2004). 16. Uydeş-Doğan, B.S., Buharalıoğlu, C.K., Sayar, E., Gastrik mukus sekresyonunda

21 potasyum kanallarının işlevi, Gazi Üniversitesi, Araştırma Fonu, EF-02/98-02, Ankara, Araştırıcı, ( ). 17. Kanzık, İ., Uydeş-Doğan, B.S., Buharalıoğlu, C.K., İlter, Ö., Etanolle indüklenen gastrik ülserde potasyum kanal işlevinin araştırılması, Gazi Üniversitesi, Araştırma Fonu, SBE 11 / 98-01, Ankara, Araştırıcı, ( ). 18. Akar, F., Buharalıoğlu, C.K., Uydeş, S., Tufan, H., Gastrik asit sekresyonunda potasyum kanallarının rolü, Gazi Üniversitesi, Araştırma Fonu, SBE 11 / 96-8, Ankara, Araştırıcı, ( ). 19. Kanzık, İ., Akar, F., Buharalıoğlu, C.K., Peptik ülserde potasyum kanal işlevinin araştırılması, Gazi Üniversitesi, Araştırma Fonu, SBE 11 / 94-23, Ankara, Araştırıcı, ( ). 20. Akar, F., Tufan, H., Buharalıoğlu, C.K., Preeklampsili kadınların umbilikal ve omental arterlerinde potasyum kanal fonksiyonlarının incelenmesi, TÜBİTAK- SBAG, AYD 116, Ankara, Araştırıcı, ( ). 7. BURSLAR: TÜBİTAK Doktora sonrası araştırma bursu 8. ÜYELİKLER: 1. Türk Farmakoloji Derneği 2. Kronobiyoloji Derneği 3. Farmasötik Bilimler Ankara Derneği 4. American Heart Association & American Stroke Association 5. Atatürk Kültür, Dil ve Tarih Yüksek Kurumu İlaç ve Eczacılık Terimleri Çalışma Grubu Üyesi (2004; devam ediyor) 6. Türk Farmakopesi Çalışma Grubu Üyesi (2010; devam ediyor) 7. Mersin Üniversitesi, Proje Bilgilendirme ve Destek Birimi Üyesi (2011; devam ediyor) 8. Mersin Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Yayın Değerlendirme Komisyonu (2011; devam ediyor) 9. YABANCI DİL: İngilizce YAYIN LİSTESİ Science Citation Index-Expanded Kapsamındaki Dergilerde Yer Alan Araştırma Makaleleri 1. Buharalioglu, C.K., Akar, F., The reactivity of serotonin, acetylcholine and KCl-induced contractions to relaxant agents in the rat gastric fundus, Pharmacol Res, 45(4), (2002). 2. Deliorman, D., Calis, I., Ergun, F., Uydes-Dogan, B.S., Buharalıoglu, C.K., Kanzik, I., Studies on the vascular effects of the fractions and phenolic compounds isolated from Viscum album ssp. Album, J Ethnopharmacol, 72 (1-2), (2000). 3. Akar, F., Uydes-Dogan, B.S., Buharalioglu, C.K., Abban, G., Heinemann, A., Holzer, P., van de Voorde, J., Protective effect of cromakalim and diazoxide and proulcerogenic effect of glibenclamide on indomethacin-induced gastric injury, Eur J Pharmacol, 374, (2000). 4. Dayioglu, E., Buharalioglu, C.K., Saracoglu F., Akar F., The effects of bumetanide on human umbilical artery contractions, Reproductive Sciences, 14, (2007). 5. Tunctan, B., Korkmaz, B., Dogruer, Z.N., Tamer, L., Atik, U., Buharalioglu, C.K., Inhibition of extracellular signalregulated kinase (ERK1/2) activity reverses endotoxin-induced hypotension via decreased nitric oxide production in rats, Pharmacol Res 56(1), (2007). 6. Korkmaz, B., Ozveren, E., Buharalioglu, C.K., Tunctan, B., Extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) contributes to endotoxininduced hyporeactivity via nitric oxide and prostacyclin production in rat aorta, Pharmacology, 78(3), (2006). 7. Ozveren, E., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Tunctan, B., Involvement of calcium/calmodulindependent protein kinase II to endotoxininduced vascular hyporeactivity in rat superior mesenteric artery, Pharmacol Res, 54(3), (2006). 19

22 8. Tunctan, B., Ozveren, E., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Tamer, L., Degirmenci, U., Atik, U., Nitric oxide reverses endotoxin-induced inflammatory hyperalgesia via inhibition of prostacyclin production in mice, Pharmacol Res, 53(2), (2006). 9. Tunctan, B., Korkmaz, B., Yildirim, H., Tamer, L., Atik, U., Buharalioglu, C. K., Reversal of endotoxin-induced hypotension by inhibition of inducible nitric oxide synthase activity is associated with improved oxidative status in rat heart, aorta and mesenteric artery, Turkish Journal of Medical Sciences, 36, (2005). 10. Tunctan, B., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Sahan-Firat, S., Anjaiah, S., Falck, J., Roman, R.J., Malik, K.U., 20-HETE Agonist, N-[20-hydroxyeicosa- 5(Z),14(Z)-dienoyl]glycine, Opposes the Fall in Blood Pressure and Vascular Reactivity in Endotoxin-Treated Rats, Shock, 30(3), (2008). 11. Mugabe, B.E., Yaghini, F.A., Song, C.Y., Buharalioglu, C.K., Waters, C.M., Malik, K.U., Angiotensin II-Induced Migration of Vascular Smooth Muscle Cells is Mediated by p38 Mitogen- Activated Protein Kinase-Activated c-src through Spleen Tyrosine Kinase and Epidermal Growth Factor Receptor Transactivation, J Pharmacol Exp Ther, 332(1), (2010). 12. Cuez, T., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Sahan-Firat, S., Falck, J., Malik, K.U., Tunctan, B., A Synthetic Analog of 20-HETE, 5,14-HEDGE, Reverses Endotoxin-Induced Hypotension via Increased 20-HETE Levels Associated with Decreased inos Protein Expression and Vasodilator Prostanoid Production in Rats, Basic and Clinical Pharmacology Toxicol, 106(5), (2010). 13. Tunctan B., Korkmaz, B., Cuez, T., Kemal Buharalioglu, C., Sahan-Firat S., Falck, J., Malik, K.U., Contribution of Vasoactive Eicosanoids and Nitric Oxide Production to the Effect of Selective Cyclooxygenase-2 Inhibitor, NS-398, on Endotoxin-Induced Hypotension in Rats, Basic Clin Pharmacol Toxicol, Apr 23 (2010) Korkmaz, B., Buharalioglu, K., Sahan- Firat, S., Cuez, T., Tuncay Demiryurek, A., Tunctan, B. Activation of MEK1/ERK1/2/iNOS/sGC/PKG pathway associated with peroxynitrite formation contributes to hypotension and vascular hyporeactivity in endotoxemic rats Nitric Oxide, 24(3): (2011). 15. Buharalioglu, C.K., Korkmaz, B., Cuez, T., Sahan-Firat, S., Sari, A.N., Malik, K.U., Tunctan, B., Piroxicam reverses endotoxin-induced hypotension in rats: contribution of vasoactive eicosanoids and nitric oxide Basic Clin Pharmacol Toxicol, 109(3): (2011). 16. Buharalioglu, C.K., Song, C.Y., Yaghini, F.A., Ghafoor, H.U., Motiwala, M., Adris, T., Estes, A.M., Malik, K.U., Angiotensin II-induced process of angiogenesis is mediated by spleen tyrosine kinase via VEGF receptor-1 phosphorylation Am J Physiol Heart Circ Physiol, 301(3): H (2011). 17. Buharalioglu, C.K., Ugur, M., Akar, F., The characteristics of contractions to hyperosmolar stress in rat aorta, Int J Pharmacol, DOI: /ijp.2011 (2011). Science Citation Index-Expanded Kapsamındaki Dergilerde Yer Alan ve Uluslararası Toplantılarda Sunulan Poster Özetleri 1. Buharalioglu, C.K., Song, C.Y., Yaghini, F.A., Ghafoor, H.U., Estes, A.M., Malik, K.U., "Angiotensin II-induced angiogenesis is mediated by spleen tyrosine kinase via epidermal growth factor receptor-stimulated vascular endothelial growth factor receptor 1 phosphorylation independent of vascular endothelial growth factor expression, 63 rd High Blood Pressure Research Conference, Chicago, IL, USA, September 23-26, Program /Abstract No: P212, 110 (2009). 2. Buharalioglu, C.K., Yaghini, F.A., Song, C.Y., Ghafoor, H.U., Estes, A.M., Malik, K.U., "Spleen tyrosine kinase mediates angiotensin II- and vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis", Experimental Biology, New Orleans, LA,

23 USA, April 18-22, Program/Abstract No: 625.9/472, FASEB J 23 (2009). 3. Buharalioglu, C.K., Ozbasoglu, O., Korkmaz, B., Cuez, T., Sahan-Firat, S., Yalcin, A., Tunctan, B., Thalidomide potentiates analgesic effect of COX inhibitors on endotoxin-induced hyperalgesia by modulating TNF-, PGE and NO synthesis in mice Experimental Biology, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: 742.4/1561, FASEB J 23 (2009). 4. Tunctan, B., Korkmaz, B., Cuez, T., Sahan-Firat, S., Yildirim, H., Tamer, L., Buharalioglu, C.K., Falck, J.R., Malik, K.U., Increased production of 20-HETE contributes to the effects of COX inhibitors to prevent the decrease in lipid peroxidation and increase in catalase activity during endotoxemia Experimental Biology, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: /658, FASEB J 23 (2009). 5. Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Demiryurek, T.A., Sahan-Firat, S., Cuez, T., Tunctan, B., Activation of MEK1/ERK1/2/iNOS/sGC/PKG pathway contributes to the fall in blood pressure and vascular reactivity in endotoxemic rats, Experimental Biology, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: 932.5/1009, FASEB J 23 (2009). 6. Sahan-Firat, S., Korkmaz, B., Cuez, T., Ayaz, L., Tamer, L., Buharalioglu, C.K., Sari, A.N., Tunctan, B., Prostaglandins contribute to endotoxin-induced increase in lipid peroxidation via nitric oxide production during endotoxemia in rats, Experimental Biology, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: LB368/656, FASEB J 23 (2009). 7. Sahan-Firat, S., Canacankatan, N, Korkmaz B, Yildirim, H., Tamer, L., Buharalioglu C.K., Sari, AN., Tunctan, B., Differential regulation of oxidative stress by NO in vascular and nonvascular tissues of endotoxemic rats, Experimental Biology, San Diego, CA, USA, April 5-9, FASEB J Abstract No: 5981 (2008). 8. Yaghini, F.A., Mugabe, B.E., Buharalioglu, C.K., Estes, A.M., Malik, K.U., "Mechanism of angiotensin IIinduced c-src activation in vascular smooth muscle" Experimental Biology, San Diego, CA, USA, April 5-9, FASEB J Abstract No: 22:911.5 (2008). 9. Tunctan, B., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Sahan-Firat, S., Anjaiah, S., Falck, JR., Yildirim, H., Tamer, L., Roman, RJ., Malik, KU., 20-HETE agonist, N-[20- hydroxyeicosa-5(z),14(z)-dienoyl]glycine, opposes the endotoxin-induced fall in blood pressure and the decrease in vascular reactivity and lipid peroxidation and increased catalase activity via inhibition of NO production in rats, Experimental Biology, San Diego, CA, USA, April 5-9, FASEB J Abstract No: 6051 (2008). 10. Buharalioglu, C.K., Dayıoglu, E., Saracoglu, F., Akar, F., The effects of bumetanide on human umbilical artery contractions, XVth World Congress of Pharmacology, Beijing, China, Abstract Book, P (2006). 11. Tunctan, B., Ozveren, E., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Calcium/ calmodulin dependent protein kinase II contributes to endotoxin-induced hyporeactivity via prostaglandin production in rat mesenteric artery, Experimental Biology, San Diego, CA, USA FASEB J 19(5), p. A1551, Abstract No: (2005). 12. Tunctan, B., Korkmaz, B., Ozveren, E., Buharalioglu, C.K., Mitogen-activated protein kinase signalling cascade contributes to endotoxin-induced hyporeactivity via nitric oxide and prostaglandin production in rat thoracic aorta, Experimental Biology, San Diego, CA, USA FASEB J 19(5), p. A1551, Abstract No: (2005). Ulusal / Uluslararası Toplantılarda Sunulan Poster Özetleri 1. Ozveren, E., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Tunctan, B., Inhibition of inducible nitric oxide synthase restores attenuation of endothelium-dependent and endothelium-independent relaxations in rat superior mesenteric artery exposed to endotoxin, 8 th International Symposium on Pharmaceutical Sciences (ISOPS-8), 21

24 Ankara, Turkey, Abstract Book, P121 (2006). 2. Akar, F., Buharalioglu, C.K., The involvement of MLCK in hypertonicityinduced contraction in vascular smooth muscle, 7 th International Symposium on Resistance Arteries, Muskoka Sands, Ontario, Canada, Abstract Book, P.105 (2001). 3. Akar, F., Buharalioglu, C.K., The role of endothelium and Na-K-2Cl cotransport in hypertonicity-induced contractions, 7 th International Symposium on Resistance Arteries, Muskoka Sands, Ontario, Canada, Abstract Book, P.85, (2001). 4. Buharalioglu, C.K., Akar, F., Losartan differentially affects hypertonic sucroce and NaCl induced contractions in rat aorta, 2 nd International Forum on Angiotensin II Receptor Antagonism, Monte-Carlo, Abstract Book, P.1.6 (2001). 5. Deliorman, D., Calis, I., Ergun, F., Uydes- Dogan, S., Buharalioglu, C.K., Kanzık, I., Studies on the vascular effect of fractions and phenolic compounds isolated from Viscum Album SSP. Album, 2000 Years of Natural Products Research, Amsterdam, Netherlands, Abstract Book, P.192 (1999). 6. Uydes-Dogan, B.S., Sayar, S., Buharalioglu, C.K., Kanzık, I., Akar, F., Effects of K + channel openers cromakalim and diazoxide on gastric acid secretion in the pylorus-ligated rats, 32 nd Annual Meeting, European Society for Clinical Investigation, Cracow, Poland, Eur. J. Clin. Invest., 55( Suppl.1), 266 (1998). 7. Akar, F., Buharalioglu, C.K., Uydes- Dogan, B.S., Kanzık, I., The investigation of effects of K + channel openers on gastric injury and contractions in rats, XXXIII. International Congress of Physiological Sciences, IUPS, St. Petersburg, Russia, Abstract Book, P (1997). 8. Tufan, H., Buharalioglu, C.K., Uydes- Dogan, B.S., Kanzık, I., Akar, F., K + channel active agents can play a role in indomethacin-induced gastric mucosal injury in rats, 10 th International Conference on Prostaglandins and 22 Releated Compounds, Vienna, Austria, Prostaglandin Leukot. Essential Fatty Acids, 55(Suppl.1), P260 (1996). 9. Cüez, T., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Falck, J., Malik, K.U., Tunçtan, B., Endotoksemik sıçanlarda N-[20-hidroksieikoza- 5(Z),14(Z)-dienoil]glisinin enos, inos ve hsp90 protein ekspresyonu ile prostanoit ve 20-HETE düzeyleri üzerindeki etkisi, XX. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kızılağaç, Manavgat, Antalya, 4-7 Kasım, Özet Kitabı, s. 262, Bildiri No: P-082 (2009). 10. Şahan-Fırat, S., Canacankatan, N., Korkmaz, B., Yıldırım, H., Tamer, L., Buharalıoğlu, C.K., Tunçtan, B., Endotoksemik sıçanların karaciğerinde artan oksidatif stres üzerinde indüklenebilir nitrik oksit sentaz inhibisyonunun etkisi, 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Trabzon, Ekim, Özet Kitabı, s. 378, Bildiri No: P104 (2007). 11. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan-Fırat S., Anjaiah, S., Falck, J., Roman, R.J., Malik, K.U., Endotoksin ile olusan nitrik oksit aracilikli hipotansiyon ve vaskuler hiporeaktivite üzerinde selektif 20- hidroksieikozatetraenoik asit agonisti N- [20-hidroksieikoza-5(Z),14(Z)-dienoil] glisinin etkileri, 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Trabzon, Ekim, Özet Kitabı, s. 212, Bildiri No: S-02 (2007). 12. Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Demiryürek A.T., Şahan-Fırat S., Tunçtan, B., Endotoksemik sıçanların torasik aortasında gelişen vasküler hiporeaktiviteye indüklenebilir nitrik oksit sentaz/çözünebilir guanilil siklaz/protein kinaz G yolunun katkısı, 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Trabzon, Ekim, Özet Kitabı, s. 211, Bildiri No: S-01 (2007). 13. Korkmaz, B., Özveren, E., Buharalıoğlu, C.K., Tunçtan, B., Sıçan torasik aortunda endotoksin ile oluşan nitrik oksit ve prostaglandin aracılıklı hiporeaktiviteye mitojen ile aktive edilen protein kinaz sinyal ileti yolu katkıda bulunur, XVIII. Ulusal Farmakoloji Kongresi, İzmir, 28 Eylül-1 Ekim 2005, s. 341, SP42 (2005).

25 14. Tunçtan, B., Özveren, E., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Tamer, L., Değirmenci, U., Atik, U., Endotoksin ile oluşan nitrik oksit aracılıklı inflamatuvar hiperaljezide nükleer transkripsiyon faktörü K B, siklooksijenaz ve poli-adpriboz sentazın rolü, XVIII. Ulusal Farmakoloji Kongresi, İzmir, 28 Eylül-1 Ekim 2005, s. 301, S21 (2005). 15. Buharalıoğlu C.K., Korkmaz B., Yıldırım H., Tamer L., Atik U., Tunçtan B., Nitrik oksidin böbrek sitozolik fosfolipaz A 2 aktivitesini azaltıcı etkisi endotoksin ile oluşan hipotansiyona katkıda bulunabilir, XVIII. Ulusal Farmakoloji Kongresi, İzmir, 28 Eylül-1 Ekim 2005, s. 154, P15 (2005). 16. Tunctan, B., Ozveren, E., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Tamer, L., Atik, U., Role of NF -B and nitric oxide synthase in endotoxin-induced inflammatory hyperalgesia, 17 th National Congress Of Pharmacology, 1 st Clinical Pharmacology Symposium & Joint Meeting of the Turkish & Dutch Pharmacological Societies, Antalya, October, Turkey, Abstract Book, P56 (2003). 17. Buharalıoğlu, C.K., İlter, Ö.R., Akar, F., Uydeş-Doğan, B.S., Potasyum kanal açıcılarının sıçanlarda etanolle oluşturulan gastrik mukozal lezyonlar üzerine etkisi, Türk Farmakoloji Derneği, XV. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 1-5 Kasım, Manavgat, (1999). 18. Buharalıoğlu, C.K., Uydeş-Doğan, B.S., Kanzık, İ., Akar, F., Sıçanlarda indometazin ülseri üzerine çeşitli vazoaktif bileşiklerin etkisi, Türk Farmakoloji Derneği, XIII. Ulusal Kongresi, 4-8 Kasım, s. 88, Tekirova- Antalya (1996). 19. Köksoy, C., Kuzu, A., Buharalıoğlu, C.K., Uydeş-Doğan, B.S., Akar, F., Kesenci M., İntestinal iskemireperfüzyon hasarının çeşitli damar yatakları üzerine olan etkileri, VIII. Ulusal Vasküler Cerrahi Kongresi, Nisan, s. 27 (1996). Ulusal / Uluslararası Toplantılarda Yapılan Sözlü Sunumlar 1. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Cüez, T., Sari, A.N., Kaçan, M., Gilik, D., Buharalioğlu, C.K., Şahan Firat, S., Schunk, W.H., 23 Serin M.S., Falck, J.R., Malik, K.U., "Sıçan ve Farelerde Oluşturulan Deneysel Septik Şok Modelinde 20-HETE Analoğu 5, 14-HEDGE nin Hipotansiyonu ve Mortaliteyi Önleyici Etkisine inos, COX-2, CYP4A1 ve NADPH Oksidazın Etkisi", XXI. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Bildiri no: S-4, Eskişehir Osmangazi Üniversitesi Kongre Merkezi, Eskişehir, Sari, A.N., Kaçan, M., Gilik, D., Şahan Firat, S., Buharalioğlu, C.K., Vezir, Ö., Korkmaz, B., Cüez, T., Sucu, N., Tunçtan, B., "Sıçanlarda Oluşturulan Periferik İskemi/Reperfüzyona Bağlı Hedef Organ Gastrokinemus Kası ve Uzak Organ Böbrek Zedelenmesine RhoA/Rhokinaz/ERK1/2/ İNOS/NADPH Oksidaz Yolunun Katkısı, XXI. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Bildiri no: S-3, Eskişehir Osmangazi Üniversitesi Kongre Merkezi, Eskişehir, Tunctan, B., Korkmaz, B., Cuez, T., Sarı, A.N., Kacan, M., Gilik, D., Buharalioglu, C.K., Sahan-Firat, S., Schunck, W.H, Serin, M.S., Falck, J.R., Malik, K.U., Contribution of inos, COX-2 and CYP4A1 to the Protective Effect of a Synthetic Analog of 20-HETE, 5,14- HEDGE, Against Endotoxin-İnduced Hypotension and Mortality in Experimental Model of Septic Shock in Rats and Mice, 10th World Congress on Inflammation, Paris, France, OC-059, Inflammation Research 60 (Suppl. 1), S55, Korkmaz, B., Cüez, T., Buharalıoğlu, C.K., Demiryürek, A.T., Şahan Fırat, S., Sarı, A.N., Tunçtan, B., Endotoksemik sıçanlarda gelişen kaspaz-3 aracılıklı apoptoza ve oksidatif strese MEK1/ERK1/2/iNOS yolunun katkısı, XX. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kızılağaç, Manavgat, Antalya, 4-7 Kasım, Özet Kitabı, s. 141, Bildiri No: S-01 (2009). 5. Tunçtan, B., Cüez, T., Korkmaz, B., Şahan Fırat, S., Buharalıoğlu, C.K., Yıldırım, H., Sarı, A.N., Tamer, L., Falck, J., Malik, K.U., Endotoksemik sıçanlarda NO oluşumundaki artmaya 20-HETE düzeylerindeki azalmanın eşlik ettiği oksidatif stres ve inflamasyon üzerinde yapay bir 20-HETE analoğu olan N-[20-

26 hidroksieikoza-5(z),14(z)-dienoil]glisinin etkisi, XX. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kızılağaç, Manavgat, Antalya, 4-7 Kasım, Özet Kitabı, s. 129, Bildiri No: SS-01 (2009). 6. Tunctan, B., Korkmaz, B., Cuez, T., Buharalıoglu, C.K., Sahan-Fırat, S., Falck, J., Malik, K.U., "Interactions between Cytochrome P4504A, Cyclooxygenase and Nitric Oxide Synthase during Endotoxemia: Therapeutic Implications for Inflammatory Diseases" EHRLICH II - 2 nd World Conference on Magic Bullets, Celebrating the 100 th Anniversary of the Nobel Prize Award to Paul Ehrlich, Nurnberg, Germany, October 3-5, Abstract Book, p. A-330 (2008). NOTLAR * * * * * 24

27 Septik Sıçanlarda Bozulmuş İnflamatuvar Cevap, Organ Hasarı ve Mortalitenin Önlenmesinde Yeni Bir Hedef: Periferik 5HT 7 Reseptörleri Elif ÇADIRCI Atatürk Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı, Erzurum GİRİŞ VE AMAÇ Sepsis; şok, organ yetmezliği ve ölüme kadar giden, acil tedavi edilmesi gereken sistemik bir enfeksiyon hastalığıdır ve gelişen tedavi yöntemlerine rağmen yüksek mortalite ile seyreden bir hastalık olma özelliğini korumaktadır (Alberti et al., 2002). Sepsis veya septik şok ciddi hipotansiyon, metabolik asidoz, sistemik inflamatuvar yanıt (SIRS), doku hasarı ve çoklu organ yetmezliği, akut respiratuvar distres sendromu (ARDS) ve/veya akut akciğer hasarı (ALI) ve hatta ölümle sonlanabilen kompleks bir patofizyolojik süreçtir (Ozdulger et al., 2003). Sepsis fizyopatolojisinde mikrobiyal patojenler ve inflamatuvar yanıt yer almaktadır. Dokularda oluşan enfeksiyon ve travmatik hasar vücutta hümoral sistemi aktive eder ve çeşitli sitokinler salınır. Sonuç, sistemik inflamatuvar yanıt, hemostatik değişiklikler ve organ hasarının ortaya çıkmasıdır (Bone, 1991; Hotchkiss and Karl, 2003). Sepsiste ortaya çıkan sistemik inflamatuvar yanıt, zıt etki gösteren molekül, mediatör ve sitokinlerle dengelenmeye, düzenlenmeye çalışılır. Bu süreçte sepsise neden olan endotoksin ile uyarılan monositlerden tümör nekrozis faktör (TNF), interlökin 1 (IL-1), IL-6, IL-8 ve trombositleri aktive eden faktör (PAF) salınır. TNF ve IL-1 inflamatuvar sitokinlerin prototipini oluştururken, IL-10 anti-inflamatuvar sitokinlerin prototipidir. Sepsis indüksiyonundan sonra kısa sürede TNF ve IL-1 salınır. Bunlar ikinci sıra sitokinlerin, lipid mediatörlerin ve reaktif oksijen metabolitlerinin salınımına neden olur (Karaali and Tabak, 2009 ; Yorganci, 2005). Son yapılan çalışmalarda oksidatif stresin sepsise bağlı mortalite ve organ hasarında oldukça önemli roller oynayabileceği gösterilmiştir. Oksidanlar inflamasyonda ve birçok doku hasarında belirgin bir role sahiptir (Cadirci et al., 2011; Cadirci et al., 2010; Shah et al., 2007). Fizyolojik şartlarda serbest oksijen radikalleri ve endojen süpürücü antioksidanlar arasında bir denge mevcutken (Gutteridge and Mitchell, 1999) sepsiste aşırı oksijen radikali üretimine bağlı olarak bu denge bozulur (Coskun et al., 2011). Sepsise bağlı olarak karaciğer (Collin and Thiemermann, 2003), kalp (Verma et al., 2009) ve böbrek (Yang et al., 2009) gibi vital organlarda oluşan yetmezliklerde ve özellikle akciğerlerde oluşan ARDS ve ALI da proinlamatuvar sitokinler kadar artmış reaktif oksijen radikallerinin (ROS) üretimi de göze çarpmaktadır (Albayrak et al., 2011; Cadirci et al., 2011; Cadirci et al., 2010). Serotonin (5-hidroksitriptamin, 5-HT) depresyon, anksiyete, sirkadyen ritim, şizofreni, blumia nervoza, anoreksia nervosa, astım, vb. birçok hastalığın patofizyolojisinde rol alan biyolojik bir amindir (Yang et al., 2006). Aslında serotoninin 14 farklı reseptör alttipinin olması, bu nörotransmitterin geniş fizyolojik etkilerin açıklanmasına kolaylık getirmektedir (MaassenVanDenBrink et al., 2008). 5-HT 7 de serotoninin en son keşfedilen ancak en az karakterize edilmiş reseptörlerinden biridir (Hedlund, 2009; Hedlund et al., 2004; Hedlund and Sutcliffe, 2004). Doku dağılımı araştırıldığında özellikle beyin dokusunda talamus, hipotalamus, serebral korteks, hipokampüs ve amigdalada bulunduğu gösterilmiştir (Neumaier et al., 2001; To et al., 1995; Tsou et al., 1994). Ancak bu reseptörlerin periferdeki ekspresyonları ile ilgili çalışmalar oldukça kısıtlıdır. Periferde düz kaslar üzerinde bulunmalarından dolayı muhtemel etkileri araştırılmış ve irritable bowel sendromda rol aldığı gösterilmiştir (Beattie and Smith, 2008; Hedlund, 2009). Bu reseptörlerin pulmoner, koroner arterler ve aort gibi arterlerde bulunduğu gösterilmiştir (Nilsson et al., 1999; Ullmer et al., 1995). 5-HT 7 reseptörlerinin olgunlaşmamış T hücrelerinde bulunduğu ve uyarılmalarının T hücrelerinin foksiyonlarında ve aktivasyonlarında rol aldıkları gösterilmiştir (Leon-Ponte et al., 2007). 5- HT nin monositlerde de 5-HTR1 ve/veya 5- HT 7 reseptörleri aracılığı ile monositik apoptozisi önlediği gösterilmiştir (Soga et al., 2007). Stefulj ve arkadaşlarının çalışmasında sıçan immun doku hücrelerinde serotonin reseptörlerinin ekspresyonu çalışılmış ve timüs, periferal 25

28 lenfositler, dalak ve mitojenle aktive edilmiş dalak hücrelerinde 5-HT 7 mrnası tespit edilmiştir (Stefulj et al., 2000). 5-HT 7 reseptörlerinin insan (Heidmann et al., 1997) ve sıçan (Shen et al., 1993; Stefulj et al., 2000) immun dokularında varlığı, enflamasyonda ve sepsiste oluşan immun cevapta bu reseptörlerin de rolü olabileceğini düşündürmektedir. Ancak literatürde 5-HT 7 reseptörlerinin sepsiste ve sepsise bağlı gelişen akciğer hasarındaki rolünü araştıran bir çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle bu çalışmanın amacı, çekal ligasyon ve puncture (CLP) ile indüklenen polimikrobiyal sepsis modelinde 5-HT 7 reseptörlerinin muhtemel rolünü göstermek, sepsise bağlı mortalitede önemli olan akciğer dokusunda 5-HT 7 reseptör dağılımını incelemek ve septik sıçanlara 5-HT 7 reseptör agonist ve antagonisti uygulanmasının sepsisin normal gidişini nasıl değiştireceğini gözlemleyerek yeni ilaç araştırmalarına ışık tutmaktır. GEREÇ VE YÖNTEM Hayvanlar Bu çalışmada Atatürk Üniversitesi Tıbbi Deneysel Uygulama ve Araştırma Merkezinden temin edilen ve ağırlıkları gram arasında değişen toplam 80 adet Albino Wistar erkek sıçan kullanıldı. Hayvanlar deney öncesi gruplar halinde laboratuvarda normal oda sıcaklığında (22 o C) barındırıldı ve beslendi. Çalışmanın Atatürk Üniversitesi Rektörlüğü Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu Başkanlığı tarafından etik kurallara uygun olduğu onaylandı. Kimyasallar Çalışmada 5-HT 7 reseptör agonisti olarak AS-19 (Cat. No. 1968; TOCRIS Bioscience;), antagonisti olarak ise SB hydrochloride (Cat. No. 1612; TOCRIS Bioscience) kullanıldı. Biyokimyasal, histopatolojik ve moleküler analiz için gerekli olan bütün kimyasallar SIGMA Co. (Almanya) den temin edildi. Deney grupları 1. Sham (n=20) 2. CLP (n=20) 3. CLP+Agonist- AS-19 (n=20) 4. CLP+Antagonist- SB (n=20) İlaç uygulaması Deney gruplarına 5-HT 7 agonisti AS-19 (Bosker et al., 2009; Hedlund, 2009) ve antagonisti SB (Forbes et al., 2002; Thomas et al., 2003) 10 mg/kg dozunda intraperitoneal yoldan verildi. Toz halindeki maddelerin çözelti haline getirilmesi için 100 mm DMSO kullanıldı. Sham gruba da aynı DMSO çözeltisi aynı yoldan uygulandı. İlaç uygulamaları sepsis indüksiyonundan 30 dk önce ve 8 saat sonra olmak üzere iki kez tekrarlandı. Polimikrobiyal sepsis modeli Sıçanlarda CLP modeli ile polimikrobiyal sepsis modeli oluşturmak için 24 saat aç bırakılan sıçanlara ilaç uygulamalarından 30 dk sonra 20 mg/kg tiopental sodyum ile anestezi yapıldı. Anestezi sonrasında sıçanların karın orta hatta yaklaşık 3 cm çapında insizyon yapılarak ve periton karın kasları geçilerek dışarı alınan çekum 3.0 sutur ile bağlandı. Ayrıca çıkarılan çekum distalinden 16 G bir iğne yardımıyla karşılıklı 2 adet çift delik açıldı. Sonrasında çekum ve bağırsak bölümü yerine koyularak batın kapatıldı ve dikildi. Her hayvana sıvı takviyesi olarak 2 ml serum fizyolojik verildi. Operasyon sonrasında sıçanlar kafeslerinde 16 saat gözlendi. 16. saatin sonunda sağ kalan hayvanlardan grup başına rastgele 6 hayvan seçilerek ötenazi yapıldı, kan ve doku örnekleri alındı. Biyokimyasal analiz için dokular hemen C ye konuldu. Moleküler analiz için dokular sıvı azotta dondurulduktan sonra C de saklandı. Her deney grubunda sağ kalan diğer hayvanlar 72 saat boyunca izlenmeye devam edildi. Biyokimyasal analizler Kanlardan elde edilen serumlarda TNF-α (Invitrogen; KRC33012), IL-1β (Invitrogen; KRC0012) ve IL-6 (RayBiotech; Cat-ELR- IL6-001) seviyeleri üretici firmanın talimatlarına göre ELISA kiti ile ölçüldü. Ayrıca her bir sıçan akciğeri oksidatif stres yönünden değerlendirildi. Bu amaçla sıçan akciğerlerinde, 8-izoprostan (Cell Biolabs Inc; STA-337), superoksit dismutaz (SOD) (Cayman; ), ve glutatyon (GSH) (Cell Biolabs; STA-312) seviyeleri yine ELİSA kitleri ile ölçüldü. Tüm ölçümler 2 kez tekrarlandı ve ortalamaları alındı. 26

29 Western Blot Dokular sıvı azot ile toz haline getirildikten sonra, RIPA tamponunda ultra-turraks ile homojenize edildi. Daha sonra doku lizatları Lowry metoduna göre (Lowry et al., 1951) protein miktarları tayin edildi. Her bir doku lizatından 20 µg olacak şekilde %10 luk SDS PAGE jeline (Mini-Protean TGX; BIORAD) yüklendi. Protein standardı olarak Precion Plus Protein Standart (BIORAD) 7 µl yüklendi ve Tris/Glisin/SDS yürütme tamponu ile 130 voltta yürütüldü. Yürütme sonrası jeldeki ayrışan proteinler PVDF membrana (Trans-Blot Turbo Transfer Pack; BIORAD) Trans-Blot Turbo Transfer System (BIORAD) aracılığı ile aktarıldı. Membran transfer sonrası %5 lik BSA da 1 saat 40C de bloke edildi. 5 dakika TBST tamponu ile yıkandı. Primer antikor olarak 5-HT 7 reseptörüne spesifik poliklonal antikor (Ab13898; Abcam) sekonder antikor olarak HRP-conjugate poliklonal antikor (Ab6751; Abcam) kullanıldı. Referans protein olarak β- aktin (Ab8227; Abcam) seçildi. Kemiluminasans ışıma için Super-signal West Pico ECL substrat (PIERCE; 34077) kullanılarak Fusion Fx (Vilber Lourmat) cihazında görüntülendi. Hedef protein β-aktin e göre normalize edildi. Histopatolojik analizler Histolojik prosedür: Elde edilen doku örnekleri saat boyunca %4 lük formaldehit ile fikse edildi. Fiksasyondan sonra 6 saat boyunca yıkandı ve giderek artan alkol serilerinden geçirildi. Daha sonra 10 ar dakika 2 kez ksilol uygulaması ile dokunun sertleşmesi sağlandı. En son aşamada ise dokular 60ºC etüv içerisindeki eriyik halde bulunan parafin serilerinden geçirilerek gömüldü. Elde edilen parafin bloklardan rutin histokimyasal, immunhistokimyasal ve stereolojik incelemeler amacıyla mikrotom yardımıyla 5 µm kalınlığında yaklaşık adet kesit elde edildi. Rutin histokimyasal prosedür: Elde edilen kesitler yaklaşık 1 saat boyunca deparafinizasyon amacıyla 65ºC lik etüvde bekletildi ve daha sonra 2 adet ksilen serisinden, giderek artan alkol serilerinden geçirildi. Daha sonra çeşme suyunda yıkanan kesitlerin; Hematoksilen, asit-alkol ve Eozin serilerinden geçirilerek boyanması sağlandı. Son aşamada ise yıkama, giderek artan alkol serileri ve ksilol serilerinden geçirilen kesitler entellan ile kapatıldı. HE boyanan kesitler kamera ataçmanlı mikroskop (Olympus BH40 ) yardımıyla görüntülenerek değerlendirildi. Akciğerde enflamasyon skorlaması: Sistematik olarak kesilen ve rastgele örneklenen kesit ler perivasküler alandaki enflamasyon derecesine aşağıdaki şekilde göre skorlandı: 0: hücre yok; 1: az miktarda hücre; 2: perivasküler alanın periferal kısımlarında birçok hücre; ve 3: perivasküler alanda çok sayıda hücre (Singh et al., 2005). İmmunhistokimyasal prosedür: Polilizinli lama alınan kesitler immunhistokimyasal boyama cihazında (Leica Bond-Max ), 5HT- 7 Ab Leica Bond Polymer Refine Detection Kit ile boyandı. 5HT-7 Ab ile boyanan kesitlerde + boyanma paterni gösteren interstisyel alanda bulunan peribronşial makrofajlar ve lenfositler, alveol duvarını oluşturan tip-1 pnömositler, damar endotel hücreleri tespit edildi. NF-κB nin değerlendirilmesi için gruplara ait parafin bloklardan yeni kesitler alınarak NF-κB immunhistokimyasal boyası uygulandı. NFκB için akciğer dokusunda nükleer boyanmanın olduğu alanlar değerlendirildi. İstatistiksel Analiz Elde edilen sonuçlar ortalama±standart sapma olarak gösterildi. Elde edilen sayısal bulguların değerlendirilmesi için tek yönlü varyans analizinde Tukey testi kullanıldı. Sağkalım sürelerinin değerlendirilmesinde çift yönli varyans analizinde faktöryel tasarıma uygun olarak Tukey testi yapıldı. P< 0.05 anlamlı olarak kabul edildi. BULGULAR Sağkalım süresi Deney gruplarının gözlenmesi sonucunda sham grubunda 72 saat boyunca ölüm gözlenmemiştir. CLP grubundaki hayvanlar ortalama 16,71 saat yaşamışken, CLP+agonist grubunda bu süre ortalama 35,43 saate çıkmıştır. CLP antagonist grubunda ise CLP grubuna göre anlamlı bir fark gözlenmemiştir (Şekil 1). 27

30 Şekil 1. Deney gruplarında 72 saat içinde sağkalan hayvan sayısı. Biyokimyasal bulgular Sitokinler Çalışmada serum TNF-α, IL-1β ve IL-6 seviyelerinin CLP grubunda sham gruplara göre anlamlı derecede yüksek olduğu, septik sıçanlara agonist uygulamasının bu değerleri anlamlı şekilde düşürdüğü ancak antagonist uygulamasının anlamlı bir değişikliğe neden olmadığı görüldü (Şekil 2, 3, 4). Şekil 4. Deney gruplarında serum IL-6 değerleri (*CLP grubuna göre p<0,05 oranında anlamlı). Oksidatif stres bulguları Akciğer dokularında yapılan ELİSA analizleri sonucunda septik akciğer dokularında lipid peroksidasyonu belirteci olan 8-izoprostan miktarının sham gruplara göre anlamlı derecede artmış olduğu gözlendi (Şekil 6). CLP grubuna AS-19 uygulanması bu artışı anlamlı şekilde azaltırken SB uygulanan CLP grubunda septik sıçanlara göre anlamlı bir fark yoktu. Dokuda antioksidan seviyenin göstergesi olan SOD ve GSH seviyeleri ise CLP grubunda sham gruba göre anlamlı şekilde azalmışken, AS- 19 uygulaması bu durumu düzeltti (Şekil 7-8). Şekil 2. Deney gruplarında serum TNF-α değerleri (*CLP grubuna göre p<0,05 oranında anlamlı). Şekil 5. Deney gruplarında akciğer 8-izoprostan değerleri (*CLP grubuna göre p<0,05 oranında anlamlı). Şekil 3. Deney gruplarında serum IL-1β değerleri (*CLP grubuna göre p<0,05 oranında anlamlı). Şekil 6. Deney gruplarında akciğer GSH değerleri (*CLP grubuna göre p<0,05 oranında anlamlı). 28

31 Şekil 7. Deney gruplarında akciğer SOD değerleri (*CLP grubuna göre p<0,05 oranında anlamlı). Moleküler bulgular Yürütme sonrasında Sham grubunda 5-HT 7 reseptör varlığı belirlendi. CLP uygulanan bütün sıçan gruplarında bu reseptör ekspresyonunda artış gözlenirken, CLP gruplarına agonist uygulaması bu artışı anlamlı azalttı. Antagonist grubunda ise ekpresyonda bir miktar artış vardı ancak anlamsızdı (Şekil 8, 9) Histopatolojik bulgular Konvansiyonel ışık mikroskobu bulguları Sham grubuna ait bulgular: Sham grubuna ait H&E ile boyanmış kesitler incelendiğinde terminal bronşioller, alveoller, vasküler yapılar ve çok az miktarda interstisyel doku varlığı gözlendi (Resim 1A-D). Terminal bronşiollerin lümeni tek katlı kübik epitel hücreleri ve lümene doğru çıkıntı yapan clara hücreleri ile döşeliydi (Resim 1D). Etrafında ise ince düz kas tabakası bulunmakta, en dış kısımda ise tek tük interstisyel dokuya ait hücreler izlenmekteydi (Resim 1D). Vasküler yapılar da lümene doğru çıkıntı yapan endotel hücreleri ve onu çevreleyen düz kas tabakası ile birlikte kolaylıkla ayırt edilebilmekteydi (Resim 1A, C). Alveoller; oldukça ince duvarlı, bol kapillere sahip şekilde izlenmekteydi (Resim 1A-D ). Şekil 8. Sham ve CLP gruplarında 5-HT 7 proteinine (50 kda) ait bant görüntüleri Resim 1. Sham grubuna ait akciğer kesitleri. Bv: kan damarları, a: alveol, TB: terminal bronşiol. Boya; H&E, kesit kalınlığı:5 µm. Ortalama skor: 0,84 CLP uygulanan gruba ait bulgular: CLP uygulanan gruba ait H&E boyalı akciğer preparatlarında ilk bakışta interstisyel alanda inflamatuar hücre infiltrasyonu ile birlikte eritrosit ekstravazasyonu dikkati çekmekteydi (Resim 2A). İnflamatuar hücre infiltrasyonu aynı zamanda bronşiol duvarları ve vasküler yapıların duvarlarında da izlenmekteydi (Resim 2B,C). Alveolar yapılar incelendiğinde ise alveolar septalarda kalınlaşma ve irregülasyon, kapillerlerde de dilatasyon tespit edildi (Resim 2A,B,D). Şekil 9. Sham ve CLP gruplarında 5-HT 7 proteinin miktarları (*CLP grubuna göre p<0,05 oranında anlamlı). 29

32 Resim 2. CLP grubuna ait akciğer kesitleri. Bv: kan damarları, a: alveol, TB: terminal bronşiol. Boya; H&E, kesit kalınlığı:5 µm. Ortalama skor: 2,71. CLP uygulanan ve agonist ile tedavi edilen gruba ait bulgular: Bu gruba ait preparatlar incelendiğinde, CLP uygulanan gruba göre inflamasyonun daha önce bahsedilen tüm alanlarda oldukça azaldığı gözlendi (Resim 3A,B,C). Bunun yanında alveollerde de CLP grubuna göre kalınlaşma, irregülarite ve kapiller dilatasyonda azalma mevcuttu (Resim 3B, D). Resim 4. CLP + antagonist grubuna ait akciğer kesitleri. Bv: kan damarları, a: alveol, TB: terminal bronşiol. Boya; H&E, kesit kalınlığı:5 µm. Ortalama skor:2,77 Şekil 10. Konvansiyonel ışık mikroskobu skorlamasından elde edilen sayısal veriler. (*CLP grubuna göre p<0,05 oranında anlamlı). İmmunhistokimya bulguları 5HT-7 bulguları Resim 3. CLP + agonist grubuna ait akciğer kesitleri. Bv: kan damarları, a: alveol, TB: terminal bronşiol. Boya; H&E, kesit kalınlığı:5 µm. Ortalama skor: 1,86 CLP uygulanan ve antagonist ile tedavi edilen gruba ait bulgular: Bu gruba ait akciğer kesitleri incelendiğinde inflamatuar hücre infiltrasyonu ve eritrosit ekstravazasyonunun CLP uygulanan gruba göre daha şiddetli olduğu gözlendi (Resim 4A-D). Ayrıca diğer gruplardan farklı olarak pekçok damarda total obstrüksiyon ve çevresindeki hücrelerde nekroz tespit edildi (Resim 4C). Ayrıca alveol duvarlarında kalınlaşma, irregülarite ve kapiller dilatasyon da CLP uygulanan gruba kıyasla daha şiddetliydi (Resim 6A-D). Sham grubuna ait bulgular: Sham grubuna ait 5HT-7 ile boyanmış akciğer kesitleri incelendiğinde tutulumun oldukça az olduğu gözlendi. Tutulum interstisyel hücrelerle sınırlı olarak tespit edildi. (Resim 5 A,B). Resim 5. Sham grubuna ait immünhistokimyasal olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, ok: 5HT-7 immunpozitivite gösteren yapılar. Boya: 5HT-7, kesit kalınlığı: 5 µm, barlar:10 µm. 30

33 CLP uygulanan gruba ait bulgular: CLP uygulanan gruba ait kesitlerde immünpozitivitenin sham gruplarına göre çok fazla miktarda olduğu belirlendi. İnterstisyel alandaki tutulum terminal bronşiol çevresindeki alanda gruplar halindeydi (Resim 6A). Ayrıca büyük ve orta çaplı damarların endotel hücrelerinde de tutulum izlenmekteydi (Resim 6A). Alveollerin arasındaki interstisyel hücrelerde ve alveolleri oluşturan tip-1 pnömositlerde de tutulum oldukça belirgindi (Resim 6B). bronşiolleri döşeyen epitel hücrelerinde tutulum gözlenmezken, alveolleri döşeyen tüm hücrelerde ve interstisyel hücrelerde kuvvetli pozitiflik mevcuttu (Resim 8A). Ayrıca daha küçük bronşiolleri döşeyen epitel hücrelerinde de kuvvetli pozitiflik mevcuttu (Resim 8B). Resim 8. CLP + antagonist ilaç uygulanan gruba ait immunhistokimyasal olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, ok:5ht-7 immunpozitivite gösteren yapılar. Boya: 5HT-7, kesit kalınlığı 5 µm, barlar:10 µm. Resim 6. CLP uygulanan gruba ait immunhistokimyasal olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, ok:5ht-7 immunpozitivite gösteren yapılar. Boya: 5HT-7, kesit kalınlığı 5 µm, barlar:10 µm. CLP uygulanan ve agonist ile tedavi edilen gruba ait bulgular: Bu gruba ait preparatlarda 5HT-7 tutulumu terminal bronşiollerin periferinde, 1-2 hücreyle sınırlı şekildeydi (Resim 7A). Ayrıca interstisyel alandaki hücrelerde CLP grubundaki kadar şiddetli olmayan tutulum mevcuttu. Alveolleri oluşturan hücrelerde boyanma CLP grubundan çok daha azdı (Resim 7B). NF-κB boyası Sham grubuna ait bulgular: Sham grubuna ait NfκB ile boyanan akciğer kesitlerinde terminal bronşiol bazalindeki hücrelerde çok az miktarda nükleer immünpozitiflik gözlendi (Resim 9A). Ek olarak alveoller ve aradaki interstisyumdaki vasküler yapılara ait hücrelerde de sadece sitoplazmik pozitiflik izlendi (Resim 9B). Resim 7. CLP + agonist ilaç uygulanan gruba ait immunhistokimyasal olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, RB: respiratuar bronşiol, ok:5ht-7 immunpozitivite gösteren yapılar. Boya: 5HT-7, kesit kalınlığı 5 µm, barlar: 10 µm. CLP uygulanan ve antagonist ile tedavi edilen gruba ait bulgular: Terminal Resim 9. Sham grubuna ait immunhistokimyasal olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, Bv: damar ok: nükleer NfκB immunpozitivitesi gösteren yapılar. Boya: NfκB, kesit kalınlığı 5 µm, barlar: 10 µm. CLP uygulanan gruba ait bulgular: CLP uygulanan gruba ait akciğer kesitlerinde ise terminal bronşiol epitelinde yaygın nükleer immünpozitiflik, bununla birlikte terminal bronşiol çevresinde nükleer immünpozitif boyanmış yaygın enflamasyon tespit edildi (Resim 10A). Alveolleri oluşturan hücrelerde 31

34 ve intersitisyuma ait kan damarlarının endotel hücrelerinde de nükleer immünpozitiflik mevcuttu (Resim 10B). Resim 10. CLP uygulanan gruba ait immunhistokimyasal olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, Bv: damar, ok: nükleer NfκB immunpozitivitesi gösteren yapılar. Boya: NfκB, kesit kalınlığı 5 µm, barlar: 10 µm. CLP uygulanan ve agonist ile tedavi edilen gruba ait bulgular: CLP uygulanan ve agonist ile tedavi edilen gruba ait kesitlerde hem terminal bronşiolü oluşturan epitel hücrelerinde hem de alveolü oluşturan hücrelerin pek azında nükleer pozitiflik mevcuttu (Resim 11A, B). Resim 11. CLP + agonist ilaç uygulanan gruba ait immunhistokimyasal olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, Bv: damar, siyah ok: nükleer NfκB immunpozitivitesi gösteren yapılar, beyaz ok: nükleer NfκB immunpozitivitesi göstermeyen yapılar Boya: NfκB, kesit kalınlığı 5 µm, barlar: 10 µm. CLP uygulanan ve antagonist ile tedavi edilen gruba ait bulgular: Bu gruba ait akciğer kesitlerinde ise CLP grubuna benzer şekilde bronşiollere ait hücrelerde ve çevresindeki kan damarlarına ait endotel hücrelerinde nükleer immünpozitiflik çok fazlaydı (Resim 12A). Ayrıca alveollerde ve interalveolar septumlarda nükleer immünpozitiflik göstermeyen hücre neredeyse hiç bulunmamaktaydı (Resim 12A). Resim 12. CLP + antagonist ilaç uygulanan gruba ait immunhistokimyasal olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, Bv: damar. Boya: NfκB, kesit kalınlığı 5 µm, barlar: 10 µm. TARTIŞMA ve SONUÇ Bu çalışmada CLP ile indüklenen polimikrobiyal sepsis modelinde 5-HT 7 reseptörlerinin rolü gösterilmiştir. Yine sepsise bağlı mortalitede önemli olan akciğer dokusunda 5-HT 7 reseptör varlığı incelenmiş, 5-HT 7 reseptör agonist ve antagonistinin polimikrobiyal sepsis ile indüklenen akut akciğer hasarı üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Ayrıca çalışmamızda serum sitokin seviyeleri, akciğerdeki histopatolojik değişiklikler ve oksidatif stress parametreleri, akciğerlerde NF-κB ve 5-HT 7 boya tutulumu ve ayrıca akciğerde 5-HT 7 reseptör mrna sının sepsise bağlı olarak değişen miktarı gösterilmiştir. CLP ile indüklenen sepsis, insanlarda bağırsak perforasyonu ve bakteriyel enfeksiyonun oluşturduğu klinik tabloyu taklit eden bir hayvan modelidir (Chen et al., 2001; Hubbard et al., 2005; İskit, 2005). Bu sepsis modelinde saatler intraabdominal sepsisin geç fazı olarak kabul edilir (Wang et al., 1997). Bu çalışmada da 16. saat, geç fazın başlangıcı olarak değerlendirilmiş ve bu saatte deney hayvanlarından kan ve doku örnekleri alınmıştır. Aynı zamanda çalışmada hayvanlar 72 saat boyunca mortalite açısından gözlenmiştir. Sham gruplarında 72 saat boyunca mortalite gözlenmezken CLP grubunun ortalama hayatta kalma süresi 16,71 saat olarak belirlenmiştir. CLP grubu hayvanlara 5-HT 7 reseptörlerinin selektif agonisti olan AS-19 (Bosker et al., 2009; Hedlund, 2009) uygulandığında ortalama yaşam süresi 35,43 saate kadar çıkmıştır ancak antagonist olarak SB (Forbes et al., 2002; Thomas et al., 2003) verilen 32

35 grupta ortalama sağkalım süresi septik gruptan farksız bulunmuştur. Hayvanlardaki sağkalım oranları yapılan histopatolojik analizlerle de desteklenmektedir. Şöyle ki septik sıçanların akciğerinde inflamatuvar hücre birikimi skorlandığında, CLP grubu hayvanların akciğerinde sham gruplara göre oldukça yüksek enflamasyon skorları elde edilmiş olmasına rağmen; 5-HT 7 reseptör agonisti uygulanması bu enflamasyonu anlamlı şekilde azaltmış ancak antagonist uygulanmış septik akciğerler ile CLP grubu akciğerleri arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. Bizim çalışmamızda da gösterdiğimiz gibi, septik sıçanlarda mortalite oldukça yüksek oranda olup (Coskun et al., 2011; Otero- Anton et al., 2001) bu mortalitenin en önemli nedeninin akut akciğer hasarı olduğu öne sürülmüştür (Cadirci et al., 2010; Vincent, 2011). Daha önceki çalışmalarımızda da akciğer hasarı önlenen sıçanlarda mortalitenin anlamlı azaldığını ortaya koymuştuk (Cadirci et al., 2011; Cadirci et al., 2010). Çalışmamızda elde ettiğimiz sağkalım süreleri ile sepsise bağlı gelişen akciğer hasarında 5-HT 7 reseptörlerinin uyarılmasının koruyucu etkili olduğunu gösterdik. 5-HT 7 reseptörlerinin immun yanıt hücreleri olan monositler (Soga et al., 2007), T hücreleri (Leon-Ponte et al., 2007) ve timüs, periferal lenfositler, dalak ve mitojenle aktive edilmiş dalak hücrelerinde gösterilmiş olması (Stefulj et al., 2000) bu reseptörlerin uyarılmasının akciğerdeki koruyucu etkiye aracılık etmiş olabileceğini düşündürmektedir. Daha önceki çalışmalarda da periferal dokularda 5-HT, mast hücreleri, bazofiller ve enterokromafin hücrelerde salındığı ve inflamasyon sırasında ekstraselüler 5-HT seviyesinin oldukça arttığı gösterilmiştir (Matsuda et al., 1997). Bu kapsamda 5-HT bir immunmodülatör olarak değerlendirilebilir. Soga et al. tarafından 5-HT1 ve 5-HT 7 reseptörlerinin monosit apoptozisinin önlenmesinde rol aldığı gösterilmiş (Soga et al., 2007), ve bu etkinin 5-HT 7 reseptör uyarılmasına bağlı olarak LPS li monosit kültürlerinde intrasellüler siklik adenozin fosfatı artırıp sitokinlerin üretimini indüklemesine bağlı olabileceğini (Durk et al., 2005) öne sürmüştür. Deneysel sepsis modellerinde ve klinik çalışmalarda proinflamatuvar ve potansiyel olarak ototoksik mediyatörlerin salıverildiği gösterilmiştir. Makrofaj kaynaklı proinflamatuvar sitokinler olan TNF-α, IL-1β ve IL-6 septik şok ve çoklu organ yetmezliğinin patogenezinde önemlidir (Damas et al., 1992). Sepsise bağlı olarak gelişen akut akciğer hasarının patogenezinde de bu inflamatuvar mediyatörlerin oldukça önemli bir rolü vardır (Bhatia and Moochhala, 2004). Bu çalışmada CLP yapılan sıçanlarda serum TNF-α, IL-1β, and IL-6 seviyeleri anlamlı derecede yükselmiş ve 5-HT 7 reseptörlerinin AS-19 ile uyarılması sitokinlerdeki bu artışı önlemiştir. Bu bulgular sitokin seviyelerinin artmış olduğu diğer çalışmalarla desteklenmektedir (Cadirci et al., 2010; Li et al., 2009a). TNF-α inflamatuvar yanıt içinde birçok önemli sürece katkıda bulunur (Kuwano and Hara, 2000). Diğer yandan IL- 6 da nötrofil migrasyonunda önemli role sahiptir; sepsisin oluşumuna katkıda bulunan bir mediatör olduğu için sepsisin şiddetinin gösterilmesi için kullanılır (Li et al., 2009b; Remick et al., 2005). Bu sitokinlerden TNF-α ve IL-1β alveolar iyon miktarını azaltarak sıvı transferini ve sonuç olarak pulmoner ödem oluşumunu azaltırlar (Braun et al., 2005). Dürk et al. tarafından yapılan çalışmada da 5-HT 7 nin monositler üzerinde oluşturduğu etkiler incelenmiş ve 5-HT 4 ve 5-HT 7 reseptör agonist ve antagonistlerinin monositlerden IL-1β, IL-6 ve TNF-α gibisitokinlerin salınımının düzenlenmesine katkıda bulunduğu ve monositlerden camp salınımını artırdığı gösterilmiştir (Durk et al., 2005). Bizim bulgularımız 5-HT 7 agonist uygulamasının serum sitokin seviyelerini azaltmasının yanı sıra akciğer dokularında yapılan immunhistokimyasal boyamada CLP uygulamasının NF-κB pozitifliğini artırdığını da gösterdi. Agonist uygulaması NF-κB boyasında daha az tutuluma neden oldu. NF-κB aktivasyonu ve ardından birçok proinflamatuvar molekülün ekspresyonunun artışı enflamasyon patogenezinde (Sakurai et al., 1999) ve buna bağlı olarak TNF-a, IL- 6 vb birçok inflamatuvar sitokinin transkripsiyonunun düzenlenmesinde merkezi role sahiptir (Shen et al., 2009). Bizim bulgularımız da akciğer NF-κB aktivasyonu artmış septik ratlarda serum TNF-α, IL-6 ve IL-1β seviyelerinin arttığını göstermiştir. Oksidatif stresin de NF-κB transkripsiyonunu upregüle ettiği ve antioksidanların artmış NFκB transkripsiyonunda downregülasyon yaptığı gösterilmiştir (van den Berg et al., 2001). Bu çalışma 5-HT 7 reseptör agonisti olan AS-19 un çeşitli enflamatuvar hastalıkların başlamasında ve devamında 33

36 muhtemel terapötik etkinliğinin NF-κB inhibisyonuna bağlı olarak oksidatif stresin azalmasına ve aynı zamanda proinflamatuvar sitokinlerin azalmasına bağlı olabileceğini öne sürmektedir. Nötrofillerden artmış ROS üretimi akciğer hasarına neden olan mekanizmalardan biri olarak görülmektedir (Fink, 2002). Sepsis vakalarında antioksidan sistemin ciddi şekilde etkilenmesi ve plazma lipid peroksidasyon son ürünlerinin anlamlı derecede artması sepsise bağlı akciğer hasarında oksidatif stresin oldukça artmış olduğunu göstermektedir (Metnitz et al., 1999). SOD ve GSH antioksidan sistem içinde yer alan ana parametrelerdir. Bu antioksidanlar toksik serbest radikallerin sitotoksik etkilerini azaltırlar (Fink, 2002) ve birçok sepsis çalışmasında akciğer dokusundaki seviyelerinin azaldığı gösterilmiştir (Cadirci et al., 2011; Cadirci et al., 2010; Coskun et al., 2011; Qiao et al., 2011; Starr et al., 2011). Bizim çalışmamız-da AS-19 septik sıçanlarda antioksidan enzim aktivitesini artırmıştır. AS-19 verilen septik sıçanların akciğer dokularında hem SOD aktivitesinin hem GSH miktarı tedavi edilmemiş CLP grubuna göre anlamlı artış göstermiştir. Doku lipid peroksidas-yonunun son ürünlerinden olan 8-isoprostan miktarının da CLP grubunda artmış olmasına rağmen AS-19 uygulanan septik sıçanlarda azalmış olması, AS-19 un akciğerde oluşan oksidatif stresi azalttığını göstermektedir. Oksidatif hasarın bir göstergesi olan lipid peroksidasyonu membran geçirgenliğinde değişmelere, böylece protein degradasyonunda artmaya ve sonuçta hücrelerde lizise neden olabilir (Garcia et al., 1997). Sıçanlarda ve insanlarda CLP ile indüklenen sepsiste doku LPO seviyelerinin oldukça arttığı gözlenmiştir (Ortolani et al., 2000). Bunların yanında biz de çalışmamızda doku LPO konsantrasyonunun hassas bir belirteci olan 8-izopostan (Wood et al., 2003) miktarının daha önce de bildirildiği üzere akciğerlerde (Razavi et al., 2005) artmış olduğunu gördük. Agonist uygulamasının 8- isoprostan seviyesini düşürmesi 5-HT 7 reseptörlerinin uyarılmasının akciğer dokusunda oksidatif stresi de azaltarak koruyucu etki oluşturduğunu düşündürdü. Bu veriler 5-HT 7 agonisti verilen sıçanlarda daha az mortalite gözlenmesinin AS-19 un CLP ye bağlı oluşan sitokin yanıtını azaltmasına, akciğerde oluşan oksidatif stresi azaltmasına ve buna bağlı akciğer hasarını önlemesine bağlı olabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle 5-HT 7 reseptörlerinin uyarılması şiddetli sepsise bağlı akciğer hasarının önlenmesinde güçlü bir terapotik hedef teşkil edebilir. 5-HT 7 reseptörlerinin uyarılmasının akciğerlerde koruyucu etki oluşturmuş olması, genelde beyinde varlığı gösterilmiş ancak periferdeki varlığı üzerine çalışmalar kısıtlı olan (Segura et al., 2010) bu reseptörün akciğerlerde eksprese olduğunu ve bu ekspresyonun inflamatuvar bir uyarı olan sepsisle arttığını düşündürmektedir. Birçok çalışmada 5-HT 2A reseptörlerinin havayolu düz kası membranlarında bulunduğu gösterilmiştir (Cazzola and Matera, 2000; Rhoden et al., 2000; Yang et al., 1994). Ancak 5-HT 7 reseptörlerinin pulmoner yerleşimleri oldukça az incelenmiştir (Segura et al., 2010). Bunun üzerinde yaptığımız immunhistokimyasal çalışmada akciğerlerden alınan kesitlerde 5- HT 7 boyası ile immun boyama yapılmış ve CLP grubunda sham gruba kıyasla oldukça yüksek tutulum görülmüştür. Daha önce Segura et al. tarafından kobaylar üzerinde yapılan bir çalışmada 5-HT 7 reseptör antagonisti olan SB antijenle indüklenen havayolu aşırı-duyarlılığını azaltmış, izole organ banyosunda ise başka bir 5-HT 7 reseptör agonisti olan LP44 trakede kasılma cevaplarını artırmıştır (Segura et al., 2010). Segura et al. çalışmalarıda 5-HT 7 reseptörlerinin yanısıra 5-HT 2A ve 5-HT 4 reseptörlerinin de havayolu duyarlılığında rol aldığını göstermiş ancak RT-PCR çalışmasında ne sensitizasyonun ne de antijene maruz kalmanın akciğer 5- HT 2A mrnasını değiştirmediğini öne sürmüşlerdir. Bizim çalışmamızda olduğu gibi bu çalışmada da normal olmayan koşullarda 5-HT 7 reseptörleri devreye girdiği anlaşılmaktadır. Ancak yazarlar bu etkinin pulmoner nöroendokrin hücreler aracılığı ile gerçekleştirdiğini öne sürmüş, 5-HT 7 reseptörlerinin akciğerlerdeki varlığı ile ilgili detaylı inceleme yapmamışlardır. Bu bakımdan bizim çalışmamız akciğer dokusunda 5-HT 7 reseptör varlığını immunhistokimyasal olarak gösteren ilk çalışmadır. Çalışmamızda immun boyama sonrasında en yüksek tutulum CLP grubunda görülmüş, AS-19 uygulanan dokularda boyanma oranı azalmıştır. Bu durum 5-HT 7 reseptörlerinin uyarılmasının iyileştirici etkisinden dolayı inflamatuvar yanıtın azalmasına ve sonuçta akciğerdeki 34

37 5-HT 7 reseptör yoğunluğunun azalmasına bağlı olabilir. Ancak septik akciğerlerdeki boyanmanın sham gruba göre artması, 5- HT 7 reseptörlerini taşıdığı daha önceden gösterilmiş olan monositler, T hücreleri, ve periferal lenfositlerin (Leon-Ponte et al., 2007; Soga et al., 2007; Stefulj et al., 2000) aşırı inflamatuvar yanıt sonucu akciğerlerde toplanmasından kaynaklanıyor da olabilir. Bu nedenle akciğerlerde sepsise bağlı değişen 5-HT 7 reseptör ekspresyonunun daha iyi anlaşılması için Western Blot çalışması gerçekleştirilmiştir. Western blot analizinde, doku lizatlarında 5- HT 7 mrna sı incelendi. Yapılan yürütmede sham grubunda 5-HT 7 reseptör varlığı belirlenmiştir. Akciğer dokusunda 5-HT 7 reseptör mrna sının ilk kez gösteriliyor olmasından dolayı bu çalışma bir ilktir. Çalışmamızda CLP uygulanan bütün sıçan gruplarında bu reseptör ekspresyonunda artış gözlenmesi bu reseptörlerin enflamatuvar bir uyarım karşısında ekspresyonunun arttığını ve bu artışın sepsis patofizyolojisine katkıda bulunuyor olabileceğini göstermiştir, CLP gruplarına agonist uygulaması reseptör ekspresyonunu anlamlı azaltırken antagonist uygulanması ekpresyonu CLP grubuna göre bir miktar artırmış ancak bu artış anlamlı bulunmamıştır. SONUÇ Bu çalışmamız periferik 5-HT 7 reseptörlerinin CLP ile indüklenen sepsiste çok önemli rollerinin olduğunu ilk kez gün yüzüne çıkarırken; 1. Bu reseptörlerin bir agonist ile uyarılmasının sepsise bağlı artmış mortaliteyi oldukça azalttığını, 2.Sepsis ile artmış ve mortaliteden büyük oranda sorumlu akciğer hasarını azalttığını, 3. Tüm bu önemli etkilerini sepsis şiddetinin göstergesi olan serum sitokin seviyelerini ve sitokin salınımını tetikleyen akciğer NFKB miktarını azaltarak, ayrıca organ hasarında rol alan doku oksidatif stresini azaltıp, antioksidan sistemi güçlendirerek ortaya koyduğunu göstermiştir. Tüm bu bulgular; 5-HT 7 reseptörlerinin uyarılmasının bozulmuş inflamatuvar cevaba bağlı oluşabilecek organ hasarı ve mortalitenin önlenmesinde yeni bir hedef olabileceğini göstermiştir. TEŞEKKÜR Prof. Dr. Fatma Göçer, Prof. Dr. Cemal Gündoğdu, Prof. Dr. Bünyami Ünal, Doç. Dr. Zekai Halıcı, Doç. Dr. Ahmet Hacımüftüoğlu, Yrd. Doç. Dr. Abdulmecit Albayrak, Yrd. Doç. Dr. Yasin Bayır, Yrd. Doç. Dr. Emre Karakuş, Yrd. Doç. Dr. Deniz Ünal, Arş. Grv. Beyzagül Polat, Arş. Grv. Irmak Ferah, Arş. Grv. Muhammet Yayla, Arş. Grv. Selina Aksak, Yüksek Lisans Öğrencileri Seda Özaltın, Nurcan Yüksel e, Laboratuvar imkanlarından ve deneyimlerinden yararlandığım ve serotoninle ilgili desteğini esirgemeyen Dr. Trevor Sharp a en içten teşekkürlerimi sunarım. KAYNAKLAR * * * * * Albayrak, A., Uyanik, M.H., Odabasoglu, F., Halici, Z., Uyanik, A., Bayir, Y., Albayrak, F., Albayrak, Y., Polat, B., Suleyman, H. (2011) The effects of diabetes and/or polymicrobial sepsis on the status of antioxidant enzymes and pro-inflammatory cytokines on heart, liver, and lung of ovariectomized rats. The Journal of Surgical Research 169: Alberti, C., Brun-Buisson, C., Burchardi, H., Martin, C., Goodman, S., Artigas, A., Sicignano, A., Palazzo, M., Moreno, R., Boulme, R., Lepage, E., Le Gall, R. (2002) Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive Care Medicine 28: Beattie, D.T., Smith, J.A. (2008) Serotonin pharmacology in the gastrointestinal tract: a review. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 377: Bhatia, M., Moochhala, S. (2004) Role of inflammatory mediators in the pathophysiology of acute respiratory distress syndrome. The Journal of Pathology 202: Bone, R.C. (1991) The pathogenesis of sepsis. Annals of Internal Medicine 115: Bosker, F.J., Folgering, J.H., Gladkevich, A.V., Schmidt, A., van der Hart, M.C., Sprouse, J., den Boer, J.A., Westerink, B.H., Cremers, T.I. (2009) Antagonism of 5-HT(1A) receptors uncovers an excitatory effect of SSRIs on 5-HT neuronal activity, an action probably mediated by 5-HT(7) receptors. Journal of Neurochemistry 108: Braun, C., Hamacher, J., Morel, D.R., Wendel, A., Lucas, R. (2005) Dichotomal role of TNF in 35

38 experimental pulmonary edema reabsorption. J Immunol 175: Cadirci, E., Halici, Z., Odabasoglu, F., Albayrak, A., Karakus, E., Unal, D., Atalay, F., Ferah, I., Unal, B. (2011) Sildenafil treatment attenuates lung and kidney injury due to overproduction of oxidant activity in a rat model of sepsis: a biochemical and histopathological study. Clinical and Experimental Immunology 166: Cadirci, E., Oral, A., Odabasoglu, F., Kilic, C., Coskun, K., Halici, Z., Suleyman, H., Nuri Keles, O., Unal, B. (2010) Atorvastatin reduces tissue damage in rat ovaries subjected to torsion and detorsion: biochemical and histopathologic evaluation. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 381: Cazzola, I., Matera, M.G. (2000). 5-HT modifiers as a potential treatment of asthma. Trends in Pharmacological Sciences 21: Chen, J., Raj, N., Kim, P., Andrejko, K.M., Deutschman, C.S. (2001) Intrahepatic nuclear factor-kappa B activity and alpha 1-acid glycoprotein transcription do not predict outcome after cecal ligation and puncture in the rat. Critical Care Medicine 29: Collin, M., Thiemermann, C. (2003) The PPARgamma ligand 15-deoxy(delta12,14) prostaglandin J2 reduces the liver injury in endotoxic shock. European Journal of Pharmacology 476: Coskun, A.K., Yigiter, M., Oral, A., Odabasoglu, F., Halici, Z., Mentes, O., Cadirci, E., Atalay, F., Suleyman, H. (2011) The effects of montelukast on antioxidant enzymes and proinflammatory cytokines on the heart, liver, lungs, and kidneys in a rat model of cecal ligation and puncture-induced sepsis. The Scientific World Journal 11: Damas, P., Ledoux, D., Nys, M., Vrindts, Y., De Groote, D., Franchimont, P., Lamy, M. (1992) Cytokine serum level during severe sepsis in human IL-6 as a marker of severity. Annals of Surgery 215: Durk, T., Panther, E., Muller, T., Sorichter, S., Ferrari, D., Pizzirani, C., Di Virgilio, F., Myrtek, D., Norgauer, J., Idzko, M. (2005) 5- Hydroxytryptamine modulates cytokine and chemokine production in LPS-primed human monocytes via stimulation of different 5-HTR subtypes. Int Immunol 17: Fink, M.P. (2002) Reactive oxygen species as mediators of organ dysfunction caused by sepsis, acute respiratory distress syndrome, or hemorrhagic shock: potential benefits of resuscitation with Ringer's ethyl pyruvate solution. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care 5: Forbes, I.T., Douglas, S., Gribble, A.D., Ife, R.J., Lightfoot, A.P., Garner, A.E., Riley, G.J., Jeffrey, P., Stevens, A.J., Stean, T.O., Thomas, D.R. (2002) SB A: a novel 5- HT(7) receptor antagonist with improved in vivo properties. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12: Garcia, J.J., Reiter, R.J., Guerrero, J.M., Escames, G., Yu, B.P., Oh, C.S., Munoz- Hoyos, A. (1997) Melatonin prevents changes in microsomal membrane fluidity during induced lipid peroxidation. FEBS Letters 408: Gutteridge, J.M., Mitchell, J., Redox imbalance in the critically ill. British Medical Bulletin 55: Hedlund, P.B. (2009) The 5-HT 7 receptor and disorders of the nervous system: an overview. Psychopharmacology 206: Hedlund, P.B., Kelly, L., Mazur, C., Lovenberg, T., Sutcliffe, J.G., Bonaventure, P. (2004) 8- OH-DPAT acts on both 5-HT1A and 5-HT 7 receptors to induce hypothermia in rodents. European Journal of Pharmacology 487: Hedlund, P.B., Sutcliffe, J.G. (2004) Functional, molecular and pharmacological advances in 5- HT 7 receptor research. Trends in Pharmacological Sciences 25: Heidmann, D.E., Metcalf, M.A., Kohen, R., Hamblin, M.W. (1997) Four 5- hydroxytryptamine7 (5-HT 7 ) receptor isoforms in human and rat produced by alternative splicing: species differences due to altered intron-exon organization. Journal of Neurochemistry 68: Hotchkiss, R.S., Karl, I.E. (2003) The pathophysiology and treatment of sepsis. The New England Journal of Medicine 348: Hubbard, W.J., Choudhry, M., Schwacha, M.G., Kerby, J.D., Rue, L.W., 3rd, Bland, K.I., Chaudry, I.H. (2005) Cecal ligation and puncture. Shock 24 (Suppl 1): İskit, A.B. (2005) Sepsiste Deneysel Modeller. Yoğun Bakım Dergisi 5: Karaali, R., Tabak, F. (2009) Sepsis Patogenezi. Klinik Gelişim 22: Kuwano, K., Hara, N. (2000) Signal transduction pathways of apoptosis and inflammation induced by the tumor necrosis factor receptor 36

39 family. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 22: Leon-Ponte, M., Ahern, G.P., O'Connell, P.J. (2007) Serotonin provides an accessory signal to enhance T-cell activation by signaling through the 5-HT 7 receptor. Blood 109: Li, Q.F., Zhu, Y.S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. (2009a) Heme oxygenase-1 mediates the antiinflammatory effect of isoflurane preconditioning in LPS-stimulated macrophages. ACTA Pharmacologica Sinica 30: Li, Q.F., Zhu, Y.S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. (2009b) Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats. Anesth Analg 109: Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry 193: Maassen Van Den Brink, A., Centurion, D., Villalon, C.M. (2008) Crosstalk of vascular 5- HT1 receptors with other receptors: clinical implications. Neuropharmacology 55: Matsuda, H., Ushio, H., Geba, G.P., Askenase, P.W. (1997) Human platelets can initiate T celldependent contact sensitivity through local serotonin release mediated by IgE antibodies. J Immunol 158: Metnitz, P.G., Bartens, C., Fischer, M., Fridrich, P., Steltzer, H., Druml, W. (1999) Antioxidant status in patients with acute respiratory distress syndrome. Intensive Care Medicine 25: Neumaier, J.F., Sexton, T.J., Yracheta, J., Diaz, A.M., Brownfield, M. (2001) Localization of 5- HT(7) receptors in rat brain by immunocytochemistry, in situ hybridization, and agonist stimulated cfos expression. Journal of Chemical Neuroanatomy 21: Nilsson, T., Longmore, J., Shaw, D., Pantev, E., Bard, J.A., Branchek, T., Edvinsson, L. (1999) Characterisation of 5-HT receptors in human coronary arteries by molecular and pharmacological techniques. European Journal of Pharmacology 372: Ortolani, O., Conti, A., De Gaudio, A.R., Moraldi, E., Cantini, Q., Novelli, G. (2000) The effect of glutathione and N-acetylcysteine on lipoperoxidative damage in patients with early septic shock. Am J Respir Crit Care Med 161: Otero-Anton, E., Gonzalez-Quintela, A., Lopez- Soto, A., Lopez-Ben, S., Llovo, J., Perez, L.F. (2001) Cecal ligation and puncture as a model of sepsis in the rat: influence of the puncture size on mortality, bacteremia, endotoxemia and tumor necrosis factor alpha levels. European Surgical Research 33: Ozdulger, A., Cinel, I., Koksel, O., Cinel, L., Avlan, D., Unlu, A., Okcu, H., Dikmengil, M., Oral, U. (2003) The protective effect of N- acetylcysteine on apoptotic lung injury in cecal ligation and puncture-induced sepsis model. Shock 19: Qiao, Y., Bai, X.F., Du, Y.G. (2011) Chitosan oligosaccharides protect mice from LPS challenge by attenuation of inflammation and oxidative stress. Int Immunopharmacol 11: Razavi, H.M., Wang, L., Weicker, S., Quinlan, G.J., Mumby, S., McCormack, D.G., Mehta, S. (2005) Pulmonary oxidant stress in murine sepsis is due to inflammatory cell nitric oxide. Critical Care Medicine 33: Remick, D.G., Bolgos, G., Copeland, S., Siddiqui, J. (2005) Role of interleukin-6 in mortality from and physiologic response to sepsis. Infection and Immunity 73: Rhoden, K.J., Dodson, A.M., Ky, B. (2000) Stimulation of the Na(+)-K(+) pump in cultured guinea pig airway smooth muscle cells by serotonin. J Pharmacol Exp Ther 293: Sakurai, H., Chiba, H., Miyoshi, H., Sugita, T., Toriumi, W. (1999) IkappaB kinases phosphorylate NF-kappaB p65 subunit on serine 536 in the transactivation domain. The Journal of Biological Chemistry 274: Segura, P., Vargas, M.H., Cordoba-Rodriguez, G., Chavez, J., Arreola, J.L., Campos-Bedolla, P., Ruiz, V., Garcia-Hernandez, L.M., Mendez, C., Montano, L.M. (2010) Role of 5-HT2A, 5- HT4 and 5-HT 7 receptors in the antigeninduced airway hyperresponsiveness in guinea-pigs. Clin Exp Allergy 40: Shah, S.V., Baliga, R., Rajapurkar, M., Fonseca, V.A. (2007) Oxidants in chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology: JASN 18: Shen, L., Mo, H., Cai, L., Kong, T., Zheng, W., Ye, J., Qi, J., Xiao, Z. (2009) Losartan prevents sepsis-induced acute lung injury and decreases activation of nuclear factor kappab and mitogen-activated protein kinases. Shock 31: Shen, Y., Monsma, F.J., Jr., Metcalf, M.A., Jose, P.A., Hamblin, M.W., Sibley, D.R. (1993) 37

40 Molecular cloning and expression of a 5- hydroxytryptamine7 serotonin receptor subtype. The Journal of Biological Chemistry 268: Singh, B., Shinagawa, K., Taube, C., Gelfand, E.W., Pabst, R. (2005) Strain-specific differences in perivascular inflammation in lungs in two murine models of allergic airway inflammation. Clinical and Experimental Immunology 141: Soga, F., Katoh, N., Inoue, T., Kishimoto, S. (2007) Serotonin activates human monocytes and prevents apoptosis. The Journal of Investigative Dermatology 127: Starr, M.E., Ueda, J., Yamamoto, S., Evers, B.M., Saito, H. (2011) The effects of aging on pulmonary oxidative damage, protein nitration, and extracellular superoxide dismutase downregulation during systemic inflammation. Free Radic Biol Med 50: Stefulj, J., Jernej, B., Cicin-Sain, L., Rinner, I., Schauenstein, K. (2000) mrna expression of serotonin receptors in cells of the immune tissues of the rat. Brain, Behavior, and Immunity 14: Thomas, D.R., Melotto, S., Massagrande, M., Gribble, A.D., Jeffrey, P., Stevens, A.J., Deeks, N.J., Eddershaw, P.J., Fenwick, S.H., Riley, G., Stean, T., Scott, C.M., Hill, M.J., Middlemiss, D.N., Hagan, J.J., Price, G.W., Forbes, I.T. (2003) SB A, a novel selective 5-HT 7 receptor antagonist, modulates REM sleep in rats. British Journal of Pharmacology 139: To, Z.P., Bonhaus, D.W., Eglen, R.M., Jakeman, L.B. (1995) Characterization and distribution of putative 5-HT 7 receptors in guinea-pig brain. British Journal of Pharmacology 115: Tsou, A.P., Kosaka, A., Bach, C., Zuppan, P., Yee, C., Tom, L., Alvarez, R., Ramsey, S., Bonhaus, D.W., Stefanich, E., et al. (1994) Cloning and expression of a 5- hydroxytryptamine7 receptor positively coupled to adenylyl cyclase. Journal of Neurochemistry 63: Ullmer, C., Schmuck, K., Kalkman, H.O., Lubbert, H. (1995) Expression of serotonin receptor mrnas in blood vessels. FEBS Letters 370: van den Berg, R., Haenen, G.R., van den Berg, H., Bast, A. (2001) Transcription factor NFkappaB as a potential biomarker for oxidative stress. The British Journal of Nutrition 86 (Suppl 1): S Verma, R., Huang, Z., Deutschman, C.S., Levy, R.J. (2009) Caffeine restores myocardial cytochrome oxidase activity and improves cardiac function during sepsis. Critical Care Medicine 37: Vincent, J.L. (2011) Acute kidney injury, acute lung injury and septic shock: how does mortality compare? Contributions to Nephrology 174: Wang, P., Ba, Z.F., Chaudry, I.H. (1997) Mechanism of hepatocellular dysfunction during early sepsis. Key role of increased gene expression and release of proinflammatory cytokines tumor necrosis factor and interleukin- 6. Arch Surg 132: ; discussion Wood, L.G., Gibson, P.G., Garg, M.L. (2003) Biomarkers of lipid peroxidation, airway inflammation and asthma. Eur Respir J 21: Yang, C.M., Yo, Y.L., Hsieh, J.T., Ong, R. (1994) 5-Hydroxytryptamine receptor-mediated phosphoinositide hydrolysis in canine cultured tracheal smooth muscle cells. British Journal of Pharmacology 111: Yang, G.B., Qiu, C.L., Zhao, H., Liu, Q., Shao, Y. (2006) Expression of mrna for multiple serotonin (5-HT) receptor types/subtypes by the peripheral blood mononuclear cells of rhesus macaques. Journal of Neuroimmunology 178: Yang, Q.H., Liu, D.W., Long, Y., Liu, H.Z., Chai, W.Z., Wang, X.T. (2009) Acute renal failure during sepsis: potential role of cell cycle regulation. The Journal of Infection 58: Yorganci, K. (2005) Sepsis Patofizyolojisi. Yoğun Bakım Dergisi 5: * * * * * 38

41 ÖZGEÇMİŞ 1. KİMLİĞİ: Adı, soyadı: Elif ÇADIRCI Doğum yeri ve tarihi: İş adresi: Atatürk Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji AD, Erzurum. Telefon: Fax: e-posta: 2. EĞİTİM ÖYKÜSÜ: Ortaokul: Erzurum Anadolu Lisesi, 199 Lise: Erzurum İbrahim Hakkı Fen Lisesi, 2000 Lisans: Eczacılık Fakültesi, Atatürk Üniversitesi, Haziran, 2004 Doktora: Tıp Fakültesi-Farmakoloji Anabilim Dalı, Atatürk Üniversitesi, Nisan, MESLEKİ DENEYİMLERİ: Ar. Gör.: Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji A.D. ( ) Dr. Ar. Gör.: Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji A.D. ( ) Yrd. Doç. Dr.: Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji A.D. (2010-) Doktora Sonrası Araştırmacı: Oxford Üniversitesi Farmakoloji Departmanı, Oxford, İngiltere (16 Mayıs-15 Eylül 2011). İdari görevler: Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı Başkanı: Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Staj Komisyonu Başkanı: Atatürk Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurul Üyesi: Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Staj Komisyonu Üyesi: DOKTORA TEZİ: Bazı non-steroidal antiinflamatuvar ilaçların analjezik etki mekanizmasında β-2 adrenerjik reseptörlerin indirekt rolü. Danışman: Prof. Dr. Halis SÜLEYMAN 5. PROJELER: Bilimsel Araştırma Projeleri 1. ATAUNİ-BAP-2011/291: Amiodaronun ratlarda oluşturulan deneysel sepsis modelinde koruyucu etkilerinin incelenmesi. (Yürütücü) 2011-Devam Ediyor. 2. ATAUNİ-BAP-2011/52: Ratlarda CLP ile oluşturulan sepsis modelinde beta reseptörlerin etkisinin incelenmesi. (Yürütücü) 2011-Devam Ediyor. 3. ATAUNİ-BAP-2011/17: L-Tipi kalsiyum kanal blokörlerinin sıçanlarda inflamasyon ile oluşturulan osteoporoz modelinde kemik mineralizasyonu üzerine olan etkilerinin araştırılması. (Araştırmacı) 2011-Devam Ediyor. 4. ATAUNİ-BAP-2011/14: Sıçanlarda deneysel miyokard infarktüsünde lasidipin, ramipril ve valsartan ın akut ve kronik koruyucu etkilerinin incelenmesi (Araştırmacı) 2011-Devam Ediyor. 5. ATAUNİ-BAP-2010/179: Klinik ve deneysel araştırmalar laboratuvarı ve Atatürk Üniversitesi Sağlık Bilimleri Klinik ve Deneysel Araştırma Merkez Müdürlüğünün kurumsal projesi (Güdümlü Araştırma Projesi). (Araştırmacı) 2010-Devam Ediyor. 6. ATAUNİ-BAP-2009/320: Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Laboratuarı kurulumu projesi (Alt Yapı Projesi). (Yürütücü) ATAUNİ-BAP-2009/140: Tiyaneptinin antiülser mekanizmasında adrenerjik reseptörlerin rolünün araştırtması. (Araştırmacı) ATAUNİ-BAP-2008/199: N-asetil sistein in gastroprotektif etki sürecinde meydana gelen bazı biyokimyasal değişikliklerin araştırılması. (Araştırmacı) ATAUNİ-BAP-2008/126: Talamus bölgesinde antikanser ilaçların oluşturduğu hipersensitivitede nörotransmitterlerdeki değişimin in vivo voltamerti ile gösterilmesi ve antikanser ilaçların oluşturduğu ağrı yan etkisinin ortadan kaldırılması. (Araştırmacı) Devam Ediyor. 10. ATAUNİ-BAP-2007/92: Yeni doğan sıçan beyin hücre kültürlerinde glutamat ve 39

42 histaminle indüklenen nörotoksisite de ve ayrıca hipoksinin oluşturduğu nörotoksisite de kalsiyum kanal blokerlerinin nöroprotektif ve antioksidant etkisinin araştırılması. (Araştırmacı) Tübitak Projesi Deneyimi TÜBİTAK-2007/30: Antikanser ilaçların indüklediği ağrı duyarlılık artışının glutamat düzeyiyle ilişkisi. (Araştırmacı) BURSLAR: Yurt İçi Doktora Burs Programı TÜBİTAK 7. ÜYELİKLER: Türk Farmakoloji Derneği 8. ÖDÜLLER: 1. Atatürk Üniversitesi Rektörlüğü Sağlık Bilimleri Alanı Etkin Makale Dalı nda Bilimsel Teşvik Ödülü (2011). 2. Roche Tıp Bilimleri, Osteoporoz alanında ikincilik Ödülü Halici Z, Borekci B, Ozdemir Y, Cadirci E and Suleyman H, Protective effects of amlodipine and lacidipine on ovariectomy-induced bone loss in rats. European Journal of Pharmacology 579: (2008). çalışması ile (2008). 3. Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi ikincisi (2004). 4. Özel Öğrenci Teşvik Ödülü, Eczacılık Ödülleri 2004, Artı Organizasyon + Güncel Eczacılık Dergisi + Marmara Üniversitesi Eczacılık Mezunları Derneği (2004). 9. YABANCI DİL: İngilizce (ÜDS 95) YAYIN LİSTESİ Science Citation Index-Expanded Kapsamındaki Dergilerde Yer Alan Araştırma Makaleleri 1. Cadirci E, Suleyman H, Gurbuz P, Kuruuzum-Uz A, Guvenalp Z: Antiinflammatory effects of different extracts from three salvia species. Turkish Journal of Biology 2012;36: Odabasoglu F, Yildirim OS, Aygun H, Halici Z, Halici M, Erdogan F, Cadirci E, Cakir A, Okumus Z, Aksakal B, Aslan A, Unal D, Bayir Y: Diffractaic acid, a novel proapoptotic agent, induces with olive oil both apoptosis and antioxidative systems in ti-implanted rabbits. Eur J Pharmacol 2012;674: Cadirci E, Halici Z, Odabasoglu F, Albayrak A, Karakus E, Unal D, Atalay F, Ferah I, Unal B: Sildenafil treatment attenuates lung and kidney injury due to overproduction of oxidant activity in a rat model of sepsis: A biochemical and histopathological study. Clin Exp Immunol 2011;166: Coskun AK, Yigiter M, Oral A, Odabasoglu F, Halici Z, Mentes O, Cadirci E, Atalay F, Suleyman H: The effects of montelukast on antioxidant enzymes and proinflammatory cytokines on the heart, liver, lungs, and kidneys in a rat model of cecal ligation and punctureinduced sepsis. ScientificWorldJournal 2011;11: Odabasoglu F, Halici Z, Aygun H, Halici M, Atalay F, Cakir A, Cadirci E, Bayir Y, Suleyman H: Alpha-lipoic acid has antiinflammatory and anti-oxidative properties: An experimental study in rats with carrageenan-induced acute and cotton pellet-induced chronic inflammations. Br J Nutr 2011;105: Özbakış-Dengiz G, Çadırcı E, Yurdakan G: Histopathologic evaluation of antiulcerogenic effect of montelukast in indomethacin-induced experimental ulcer model. Turkish Journal of Gastroenterology Salman S, Kumbasar S, Kumtepe Y, Karaca M, Borekci B, Yildirim K, Alp HH, Cadirci E, Suleyman H: Role of adrenal gland hormones in the anti-inflammatory effect mechanism of tamoxifen, a partial antagonist for oestrogen receptors, and relation with cox levels. Gynecol Endocrinol 2011;27: Albayrak A, Polat B, Cadirci E, Hacimuftuoglu A, Halici Z, Gulapoglu M, Albayrak F, Suleyman H: Gastric antiulcerative and anti-inflammatory activity of metyrosine in rats. Pharmacol Rep 2010;62: Cadirci E, Altunkaynak BZ, Halici Z, Odabasoglu F, Uyanik MH, Gundogdu C, Suleyman H, Halici M, Albayrak M, Unal 40

43 B: Alpha-lipoic acid as a potential target for the treatment of lung injury caused by cecal ligation and puncture-induced sepsis model in rats. Shock 2010;33: Cadirci E, Oral A, Odabasoglu F, Kilic C, Coskun K, Halici Z, Suleyman H, Nuri Keles O, Unal B: Atorvastatin reduces tissue damage in rat ovaries subjected to torsion and detorsion: Biochemical and histopathologic evaluation. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2010;381: Cadirci E, Suleyman H, Hacimuftuoglu A, Halici Z, Akcay F: Indirect role of beta2- adrenergic receptors in the mechanism of analgesic action of nonsteroidal antiinflammatory drugs. Crit Care Med 2010;38: Kara C, Suleyman H, Tezel A, Orbak R, Cadirci E, Polat B, Kara I: Evaluation of pain levels after nd: Yag laser and scalpel incisions: An experimental study in rats. Photomed Laser Surg 2010;28: Koc F, Cadirci E, Albayrak A, Halici Z, Hacimuftuoglu A, Suleyman H: Antiinflammatory activity of 2,5- dihydroxycyclohepta-2,4,6-trienone in rats. Medicinal Chemistry Research 2010;19: Suleyman H, Albayrak A, Bilici M, Cadirci E, Halici Z: Different mechanisms in formation and prevention of indomethacin-induced gastric ulcers. Inflammation 2010;33: Suleyman H, Cadirci E, Albayrak A, Halici Z, Gundogdu C, Hacimuftuoglu A: Occurrence of anticancer activity of prednisolone via adrenalectomy and inhibition of adrenaline in rats. Int J Cancer 2010;126: Uyanik A, Unal D, Uyanik MH, Halici Z, Odabasoglu F, Altunkaynak ZB, Cadirci E, Keles M, Gundogdu C, Suleyman H, Bayir Y, Albayrak M, Unal B: The effects of polymicrobial sepsis with diabetes mellitus on kidney tissues in ovariectomized rats. Ren Fail 2010;32: Halici Z, Dursun H, Keles ON, Odaci E, Suleyman H, Aydin N, Cadirci E, Kalkan Y, Unal B: Effect of chronic treatment of haloperidol on the rat liver: A stereological and histopathological study. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2009;379: Karaca M, Odabasoglu F, Kumtepe Y, Albayrak A, Cadirci E, Keles ON: Protective effects of erythropoietin on ischemia/reperfusion injury of rat ovary. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2009;144: Suleyman H, Cadirci E, Albayrak A, Halici Z, Polat B, Hacimuftuoglu A, Alp HH: Reason for the aggravation of diseases caused by inflammation and the ineffectiveness of NSAIDs on these diseases in rainy weather. Pharmacol Rep 2009;61: Suleyman H, Cadirci E, Albayrak A, Polat B, Halici Z, Koc F, Hacimuftuoglu A, Bayir Y: Comparative study on the gastroprotective potential of some antidepressants in indomethacin-induced ulcer in rats. Chem Biol Interact 2009;180: Suleyman H, Dursun H, Bilici M, Cadirci E, Halici Z, Gulaboglu M, Albayrak F: Relation of adrenergic receptors, which have roles in gastroprotective and antiinflammatory effect of adrenal gland hormones, with cyclooxygenase enzyme levels in rats. J Physiol Pharmacol 2009;60: Borekci B, Kumtepe Y, Karaca M, Halici Z, Cadirci E, Albayrak F, Polat B, Suleyman H: Role of alpha-2 adrenergic receptors in anti-ulcer effect mechanism of estrogen and luteinising hormone on rats. Gynecol Endocrinol 2009;25: Borekci B, Cadirci E, Albayrak A, Suleyman H, Halici Z, Kadanali S: Effects of progesterone on fsh-stimulated indomethacin ulcers in rats. Fertil Steril 2008;90: Halici Z, Borekci B, Ozdemir Y, Cadirci E, Suleyman H: Protective effects of amlodipine and lacidipine on ovariectomy-induced bone loss in rats. Eur J Pharmacol 2008;579: Halici Z, Karaca M, Keles ON, Borekci B, Odabasoglu F, Suleyman H, Cadirci E, Bayir Y, Unal B: Protective effects of amlodipine on ischemia-reperfusion injury of rat ovary: Biochemical and histopathologic evaluation. Fertil Steril 2008;90:

44 26. Halici Z, Keles ON, Unal D, Albayrak M, Suleyman H, Cadirci E, Unal B, Kaplan S: Chronically administered risperidone did not change the number of hepatocytes in rats: A stereological and histopathological study. Basic Clin Pharmacol Toxicol 2008;102: Halici Z, Suleyman H, Cadirci E: Effects of calcium channel blockers on hyaluronidase-induced capillary vascular permeability. Arch Pharm Res 2008;31: Odabasoglu F, Halici Z, Cakir A, Halici M, Aygun H, Suleyman H, Cadirci E, Atalay F: Beneficial effects of vegetable oils (corn, olive and sunflower oils) and alphatocopherol on anti-inflammatory and gastrointestinal profiles of indomethacin in rats. Eur J Pharmacol 2008;591: Suleyman H, Cadirci E, Albayrak A, Halici Z: Nimesulide is a selective cox-2 inhibitory, atypical non-steroidal antiinflammatory drug. Curr Med Chem 2008;15: Suleyman H, Halici Z, Cadirci E, Hacimuftuoglu A, Bilen H: Indirect role of beta2-adrenergic receptors in the mechanism of anti-inflammatory action of nsaids. J Physiol Pharmacol 2008;59: Cadirci E, Suleyman H, Aksoy H, Halici Z, Ozgen U, Koc A, Ozturk N: Effects of onosma armeniacum root extract on ethanol-induced oxidative stress in stomach tissue of rats. Chem Biol Interact 2007;170: Dengiz GO, Odabasoglu F, Halici Z, Cadirci E, Suleyman H: Gastroprotective and antioxidant effects of montelukast on indomethacin-induced gastric ulcer in rats. J Pharmacol Sci 2007;105: Dengiz GO, Odabasoglu F, Halici Z, Suleyman H, Cadirci E, Bayir Y: Gastroprotective and antioxidant effects of amiodarone on indomethacin-induced gastric ulcers in rats. Arch Pharm Res 2007;30: Halici Z, Dengiz GO, Odabasoglu F, Suleyman H, Cadirci E, Halici M: Amiodarone has anti-inflammatory and anti-oxidative properties: An experimental study in rats with carrageenan-induced paw edema. Eur J Pharmacol 2007;566: Ozbakis-Dengiz G, Halici Z, Akpinar E, Cadirci E, Bilici D, Gursan N: Role of polymorphonuclear leukocyte infiltration in the mechanism of anti-inflammatory effect of amiodarone. Pharmacol Rep 2007;59: Suleyman H, Halici Z, Cadirci E, Hacimuftuoglu A, Keles S, Gocer F: Indirect role of alpha2-adrenoreceptors in anti-ulcer effect mechanism of nimesulide in rats. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2007;375: Suleyman H, Salamci E, Cadirci E, Halici Z: Beneficial interaction of nimesulide with nsaids. Medicinal Chemistry Research 2007;16: Science Citation Index-Expanded Kapsamındaki Dergilerde Yer Alan ve Uluslararası Toplantılarda Sunulan Poster Özetleri 1. H. Suleyman, A. Hacimuftuoglu, E. Cadirci, A. A. Albayrak, B. Polat, H.H. Alp, Z. Halici. Relation of proepileptic activity of indomethacin with adrenal gland hormones. 22nd Congress of the European College of Neuropsychopharmacology, European Neuropsychopharmacology, pp., Istanbul, Turkey, September A. Hacimuftuoglu; F. Saruhan; H. Suleyman, Z. Halici, E. Cadirci, D. Cetin, B. Polat. Paclitaxel induced pain and its character 22nd Congress of the European-College-of- Neuropsychopharmacology, European Neuropsychopharmacology, 281 pp., Istanbul, TURKEY, September D. Unal, B.Z. Altunkaynak, Z. Halici, O.N. Keles, E. Cadirci, M.E. Altunkaynak, B. Unal. Volumetric Evaluation of Brain In Diabetic and Overectomized Rats. Third International Congress of Molecular Medicine, IUBMB LIFE, 330 pp., Istanbul, Turkey, May F. Odabasoglu, H. Aygun, Z. Halici, Y. Bayir, A. Cakir, E. Cadirci, F. Atalay. Effect of alpha-lipoic acid on myeloperoxidase activity and lipid peroxidation level in carrageenan-injected rats. 32nd Congress of the Federation-of- 42

45 European-Biochemical-Societies (FEBS) FEBS JOURNAL, 269 pp., Vienna, Austria, JUL F. Odabasoglu, Z. Halici, H. Aygun, M. Halici, A. Cakir, H. Suleyman, E. Cadirci, Anti-inflammatory effect of the alphalipoic acid on carrageenan-induced paw edema in rats and its relation with some antioxidant enzymes. 6th AFMC International Medicinal Chemistry Symposium, Drugs of the Future, pp., İstanbul, TURKEY, JUL F. Odabasoglu, H. Aygun, O.S. Yildirim, Z. Halici, A. Aslan, A. Cakir, M. Halici, E. Cadirci. Effect of usnic acid on tissue caspase activity and glutathione level in titanium-implanted subjects. 32nd Congress of the Federation-of-European- Biochemical-Societies (FEBS), FEBS Journal, 152 pp., Vienna, AUSTRIA, JUL M. Gulaboglu, Z. Halici, N. Aydin, E. Cadirci, M. Gul, H. Suleyman, E. Oral. The effects of risperidone, olanzapine and haloperidol on enzyme activities in kidney tissue of rats. 19th Congress of the European College o Neuropsychopharmacology, European Neuropsychopharmacology, pp., Paris, FRANCE, Sep 2006 Uluslararası Bilimsel Toplantılarda Sunulan ve Bildiri Kitabında (Proceedings) Basılan Bildiriler 1. E. Çadırcı, Z. Halıcı, F. Akçay. Erythropoietin as a prohibited doping agent Winter Universiade Conferance 2011, 136 pp., Erzurum, Turkey, Ocak E. Çadırcı, Z. Halıcı, F. Akçay. The use of growth hormone as performanceenhancing drug Winter Universiade Conferance 2011, 136 pp., Erzurum, Turkey, Ocak, E. Çadırcı, H. Süleyman, P. Gurbuz, A. Kuruuzum-Uz, Z. Guvenalp, L.O. Demirezer. Antiinflammatory activity of Salvia Species. 9th International Symposium on Pharmaceutical Sciences, 297 pp., Ankara, Türkiye, June, A. Atila, Y. Kadıoğlu, E. Çadırcı, H. Süleyman. Determination of prilocaine in rat plasma with GC-FID method. 9th International Symposium on Pharmaceutical Sciences, 131 pp., Ankara, Türkiye, June F. Odabasoglu, Z. Halici, A. Cakir, M. Halici, E. Cadirci, H. Suleyman. Gastroprotective effect of vegetable oils and alpha-tocopherol on indomethacineinduced gastric ulcer in rats and its relation with myeloperoxidase and glutathione s-transferase activities. 3rd International meeting on medicinal and pharmaceutical chemistry, 106 pp., Antalya, Turkey, October, F. Odabasoglu, Z. Halici, G. Ozbakis- Dengiz, E. Cadirci. Gastroprotective effect of montelukast (singulaire) on indomethacine-induced gastric ulcerin rats and its relation with myeloperoxidase and some antioxidant enzymes. 3rd International meeting on medicinal and pharmaceutical chemistry, 108 pp., Antalya, Turkey, October, F. Odabasoglu, Z. Halici, H. Aygun, M. Halici, Y. Bayir, A. Cakir, E. Cadirci, F. Atalay. Anti-inflammatory effects of the alpha-lipoic acid on carrageenan-induced acute and cotton pellet-induced chronic inflammation models in rats and its relation with nitric oxide synthase activity. International Symposium on Drug Research and Development, pp., Antalya, Turkiye, Mayıs, G.O. Dengiz, Z. Halici, F. Odabasoglu, E. Cadirci, H. Suleyman. Gastroprotective effect of montelukast (singulaire) on indomethacine-induced gastric ulcer in rats and its relation with some glutathione metabolism parameters. International Symposium on Drug Research and Development, 74 pp., Antalya, Türkiye, Mayıs, G.O. Dengiz, F. Odabasoglu, Z. Halici, E. Cadirci, M. Halici, H. Suleyman. Gastroprotective effect of amiodarone on indomethacin-induced gastric ulcer in rats and its relation with some antioxidant enzymes. International Symposium on Drug Research and Development, pp., Antalya, Türkiye, Mayıs Z. Halici, M. Karaca, O.N. Keles, B. Borekci, F. Odabasoglu, H. Suleyman, E. Cadirci, Y. Bayir, B. Unal. Protective effects of amlodipine on ischemiareperfusion injury of rat ovary: Biochemical and Histopathologic 43

46 evaluation. VII. Türk-Alman Jinekoloji Derneği Kongresi, Arch Gynecol Obstet,, 73 pp., Antalya, Türkiye, Mayıs Z. Halici, B. Borekci, Y. Ozdemir, E. Cadirci, H. Suleyman. Protective effects of amlodipine and lacidipine on oophorectomy-induced bone loss in rats. VII. Türk-Alman Jinekoloji Derneği Kongresi, Arch Gynecol Obstet, 163 pp., Antalya, Türkiye, Mayıs Z. Halici, F. Odabasoglu, D.G. Ozbakis, E. Cadirci, Y. Bayir, H. Suleyman. Gastroprotective effect of amiodarone on indomethacine-induced gastric ulcer in rats and its relation with some glutathione metabolism parameters. The 5th International Postgraduate Research Symposium on Pharmaceutics IPORSIP- 2007, Acta Pharmaceutica Turcica, 27 pp., İstanbul, Türkiye, September F. Odabasoglu, D.G. Ozbakis, Z. Halici, M. Halici, E. Cadirci, H. Suleyman. Antiinflammatory effect of amiodarone on carrageenan-induced paw edema in rats and its relation with some glutathione metabolism parameters. 5th International Symposium on Pharmaceutical Chemistry ISPC-2007, Turkish Journal of Pharmaceutical Sciences, 87 pp., İstanbul, Türkiye, September M. Halici, O.I. Kufrevioglu, F. Odabasoglu, Z. Halici, A. Cakir, A. Aslan, M. Koc, E. Cadirci, F. Atalay. Gastroprotective and anti-oxidative properties of the some extracts from Ramalina capitata. 5th International Symposium on Pharmaceutical Chemistry ISPC-2007, Turkish Journal of Pharmaceutical Sciences, 78 pp., İstanbul, Türkiye, September K.O. Yerdelen, E. Cadirci, E. Bayramoglu, H.I. Gul, Toxicity of Some Azines of Acetophenone Derived mono- Mannich Bases by Brine Shrimp Bioassay. 1st International Meeting on Medicinal and Pharmaceutical Chemistry IMMPC-1, 122 pp., Ankara, Turkey, September 2002 Ulusal Hakemli Dergilerde Yayımlanan Makaleler 1. M. Işık, E. Çadırcı. Solunum Yolu Enfeksiyonlarında Tamamlayıcı ve Alternatif Tedaviler, Turkiye Klinikleri J Fam Med-Special Topics, pp., E. Çadırcı, Z. Halıcı, B. Polat, I. Ferah. Olmesartan ve Pioglitazonun Sıçanlarda Karrageninle İndüklenen İnflamatuvar Pençe Ödemine Etkileri. Journal of Clinical and Analytical Medicine, 2011, DOI: /JCAM.574 (Online makale). 3. M. Çetin, H. Süleyman, E. Çadırcı, E. T. Demir, A. Hacımüftüoglu, B. Polat. Preparation and In Vivo Evaluation Of Eudragit L100/Eudragit Nm 30d Enteric Granules Containing Diclofanac Sodium: Anti-Inflammatory And Ulcerogenic. Turkish Journal of Pharmaceutical Sciences, pp., Y. Bayir, E. Cadirci, H. Suleyman, Z. Halici, M.S. Keles. Effects of Lacidipine, Ramipril and Valsartan on Serum BNP levels in Acute and Chronic Periods Following Isoproterenol-Induced Myocardial Infarction in Rats. The Euroasian Journal of Medicine, pp., E. Çadırcı, Z. Halıcı. Kalsiyum Kanal Blokörleri ve Selektif L-Tiplerinin Gelecekteki Yeni Endikasyonları. Medical Network, Kardiyoloji Dergisi, pp., Z. Halıcı, Y. Bayır, H. Süleyman, E. Çadırcı, M.S. Keleş, E. Bayram,. Amiodaron un Sıçanlarda İsoproterenol ile Oluşturulan Akut ve Kronik Miyokard İnfarktüsü Modelinde Eritropoetin Seviyeleri Üzerine Etkilerinin İncelenmesi. Atatürk Üniversitesi Tıp Dergisi, pp., 2006 Ulusal Bilimsel Toplantılarda Sunulan ve Bildiri Kitaplarında Basılan Bildiriler 1. G. Özbakış-Dengiz, E. Çadırcı, G. Yurdakan. Montelukastın antiülserojenik etkisinin indometazin ile oluşturulan deneysel ülser modelinde histopatolojik olarak değerlendirilmesi. Türk Farmakoloji Derneği 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 129 pp., Eskişehir, Türkiye, Ekim E. Çadırcı, Z. Halıcı, F. Odabaşoğlu, A. Albayrak, E. Karakuş, D. Ünal, F. Atalay, I. Ferak, B. Ünal. Sıçanlarda oluşturulan sepsis modelinde oksidatif stresin neden 44

47 olduğu akciğer ve böbrek hasarının sildenafil tedavisi ile azaltılması: Biyokimyasal ve Histopatolojik bir çalışma. Türk Farmakoloji Derneği 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 299 pp., Eskişehir, Türkiye, Ekim H. Suleyman, E. Çadırcı, A. Albayrak, Z. Halıcı, C. Gündogdu, A. Hacımüftüoğlu. Sıçanlarda prednizolonun antikanser aktivitesinin adrenalektomi ve adrenalin inhibisyonu ile oluşması. Türk Farmakoloji Derneği 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 167 pp., Manavgat, Türkiye, Kasım, A. Albayrak, B. Polat, E. Çadırcı, A. Hacımüftüoğlu, Z. Halıcı, M. Gülaboğlu, F. Albayrak, H. Süleyman. Metirozinin ratlardaki antiülser ve antiinflamatuvar aktivitesi. Türk Farmakoloji Derneği 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 189 pp., Manavgat, Türkiye, Kasım, E. Çadırcı, H. Süleyman, A. Hacımüftüoğlu, Z. Halıcı. Bazı-non steroidal antiinflamatuvar ilaçların analjezik etki mekanizmasında β-2 adrenerjik reseptörlerin indirekt rolü.türk Farmakoloji Derneği 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 190 pp., Manavgat, Türkiye, Kasım, A. Hacımüftüoğlu, F. Saruhan, H. Süleyman, Z. Halıcı, E. Çadırcı, D. Çetin. Deksmedetomidin, klonidin ve meperidinin sıçanlarda paktitakselle oluşturulan ağrı eşiği değişikliğine etkileri. Türk Farmakoloji Derneği 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 314 pp., Manavgat, Türkiye, Kasım H. Süleyman, E. Çadırcı, A. Albayrak, Z. Halıcı, B. Polat, A. Hacımüftüoğlu, H.H. Alp. Yağmurlu havalarda inflamasyonlu hastalıkların şiddetlenmesi ve NSAİİ lerin antiinflamatuvar aktivitesinin azalmasının nedeni. Türk Fizyolojik Bilimler Derneği, 34 Ulusal Fizyoloji Kongresi, 145 pp., Erzurum, Türkiye, Ekim B. Börekçi, Y. Kumtepe, M. Karaca, Z. Halıcı, E. Çadırcı, F. Albayrak, B. Polat, H. Süleyman. Sıçanlarda östrojen ve LH nın antiülser etki mekanizmasında α-2 adrenerjik reseptörlerin rolü.türk Fizyolojik Bilimler Derneği, 34 Ulusal Fizyoloji Kongresi, 162 pp., Erzurum, Türkiye, Ekim F. Koç, E. Çadırcı, A. Albayrak, Z. Halıcı, A. Hacımüftüoğlu, H. Süleyman. 2,5- Dihydroxycyclohepta-2,4,6-trienone un sıçanlarda anti-inflammatuar aktivitesi. Türk Fizyolojik Bilimler Derneği, 34 Ulusal Fizyoloji Kongresi, 125 pp., Erzurum, Türkiye, Ekim L.Ö. Demirezer, A. Kuruüzüm-Uz, H. Süleyman, E. Çadırcı, Z. Güvenalp. Anchusa Azurea Miller Var Azurea nın Antiülser Etkisi Üzerine Çalışmalar. 18. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı, 58 pp., İstanbul, Türkiye, Ekim A. Kuruüzüm-Uz, L.Ö. Demirezer, H. Süleyman, E. Çadırcı, Z. Güvenalp. Rozmarinik Asitin Antienflamatuvar Aktivitesi. 18. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı, 57 pp., İstanbul, Türkiye, Ekim F. Odabaşoğlu, Z. Halıcı, H. Aygün, M. Halıcı, A. Çakır, E. Çadırcı, F. Atalay, S. Mutlu. Rat pençelerinde karragenin enjeksiyonu ile oluşturulan akut enflamasyon üzerine Alfa-lipoik asidin etkisi: Anti-enflamatuvar etkinin glutatyon düzeyi, glutatyon peroksidaz ve redüktaz enzim aktiviteleri ile ilişkisi. 19. Ulusal Biyoloji Kongresi, 508 pp., Trabzon, Türkiye, Haziran Z. Halıcı, O.N. Keleş, D. Ünal, M. Albayrak, H. Süleyman, E. Çadırcı, B. Ünal, S. Kaplan. Kronik Olarak Verilen Risperidone Hepatosit Sayısını Değiştirmiyor: Stereolojik ve Histopatolojik Çalışma XVIII. Ulusal Elektron mikroskobisi Kongresi, 264 pp., Eskişehir, Türkiye, Ağustos H. Süleyman, Z. Halıcı, E. Çadırcı, A. Hacımüftüoğlu, H. Bilen. NSAİ ilaçların antiinflamatuvar etki mekanizmasında β2 adrenerjik reseptörlerinin indirekt rolü. Türk Farmakoloji Derneği 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 427 pp., Trabzon, Türkiye, Ekim G. Özbakış Dengiz, E. Çadırcı. Montelukastın ratlarda karragenin ile oluşturulan inflamasyona etkileri. Türk Farmakoloji Derneği 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 426 pp., Trabzon, Türkiye, Ekim D.G. Özbakış, E. Akpınar, Z. Halıcı, D. Bilici, E. Çadırcı. Amiodaronun antiinflamatuvar ve analjezik etkileri. Türk Farmakoloji Derneği 18. Ulusal 45

48 Farmakoloji, 312 pp., İzmir, Türkiye, Ekim G. Özbakış, Z. Halıcı, E. Çadırcı. İndometazinle oluşturulan ülser modelinde amiodaronun etkisi. Türk Farmakoloji Derneği 18. Ulusal Farmakoloji Kongresi konferansı, 269 pp., İzmir, Türkiye, Ekim Ulusal Kongre ve Kurslarda Konuşma 1. Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı ve Stereoloji Derneği Uluslararası katılımlı Stereolojik Kesit Alma Kursu konuşmacı olarak katılım, Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi, 28 Ekim (2006). 2. Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı ve Stereoloji Derneği Uluslararası katılımlı Elektron Mikroskobu Teknikleri Kursu konuşmacı olarak katılım, Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi, 29 Ekim (2006). 3. Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı ve Stereoloji Derneği Uluslararası katılımlı Klinik ve Patolojik Uygulamalarda Stereoloji Kursu Konuşmacı olarak katılım, Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi, 4-5 Kasım (2006). DİĞER BİLİMSEL AKTİVİTELER Bilimsel Kongre, Kurs ve Seminerler 1. Laboratory Animal Management & Welfare Course Modules 1 4, Oxford University BMS (Veterinary Services), Oxford/UK, 19 May-03 June Türk Farmakoloji Derneği 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi. Eskişehir, Ekim Türk Farmakoloji Derneği, 20. Farmakoloji Eğitiminde Kuşaklararası Bilimsel Etkileşme Seminerleri Prof Dr. Gültekin Sunam Toplantısı Sarıkamış / Kars Mart Türkiye Geneli Hasta Bilgilendirme Yarışması, Ankara, Mart Winter Universiade Conferance, Atatürk University, Erzurum,Turkey, Ocak Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Yöntemleri ve Biyoistatistik Kursu, Erzurum, 04 Aralık Ocak Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Çekirdek Eğitici Eğitimi Kursu, Erzurum, Haziran Sağlık Bakanlığı Klinik Araştırmacı Eğitimi Programı, Erzurum, 15 Mayıs Türk Farmakoloji Derneği, 19. Farmakoloji Eğitiminde Kuşaklararası Bilimsel Etkileşme Seminerleri Prof Dr. Oğuz Güç Toplantısı Uludağ/Bursa Mart Türk Farmakoloji Derneği 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi. Antalya, 4-7 Kasım Atatürk Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı, Voltametri Kursu, Ekim T.C. Sağlık Bakanlığı İlaç ve Eczacılık Genel Müdürlüğü Klinik Araştırmalarda Etik Yaklaşım Kursu Erzurum Mayıs Türk Farmakoloji Derneği, 15. Farmakoloji Eğitim Sempozyumu, Farmakoloji de kullanılan in vivo kayıt sistemleri Atatürk Üniversitesi 30 Haziran Türk Farmakoloji Derneği, 17. Farmakoloji Eğitiminde Kuşaklararası Bilimsel Etkileşme Seminerleri Prof Dr. Firuz Baysal Toplantısı Kartalkaya/Bolu Mart Türk Farmakoloji Derneği 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi. Trabzon Ekim Türk Farmakoloji Derneği, 16. Farmakoloji Eğitiminde Kuşaklararası Bilimsel Etkileşme Seminerleri Prof. Dr. Kazım Türker Toplantısı, Aksu/Antalya Mart Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı ve Stereoloji Derneği Uluslararası katılımlı Sinir Bilimde Temel Metodlar ve Stereoloji Kursu, Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi, 30 Ekim-3 Kasım Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı ve Stereoloji Derneği Uluslararası katılımlı Mikroskobik Kesit 46

49 Alma kursu. Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi, 27 Ekim XVI. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı. Atatürk Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Erzurum, Haziran Türk Farmakoloji Derneği, 13. Farmakoloji Eğitim Sempozyumu, Genetik Araştırmalarda kullanılan Yöntemlerin Farmakoloji de uygulamaları Van 100. Yıl Üniversitesi 2 Haziran Türk Farmakoloji Derneği 18. Ulusal Farmakoloji Kongresi. İzmir 28 Eylül-1 Ekim st International Meeting on Medicinal and Pharmaceutical Chemistry IMMPC-1, Ankara, Turkey, September 25-28, * * * * * NOTLAR 47

50 Memeli Kardiyomiyositlerinde Na + /H + Değiş-Tokuşcusunun Akut ve Uzun Süreli Hipoksiye Olan Duyarlılığı: ATP ve MikroRNA ların Rolünün İncelenmesi Hilmi Burak KANDİLCİ Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyofizik Anabilim Dalı, Ankara GİRİŞ VE AMAÇ Hücre fonksiyonları metabolizma sonucu ortaya çıkan enerji ile sürdürülmektedir. Metabolizma hücre içinde asit oluşumunu (H + iyonlarının oluşması) artırır. H + iyonları çok reaktif olduklarından hücreden hemen uzaklaştırılmaları gerekmektedir. Memeli kardiyomiyositlerinde asitin hücreden atılımdan sorumlu ana membran proteini Na + /H + değiş-tokuşcusudur (NHE-1 izoformu). NHE fizyolojik koşullarda hücre dışı Na + un hücre içi H + ile elektronötral değiş-tokuşunu gerçekleştirmektedir. NHE aracılı değiş-tokuş amilorid ve türevleri tarafından tamamen inhibe edilebilmektedir (Grinstein ve diğ., 1989; Wakabayashi ve diğ., 1992). NHE aktivitesinin hızı büyük ölçüde proteinin sitozolik kısmındaki allosterik modifiye edici bölgenin protonlanması ile belirlenir. Bu bölgenin protonlanması hücreyi asit yüklenmesinden korumak için NHE aktivitesini hızlandırır. Fizyolojik hücre içi ph (ph i ) da NHE nin allosterik bölgesinden protonun uzaklaşması ise sitozolün alkaliye kaymasını önlemek için değiş-tokuşcuyu inaktive etmektedir (Aronson ve diğ., 1982; Grinstein ve diğ., 1984; Aronson 1985). İskemi veya iskeminin ana komponenti anoksi sırasında oluşan asidin dokudan uzaklaştırılması miyokardial ph regülasyonunun önemli bir parçasıdır (Steenbergen ve diğ, 1977; Garlick ve diğ 1979). İskemi ve özellikle reperfüzyon sırasında NHE aktivitesi sonucu artan hücre içi Na + Na + /Ca +2 değiş-tokuşcusu aracılığıyla dışarı atılırken hücrenin Ca +2 yüklendiği öne sürülmüştür (Lazdunski ve diğ., 1985). Hücre içi Ca +2 artışı hücrede nekroza kadar giden birçok mekanizmayı tetiklemektedir (Tani ve Neely 1989; Haigney ve diğ., 1992). Ayrıca, hücre içi Na + miktarı ile anoksireoksijenasyon hasarının geriye dönüşünün ters orantılı olduğu gözlenmiştir (Murphy ve Allen 2009). Kardiyomiyositlerde anoksireoksijenasyon sırasında NHE aktivite ve regülasyonunun aydınlatılması iskemik hasarın oluştuğu miyokardial iskemi ve by- pass cerrahisi gibi durumlarda tedavi stratejileri geliştirmek için önemlidir. Kardiyomiyositlerde akut hipoksinin NHE-1 üzerindeki anlık etkileri yanında uzun süreli hipoksik koşulların da (koroner arter hastalığı gibi) NHE-1 in aktivite ve ekspresyonunu değiştirme potansiyeli bulunmaktadır (Anderson ve diğ., 2009). NHE-1 kronik inhibisyonunun maladaptif kardiyak hipertrofi ve sonrasında kalp yetmezliğini önlediği çeşitli hayvan modellerinde gösterilmiştir (Chen ve diğ., 2004). Dolayısı ile, uzun süreli hipoksik koşullarda NHE-1 protein seviyesinin kontrol edilmesi iskemik kalp hastalığı gibi patolojilerde önemli olabilir. Mikro RNA lar (mirna) spesifik hedef genleri düzenleyen, tek zincirli, nükleotid uzunluğunda ve protein kodlamayan RNA lardır. Bu kısa nükleotid dizileri tüm canlılarda yüksek miktarlarda üretilirler ve gen ekspresyonlarını spesifik hedef mrna ları keserek veya translasyonel susturma (hedef mrna ların özel bölgeleri (3 UTR) içindeki baz çiftleşme bölgeleri ile etkileşerek) yolu ile post-transkripsiyonel düzeyde kontrol ederler. mirna lar hedef mrna lara 5 uçtan genelde ilk sekiz nükleotid sekansından (seed sekans) bağlanırlar (Gaidatsiz ve diğ., 2007) ve birçok biyolojik süreçte spesifik basamaklarda gen ekspresyonlarının baskılanmasında önemli rol oynarlar (Bartel, 2004). Kardiyovasküler alanda da mirna birçok fizyolojik ve patofizyolojik süreçte rol oynamaktadır (Barringhaus ve Zamore, 2009). Uzun süreli hipokside NHE-1 ekspresyonunu değiştirebilecek mirna ların aydınlatılması fizyopatolojik mekanizmaların anlaşılmasında yarar sağlayabilir. GEREÇ VE YÖNTEM Sıçan kardiyak miyositlerin izolasyonu: İzole edilen sıçan kalpleri modifiye Langendorff setup ına aorttan ters perfüze edilecek şekilde asıldı. İlk olarak içeriği mm olarak 118 NaCl, 4.7 KCl, 1.25 CaCl 2, 1.2 MgSO 4, 1.2 KH 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 10 48

51 HEPES ve 10 glikoz, ph 7.4 olan ve %100 O 2 ile gazlandırılan, Ca +2 suz perfüzyon çözeltisi ile 5 dakika yıkandıktan sonra, içine kollajenaz (Sigma Boehringer Colleganase A) (1.1 mg/ml) eklenmiş aynı içerikli çözelti ile dakika daha perfüze edilerek hücre izolasyonu yapıldı. Enzimatik olarak parçalanan kalpler daha sonra mekanik olarak küçük parçalara ayrıştırılıp filtre edilerek bir tübe aktarıldı. Tüpün içerisindeki hücreler Ca +2 suz solüsyon ile iki kere yıkanarak kollajenaz ve ölü doku parçalarından arındırıldı. İzole edilen hücrelerin bekletildiği solüsyonun Ca +2 içeriği dereceli olarak arttırılarak bu iyonun konsantrasyonu 1.5 mm yapıldı ve 37 C de bir saat inkübe edildikten sonra deneye alındı. Hücrelerden NHE aracılı H + ölçülmesi: çıkışının 1- BCECF yüklenmesi ve kalibrasyonu: Hücre içi ph (ph i ) görüntülenmesi BCECF boyasının asetometil esteri (AM) ile yapıldı. Bu boya iki ayrı dalga boyunda uyarılabilen H + e duyarlı bir boyadır. HL-1 hücreleri oda sıcaklığında 10 dk 10 µm BCECF ile inkübe edildi. Hücreler epifloresan mikroskoba (Nikon Eclipse TE 2000 ve PTI D104 görüntüleme sistemi) yerleştirildikten sonra 2 ml/dk hızında perfüze edildi. Boya 440 ve 490 nm de uyarıldı ve emisyon sinyali 535 nm de eş zamanlı toplandı. Emisyon sinyalinin ph değerine çevrilebilmesi için HL- 1 hücrelerinde in situ nigerisin (K + /H + iyonoforu, 10 µm) kalibrasyonu yapıldı. Daha sonra dört parametreli lojistik denklem ile (Oran= R min + (R maks -R min )/ (pka-pho) ) kalibrasyon değerlerine eğri fit edildi. Fit eğrisinden emisyon sinyal oranının ph değerine dönüştürülebilmesi için yukarıdaki formülün ters fonksiyonu kullanıldı Hücre içi doğal tamponlamanın (β i ) hesaplanması: Na + /H + aktivitesi ölçülürken - CO 2 /HCO 3 içermeyen HEPES tamponlu Tirod çözeltisi kullanıldı. Deney prensibi farklı konsantrasyonlarda amonyum çözeltilerinin (30 mm- 0 mm arasında) perfüzyonu ile ph i de meydana gelen değişikliğin ölçülmesi esasına dayanmaktadır. Hücre içinde oluşacak H + hücre dışı amonyum konsantrasyonunun bir fonksiyonu olduğu için teorik olarak hesaplanabilmekte ve pratik olarak elde edilen sonuçla arasındaki fark doğal tamponlamayı vermektedir. Deney sırasında NHE değiştokuşu spesifik NHE-1 inhibitörü zoniporid (30 µm) kullanılarak inhibe edildi. HL-1 hücrelerinin tamponlama kapasiteleri β i = Δ [NH + 4 ] i / Δ ph i ve [NH + 4 ] i = [NH + 4 ] o x 10 (phophi) formüllerine göre hesaplandı. Hesaplamada amonyum ayrışmasının pk sı hücre içi ve dışı kompartmanlarda eşit kabül edildi. Hücre dışı ortamdan amonyum uzaklaştırılması sonucunda oluşacak hücre içi asit miktarındaki artış hücre içi amonyum konsantrasyonunda azalma ile aynı kabul edildi. Elde edilen bu veriler hücre içinde tek tip tampon modeli kullanılarak (β i =ln10[ta]x 10 (phi-pka) /(1+10 (phi-pka) ) 2 ) ifade edildi. 3- Hücreden NHE aracılı H + akısının hesaplanması (J NHE ): Amonyum ön-işlemi (20 mm NH 4 - uzaklaştırılması) hücreye asit yüklemekte ve NHE değiş-tokuşcusunu aktive etmektedir. Daha sonra zamana bağlı NHE aracılı ph i nın normale dönüş eğrisi iki bileşenli bir üstsel azalım fonksiyonuna fit edildi. Fit fonksiyonunun nümerik olarak hesaplanan ters fonksiyonundan farklı ph i değerleri için türevler (dph i /dt) elde edildi. Farklı ph lar için (0.05 ph aralıkla) hesaplanan dph i /dt değerleri aynı ph daki tamponlama değerleri ile çarpılarak NHE aracılı akı miktarı (J NHE = dph i /dt X β i ) mm/dak cinsinden verildi. Sıçan izole kardiyomiyositlerinden mitokondri membran potansiyeli, Mg +2, reaktif oksijen türevi (ROS) miktarının ölçülmesi: Anoksi ile değişen mitokondri membran potansiyeli JC-1 (Anaspec) (Ex: 490 nm, Em: 530/590) ve doğrudan olmayan (serbest Mg 2+ miktarı üzerinden) hücre içi ATP miktarı ölçümü için Mag-Fluo-4 (Invitrogen) (Ex: 490 nm, Em: 510 nm) kullanıldı. DCFH-DA (Ex:495 nm, Em:535 nm) ise reaktif oksijen türevi miktarı ölçümü için kullanıldı. Boyalar oda sıcaklığında 20 dk yaklaşık 10 µm konsantrasyonda inkübe edildi. Sıçan izole kardiyomiyositlerinde akut anoksi ve gerçek hipoksik koşulların oluşturulması: Deney koşullarında akut anoksi azot gazı ile sürekli gazlandırılan süperfüzyon ortamına 1 mm sodyum diatonit (Sigma) eklenmesi ile elde edildi. Sodyum diatonit bir O 2 süpürücüsü olup ortamdaki O 2 miktarını sıfıra düşürmektedir. Sodyum diatonit kullanılmadan gerçek hipoksik şartlarda (~1 mmhg PO 2 ) yapılan deneylerde hücreler yer çekimi ile süperfüze

52 edildi. Solüsyonlar gaz geçirgen olmayan metal borular ve yarı-gaz geçirgen bağlantılar ile banyo ortamına iletildi. Banyo ortamı havadan oksijen kontaminasyonunu engellemek amacıyla koni biçimli bir adaptör ile üstten sürekli argon gazı ile süpürüldü. Deney sırasında süperfüzyonun oksijen miktarı banyodan sürekli olarak ölçüldü. Kullanılan solüsyonlar ve maddeler: Hepes tamponlu tirod çözeltisi için (mm): 135 NaCl, 4.5 KCl, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2, 11 glukoz, 20 Hepes (pk a : 7.5) kullanıldı. NH 4 Cl çözeltisi hazırlanırken eşdeğer Na + ile yer değiştirilmiştir. Na + içermeyen Tirod çözeltisi için Na + eşdeğer 145 mm N-metil-Dglukamin (NMDG) ile yer değiştirildi. Alkali kalibrasyon solüsyonlarına miyozin inhibitörü 2,3-Butandion monoksim (BDM) eklendi. Solüsyonların ph sı (NMDG solüsyonu derişik HCl ile) derişik NaOH ile 37 C 7.4 e ayarlandı. Deneylerde 2-deoksi-D-glukoz (DOG) kullanılırken 11 mm glukoz ile yer değistirildi. HL-1 hücre hattının kültür edilmesi: HL-1 (tümör kökenli fare atrial kardiyomiyosit) hücreleri için özel üretilen Claycomb ortamı içerisine 2 mm L-glutamin, 0.1 mm norepinefrin, %10 FBS (fetal sığır serumu), 100 U/ml penisilin ve 100 μm streptomisin eklenerek hücrelerin içerisinde yaşayacağı ve çoğalacağı ortam hazırlandı. Hücreler bu ortam içerisinde, %5 CO 2 in bulunduğu, %95 oranında neme sahip olan 37 o C deki etüvde kültür edildi. Bu ortam her gün düzenli olarak değiştirildi. Hücrelerin flasklara ekilmesinden önce flaskların içerisine jelatin/fibronektin koyularak bir gece 37 o C lik etüvde inkübe edildi ve hücrelerin yüzeye tutunacakları ortam sağlandı. Hücreler üç günde % 90 konfluent durumuna geldikten sonra pasajlandı (%0.05 tripsin/edta ile). Deneyde kullanılacak olan hücreler pasajlama işleminde camlara ekildi. Camlar, altı kuyulu plate lere yerleştirildikten sonra kuyulara jelatin/fibronektin (1 er ml) koyularak bir gece etüvde 37 o C de inkübe edildi. HL-1 hücrelerinde uzun süreli gerçek hipoksik şartların oluşturulması: Uzun süreli gerçek hipoksi şartları gaz geçirgen olmayan kapalı bir kabın (chamber) istenilen miktarda oksijen ile gazlandırılmasından sonra 37 lik bir etüvde 48 saat bekletilmesi ile oluşturuldu. Chamber in oksijen içeriği 49 sürekli olarak oksijene duyarlı bir prob ile kontrol altında tutuldu ve sıklıkla gaz karışımı tazelendi. Chamber ın içinde elde edilen kısmi oksijen basıncı ortalama 4-5 mmhg (normoksi; 158 mmhg) ölçüldü. Kültür ortamının ph sının kontrolü için ortamın renk değişimi izlendi. Protein miktar tayini (Western blot): HL 1 hücreleri lizis tamponu (mm: 20 Tris-HCl (ph:7.4), 150mM NaCl, 2mM KCl, 2mM EDTA, 0.5mM DTT, 100mM proteaz inhibitör karışımı, 0.4mM PMSF, %2 NP-40 ve %1 deoksikolat) ile parçalandıktan sonra 1000 g de 10 dk +4 C da santrifüj edildi. Elde edilen süpernatant spektrofotometrede protein sayımı gerçekleştirildikten sonra ölçüm yapmak için kullanıldı. Protein miktar tayini için %8 lik SDS-PAGE jel hazırlandı ve denatürasyondan sonra jel kuyularına yüklenen örneklere elektroforez uygulandı (10 ma da 3 saat). Moleküler ağırlıklarına göre jel üzerinde ayrılan proteinler PVDF membrana transfer edildi (200 ma, 2 saat). Transfer işleminden sonra membranlar 1 saat oda sıcaklığında % 2.5 BSA ve TTBS (%20 Tween, 2M Tris (ph:7.6), 11.6 g NaCl 2ml lik hacimde) ile inkübe edilerek bloklandı. TTBS tamponu ile yıkamadan sonra, membranlar TTBS tampon ve primer antikor (Abcam, 1 µg/ml) ile 1 gece +4 C de inkübe edildi. Daha sonra yıkanan örnekler TTBS tampon ve sekonder antikor ile 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi. İnkübasyon periyodunun sonunda membranlar son olarak tekrar yıkandı. Sekonder antikora bağlı olan peroksidaz enziminin substratı luminol membranın üzerine doğrudan uygulandı ve 5 dakika içerisinde görüntü filme aktarıldı. Β-aktin ve GADPH referans gen olarak kullanıldı. Toplam RNA İzolasyonu: Kontrol ve hipoksik HL-1 hücrelerinden total RNA izolasyonu için toplam RNA izolasyon kiti (Trizol Reagent, Invitrogen) kullanıldı. Elde edilen RNA miktar tayini Qubit 2.0 (Invitrogen) ile yapıldı. Komplementer DNA (cdna) Sentezi: Kontrol ve hipoksik HL-1 hücrelerinden elde edilen 1 μg total RNA dan, üretici firmanın (DyNAmo cdna Synthesis Kit, Finnzymes) önerdiği protokol doğrultusunda cdna sentezi gerçekleştirildi. mirna lardan cdna sentezi için Qiagen miscript Reverse Transcription kiti kullanıldı.

53 Primer Tasarımı: PCR deneylerinde kullanılan spesifik primerler Vector NTI (Invitrogen) programı ile tasarlandı. mirna ölçümlerinde kullanılan primerler doğrudan Qiagen firmasından temin edildi. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR): HL-1 hücrelerinde ilgili genlere ait (NHE-1, NHE-3, NHE-8 ve Na + /HCO 3 - ko-transportörü (NBC)) kontrol ve hipoksik mrna ekspresyonlarını gösterebilmek için polimeraz zincir reaksiyonu ve analizi gerçekleştirildi. Deneylerde Finnzymes DyNAzyme II DNA Polymerase kiti üretici firma talimatları doğrultusunda kullanıldı. Gerçek Zamanlı PCR (qpcr): Deneylerde Roche LightCycler 1.2 gerçek zamanlı PCR cihazı kullanıldı. mirna ekspresyon deneyleri için Qiagen miscript SYBR Green qpcr kiti, diğer gen ekspresyon deneylerinde ise Finnzymes DyNAmo Capillary SYBR Green qpcr Kiti kullanıldı. qpcr deneylerinin sonunda erime eğrisi analizi yapıldı. Analiz: Kontrol ve hipoksik örneklerden elde edilen hedef mrna ve mirna ların miktarlarının karşılaştırılması ΔΔCt metoduna göre ekspresyon oranı olarak hesaplandı. Bu yöntemde Ct çoğaltılan mrna ya da mirna kopyalarının sabit bir şekilde artmaya başladığı (doğrusal faz) eşik siklustur. mrna miktar tayininde β2- mikroglobulin ve GADPH, mirna miktar tayininde ise RNU6B, SCA17 endojen referens gen primerleri kullanıldı. Gerçek zamanlı PCR ölçümlerinde hedef ve referans gen primerlerinin verim analizleri gerçekleştirildi (Pfaffl, 2001). Tüm sonuçların istatistiksel değerlendirmeleri için Student s t-test (p<0.05) kullanıldı. Biyoinformatik araçların kullanımı: NHE 3 UTR bölgesini hedef alabilecek mirna ların belirlenmesinde veri bankaları ve hedef şeçme araçları mirbase( TargetScan( ve Vector NTI (Invitrogen) programı kullanıldı. Mikrodizin analizi: Kontrol ve hipoksik HL-1 hücrelerinden elde edilen 1 µg total RNA ya poli A kuyruğu takılması işleminden sonra biotin ile işaretlenmiş sinyal molekülleri bağlandı. Daha sonra hibridizasyon işlemi (48 C, 60 rpm, 16 saat) hedef mirna lara 49 komplementer nükleotid segmentleri içeren mikroçipler üzerinde (Affymetrix) yapıldı. Elde edilen floresan resimler tarayıcı ile toplandıktan sonra ışıma şiddetleri hesaplandı. Data özeti, normalizasyon, kalite kontrol işlemleri MicroRNA QC tools (ver. 2.0, Affymetrics) yazılımı kullanılarak yapıldı. Aynı yazılım ile ham datadan arka plan düzeltme, medyan parlatma ve log2 dönüşümü gerçekleştirildi. Daha sonra istatistiksel analiz için Student s t-test uygulandı. BULGULAR 1. İzole sıçan kardiyomiyositlerinde akut anoksinin (5-9 dk) NHE-1 aracılı H + atılımına etkisi İskeminin ana komponentlerinden birisi ortamdaki oksijen konsantrasyonunun azalması ya da olmamasıdır (anoksi). Anoksinin NHE-1 aktivitesi üzerindeki etkisi izole sıçan kardiyomiyositlerinde sabit hücre dışı ph da (7.4) test edildi. Bunun için ph duyarlı problar SNARF-1AM ve BCECF-AM boyaları kullanıldı. Anoksik koşullar (1 mm Na + diatonit ve %100 N 2 ) SNARF-1 boyasında artefak oluştururken BCECF boyası ile bu durum gözlenmedi. Bu nedenle deneylerde BCECF boyası kullanıldı. 1 mm Na + diatonit eklenmesi ve nitrogen gazı ile gazlandırma solüsyonların ph sını değiştirmedi. Akut anoksi (5-9 dk), hücreden NHE-1 aracılı H + çıkışının ph duyarlılığını sola kaydırdı (NHE-1 aktivitesinde azalma) (Şekil 1a, d). Anoksinin NHE-1 aktivitesini azaltması zamana bağlı olarak 5. dk dan itibaren başlarken, ilk 2 dk süresince anoksi uygulanması NHE-1 aktivitesini değiştirmedi (Şekil 1b, d). Anoksi uygulanması ile bazı hücrelerde bazal durumda geçici bir alkalozis oluştu ancak hücre içi asidik iken bu durum gözlenmedi (Şekil 1c). Reoksijenasyondan ~15 sn sonra anoksinin oluşturduğu inhibisyon kontrol değerlerine geri döndü. Reoksijenasyon başlangıcında geçici bir asidozis gözlendi (Şekil 1a, e).

54 J NHE (mm/dk) J NHE (mm/min) Oran 440/490 a Hepes tamponlu tirod b Hepes tamponlu tirod mm Na diatonit + 100% N 2 0Na mm Na diatonit + 100% N 2 ph i c 20 mm NH 4Cl 20 mm NH 4Cl 20 mm NH 4Cl 4 dk d mm NH 4Cl dk Hepes tamponlu tirod ph i Kariporid (30 µm) 1 mm Na diatonit + 100% N * * * * * * * * Kontrol (n:9) 2 dk anoksi (n:5) 5 dk anoksi (n:5) 9 dk anoksi (n:7) * Kontrol vs 9 dk anoksi, p<0.05 Kontrol vs 5 dk anoksi, p< mm NH 4Cl 4 dk [ph] i e Kontrol (n:9) Reoksijenasyon (n:5) Şekil 1. Aynı hücrede NH 4Cl ile hücre içine asit yüklenmesinden sonra anoksi (1 mm Na + diatonit ve %100 N 2) varlığında ya da yokluğunda ph i nin NHE- 1 aracılı hücre içi asiti dışarı atışını gösteren trase (a). 2 dk süreli anoksinin NHE-1 aktivitesinde azalma yapmadığını gösteren örnek trase (b). Anoksi bazal durumda geçici alkalozis oluşturdu ancak hücre asidik iken (ph i~6) ph i yı daha fazla düşürmedi (c). A da ölçülen hücre içi asitin normale dönüş eğrilerinin kontrol ve anokside NHE-1 akısına (J NHE) dönüştürülmüş şekilleri (d). Reoksijenasyondan ~15 sonra NHE-1 aktivitesi (e).*, p<0.05 kontrole göre karşılaştırıldığında. ph i

55 J NHE (mm/min) J H + (mm/dk) 2. Akut anoksiye bağlı hücre içinde asit oluşması ve anoksinin hücre içi doğal tamponlama kapasitesine (β i ) etkisi Hücreden asit dışarı atılımının 30 µm selektif NHE-1 inhibitörü kariporid ile bloke edildiği durumda anoksinin hücre içinde asit oluşumuna yol açtığı görüldü (Şekil 2a, b). Ancak bu artış ihmal edilebilecek kadar az olduğu için ( 0.5 mm/dk) NHE-1 aracılı H + akısı eğrilerinden çıkartılmadı. Anoksik koşullarda hücrenin doğal tamponlama kapasitesinde oluşabilecek değişiklik NHE-1 aktivitesini değiştirebileceğinden anoksik koşullarda hücrenin doğal tamponlama kapasitesi ölçüldü ancak kontrole göre anlamlı bir fark bulunmadı (Şekil 2c). Benzer şekilde, anoksik koşullarda Cl - bağımlı hücre içine asit yükleyicilerin (Cl - -HCO3 - değiştokuşcusu, Cl - -OH - değiş-tokuşcusu) aktivitelerinde olası bir artış da NHE-1 aktivitesini anoksinin etkisinden bağımsız olarak azaltacağından deneyler Hepes çözeltilerinden Cl - iyonu çıkartılarak tekrarlandı. Cl - iyonunun uzaklaştırılması anoksi ile indüklenen NHE-1 inhibisyonunu değiştirmedi (Şekil 2d). 3. İzole sıçan kardiyomiyositlerinde gerçek hipoksinin (~1 mm Hg PO 2 ) NHE-1 aracılı H + atılımına etkisi Akut anokside gözlendiği gibi gerçek hipoksik şartlar da (Na + diatonit eklenmeden sadece perfüzyon solüsyonlarının %100 N 2 ile gazlandırılması ile) hücre içine asit yüklenmesinden sonra ph i nin normale dönüş eğrisinin eğimini (dph i /dt) ve dolayısı ile hücreden NHE-1 aracılı H + çıkışını kontrole göre azalttı (ph i : 6.85) (Şekil 3a, b). 4. Oksidatif ve glikolitik inhibitörlerin NHE-1 aracılı H + atılımına etkisinin karşılaştırılması Anoksi yerine hücre solunumu 9 dk süresince iyodoasetat (0.5 mm, glikoliz ve oksidatif fosforilasyonu birlikte inhibe eder) ya da mitokondride solunum zincirini farklı yerlerde bloke eden oksidatif fosforilasyon inhibitörleri (miksotiazol, rotenon, 10-6 M; antimisin A, 5 µg/ml) ile inhibe edildiğinde anoksinin etkisinin taklit edildiği ve NHE-1 aktivitesinin azaldığı görüldü. Ancak diğer bir glikoliz inhibitörü DOG NHE-1 aktivitesini değiştirmedi (Şekil 4a,b) a ph i c βi (mm/ph) y = x y = x Kariporid+Anoksi Kariporid Kontrol Anoksi ph i b d Kariporid (n:3) Kariporid+anoksi (n:6) * * * * * * Kontrol (n:9) Kontrol 0Cl (n:7) 9 dk anoksi (n:7) 9 dk anoksi 0Cl (n:5) * Kontrol vs 9 dk anoksi 0Cl, p< [ph] i * Şekil 2. Anoksinin H + dışarı çıkışı kariporid ile bloke edildiğinde hücre içinde asit oluşturduğunu gösteren örnek trase (a). Anoksi ile indüklenen hücre içi asit oluşumunun hesaplanmış şekli (b). Hepes tamponlu süperfüzyon solüsyonundan kademeli olarak amonyum uzaklaştırılarak hesaplanan doğal tamponlama kapasitesinin (β i) ph i nin bir fonksiyonu olarak gösterilmesi (c). Hepes süperfüzyon solüsyonundan Cl - iyonunun uzaklaştırılması sonrasında tekrarlanan anoksi deneylerine ait grafik (d). *p<0.05 kendi kontrollerine göre karşılaştırıldıklarında. 49

56 J NHE (mm/min) J NHE (mm/dk) Normalize egim J NHE (mm/min) a b Hipoksi (~1 mmhg PO 2 ) Eslesmis kontrol * ph i (ortalama 6.85) Hipoksi (~1 mmhg PO2) Eslesmis kontrol (n:4) a b * Kontrol (n:9) 9 min anoksi (n:7) DOG (n:6) IAA (0.5 mm) (n:4) * Kontrol vs IAA, p < [ph]i 15 Kontrol (n:9) * ph i (ortalama 6.85) Şekil 3. Gerçek hipoksinin (sadece %100 N 2 ile gazlandırılan süperfüzyon solüsyonları) amonyum ön işlemi sonrasında ph i nin normale dönme eğrisinin eğimi (dph i/dt) (a) ve NHE-1 akısı (ph i 6.85) (b) üzerine etkisi. *p<0.05 kontrole göre karşılaştırıldığında. 5. Akut anoksinin (5-9 dk) mitokondri membran potansiyeli ve hücre içi ATP miktarına etkisi Anoksi yavaş ve geri dönüşümlü olarak mitokondri membran potansiyelini depolarize etti (plato: 8.3 ± 0.98 dk, n=4) (Şekil 5a). Mitokondrial elektron transferi-fosforilasyon arasındaki kenetlenmeyi bozan karbonil siyanür-p-triflorometoksifenilhidrazon(fccp; 5 µm) ise hızlı (plato: 32 ± 3.9 sn n=3) ve geri dönüşümsüz bir depolarizasyon oluşturdu (Şekil 5b). Daha sonra hücre içi ATP miktarının indirekt ölçüm metodu olan Mag-Fluo-4 boyası ile görüntüleme yapıldı. Bu yöntemde Mg +2 -ATP birlikte bulunduğundan serbest Mg +2 miktarındaki artışın büyük kısmının ATP nin tüketilmesine bağlı olduğu ön görülmektedir. FCCP (5 µm) ve 2,4-dinitrofenol (DNP; 1 mm) saniyeler içerisinde ATP yi tüketirken, anoksi uygulanması 9 dk içerisinde ATP konsantrasyonunu daha az düşürdü (Şekil 5c). DNP bazal ph i yı aside kaydırırken, NHE-1 aktivitesini tamamen inhibe etti (Şekil 5d, e) * * * 9 min anoksi (n:7) Miksotiazol (10-6 M) (n:7) Rotenon (10-6 M) (n:3) Antimisin A (5 ug/ml) (n:3) Rotenone vs control, p < [ph] i * Myxothiazol, Antimisin A vs control, p < 0.05 Şekil 4. Anoksi için uygulanan protokoller tekrarlanarak solunumun çeşitli glikoliz (a) ve oksidatif fosforilasyon inhibitörleri (b) ile bloke edilmesinin NHE-1 aktivitesi üzerine etkileri. *, p<0.05 kendi kontrollerine göre karşılaştırıldıklarında. 6. Serbest radikal süpürücüsü 2- merkaptopropionil glisin (MPG) ve antimisin A nın NHE-1 aracılı H + atılımına etkisinin karşılaştırılması Mitokondri oksidatif fosforilasyon inhibitörlerinin reaktif oksijen türevleri (ROS) oluşturma potansiyelleri ve NHE-1 fonksiyonunun hücre içi ROS miktarı ile değişebileceği göz önünde bulunduruldu ancak kontrol koşullarında (%21 O 2 ) ROS süpürücüsü MPG (300 µm) varlığında NHE- 1 aktivitesi değişmedi (Şekil 6a). Ayrıca, kontrol koşullarında NHE-1 aktivitesini azaltan antimisin A (5 µg/ml) ROS oluşturdu (Şekil 6b). p <

57 % Mg-Fluo-4 floresanindaki artis Em: 535 nm Oran 530/590 Oran 440/490 Oran 530/590 Reoksijenasyon a Anoksi a Hepes tamponlu tirod MPG (300 µm) dk b dk FCCP 5 µm b H 2O 2 (1 mm) dk ph i c d e ph i DT (1 mm) (n:3) DNP (1 mm) (n:3) FCCP (5 M) (n:3) DOG ile sinyal artisi yok (n:4) Dakika Hepes tamponlu tirod DNP (1 mm) 4 Hepes tamponlu dk tirod DNP (1 mm) rigor mm NH 4Cl 1 dk rigor Şekil 5. JC-1 boyası kullanılarak anoksi protokolü sırasında (a) veya FCCP varlığında (b) mitokondri membran potansiyelinin değişimi. Mag-Fluo-4 boyası kullanılarak doğrudan olmayan hücre içi ATP ölçümleri (c). Bazal (d) ve amonyum ön işlemi sonrasında hücreye asit yüklendikten sonra (e) DNP nin etkisini gösteren traseler Antimisin A (5 µg/ml) dk Şekil 6. Normal koşullarda (%21 O 2) MPG varlığında NHE-1 aktivitesini gösteren örnek trase (a). DCFH-DA (Ex:495 nm, Em:535 nm) boyası ile antimisin A nın ROS oluşumuna yol açtığını gösteren örnek trase (b). n: HL-1 hücrelerinde NHE aracılı H + atılımı özelliklerinin belirlenmesi HL-1 hücrelerinde süperfüzyon solüsyonundan sodyumun uzaklaştırılması (NHE aktivitesinin tamamen inhibe olduğu durum) ve spesifik NHE 1 inhibitörü zoniporid (30 µm) büyük ölçüde hücrenin asiti dışarı atmasını bloke etti (Şekil 7a, b). HL 1 hücrelerinde ekspresyonu olabileceği düşünülen NHE izoformlarının varlığı PCR reaksiyonu ile test edildi ve NHE-1, NHE-8 ve Na + - /HCO 3 ko-transportunun (NBC) mrna ları bulundu (Şekil 7c, d). Bu sonuçlara göre HL 1 hücrelerinde H + dışarı atılımından sorumlu ana izoform NHE 1 dir.

58 ph i ph i a mm NH 4Cl Hepes tamponlu tirod 0Na 3 dk 8 3 dk b Hepes tamponlu tirod Zoniporid (30 µm) 8. HL-1 hücrelerinde uzun süreli gerçek hipoksinin (48 saat, PO 2 : 4-5 mmhg) hücre içi doğal tamponlama kapasitesi (β i ) ve NHE-1 aracılı H + atılımına etkisi 48 saat hipoksi HL-1 hücrelerinin tamponlama kapasitesini anlamlı olarak değiştirmedi (Şekil 8a, b) Elde edilen bu veriler hücre içinde tek tip bir tampon kullanılarak ifade edildi (hücre içi tampon=84.35 mm, pk a =6.58). Akut anoksideki duruma benzer şekilde uzun süreli hipoksi de NHE-1 aktivitesinde azalma oluşturdu (Şekil 8c). Bu etki deney yapıldığı süre boyunca (yaklaşık 30 dk) geriye dönmedi. a [NH 4 + ] 0 (mm) mm NH 4Cl 20 mm NH 4Cl 20 mm NH 4Cl 5 dk Hepes tamponlu tirod Zoniporid (30 µm ) c ph i 6.5 NK NHE-3 NHE-8 NBC bp NHE-1 Şekil 7. Ortamdan Na + uzaklaştırıldığında NHE aracılı asit atılımı (a). Aynı hücreden arka arkaya alınan amonyum ön işlemi sonrasındaki NHE aktivitesi. 3 lü trasenin son kısmında ortamda zoniporid (30 µm) varken NHE büyük ölçüde inhibe olmaktadır (b). HL-1 Hücrelerinde NHE-1 (c), NHE- 3, NHE-8 ve NBC (d) ekspresyonlarının %1.5 lik agaroz jelde gösterilmesi. Sonuçlarda NHE-3 ekspresyonu gözlenmemiştir. NK negatif kontrol. d 49 b βi (mm/ph) c JNHE (mm/dk) s hipoksi 48 s hipoksi Kontrol Kontrol 3 dk 3 dk 6,5 6,7 6,9 7,1 7,3 7,5 7,7 7,9 8,1 8,3 ph i 0 6,55 6,65 6,75 6,85 6,95 7,05 ph i Şekil 8 HL-1 hücrelerinde hücre içi doğal tamponlama deneyi (a). Kontrol ve 48 saat hipokside tutulmuş hücrelerde doğal tamponlama kapasitesinin (β i) ph i nin bir fonksiyonu olarak gösterilmesi (b). Kontrol ve anokside NHE-1 akılarını (J NHE) gösteren grafik (c). p<0.05, n=7-10.

59 -log (p değeri) -log(p değeri) NHE-1 protein miktari 9. HL-1 hücresinde 48 saatlik uzun süreli gerçek hipoksinin NHE-1 protein düzeyi ve mirna ekspresyon profili üzerine etkisi Uzun süreli hipoksi ile tamponlama kapasitesinde anlamlı bir değişiklik gözlenmedi. Dolayısı ile NHE-1 aktivitesinde gözlenen azalmadan protein miktar değişiklikleri sorumlu olabilir. 48 saatlik hipoksi NHE-1 protein seviyesinde kontrole göre ~%60 lık bir azalma oluşturdu (Şekil 9a). a s hipoksi HL-1 Hedef seçme araçları ve literatür bilgisi kullanılarak NHE-1 3 UTR sine bağlanabilecek bazı potansiyel mirna lar belirlendi (Şekil 9b). Potansiyel eşleşme gösteren mirna ların uzun süreli hipoksi sonrası ekspresyon profillerini görmek ve hipoksi sonrası ekspresyonları artan, NHE-1 mrna sı ile eşleşme gösterebilecek diğer mirna ları saptamak için mikrodizin analizi gerçekleştirildi. Uzun süreli hipoksinin mirna ekspresyonlarını değiştirdiği görüldü (Şekil 9c). Mikrodizin analizi sonrası mir- B nin NHE-1 protein seviyesindeki azalmadan sorumlu olabilecek en uygun aday olduğuna karar verildi (Şekil 9d). 0.5 * b c Kontrol NHE-1 48 s hipoksi HL-1 mirna mikrodizin analizi mir-b Şekil 9. Kontrol ve 48 saat hipoksi sonrasında NHE-1 protein seviyeleri *, p<0.05 kontrole göre, n=3-6. (a). Hedef seçme algoritmaları kullanılarak NHE-1 mrna sının 3 UTR bölgesine (translasyona uğramayan 3 ucundaki bölge) ilk sekiz nükleotitden (seed sequence) bağlanması öngörülen mirna ların şematik gösterimi. Hatalı eşleşme sayıları (mm) parantez içerisinde verilmiştir. (b). 48 saat hipoksi sonrasında mirna ların kontrol grubuna göre karşılaştırılması. Grafikte x- ekseni kontrol ortalamasına göre hipoksi grubunda artan ya da azalan mirna ları, y- ekseni ise istatistiksel anlamlılığı göstermektedir. Kesikli çizgiler %50 kat değişiklik ve p<0.05 sınırını göstermektedir. Oklar şekil 9b de NHE-1 3 UTR bölgesine bağlanma potansiyeli öngörülen mirna ları göstermektedir (mir B, C). mirna probları insan, sıçan ya da fare nükleotid dizilerine komplementerdir (kontrol n=3; hipoksi n=4) (c). mir-b nin seed sekansının NHE-1 3 UTR bölgesindeki eşleşmelerine iki örnek. Gri bölgeler seed sekansı göstermektedir (d). d mir-c log 2(ekspresyon oranı) -log 2 (ekspresyon oranı) 5...TCCCACAG NHE-1 3 UTR : : 3...UGCGUGUC mir-b 5...AGGCACAC NHE-1 3 UTR : : 3...UGCGUGUC mir-b 10. HL-1 hücrelerinde uzun süreli gerçek hipoksinin NHE-1 mrna ve hedef mirna düzeylerine etkisi İlgilenilen mirna ların mikrodizin analizi sonuçları gerçek zamanlı PCR (qpcr) ile test edildi. Mikrodizin analizi ve qpcr datasının paralellik gösterdiği bulundu (Şekil 10a). Uzun süreli hipoksi NHE-1 ve 8 mrna seviyelerini azalttı (Şekil 10b). 49

60 NHE-1 mrna ekspresyon orani mirna ekspresyon oranlari a b s hipoksi HL-1 Kontrol mir-a mir-b mir-c Kontrol NHE-1 NHE-8 * 48 s hipoksi HL-1 Şekil saatlik hipoksi sonrasında HL-1 hücrelerinde ΔΔCt metoduna göre hesaplanmış normalize hedef mirna (a) ve NHE-1, 8 mrna (b) ekspresyon oranları. *p<0.05 kontrole göre, n=4-6. TARTIŞMA VE SONUÇ Bulgularımıza göre kardiyomiyositlerde akut anoksi NHE-1 aktivitesinde azalmaya yol açmaktadır. NHE-1 aktivitesindeki azalma gerçek hipoksik koşullarda da görüldüğünden anoksi için kullanılan sodyum diatonitin artefakt oluşturmadığına karar verildi. Sonuçlarımızla paralel olarak, akut hipoksinin farklı dokularda (eklem kondrositleri) da NHE aktivitesinde azalmaya yol açtığı bildirilmiştir (Gibson ve diğ., 2009). NHE-1 aktivitesindeki azalma anoksinin hücre içi asit oluşturması, tamponlama kapasitesini artırması ya da Cl - bağımlı asit yükleyicilerin (Cl - /HCO 3 -, Cl - /OH - ) hızlarındaki artış ile açıklanamamaktadır (Şekil 1 ve 2). Deneylerimizde gözlemlediğimiz NHE-1 aktivitesindeki azalma aynı zamanda mitokondri ATP üretim fonksiyonunu durduran farklı inhibitörlerle de (oksidatif ve glikolitik inhibitörler) taklit edildi. Ancak glikolitik ve oksidatif inhibitör olan DOG 10 dk içerisinde diğer solunum inhibitörleri gibi NHE-1 aktivitesinde azalmaya yol açmadı. Daha * * * 49 önce doğrudan hücre içi ATP (ATP i ) ölçümü bulgularımıza göre, ATP i miktarını rotenon ve antimisin A uygulaması hızla azaltmakta, DOG ise ancak 45 dk sonra ATP i miktarını düşürmektedir. Bu çalışmada da akut anoksi ATP i yi hızla azaltmakta, DOG ATP i de herhangi bir değişiklik oluşturmamaktadır (Şekil 5c). DOG nin 10 dk içerisinde NHE-1 aktivitesini etkilememesi ATP i miktarını azaltmaması ile açıklanabilir. Bu bulgular ile korele olarak, fosforilasyon kenetini bozan DNP hücre içinde asit oluşturması ve kısa bir süre kullanılabilmesi gibi kısıtlamalara rağmen NHE-1 aktivitesini tamamen inhibe etti (Şekil 5d, e). Benzer şekilde anoksi protokolü mitokondri membranını depolarize ederken, reoksijenasyon ile hızlı repolarizasyon oluştu (Şekil 5a). Mitokondri membran potansiyelinin repolarizasyonu NHE-1 reaktivasyonu datası ile korelasyon göstermektedir. Bu sonuçlar ATP i nin NHE-1 aktivitesindeki azalmadan sorumlu molekül olabileceğini akla getirmektedir. NHE aracılı değiş-tokuşun direkt enerji kullanılmadan Na + ve H + in elektrokimyasal gradientlerini kullanarak pasif olarak gerçekleştiği bilinmektedir. NHE aracılı iyon transportunun ATP i ye ihtiyaç duymadığı plazma membran veziküllerinde ATP siz ortamda NHE nin aktivitesini sürdürebilmesinden anlaşılmıştır (Murer ve diğ., 1976; Kinsella ve Aronson, 1980). Ancak canlı hücrelerde, bulgularımızla paralel bir biçimde, ATP i nin miktarının azaltılması hücre tipine bağlı olarak çeşitli oranlarda NHE inhibisyonuna yol açmaktadır (Kapus ve diğ., 1994; Levine ve diğ., 1993). ATP i nin NHE yi nasıl regüle ettiğinin mekanizması henüz aydınlatılamamış ve bu konuda farklı hipotezler ortaya atılmıştır (Aharonovitz ve diğ., 1999). Daha önceki çalışmaların deney koşullarında ATP etkisinin ph i nın ve transmembran Na + gradientinin sabit tutulmasına rağmen devam ettiği görülmüştür (Demaurex ve diğ., 1997). Dolayısı ile ATP i nin etkisinin Na + ve H + elektrokimyasal gradientlerinin değişmesine bağlı olmadığı öne sürülmüştür. Diğer bir çalışmada bazal koşullarda hücrelerde NHE-1 izoformunun fosforile konumda olduğu bildirilmiştir (Sardet ve diğ., 1990, 1991). Bu bulguya dayanarak, ATP nin boşaltılması ile gözlenen NHE inhibisyonunun yapısal fosfat gruplarının kaybından kaynaklandığı öne sürülmüştür. Ancak, ATP i kısa süreliğine boşaltıldığında NHE nin fosforilasyon durumunda değişme olmadan

61 da inhibisyon gözlenmektedir (Goss ve diğ., 1994). Benzer şekilde, fosforilasyon bölgeleri olmayan NHE-1 mutantlarında ATP i nin boşaltılması da NHE yi inhibe etmektedir (Wakabayashi ve diğ., 1994). ATP nin NHE üzerindeki direkt regüle edici etkisi ATP i miktarının doğrudan değiştirilebildiği bir deney metodu ile Demaurex ve diğ. (1997) tarafından gösterilmiştir. Ancak, izole memeli kardiyomiyositlerinde akut anoksi veya gerçek hipoksinin yaptığı NHE-1 inhibisyonunda ATP nin katkısı için doğrudan kanıt bulunmamaktadır. Gibson ve ark. (2009) ise hipoksinin NHE aktivitesi üzerindeki yavaşlatıcı etkisinin ATP i den bağımsız olduğunu ve hipoksi sırasında azalan reaktif oksijen türevlerinin NHE aktivitesindeki azalmadan sorumlu olduğunu öne sürmüşlerdir. Araştırmacılar, antimisin A nın azalan oksijen seviyesi yüzünden düşen ROS miktarını artırdığını böylece hipoksi ile indüklenen NHE inhibisyonunu geri çevirdiğini bildirmişlerdir. ROS hipotezine göre, antimycin A mitokondrinin iki membranı arasındaki boşluğa doğru süperoksit anyonu oluşturarak NHE aktivitesini regüle etmektedir. Diğer oksidatif inhibitörler (rotenon ve miksotiazol) mitokondrinin matriks tarafına doğru süperoksit oluşturdukları için mitokondride bol bulunan antioksidanlar tarafından süperoksidin indirgendiği dolayısı ile bu inhibitörlerin NHE üzerinde regülasyonlarının bulunmadığı öne sürülmüştür. Antimisin A nın ROS ürettiği bulgusu bu çalışmada da gözlenmiştir (Şekil 6b). Ancak antimisin A kondrositlerdeki etkisine ters bir şekilde kardiyomiyositlerde kontrol koşullarda (normoksik) NHE-1 aktivitesini azaltmaktadır (Şekil 4b). Ayrıca, normoksideki bazal ROS un NHE-1 aktivitesi üzerindeki etkisini test etmek amacıyla ROS süpürücüsü MPG kullanıldı ancak NHE-1 aktivitesi değişmedi (Şekil 6a). Tüm bu sonuçlar, hipokside görülen NHE-1 aktivitesindeki yavaşlamanın ROS oluşumundaki değişikliklerden kaynaklanmadığını öne sürmektedir. Elde edilen sonuçlara göre, akut anoksi ve hipoksi, kardiyomiyositlerde hızlı olarak NHE-1 aktivitesini azaltmakta (10 dk) ve reoksijenasyon ile bu azalma hızlı bir şekilde geriye dönmektedir ( 30 s). Bu bulgu HL-1 hücresinde yapılan ön deneylerde de gözlendi. Ayrıca, reoksijenasyon sırasında diğer çalışmalarda da gözlenen geçici asidozis oluştu (Bright ve diğ., 1992). Kronik 49 hipoksinin uygulandığı şartlarda ise, HL-1 hücrelerinde NHE-1 aktivitesi benzer şekilde azalırken, bu azalma reoksijenasyon ile hemen geriye dönmedi (yaklaşık 30 dk). Bu sonuçlar, akut ve kronik hipoksideki NHE-1 aktivitesindeki azalma ve reaktivasyon mekanizmalarının farklı olabileceğini düşündürmektedir. Anderson ve diğ. (2009) tarafından HL-1 hücre kültüründe 5 saatlik hipoksi sonucunda NHE-1 izoformunun mrna ve protein seviyesinde azalma meydana geldiği bildirilmiş ancak mekanizması belirtilmemiştir. Diğer taraftan, pulmoner arter düz kas hücrelerinde 48 saatlik hipoksi NHE aktivitesinde artışa yol açmaktadır. Ayrıca bu çalışmada, NHE-1 protein ve mrna seviyelerinin de yükseldiği bulunmuştur (Shimoda ve diğ., 2006). Bizim bulgularımızla paralel bir biçimde Milner ve diğ. (2006) kondrositlerde uzun süreli hipoksinin (3 saat) NHE aktivitesini inhibe ettiğini göstermişlerdir. Diğer bir çalışmada, miyokard enfarktüsü sonrası enfarkt oluşmayan alanda NHE-1 mrna ve protein seviyelerinin azaldığı bildirilmiştir (Shimohama ve diğ., 2002). Bu çalışmadaki bulgular da uzun süreli hipokside NHE-1 mrna ve protein seviyesinin azaldığını göstermektedir (Şekil 9a, 10b). Tüm bu sonuçlar uzun süreli hipoksi ile NHE-1 aktivitesinde gözlenen azalmanın protein seviyesinde azalmaya bağlı olabileceğini düşündürmektedir. Paralel bir şekilde NHE-1 ekspresyonunu değiştirebilecek hedef belirlediğimiz bazı mirna lar korele bir şekilde artış göstermektedir (Şekil 9b, d ve Şekil 10a). Artan hedef mirna lar NHE-1 mrna sı ile kompleks oluşturarak ekspresyonunu baskılayabilirler. Ancak bu çalışmadaki fonksiyonel bulgularımız uzun süreli hipoksi ile antiporterin ph duyarlılığında azalma (sola kayma) olduğunu göstermektedir. Amonyum ön işlemi hücre içine NHE değiş-tokuşcusunun maksimum hızının ölçülmesine imkan verecek kadar hücreye asit yükleyememekte ve NHE-1 akı eğrilerinden protein miktar değişiklikleri hakkında fikir verebilecek maksimum transport hızı anlaşılamamaktadır. Dolayısı ile bulgularımızı, uzun süreli hipokside protein ekspresyonunda azalma ya da NHE-1 in H + e olan afinitesinde azalma ile açıklamak mümkündür. Ayrıca, akut anoksik koşulların aksine uzun süreli hipokside hipoksi ile indüklenen faktör-1α nın (Hif-1α) NHE aktivitesindeki rolünün de aydınlatılması faydalı olacaktır.

62 Destek Bu çalışma TÜBİTAK (2214-Yurt dışı araştırma burs programı), British Heart Foundation Programme Grant (Postdoctoral Research Scientist-Prof. R. D. Vaughan- Jones), TÜBİTAK BMBS COST TD0901 (B.Turan) ve A.Ü. BAP 11B (H.B. Kandilci) tarafından desteklenmiştir. Teşekkür Bu çalışmaların yürütülmesindeki katkı ve desteklerinden dolayı Prof. Dr. Belma Turan, Prof. Richard D. Vaughan Jones, Prof. Dr. Mehmet Uğur, Prof. Dr. Özlem Uğur, Doç. Dr. Hilal Özdağ, Dr. Pawel Swietach, Dr. Francisco C. Villafuerte, Dr. Figen A. Çiçek, Uzm. Biyolog Esma N. Okatan, Uzm. Biyolog Samet S. Yıldırım, Uzm. Biyolog Nilgün Tekin ve Mr. Philip Cobden e teşekkür ederim. KAYNAKLAR Aharonovitz, O., Demaurex, N., Woodside, M., Grinstein, S. (1999) ATP dependence is not an intrinsic property of Na+/H+ exchanger NHE1: requirement for an ancillary factor. Am J Physiol 276(6 Pt 1): C Andersen, AD., Poulsen, KA., Lambert, IH., Pedersen, SF. (2009) HL-1 mouse cardiomyocyte injury and death after simulated ischemia and reperfusion: roles of ph, Ca2+independent phospholipase A2, and Na+/H+ exchange. Am J Physiol Cell Physiol 296(5): C Aronson, PS., Nee, J., Suhm, MA. (1982) Modifier role of internal H+ in activating the Na+-H+ exchanger in renal microvillus membrane vesicles. Nature 299(5879): Aronson, PS., (1985) Kinetic properties of the plasma membrane Na+-H+ exchanger. Annu Rev Physiol 47: Barringhaus KG., Zamore PD. (2009) MicroRNAs: regulating a change of heart. Circulation 119: Bartel DP. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function, Cell 116: Bright, CM., Ellis, D. (1992) Intracellular ph changes induced by hypoxia and anoxia in isolated sheet heart Purkinje fibres. Exp Physio 77: Chen, L., Chen, CX., Gan, XT., Beier, N., Scholz, W., Karmazyn M. (2004) Inhibition and reversal of myocardial infarction induced hypertrophy and heart failure by NHE-1 inhibition. Am J Physiol Heart Circ Physiol 286: H381 H387. Demaurex, N., Romanek, RR., Orlowski, J., Grinstein, S. (1997) ATP dependence of Na+/H+ exchange. Nucleotide specificity and assessment of the role of phospholipids. J Gen Physiol 109(2): Gaidatzis, D., van Nimwegen, E., Hausser, J., Zavolan, M. (2007) Inference of mirna targets using evolutionary conservation and pathway analysis. BMC Bioinformatics 1;8:69. Garlick, P.B., Radda, G.K., Seeley, P.J., (1979 )Studies of acidosis in the ischaemic heart by phosphorus nuclear magnetic resonance. Biochem J 184(3): Gibson, J.S., McCartney, D., Sumpter, J., Fairfax, T.P., Milner, P.I., Edwards, H.L., Wilkins, R.J. (2009) Rapid effects of hypoxia on H+ homeostasis in articular chondrocytes. Pflugers Arch 458(6): Goss, G.G., Woodside, M., Wakabayashi, S., Pouyssegur, J., Waddell, T., Downey, G.P., Grinstein, S. (1994) ATP dependence of NHE- 1, the ubiquitous isoform of the Na+/H+ antiporter. Analysis of phosphorylation and subcellular localization. J Biol Chem 269(12): Grinstein, S., Rotin, D., Mason M.J. (1989) Na+/H+ exchange and growth factor-induced cytosolic ph changes. Role in cellular proliferation. Biochim Biophys Acta 988(1): Grinstein, S., Cohen, S., Rothstein A. (1984) Cytoplasmic ph regulation in thymic lymphocytes by an amiloride-sensitive Na+/H+ antiport. J Gen Physiol 83(3): Haigney M.C., Miyata H., Lakatta E.G., Stern M.D., Silverman H.S. (1992) Dependence of hypoxic cellular calcium loading on Na+-Ca2+ exchange. Circ Res 71: 547. Kapus, A., Grinstein, S., Wasan, S., Kandasamy, R., Orlowski, J. (1994) Functional characterization of three isoforms of the Na+/H+ exchanger stably expressed in Chinese hamster ovary cells. ATP dependence, osmotic sensitivity, and role in cell proliferation. J Biol Chem 269(38):

63 Kinsella, J.L., Aronson P.S., (1980) Properties of the Na+-H+ exchanger in renal microvillus membrane vesicles. Am J Physiol 238(6):F Lazdunski, M., Frelin, C., Vigne P. (1985) The sodium/hydrogen exchange system in cardiac cells: its biochemical and pharmacological properties and its role in regulating internal concentrations of sodium and internal ph. J Mol Cell Cardiol 17(11): Levine, S.A., Montrose, M.H., Tse, C.M., Donowitz, M. (1993) Kinetics and regulation of three cloned mammalian Na+/H+ exchangers stably expressed in a fibroblast cell line. J Biol Chem 268(34): Milner, P.I., Fairfax, T.P.A., Browning, J.A., Wilkins, R.J., Gibson, J.S. (2006) The Effect of O2 Tension on ph Homeostasis in Equine Articular Chondrocytes Arthritis & Rheumatism 54: Murer, H., Hopfer, U., Kinne, R. (1976) Sodium/proton antiport in brush-bordermembrane vesicles isolated from rat small intestine and kidney. Biochem J 154(3): Murphy, E., Allen, D.G. (2009) Why did the NHE inhibitor clinical trials fail? J Mol Cell Cardiol 46(2): Pfaffl, M.W. (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research 29: Sardet, C., Counillon, L., Franchi, A., Pouyssegur, J. (1990) Growth factors induce phosphorylation of the Na+/H+ antiporter, glycoprotein of 110 kd. Science. 247(4943): Sardet, C., Fafournoux, P., Pouyssegur, J. (1991) Alpha-thrombin, epidermal growth factor, and okadaic acid activate the Na+/H+ exchanger, NHE-1, by phosphorylating a set of common sites. J Biol Chem. 266(29): Shimoda, L.A., Fallon, M., Pisarcik, S., Wang, J., Semenza, G.L. (2006) HIF-1 regulates hypoxic induction of NHE1 expression and alkalinization of intracellular ph in pulmonary arterial myocytes. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 291(5):L Shimohama, T., Suzuki, Y., Noda, C., Niwano, H., Sato, K., Masuda, T., Kawahara, K., Izumi, T. (2002) Decreased Expression of Na+/H+ Exchanger Isoform Jpn Heart J 43: Steenbergen, C., Deleeuw, G., Rich, T., Williamson, J.R. (1977) Effects of acidosis and ischemia on contractility and intracellular ph of rat heart. Circ Res 41(6): Tani M, Neely J.T. (1989) Role of intracellular Na+ in Ca2+ overload and depressed recovery of ventricular function of reperfused ischemic rat hearts. Possible involment of H+ -Na+ and Na+-Ca2+ exchange. Circ Res 65: Wakabayashi, S., Bertrand, B., Shigekawa, M., Fafournoux, P., Pouyssegur, J. (1994) Growth factor activation and "H(+)-sensing" of the Na+/H+ exchanger isoform 1 (NHE1). Evidence for an additional mechanism not requiring direct phosphorylation. J Biol Chem 269(8): Wakabayashi, S., Sardet, C., Fafournoux, P., Counillon, L., Meloche, S., Pages, G., Pouyssegur, J. (1992) Structure function of the growth factor-activatable Na+/H+ exchanger (NHE1). Rev Physiol Biochem Pharmacol 119: * * * * * 49

64 ÖZGEÇMİŞ 1. KİMLİĞİ: Adı, soyadı: Hilmi Burak Kandilci Doğum Yeri ve tarihi: Ankara, 1974 Ocak Uyruğu: T.C. Medeni Hali: Evli, 1 çocuk İş adresi: Ankara Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Morfoloji Yerleşkesi, Biyofizik Anabilim Dalı,06100 Sıhhiye/Ankara Telefon: Fax: e-posta: kandilci@medicine.ankara.edu.tr 2. EĞİTİM ÖYKÜSÜ: İlk ve Ortaöğrenim: ; TED Ankara Koleji Lisans: ; Eczacı, Ankara Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Ankara Yükseklisans: ; Uzman Eczacı, Hacettepe Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmakoloji Programı, Ankara Doktora: ; Doktor Eczacı, Hacettepe Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmakoloji Programı, Ankara Doktora: ; Ankara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyofizik Programı, Ankara 3. MESLEKİ DENEYİMLERİ: Araştırma Görevlisi, Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı, Ankara Doktora sırasında deneysel araştırmacı, Oxford Üniversitesi, Fizyoloji Departmanı, Prof. Richard Vaughan- Jones Lab., İngiltere (4 ay süre ile) Doktora sırasında deneysel araştırmacı, Oxford Üniversitesi, Fizyoloji, Anatomi ve Genetik Departmanı, Prof. Richard Vaughan- Jones Lab., İngiltere (3 ay süre ile) Eczacı, Ankara Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Biyofizik Anabilim Dalı, Ankara Doktora sonrası deneysel araştırmacı, Oxford Üniversitesi, 49 Fizyoloji, Anatomi ve Genetik Departmanı, Prof. Richard Vaughan- Jones Lab., İngiltere (5 ay süre ile) Yardımcı Doçent, Ankara Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Biyofizik Anabilim Dalı, Ankara 4. FARMAKOLOJİ BİLİM UZMANLIĞI TEZİ: Sıçan İzole Akciğerinde İskemi ile Oluşturulan Önkoşullamada Endojen Nitrik Oksit in Rolü, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Ankara (2002). 5. FARMAKOLOJİ DOKTORA TEZİ: İntermedin in Sıçan Pulmoner Vasküler Yatağa Etkilerinin İncelenmesi, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Ankara (2008). 6. PROJELER: Yardımcı araştırmacı olduğu projeler 1. Sıçan izole akciğerinde iskemi ile oluşturulan önkoşullamada nitrik oksit ve potasyum kanallarının rolü: GÜMÜŞEL, Bülent (Doç.Dr.), Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi, Siklooksijenaz-2 inhibitörü bazı yeni 1,5- diarilpirazol türevlerinin sentezi ve farmakolojik olarak değerlendirilmesi: DEMİRDAMAR, Rümeysa (Prof. Dr.), Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi, Sıçan izole akciğerinde iskemi ile oluşturulan önkoşullamanın monoamin oksidaz (MAO) aktivitesi ve MAO-bağımlı hidroksil radikal oluşumuna etkisi: UÇAR Gülberk (Doç. Dr.) Tübitak SBAG-2670 ( ), Antidepresan ve antikonvülzan etkiye sahip yeni pirazolin türevlerinin sentezi: BİLGİN Altan (Prof. Dr.) Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi, Osteoporotik Sıçanlarda İskelet Kasının İşlevsel Analizi ve Atrofiye ait Sinyal Mekanizmalarının İmmunohistoloji ve Moleküler Biyoloji Yöntemleriyle Araştırılması: ZEYBEK Dilara (Öğr.Gör.Dr.) Hacettepe Üniversitesi

65 Bilimsel Araştırmalar Birimi, Kardiyomiyositlerde hücreiçi Na + ve H + homeostazında rol oynayan faktörlerin incelenmesi: TURAN Belma (Prof. Dr.) Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi, 09B Hipoksinin normal ve hiperglisemik HL-1 kardiyomiyositlerrinde Na+/H+ değiştokuşcusu ve Na + - /HCO 3 ko-transportörü aktivite ve ekspresyonu üzerine etkileri: Hücre içi sinyal yolaklarında mirna ve S- nitrolizasyonun rolü: TURAN Belma (Prof. Dr.) TUBİTAK COST 109S267. Yürütücü olduğu projeler 8. Hipoksinin fare HL-1 kardiyomiyositlerinde H + homeostazı üzerindeki hızlı ve uzun süreli etkileri: KANDİLCİ H. Burak (Yrd. Doç. Dr.) Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi 11B ÖDÜLLER: Poster ödülü (XVI. Türk Farmakoloji Derneği Ulusal Kongresi, 2001) 8. BURSLAR: TÜBİTAK Yurt Dışı Araştırma Bursu (2005; 4 ay süreli) Türk Farmakoloji Derneği Bilimsel Etkinlik Destekleme Bursu (2008) İngiliz Farmakoloji Derneği Bilimsel Etkinlik Destekleme Bursu (2009) 9. ÜYELİKLER: TED Ankara Koleji Mezunlar Derneği, 1991 Türk Farmakoloji Derneği (TFD), 1999 Amerikan Fizyoloji Derneği (APS), 2004 İngiliz Farmakoloji Derneği (BPS), YABANCI DİL: İngilizce; Çok iyi (ÜDS 91,25) YAYIN LİSTESİ Science Citation Index-Expanded Kapsamındaki Dergilerde Yer Alan Araştırma Makaleleri 1. Ucar G, Topaloglu E, Kandilci HB, Gumusel B Effect of ischemic 49 preconditioning on reactive oxygen species-mediated ischemia reperfusion injury in the isolated perfused rat lung Clin Biochem 38, , Ucar G, Topaloglu E, Kandilci HB, Gumusel B Elevated semicarbazidesensitive amine oxidase (SSAO) activity in lung with ischemia reperfusion injury: Protective effect of ischemic preconditioning plus SSAO inhibition Life Sciences 78, , Kandilci HB, Gumusel B, Wasserman A, Witriol N, Lippton H "Intermedin/ adrenomedullin-2 dilates the rat pulmonary vascular bed: Dependence on CGRP receptors and nitric oxide release" Peptides 27, , Kandilci HB, Gumusel B, Topaloglu E, Ucar G, Korkusuz P, Ugur Y, Asan E, Demiryurek AT Effects of ischemic preconditioning on rat lung: role of nitric oxide. Exp Lung Res 32, , Kandilci HB, Gümüşel B, Demiryürek AT, Lippton H Preconditioning modulates pulmonary endothelial dysfunction following ischemia-reperfusion injury in the rat lung: Role of potassium channels Life Sci 79: , Özdemir Z, Kandilci HB, Gumusel B, Calis U, Bilgin AA Synthesis and studies on antidepressant and anticonvulsant activities of some 3-(2-furyl)-pyrazoline derivatives Eur J Med Chem 42: , Turan-Zitouni G, Kaplancıklı ZA, Özdemir A, Chevallet P, Kandilci HB, Gumusel B Studies on 1,2,4-triazole derivatives as potential anti-inflammatory agents Arch Pharm (Weinheim) 340: , Kandilci HB, Gumusel B, Lippton H Intermedin/adrenomedullin-2 (IMD/AM2) relaxes rat main pulmonary arterial rings via cgmp-dependent pathway: Role of nitric oxide and large conductance calcium- activated potassium channels (BKCa) Peptides 29: , Özdemir Z, Kandilci HB, Gümüşel B, Çalış Ü, Bilgin AA Synthesis and Studies on Antidepressant and Anticonvulsant Activities of Some 3-(2-Thienyl)- pyrazoline Derivatives Arch Pharm (Weinheim) 341: , 2008.

66 10. Basgut B, Kayki G, Bartosova L, Ozakca I, Seymen A, Kandilci HB, Ugur M, Turan B, Ozcelikay AT Cardioprotective effects of 44Bu, a newly synthesized compound, in rat heart subjected to ischemia/reperfusion injury Eur J Pharmacol 640: , Dagdeviren S, Kandilci HB, Uysal B, Zeybek ND, Korkusuz P, Gümüsel B, Korkusuz F Tumor necrosis factor-alpha antagonist administration recovers skeletal muscle dysfunction in ovariectomized rats J Orthop Res 29: , Kandilci HB, Tuncay E, Zeydanli EN, Sozmen NN, Turan B Age-related regulation of excitation-contraction coupling in rat heart. J Physiol Biochem. 2011;67(3): Zeydanli EN, Kandilci HB, Turan B Doxycycline ameliorates vascular endothelial and contractile dysfunction in the thoracic aorta of diabetic rats Cardiovasc Toxicol. 2011;11(2): TUBİTAK-ULAKBİM Ulusal Veri Tabanlarında Taranan Hakemli Dergilerde Yayınlanmış Makaleler 1. Ucar G, Topaloglu E, Kandilci HB, Gumusel B Increased Monoamine Oxidase Activity of Lung with Ischemia- Reperfusion Injury: Effect of Preconditioning FABAD J. Pharm. Sci., 29, 63-70, Kandilci HB, Gümüşel B Akciğerlerde İskemi-Reperfüzyon Hasarı ve İskemik Önkoşullama Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Dergisi 25(1), 35-49, Gumusel B, Kandilci HB "Androjenler, Anabolik Steroidler ve Antiandrojenik İlaçlar" Türkiye Klinikleri 1(35), , Gümüşel B, Kandilci HB, Uçar G. Protective effect of ischemic preconditioning plus monoamine oxidase (MAO) inhibition on ischemia-reperfusion injury in the rat pulmonary vascular bed Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Dergisi 26 (1), 23-28, Ulusal Dergilerde Yayınlanmış Makaleler 1. İyidoğan P, Özdemir Z, Kandilci HB, Gümüşel B, Çalış Ü, Bilgin AA "Synthesis of some new 1,3,5-Trisubstituted Pyrazolines with Antidepressant and Anticonvulsant Activities" J. Fac. Pharm. Istanbul 38(1), 47-56, Science Citation Index-Expanded Kapsamındaki Dergilerde Yer Alan ve Uluslararası/Ulusal Toplantılarda Sunulan Poster Özetleri 1. Sapçı H, Bozkurt TE, Durlu NT, Kandilci HB, Özsögüt B, Demirdamar R, Akalın K, Mutlugil A. Cost analysis of antihypertensive drug use in Turkey. ISPOR 5 th Annual International Meeting, Arlington, VA, USA, Abstr. No: PCD6, Value in Health, 3 (2), Sapçı H., Bozkurt TE, Durlu NT, Kandilci HB, Özsögüt B, Demirdamar R A preliminary study: the pharmacoeconomic profile of antibiotic use in Turkey. ISPOR 5 th Annual International Meeting, Arlington, VA, USA, Abstr. No: PHV10, Value in Health, 3 (2), Sapçı H, Bozkurt TE, Durlu NT, Kandilci HB, Özsögüt B, Demirdamar R Turkish physicians prescription patterns for hypertension management. ISPOR 3 rd Annual European Conference, Antwerp, Belgium, Abstr. No: PCV19, Value in Health, 3 (5), Kandilci HB, Yıldız G, Korkusuz P, Uğur Y, Aşan E, Demiryürek AT, Gümüşel B Role of nitric oxide in ischemia-induced preconditioning in isolated rat lung Experimental Biology, New Orleans, LA, ABD, Nisan Faseb Journal, 16 (4), A Kandilci HB, Yıldız G, Korkusuz P, Uğur Y, Aşan E, Demiryürek AT, Gümüşel B Does chronic hypoxia mimic ischemic preconditioning in rat isolated lung Experimental Biology, San Diego, ABD, 14 Mart Faseb Journal, 17 (4), A Kandilci HB, Gümüşel B, Demiryürek AT Sarcolemmal K ATP channel mediated protection in ischemia-induced preconditioning in rat isolated lung Experimental Biology, Washington D.C.,

67 ABD, Nisan Faseb Journal 18 (4), A Kandilci HB, Gümüşel B, Wasserman A, Witriol N, Lippton H Intermedin/ adrenomedullin-2 (IMD/AM2) dilates the rat pulmonary vascular bed: Dependence on CGRP receptors and nitric oxide release 15. Dünya Farmakoloji Kongresi, Bejing-Çin, 2-7 Temmuz Acta Pharmacologica Sinica 27, 376, P Kandilci HB, Leem CH, Vaughan-Jones RD Acute anoxia attenuates sodiumhydrogen exchange activity in isolated mammalian ventricular myocytes Experimental Biology, Washington D.C., ABD, 27 Nisan-02 Mayıs FASEB Journal 21 (6), A1281-A Kandilci HB, Gumusel B, Lippton H Intermedin/ adrenomedullin-2 (IMD/AM2) relaxes rat pulmonary arterial rings in a nitric oxide and endothelial dependent manner Experimental Biology, Washington D.C., ABD, 27 Nisan-02 Mayıs FASEB Journal 21 (6), A Kandilci HB, Gumusel B, Lippton H, Witriol N Intermedin/ adrenomedullin-2 (IMD/AM2) relaxes rat pulmonary arterial rings via protein kinase G (PKG) and BKCa channel dependent pathway: The effect of chronic hypoxia induced pulmonary hypertension Experimental Biology, San Diego, CA, ABD, 5-9 Nisan FASEB Journal 22, Kandilci HB, Gumusel B L-NAME augments -adrenoceptor desensitization in isolated rat main pulmonary artery EPHAR, Manchester, İngiltere, Temmuz Fundamental and Clinical Pharmacology 22(2), 77, Abstract No: P Tuncay E, Kandilci HB, Zeydanlı EN, Sozmen NN, Akman D, Yıldırım S, Turan B Phosphorylation of ryanodine receptors plays important role in rat heart function during maturation Frontiers in CardioVascular Biology, Berlin, Almanya, Temmuz Cardiovascular Research 87;S-62 Suppl Turan B, Bilginoglu A, Kandilci HB Intracellular Na + homeostasis in diabetic mammalian cardiomyocytes 49 Experimental Biology 2011, Washington DC, ABD, 9-13 Nisan 2011 Faseb Journal March 17, : Ulusal / Uluslararası Toplantılarda Sunulan Poster Özetleri 1. Yıldız G, Kandilci HB, Demiryürek AT, Gümüşel B Sıçan izole akciğerinde iskemik önkoşullamanın oluşturulması ve sodyum ortovanadat ın iskemi üzerindeki etkisi 16. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kuşadası, Türkiye, 1-5 Ekim 2001, Bildiri No: PY Kandilci HB, Yıldız G, Korkusuz P, Uğur Y, Aşan E, Demiryürek AT, Gümüşel B Does chronic hypoxia mimic ischemic preconditioning in rat isolated lung 17. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Belek- Antalya, Türkiye, Ekim 2003, Bildiri No: P Yıldız G, Kandilci HB, Gümüşel B, Demiryürek AT Ischemic preconditioning in isolated rat lung: Role of adenosine 14. Dünya Farmakoloji Kongresi, San Francisco, CA, ABD, 7-12 Temmuz 2002, Bildiri No: LB Uçar G, Topaloğlu E, Kandilci HB, Gümüşel B Elevated semicarbarbazidesensitive amine oxidase activity in lung with ischemia-reperfusion injury: Protective effect of preconditioning 19. European Workshop on Drug Metabolism, The European Society of Biochemical Pharmacology, Antalya- Türkiye, Ekim 2004, Bildiri No:OP İyidoğan P, Özdemir Z, Kandilci HB, Gümüşel B, Çalış Ü, Bilgin AA Synthesis and Pharmacological Studies on Novel Pyrazoline Derivatives with Antidepressant and Anticonvulsant Activities International Symposium on Medicinal Chemistry Research and Development Kuşadası-Turkey, 2005, Bildiri No: P Özdemir Z, Kandilci HB, Gümüşel B, Çalış Ü, Bilgin AA Studies on 3- Heteroaryl Pyrazoline Derivatives with Antidepressant and Anticonvulsant Activities International Symposium on Medicinal Chemistry Research and Development Kuşadası-Turkey, 2005, Bildiri No: P44.

68 7. Ucar G, Yabanoglu S, Kandilci HB, Gumusel B Protective effect of ischemic preconditioning plus monoamine oxidase (MAO) inhibition on ischemia-reperfusion injury in the rat pulmonary vascular bed 12th Amine Oxidase and Trace Amines Workshop, 8. Uçar G, Topaloğlu E, Kandilci HB, Gümüşel B Altered monoamine oxidase activity of lung with ischemia-reperfusion injury: effect of preconditioning 28. Avrupa Biyokimyasal Toplulukları Federasyonu Toplantısı İstanbul-Türkiye, Ekim Rotterdam Hollanda, 30 Temmuz-3 Ağustos 2006, Bildiri No: P Turan-Zitouni G, Kaplancıklı ZA, Özdemir A, Chevallet P, Kandilci HB, Gumusel Studies on 1,2,4-Triazole Derivatives as Potential Antiinflammatory Agents ChemInform Abstract 13 Şubat 2008, DOI: /chin Dağdeviren S, Kandilci HB, Çetinkaya A, Uysal B, Korkusuz P, Zeybek D, Kocaefe Ç, Gümüşel B, Korkusuz F Functional Analysis of Skeletal Muscles in Postmenapausal Osteoporotic Rat Model and Role of TNF-alpha International Symposium on Biotechnology: Developments and Trends, Ankara, Türkiye, Eylül Başgut B, Kaykı G, Bartosova L, Özakça I, Seymen A, Kandilci HB, Uğur M, Turan B, Özçelikay AT Yeni bir sodyum kanal blokeri 44Bu nun izole sıçan kalbinde iskemi reperfüzyon hasarına karşı koruyucu etkisi 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Manavgat-Antalya, Türkiye, 4-7 Kasım 2009, Bildiri No: P Kandilci HB, Leem CH, Swietach P,Vaughan-Jones RD Hypoxic sensitivity of the sodium-hydrogen exchanger in isolated mammalian ventricular myocytes. The role of intracellular ATP BPS toplantısı, Londra, İngiltere, Aralık pa2 online 2009; 7(4), Bildiri No: Bilginoglu A, Kandilci HB, Turan B Effect of insulin on intracellular Na + homeostasis in isolated cardiomyocytes from diabetic rats 15 th World Congress on Heart Disease, Vancouver BC, Kanada, Temmuz Bildiri No: P Dağdeviren S, Zeybek ND, Korkusuz P, Akpulat U, Yıldız Y, Kandilci HB, Gümüşel B, Korkusuz F Analysis of Skeletal Muscle in Postmenopausal Osteoporotic Animal Model: The role of TNF-alpha" 17. International Microscopy Congress, Rio de Janeiro, Brezilya, Eylül 2010, Bildiri No: L Dagdeviren S, Korkusuz F, Zeybek ND, Korkusuz P, Kocaefe C, Akpulat U, Yildiz Y, Kandilci HB, Uysal B, Gumusel B, TNF-alpha Antagonist Recovers Osteoporotic Skeletal Muscle Function ORS Annual Meeting, Long Beach, California, Ocak , Bildiri No: Yıldırım SS, Zeydanlı EN, Kandilci HB, Turan B Diyabetik makrovasküler bozulmalarda Moleküler Mekanizmalar: Rho kinaz yolağının rolü 23. Ulusal Biyofizik Kongresi, Edirne, Türkiye, Eylül Bildiri No: P-18 Science Citation Index-Expanded Kapsamındaki Dergilerde Yer Alan ve Ulusal Toplantılarda Sunulan Sözel Bildiriler 1. Dağdeviren S, Kandilci HB, Çetinkaya A, Uysal B, Korkusuz P, Zeybek D, Kocaefe Ç, Gümüsel B, Korkusuz F. Postmenapozal osteoporotik hayvan modelinde iskelet kasının fonksiyonel analizi ve TNF-alfanın rolü XXI Ulusal Türk Ortopedi ve Travmatoloji Kongresi, İzmir, Türkiye, 3-7 Kasım Acta Orthopaedica et Traumatologica Turcica 2009;43 (Supp-I):40-41, Sözel Sunum No: S-120. Ulusal/Uluslararası Toplantılarda Sunulan Sözel Bildiriler 1. Kandilci HB, Korkusuz P, Uğur Y, Gumusel B, Aşan E. Sıçan izole akciğerinde iskemi ile oluşturulan önkoşullamada endojen nitrik oksit in rolü 16. Ulusal Elektron Mikroskopi Kongresi, İzmir, 2-5 Eylül 2003, Sözel Sunum No:S Kandilci HB, Gumusel B. İntermedin/ adrenomedullin-2 (IMD/AM2) sıçan ana 49

69 pulmoner arter halkalarında endotele bağımlı, protein kinaz G ve Ca +2 ile aktive olan büyük kondüktanslı K + kanalı aracılı gevşeme oluşturmakta 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Trabzon, Ekim 2007, Sözel Sunum No: S Dağdeviren S, Zeybek D, Korkusuz P, Kocaefe Ç, Akpulat U, Yıldız Y, Kandilci HB, Uysal B, Gümüşel B, Korkusuz F Postmenopozal Osteoporptik Hayvan Modelinde İskelet Kasının Değerlendirilmesi: TNF-α nın Rolü X. Ulusal Histoloji-Embriyoloji Kongresi, İzmir, Mayıs 2010, Sözel Sunum No: S Yıldırım SS, Kandilci HB, Zeydanlı EN, Turan B. Memeli kardiyomiyositlerinde sodyum-hidrojen değiş-tokuşcusunun hipoksiye olan duyarlılığı: Mikro RNA ların rolünün incelenmesi 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Eskişehir, Ekim 2011, Sözel Sunum No:S Yıldırım SS, Kandilci HB, Turan B MicroRNAs as Diagnostic and Therapeutic Tool in Cardiovascular Pathologies XVIIth International Symposium on Biomedical Science and Technology, Ankara, Turkey, November Bildiri No: O-18 Kitap Bölümü Çevirisi 1. Gümüşel B, Kandilci HB, Akın D. Membran Taşıyıcıları ve İlaç Yanıtı, Goodman and Gilman Tedavinin Farmakolojik Temeli, Editörler: L.L. Brunton, J.S. Lazo, K.L. Parker; Çeviri Editörü: Öner Süzer, 2009 Nobel Tıp Kitabevi NOTLAR * * * * *

70 DOCA-Tuz ile Oluşturulan Hipertansiyona Sitokrom P450 1B1 in Katkısı Seyhan ŞAHAN FIRAT Mersin Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı, Mersin GİRİŞ VE AMAÇ Hipertansiyon, sistemik arteriyel kan basıncının devamlı olarak yüksek olması ile belirgin bir kalp-damar hastalığıdır. Zamanla, özellikle kalp, böbrek ve damarlar gibi yaşamsal önem taşıyan birçok doku ve organda komplikasyonlara yol açması ve toplumda oldukça sık görülmesi açısından önemli bir klinik sorun olarak kabul edilmektedir. Deoksikortikosteronasetat (DOCA)-tuz ile oluşturulan hipertansiyon modelinde, bir aldosteron analoğu olan DOCA ve içme suyuna %1 oranında NaCl eklenerek hipertansiyon oluşturulmaktadır. Anjiyotensin II den bağımsız hipertansiyon olarak da adlandırılan bu hipertansiyon modeli, su ve tuz geri emiliminde artışa neden olmakta ve buna bağlı olarak plazma hacminde artış, renin salgılanmasında ve anjiyotensin II düzeylerinde azalmaya neden olmaktadır. Bununla birlikte, katekolaminler, vazopresin ve endotelin 1 (ET-1) gibi birçok vazoaktif madde DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonun gelişimine katkıda bulunmaktadır (Crofton ve ark., 1979; de Champlain ve ark., 1987; Drolet ve ark., 1989; Schiffrin ve ark., 1995). Bu maddeler arakidonik asit (AA) salıverilmesinde artışa neden olarak, sitokrom (CYP) P450 aracılıklı metabolitlerin oluşumuna ve DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon gelişimine katkıda bulunmaktadır (Muthalif ve ark., 2000). AA metabolitleri, kalp-damar homeostazının sağlanması, nörotransmisyonun düzenlenmesi, üreme, alerjik yanıtların oluşması, astım, enflamasyon, damar endotel hücreleri ve damar düz kas hücrelerinin göçü, çoğalması, anjiyojenez, kanser ve hipertansiyon gibi birçok fizyolojik ve patofizyolojik olayda önemli bir rol oynamaktadır (Malik ve ark., 2011). Anjiyotensin II, norepinefrin (NE), vazopresin ve ET-1 gibi birçok vazoaktif etkili amaddejan sitozolik fosfolipaz A 2 (sfla 2 ) yi etkinleştirerek membranda bulunan fosfolipitlerden AA salıverilmesine neden olmaktadır. Hipertansiyona neden olan 68 (prohipertansif) ve hipertansiyonu önleyici (antihipertansif) etkileri olan AA metabolitleri arasındaki denge kan basıncının düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır (Fatima ve ark., 2004). sfla 2 nin etkinleşmesi sonucunda, fosfolipitlerden salıverilen AA, siklooksijenaz (COX) enzimleri aracılığıyla prostaglandinler (PG) ve tromboksan A 2 (TXA 2 ); lipooksijenaz (LO) enzimleri aracılığıyla lökotrienler ve -5, -12 ve -15 hidroksieikozatetraenoik asit (HETE); CYP enzimleri aracılığıyla epoksieikozatrienoik asitler (EET) ile 12-, 19- ve 20- HETE ye dönüştürülmektedir. COX enzimleri aracılığıyla oluşan (PG)E 2 ve I 2 ile CYP450 enzimleri aracılığıyla oluşan EET ler damarları genişletmekte, NE ve anjiyotensin II gibi maddelere karşı oluşan vasküler reaktiviteyi azaltmakta, diürez ve natriürezi artırmakta ve böylece antihipertansif mekanizmalara katkıda bulunmaktadır (Imig ve Hammock, 2009; McGiff, 1981; Roman, 2002). Tersine, COX ler aracılığıyla oluşan PG endoperoksit (PGH 2 ), LO lar aracılığıyla oluşan 12-HETE ve CYP aracılığıyla oluşan 20-HETE damarları daraltmakta ve damar düz kas hücreleri (DDKH) de hiperplazi ve/veya hipertrofiye neden olarak prohipertansif etki göstermektedir (Sasaki ve ark., 1997; Nasjletti, 1998; Sacerdoti ve ark., 1989; Omata ve ark., 1992; Roman ve ark., 1993). 12-HETE ve 20-HETE nin, DDKH göçü, çoğalması ve hipertrofisini ekstraselüler sinyal ile düzenlenen kinaz (ERK) 1/2 ve p38 mitojen ile etkinleştirilen protein kinaz (MAPK) yi etkinleştirerek de artırdığı (Nakao ve ark., 1982; Reddy ve ark., 2002; Natarajan ve ark., 1994; Uddin ve ark., 1998; Stec ve ark., 2007) ve anjiyotensin II nin damar daraltıcı etkisine katkıda bulunduğu gösterilmiştir (Alonso-Galicia ve ark., 2002). AA metabolitlerinden CYP2C aracılığıyla oluşan EET lerin kan damarlarını genişlettiği ve antihipertansif etki gösterdiği bilinmektedir (Capdevila ve ark., 2000). CYP4A1, CYP4A2, CYP4F enzimleri aracılığıyla oluşan AA metaboliti, 20-HETE kan damarlarını daraltıcı (Miyata ve Roman,

71 2005) etkisinin yanında, anjiyotensin II nin böbrek damarlarını daraltıcı etkisine aracılık etmekte (Alonso-Galicia ve ark., 2002), kendiliğinden hipertansif olan sıçan (SHR) de vasküler reaktiviteyi artırmakta (Zhang ve ark., 2001), SHR de hipertansiyon gelişimine (Sacerdoti ve ark., 1989; Omata ve ark., 1992; Su ve ark., 1998) ve normotansif sıçanlarda anjiyotensin II ve DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyona katkıda bulunmaktadır (Alonso-Galicia ve ark., 2002; Zhang ve ark., 2001; Sacerdoti ve ark., 1989). AA metabolizmasının aynı zamanda reaktif oksijen türleri (ROT) nin oluşumunu ve AA metaboliti 20-HETE nin ROT üretimini uyardığı gösterilmiştir (Medhora ve ark., 2008; Smith ve Weidemann, 1980). ROT nin DDKH de p38 MAPK etkinleşmesinde rol oynadığı bildirilmiştir (Touyz ve ark., 2003; Viedt ve ark., 2000). Bununla birlikte, DOCAtuz modelini de içeren birçok hipertansiyon modelinde üretimi artan ROT, endotel işlev bozukluğu ve hipertansiyon gelişimine katkıda bulunmaktadır (Bao ve ark., 2007; Hong ve ark., 2001; Landmesser ve ark., 2003; Sánchez ve ark., 2006). AA metabolitlerinin oluşumunda COX, LO ve CYP4A enzimleri dışında diğer CYP enzimlerinin de rol oynadığı gösterilmiştir (Roman, 2002). Zenobiyotikleri metabolize eden CYP1 enzimleri aynı zamanda yağ asitlerini de metabolize edebilmektedir (Choudhary, 2004). CYP1A1 ve CYP1B1 enzimleri birçok kardiyovasküler dokuda eksprese edilmektedir (Korashy ve El-Kadi, 2006) CYP1B1 DDKH de yüksek miktarda, endotel hücrelerinde ise düşük oranda eksprese olmaktadır (Zhao ve ark., 1998). CYP1B1, anjiyotensin II nin ROT oluşumuna bağlı olarak neden olduğu DDKH göçü, çoğalması ve hipertrofisine de aracılık etmektedir (Yaghini ve ark., 2010). CYP1B1, AA yı 5-, 12- ve 15-HETE yi içeren orta zincire (mid-chain) ve 20-HETE gibi HETE moleküllerine metabolize etmektedir (Choudhary ve ark., 2004) ve CYP1B1 sirna sı DDKH de 5- ve 12-HETE oluşumunu azaltmaktadır. Bu bilgiler ışığında CYP1B1 aracılığıyla oluşan AA metabolitlerinin ve/veya ROT nin DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon gelişimine katkıda bulunabileceği olasıdır. Bu metinde sunulan bilgiler, CYP1B1 in DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyona ve 69 ilişkili patofizyolojik olaylara katkıda bulunup bulunmadığı ve oluşan hipertansiyonun olası mekanizmasının aydınlatılmasına yönelik araştırma sonuçlarımızı kapsamaktadır. GEREÇ VE YÖNTEM Deney hayvanları ve DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon modeli Deneylerde 12 saat aydınlık 12 saat karanlık periyodunda senkronize edilen erkek Sprague-Dawley sıçanlar ( g) kullanılmıştır. Sıçanlara uygulanan deneysel protokoller yerel etik komite tarafından onaylanmıştır. Çalışmada dört deney grubu oluşturulmuştur. Tüm sıçanlara unilateral nefrektomi (UNX) yapılmıştır. Sıçanlar ketamin (60 mg/kg, i.p.) ve ksilazin (5 mg/kg, i.p.) ile anestezi edildikten sonra karnın sol bölgesinde 2 cm uzunluğunda ensizyon yapılmış, sol renal arter ve ven ligatüre edilerek sol böbrek uzaklaştırılmıştır. DOCAtuz grubundaki sıçanlara hipertansiyon oluşturmak amacıyla 6 hafta boyunca DOCA nın susam yağı ile hazırlanan süspansiyonu (30 mg/kg/hafta, 0.2 ml) deri altı yoluyla enjekte edilmiş ve %1 NaCl ile %0.1 KCl içme suyuna katılarak verilmiştir. CYP1B1 in DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyondaki katkısını araştırmak amacıyla seçici CYP1B1 inhibitörü TMS (300 µg/kg, i.p.) sıçanların kan basınçlarında anlamlı bir değişikliğin izlenmeye başlandığı dördüncü haftadan başlayarak her üç günde bir uygulanmış ve sıçanların her hafta ortalama arter basınçları (OAB) tail-cuff yöntemi ile ölçülmüştür. CYP1B1 etkinliğinin ölçülmesi TMS nin CYP1B1 üzerindeki etkisini göstermek amacıyla P450-Glo Assay Kit (Promega, Madison, WI, ABD) kullanılmıştır. Altı hafta boyunca uygulanan deney protokolünün ardından sıçanlar, ketamin (60 mg/kg, i.p.) ve ksilazin (5 mg/kg, i.p.) ile anestezi edildikten sonra, sol ventriküle kesi atılarak, dolaşımdaki kan soğuk NaCl ile 3 dakika perfüze edilmiştir. Kalp, böbrek ve torasik aort izole edilerek, çevre dokularından uzaklaştırılmış, sıvı nitrojende hızla dondurularak etkinlik ölçümü yapılana kadar -80 C de saklanmıştır. Dokular sıvı nitrojende toz haline getirilerek 0.1 mmol/l soğuk potasyum fosfat çüzeltisi (ph 7.4) ile

72 homojenize edilmiştir. Elde edilen süpernatantlarda Bradford yöntemi ile protein miktar tayini yapıldıktan sonra, 20 µmol/l lucipherin 6 -chloroethyl ether substratı ile 0.1 mmol/l potasyum fosfat çözeltisi (ph 7.4) içeren reaksiyon karışımı her biri 500 µg protein içeren örneklere katılarak 37 C de 10 dakika inkübe edilmiştir. İnkübasyonun ardından reaksiyon karışımına NADPH eklenerek, 37 C de 45 dakika yeniden inkübe edilmiştir. İnkübasyonun ardından örneklere 1:1 oranında luciferin detection reagent (LDR) eklenmiş, 10 saniye süre ile karıştırılmış oda ısısında 20 dakika lüminesans sinyalini stabilize etmek amacıyla inkübe edilmiştir. Elde edilen lüminesans luminometre ile ölçülmüştür. Ekzojen TMS nin CYP1B1 etkinliği üzerindeki etkisini belirlemek amacıyla reaksiyon karışımı eklenmeden önce, örnekler 6 µm TMS ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilmiş ve reaksiyon karışımı eklenerek yukarıda anlatılan deney prosedürü aynı biçimde uygulanmıştır. Kalp hipertrofisi: Kalp ağırlığı/vücut ağırlığı oranı ve beyin natriüretik peptit (BNP) mrna ekpresyonunun ölçülmesi Kalp ağırlığı/vücut ağırlığı oranı: Altı hafta sonunda deney protokolünün tamamlanmasının ardından, sıçanlar anestezi edilmiş, sol ventriküle kesi atılarak soğuk NaCl ile kan 3 dakika perfüze edilmiştir. Kalp hızla uzaklaştırılarak ağırlığı ölçülmüş ve sol ventrikül hızla sıvı nitrojende dondurulmuştur. Kalp ağırlığı/vücut ağırlığı (heart weight/ body weight; HW/BW) oranı kalp hipertrofisinin göstergesi olarak ölçülmüştür. BNP mrna ekpresyonunun ölçülmesi: Sol ventrikül homojenatlarından total RNA RNeasy Mini Kit kullanılarak (QIAGEN, Valencia, CA, ABD) izole edilmiştir. İzole edilen RNA dan ters transkripsiyon ile cdna eldesi için Transcriptor First Strand cdna Synthesis Kit (Roche, Indianapolis, IN, ABD) kullanılmıştır. Kantitatif real-time PCR (Q- RT-PCR) LightCycler (LC) 480 (Roche) cihazı kullanılarak aşağıdaki koşullarda gerçekleştirilmiştir: 95ºC de 5 dakika etkinleştirme, 45 döngü: 95ºC de 10 saniye, 60ºC de 60 saniye ve 72ºC de 10 saniye, +4ºC de saklama. Altı faklı endojen kontrol geni (housekeeping 70 gene) test edilerek BNP için kontrol geni olarak β-tübülin seçilmiştir. BNP ve β-tübülin için UPL (universal probe library) ye ait primer ve ilgili prob dizilimleri Tablo 1 de gösterilmiştir. Tüm örnekler üç kez analiz edilerek, BNP geninin göreceli mrna düzeyi kontrol geninin mrna düzeyine oranlanarak normalize edilmiştir. BNP mrna ekpresyonu ölçümü ΔΔCt yöntemi kullanılarak yapılmıştır. Tablo 1. Primer ve hibridizasyon prob dizileri. BNP, beyin natriüretik peptit; UPL, universal probe library; bp, baz çifti. Vasküler reaktivite, media/lümen oranı ve endotel işlevinin ölçülmesi Vasküler reaktivite: Altı hafta sonunda, deneylerin tamamlanmasının ardından sıçanlardan izole edilen torasik aort ve süperiyor mezenterik arterler çevre dokularından temizlenerek ~2 mm uzunluğunda hazırlanan arter halkaları izometrik gerimdeki değişiklikleri ölçmek amacıyla ince tel miyograf cihazına yerleştirilmiştir. Miyograf sistemine yerleştirilen izole arterler %95 O 2 -%5 CO 2 karışımı ile havalandırılmış Krebs çözeltisi içerisinde, 37 C de 30 dakika süre ile dengelenmeye bırakılmıştır. Dengelenme süresi boyunca banyolardaki Krebs çözeltisi her 10 dakika da bir değiştirilmiştir. Dengelenmenin ardından, arterler KCl (60 mmol/l) ile önceden kastırılmış ve Krebs çözeltisi ile üç kez yıkanmıştır. fenilefrin (10-9 mmol/l-10-5 mmol/l) ve ET-1 ( mmol/l) ile oluşturulan kümülatif derişimyanıt eğrileri elde edilmiştir. Media-lümen oranı: Anestezi sonrası izole edilen torasik aort ve süperiyor mezenterik arterler çevre dokularından temizlenerek elde edilen arter kesitleri %10 luk formalin içerisinde bir gece bekletilmiş, etanol ve ksilen (1 saat) ile dehidrate edilerek parafin içerisine gömülmüştür. Parafin içerisine

73 gömülen arter kesitleri mikrotom ile 5 µm lik parçalara kesilerek hemotoksilen ve eozin ile boyanmıştır. Örnekler invert mikroskop kullanılarak görüntülenmiş ve dijital kamera kullanılarak fotoğraflandırılmıştır. Media kalınlığı ve lümen çapı ImageJ 1.42 ( National Institutes of Health) programı kullanılarak ölçülmüş ve media-lümen oranı belirlenmiştir. Endotele bağımlı ve endotelden bağımsız damar gevşemesi: Sıçanlardan izole edilen torasik aort ve süperiyor mezenterik arterler fenilefrin (10-5 mmol/l) ile kastırıldıktan sonra asetilkolin ( mmol/l) ye karşı oluşan gevşeme yanıtları incelenmiştir. Endotel kaynaklı hiperpolarizan faktörün (Endothelium derived hyperpolarizing factor; EDHF) gevşemedeki katkısı indometasin (10-5 mmol/l) ve N(G)-nitro-L-arjinin metil ester (L-NAME) (10-4 mmol/l) varlığında araştırılmıştır. İndometasin ve L-NAME, sırasıyla vazoaktif prostanoitler ve nitrik oksitin etkisini dışlamak amacıyla, arterlerin fenilefrin ile önkastırma yapılmadan 10 dakika önce banyolara eklenmiştir. Böbrek hipertrofisi ve işlevlerindeki değişikliklerin belirlenmesi Böbrek hipertrofisinin bir göstergesi olarak böbrek ağırlığı/vücut ağırlığı (kidney weight/body weight; KW/BW) göstergesi olarak ölçülmüştür. Böbrek işlevlerinin belirlenmesi amacıyla idrar çıkışı, ozmolitesi, protein içeriği, Na + ve K + derişimleri, kan üre nitrojen (blood urea nitrogen; BUN) düzeyi, serum ve idrar kreatinin düzeyleri ve kreatinin klirensi ölçülmüştür. İdrar örneklerinin toplanması amacıyla, sıçanlar 24 saat boyunca metabolik kafeslerde barındırılmıştır. Deney sonunda 3 dakika süre ile kanın perfüzyonunun ardından böbrek izole edilmiş ve ağırlığı ölçülmüştür. İdrar hacmi ölçülmüş ve osmometre ile osmalaritesi belirlenmiş ve Bradford yöntemi ile protein miktar tayini yapılarak flame fotometer (Instrumentation Laboratory, Inc., Lexington, MA; model 443) kullanılarak Na + ve K + derişimleri ölçülmüştür. Glomerüler filtrasyon hızının (glomerular fitration rate; GFR) göstergesi olan kreatinin klirensinin belirlenmesi amacıyla serum ve idrar örneklerinde kreatinin ölçümü QuantiChrom Creatinine Assay Kit (BioAssay Systems, Hayward, CA) ve BUN ölçümü QuantiChrom Urea Assay Kit 71 (BioAssay Systems, Hayward, CA) kullanılarak yapılmıştır. 12- ve 20-HETE metabolitlerinin plazma düzeylerinin ölçülmesi 12-HETE ve 20-HETE plazma düzeylerinin ölçülmesi amacıyla sırasıyla 12(S)-HETE ELISA Kit (Abnova Corporation, Taipei, Taiwan) ve 20-HETE ELISA Kit (Detroit R&D, Inc., Detroit, MI) kullanılmıştır. Vasküler süperoksit oluşumunun ölçülmesi Torasik aort kesitleri dihidroetidiyum (DHE) ile boyanarak süperoksit oluşumu gösterilmiştir. Taze hazırlanan aort örnekleri Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) çözeltisi içerisine gömülerek -80 C de dondurulmuştur. Donmuş doku kesitleri kriyostat cihazı ile 30 µm kalınlığında kesitlere ayrılmıştır ve cam slayt üzerine yerleştirilmiştir. Kesitler 30 dakika süre ile 37 C de fosfat tamponu in PBS solüsyonu içerisinde dengelenerek DHE (2 µm) doku kesitlerine uygulanmıştır. Daha sonra kesitler 30 dakika süre ile 37 C de nemli ortamda inkübe edilmiş (light-protected humidified chamber) fosfat tamponu ile yıkanmış ve oluşan floresans invert mikroskop ile görüntülenmiştir. Görüntüler dijital kamera ile fotoğraflandırılmıştır ve floresans ölçümü ImageJ 1.42 programı kullanılarak yapılmıştır. Floresans ölçümleri üç farklı bölgenin ortalaması alınarak yapılmıştır ve UNX kontrol grubu değerlerine oranlanarak normalize edilmiştir. Dihidroksietidyum ve 2-hidroksietidyum düzeylerinin yüksek performanslı sıvı kromotogtrafisi yöntemi ile ölçülmesi Vasküler süperoksit oluşumunun ölçülmesi amacıyla dihidroksietidyum (DHE) nin oksidasyonu sonucu oluşan 2- hidroksietidyum (2-OHE) düzeyi yüksek performanslı sıvı kromotogtrafisi yöntemi ile bir florasans dedektör kullanılarak ölçülmüştür. Dondurulmuş aort halkaları 50 µmol/l DHE ve 100 µmol/l NADPH içeren Krebs çözeltisi içerisinde 37ºC de 15 dakika inkübe edilmiştir. Arterler yıkandıktan sonra Krebs çözeltisi içerisinde 1 saat daha inkübe edilerek 300 µl soğuk metanol içerisinde homojenize edilmiş, yüksek performanslı sıvı kromotografisi sistemi kullanılarak DHE nin 2-OHE ye ayrıştırılması sağlanmıştır. 2-OHE

74 üretimi 580 ve 480 nm de ölçülen florasans ışıma ile belirlenmiştir. NADPH oksidaz etkinliğinin ölçülmesi NADPH oksidaz etkinliği lusigenin ile artırılmış kemilüminesans ölçümü ile belirlenmiştir. Kalp, böbrek ve aort dokuları izole edildikten sonra çevre dokulardan temizlenerek sıvı nitrojende dondurulmuştur. Dondurulan dokular toz haline getirilerek lizis çözeltisinde homojenize edilmiş, sonikasyonun ardından, örneklerde Bradford yöntemi ile protein miktarı ölçülmüş ve örneklere 1:1 oranda 5 µmol/l lusigenin ile 100 µmol/l NADPH içeren reaksiyon çözeltisi eklenmiştir. Elde edilen lüminesans, luminometre cihazı kullanılarak ölçülmüştür. Yöntemi doğrulamak amacıyla reaksiyon NADPH oksidaz inhibitörü aposinin (100 µmol/l) varlığında da gerçekleştirilmiştir. Western blot analizi Kalp, böbrek ve torasik aort izole edilerek, çevre dokulardan uzaklaştırılıp, sıvı nitrojende dondurulduktan sonra toz haline getirilerek lizis çözeltisinde (%1 IGEPAL CA- 630, 25 mmol/l HEPES (ph 7.5), 50 mmol/l NaCl, 50 mmol/l NaF, 1 mmol/l Na 3 VO 4, 1 mmol/l fenilmetilsülfonil florit, 10 µg/ml aprotinin ve 10 µg/ml löpeptin) homojenize edilmiş, Bradford yöntemi ile protein miktar tayinleri yapılmıştır. Her bir örnekten eşit miktarda protein (30-60 µg) SDSpoliakrilamit jele yüklenmiş ve elektroforezle jelde ayrılan proteinler nitroselüloz membrana transfer edilmiştir. Membranlar, %5 lik yağsız süt tozu içeren TBST çözeltisi içinde oda sıcaklığında 2 saat bloke edildikten sonra, 1:300-1:10,000 dilüsyonlarda kullanılan ilgili primer antikorlar ile +4 C de inkübe edilmiştir. İnkübasyonun ardından membranlar 1:1000-1:1500 dilüsyonlarda kullanılan primer antikorlara özgü sekonder antikorlar ile oda sıcaklığında 2 saat inkübe edilmiştir. Antikorlara bağlanma, kemilüminesans yöntemi ile tespit edilmiş ve bantların dansiteleri Image J 1.42 programı ile ölçülmüştür. Kontrol için anti-βaktin antikoru kullanılmıştır. İstatistiksel analiz Veriler ortalama±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir. Kullanılan sıçan sayısı n ile ifade edilmiştir. Her bir değişken için gruplar arası karşılaştırmalarda tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve post-hoc 72 Newman-Keuls çoklu karşılaştırmalar testi, iki grup olduğunda Student s t-testi kullanılmıştır. İstatistiksel olarak 0.05 ten küçük değerler anlamlı kabul edilmiştir. BULGULAR TMS sıçanlarda DOCA-tuz ile oluşturulan kan basıncı artışını geri çevirmektedir. UNX sıçanlara 6 hafta boyunca uygulanan DOCA-tuz ortalama arter basıncını (OAB) 95 ± 1 mmhg dan 154 ± 1 mmhg ya anlamlı olarak yükseltmiştir. TMS (300 µg/kg, i.p.) tek başına OAB de herhangi bir etkiye neden olmazken (96 ± 1 mmhg), DOCA-tuz un neden olduğu kan basıncı artışını (154 ± 1 mmhg) anlamlı olarak geri çevirmiştir (96 ± 1 mmhg) (Şekil 1). Şekil 1. Sıçanlarda DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon modelinde ortalama arter basıncı üzerine TMS in etkisi. Sonuçlar ortalama ±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=5). * ve sırasıyla UNX ve DOCA-tuz tek başına grubu değerlerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05). TMS aort, kalp ve böbrekte CYP1B1 etkinliğini azaltmakta, ekspresyonunu değiştirmemektedir. TMS aort (Şekil 2A), kalp (Şekil 2B) ve böbrekte (Şekil 2C) CYP1B1 etkinliğinde anlamlı bir azalmaya neden olmuştur. DOCA-tuz uygulaması CYP1B1 etkinliğini değiştirmezken, DOCA-tuz ile TMS birlikte uygulanan grupta DOCA-tuz grubuna göre anlamlı bir azalmaya neden olmuştur (Şekil 2A, 2B ve 2C). TMS uygulaması aort, kalp ve böbrekte CYP1B1 ekspresyonunda herhangi bir değişikliğe neden olmamıştır (Şekil 2D, 2E ve 2F). Dokuların TMS ile eksojen olarak inkübasyonu tüm gruplarda CYP1B1 etkinliğini ileri düzeyde önlemiştir (Şekil 2A, 2B ve 2C).

75 Şekil 2. Sıçan (2A) aort, (2B) kalp ve (2C) böbrek dokularında CYP1B1 etkinliği ve CYP1B1 ekspresyonu (2D, 2E ve 2F) üzerine DOCA-tuz ve TMS nin etkisi. Sonuçlar ortalama ± ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=4). UNX kontrol grubu değerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05), DOCA-tuz tek başına grubu değerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05) ve E.T grubu kendi kontrol grubundan anlamlı olarak farklı (P < 0.05) TMS DOCA-tuz ile oluşturulan kalp hipertrofisini azaltmaktadır. Kalp hipertrofisinin bir göstergesi olarak ölçülen HW/BW, DOCA-tuz uygulanmış sıçanlarda UNX kontrol grubuna göre anlamlı bir artış gözlenmiştir. Bu artış TMS uygulaması ile anlamlı olarak geri çevrilmiştir. Kalp hipertrofisinin bir başka göstergesi olan BNP (B-type natriuretic peptide) mrna ekspresyonu da DOCA-tuz uygulanan grupta anlamlı bir artış göstermiş, bu artış TMS uygulaması ile anlamlı olarak geri çevrilmiştir. TMS tek başına grubunda herhangi bir etki gözlenmemiştir (Tablo 2). 73

76 Tablo 2. DOCA-tuz ile oluşturulan kalp hipertrofisi üzerinde TMS nin etkisi. Sonuçlar ortalama±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=5). UNX, uninefrektomize kontrol grubu; BNP, brain natriüretik peptit. * ve sırasıyla UNX ve DOCA-tuz tek başına grupları değerlerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05). TMS sıçanlarda DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda artan vasküler reaktiviteyi, damar düz kas hipertrofisini ve endotel işlev bozukluğunu önlemektedir. DOCA-tuz uygulanmış sıçanların (Şekil 3A) aort ve (Şekil 3B) mezenter arterlerinde fenilefrin ve ET-1 e karşı oluşan kasılma yanıtları UNX kontrol grubuna göre anlamlı olarak artış göstermiştir. DOCA-tuz grubuna göre fenilefrin ve ET-1 e karşı oluşan vasküler reaktivitedeki bu artışlar TMS uygulaması ile geri çevrilmiştir. TMS tek başına grubunda bu maddelere karşı vasküler reaktivitede herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir (Şekil 3A ve 3B). Vasküler reaktivitede gözlenen artışa ilişkili olarak DOCA-tuz uygulanan sıçanlarda media-lümen oranında anlamlı bir artış gözlenmiş, bu artış TMS tarafından geri çevrilmiştir (Tablo 3). TMS DOCA-tuz ile oluşturulan böbrek hipertrofisini ve böbrek işlev Tablo 3. DOCA-tuz ile oluşturulan media/lümen oranındaki artış bozukluğunu azaltmaktadır. üzerinde TMS nin etkisi. Sonuçlar ortalama ± ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=5). * ve sırasıyla UNX ve DOCA-tuz tek başına grupları değerlerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05). DOCA-tuz uygulanmış sıçanların fenilefrin ile ön kastırma yapılan (Şekil 4A) aort ve (Şekil 4B) mezenter arter dokularında asetilkoline karşı oluşan gevşeme yanıtlarında anlamlı 74 bir azalma gözlenmiştir. TMS, DOCA-tuz uygulanması sonucu oluşan torasik aort ve mezenterik arterdeki bu azalmayı anlamlı olarak önlemiştir (Şekil 4A ve 4B). DOCAtuz grubuna ait mezenter arterlerde İndometasin ve L-NAME varlığında asetilkoline karşı oluşan gevşeme yanıtlarında, UNX kontrol grubundakilere göre anlamlı bir azalma gözlenmiştir (Şekil 4C). TMS uygulaması ile bu azalma anlamlı olarak geri çevrilmiştir. Damar düz kas hücrelerine bağlı gevşeme yanıtlarına neden olan sodyum nitroprusit (SNP) uygulamasının torasik aort (Şekil 3D) ya da mezenter arterlerdeki (Şekil 3E) hiçbir uygulama grubu üzerinde etkisi gözlenmemiştir. TMS tek başına herhangi etki göstermemiştir (4A, 4B ve 4C). DOCA-tuz uygulanması sonucunda böbrek hipertrofisinin bir göstergesi olarak kabul edilen böbrek ağırlığı/vücut ağırlığı (kidney weight/body weight-kw/bw) oranında anlamlı bir artış gözlenmiştir. Bu artış TMS uygulaması sonucunda geri çevrilmiştir. DOCA-tuz uygulanan sıçanlarda idrar çıkışı, idrarda protein ve K + düzeyleri ile BUN ve serum kreatinin derişimleri artarken, idrar osmolalitesi, NA + derişimi ve kreatinin klirensi anlamlı olarak azalma göstermiştir. Bu parametrelerdeki değişiklikler TMS ile en aza indirilmiştir. TMS tek başına herhangi etki göstermemiştir (Tablo 4).

77 Şekil 3. Sıçan torasik aort (A) ve mezenter arterlerinde (B) fenilefrine (PE; mmol/l); torasik aort (C) ve mezenter arterlerinde (D) endoteline (ET-1; mmol/l) karşı oluşan kasılma yanıtları üzerine DOCA-tuz ve TMS in etkisi (n=5). * ve sırasıyla UNX kontrol ve DOCA-tuz tek başına grupları değerlerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05 ). TMS DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda 12- ve 20-HETE düzeylerini değiştirmemektedir. Çalışmamızda, DOCA-tuz uygulanan sıçanların plazma 12- ve 20- HETE düzeylerinde herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir. TMS tek başına uygulandığı ya da DOCA-tuz uygulanan grupta bu eikozanoitler üzerinde bir etki oluşturmamıştır (Tablo 5). DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda, TMS vasküler süperoksit oluşumu, NADPH etkinliği ve NOX-1 protein ekspresyonlarındaki artışı önlemekte, NOX-4 ekspresyonunu değiştirmemektedir. DHE floresan boyama yöntemi ile belirlenen ROT üretimi DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon grubunda artış göstermiştir. TMS DOCA-tuz grubunda gözlenen ROT üretimindeki bu artışı anlamlı olarak geri çevirmiştir. TMS tek başına uygulanan grupta herhangi bir etki gözlenmemiştir (Şekil 5A). DHE floresan boyama yöntemi ile belirlenen ROT üretimini doğrulamak amacı ile süperoksit oluşumunun spesifik bir göstergesi olan 2-OHE düzeyleri DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda anlamlı bir artış gösterirken, bu artış TMS uygulaması ile önlenmiştir (Şekil 5B). 75

78 Tablo 4. DOCA-tuz ile oluşturulan böbrek hipertrofisi ve böbrek işlevleri üzerinde TMS nin etkisi. Sonuçlar ortalama±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=5). UNX, uninefrektomize kontrol grubu; BUN, kandaki üre düzeyi (blood urea nitrogen). * ve sırasıyla UNX ve DOCA-tuz tek başına grupları değerlerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05). Tablo 5. DOCA-tuz ya da TMS uygulamasının plazma 12- ve 20-HETE düzeyleri üzerindeki etkisi. Sonuçlar ortalama±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=5). UNX, uninefrektomize kontrol grubu; HETE, hidroksieikozatetraenoik asit. 76

79 Şekil 4. Sıçan (A) torasik aort ve (B) mezenterik arterlerinde fenilefrin (PE; 10-5 mmol/l) ile oluşturulan ön kasılmanın ardından kümülatif asetilkolin (Ak; 10-9 mmol/l-10-5 mmol/l) uygulamaları ile oluşturulan gevşeme yanıtları üzerine; (C) mezenterik arterlerinde indometasin (10-5 mmol/l) ve N(G)-nitro-L-arginine methyl ester (L- NAME) (10-4 mmol/l) varlığında kümülatif asetilkolin ( mmol/l) uygulamaları ile oluşturulan gevşeme yanıtları; (A) torasik aort ve (B) mezenterik arterlerinde, sodyum nitroprussid (SNP; mmol/l) uygulamasının gevşeme yanıtları üzerine ve bu yanıtlara DOCA-tuz ile TMS in etkileri (n=5). * ve sırasıyla UNX kontrol ve DOCA-tuz tek başına grupları değerlerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05 ). 77

80 Şekil 5. Sıçanlarda DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon modelinde vasküler süperoksit oluşumu üzerine DOCAtuz ve TMS in etkisi. (A) Dihidroetidyum bromür (DHE) boyama ile belirlenen representatif floresan fotomikrograf kesitleri, (B) kantitatif DHE floresan sonuçları, (C) süperoksit üretimini göstergesi olan 2-hidroksietidyum (2-OHE) düzeylerinin HPLC sonuçları. Sonuçlar ortalama±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=4). * ve sırasıyla UNX kontrol ve DOCA-tuz tek başına grupları değerlerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05 ). DHE floresan yönteminde gözlenen vasküler süperoksit oluşumundaki artışa paralel olarak, DOCA-tuz uygulanan grupta aort (Şekil 6A), kalp (Şekil 6B) ve böbrekte (Şekil 6C) NADPH oksidaz etkinliğinde anlamlı bir artış gözlenir ve TMS uygulanması sonucunda bu artış önlenmiştir (Şekil 6A, 6B ve 6C). Gerek bazal gerekse artış gösteren NADPH oksidaz etkinliği Apocynin ile inhibe edilmiştir (Şekil 6A, 6B ve 6C). DOCA-tuz uygulaması NOX-1 protein ekspresyonunda TMS ile geri çevrilen anlamlı bir artışa neden olurken, NOX-4 ekspresyonunu değiştirmemiştir (Şekil 6D, 6E ve 6F). TMS tek başına uygulandığında NADPH oksidaz etkinliği ya da NOX-1 ekspresyonu üzerinde herhangi bir etki oluşturmamıştır (Şekil 6). TMS DOCA-tuz ile oluşturulan ERK1/2 ve p38 MAPK etkinliğindeki artışları önlemektedir. TMS nin (Şekil 7A) ERK1/2 ve (Şekil 7B) p38 MAPK etkinliği üzerindeki etkisini belirlemek amacı ile aort, kalp ve böbrekte ölçülen fosforilasyon düzeyleri, DOCA-tuz uygulanan grupta anlamlı bir artış gösterirken, bu artış TMS ile önlenmiştir (Şekil 7A ve 7B). 78

81 Şekil 6. Sıçan (6A) aort, (6B) kalp ve (6C) böbrek dokularında NADPH oksidaz etkinliği üzerine (n=5); sırasıyla aynı dokularda (6D, 6E ve 6F) NOX-1 ve NOX-4 ekspresyonu üzerine (n=3) DOCA-tuz ve TMS in etkisi. Sonuçlar ortalama±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=4). *UNX kontrol grubu değerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05), DOCA-tuz tek başına grubu değerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05), aposinin grubu kendi kontrol grubundan anlamlı olarak farklı (P < 0.05). 79

82 Şekil 7. Sıçan aort, kalp ve böbrek dokularında (A) p-erk1/2 ve (B) pp38 protein ekspresyonları üzerine DOCAtuz ve TMS in etkisi. Sonuçlar ortalama±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=3). * ve sırasıyla UNX kontrol ve DOCA-tuz tek başına grupları değerlerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05 ). TARTIŞMA VE SONUÇ Bu çalışma CYP1B1 in UNX sıçanlarda DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon ile kalp, böbrek ve damar işlevlerindeki patofizyolojik değişikliklere katkısını gösteren ilk çalışmadır. Sıçanlarda DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda, CYP1B1 in seçici inhibitörü TMS (Sacerdoti ve ark., 1989) nin, SBP yi normalize ettiği dozunda; 1. Aort ve mezenterik arterde HW/BW oranı, BNP mrna ekspresyonu ve media-lümen oranlarındaki artış ile ölçülen kardiyovasküler hipertrofiyi azalttığı,; 2. aort ve mezenterik arterde fenilefrin ve ET-1 e karşı oluşan vasküler reaktivitedeki artış ve endotel işlev bozukluğunu önlediği; 3. KW/BW oranı ile ölçülen böbrek hipertrofisini ve idrar çıkışı, K + atılımı, proteinürideki artışı; Na + atılımı, ozmololite ve kreatinin kleransındeki azalmaları en aza indirdiği gösterilmiştir. Çalışmamızda gözlenen, TMS nin DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon ve ilişkili patofizyolojik değişiklikler, daha çok kardiyovasküler dokulardaki CYP1B1 etkinliğindeki azalmaya dayandırılmıştır. CYP1B1 in, sıçanların aort, kalp ve böbreklerinde yüksek oranda eksprese edildiği ve yapısal olarak aktif olduğu bulunmuştur. DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon CYP1B1 ekspresyonu ya da etkinliğini artırmamıştır. Ancak, TMS uygulanması, CYP1B1 etkinliğini azaltmış, hem UNX hem de DOCA-tuz uygulanan sıçanlarda aorta, kalp ve böbreklerindeki ekspresyonunda herhangi bir değişikliğe neden olmamıştır. Her ne kadar TMS, OAB yi normal değerlere indirememiş, kardiyovasküler hipertrofiyi önlemiş ve endotel işlev bozukluğu ile damar daraltıcı maddelerle elde edilen vasküler reaktivitedeki artışı önlemiş ise de, CYP1B1 etkinliğini tamamen engelleyememiştir. Kullandığımız yöntem ayrıca CYP1A1 i de ölçmekte ve kalan etkinlik daha yüksek TMS ile inhibe edilebilen CYP1A1 den kaynaklanabilmektedir. Bu görüşe karşıt olarak CYP1A1 protein ekspresyonu normal hayvanların aorta, kalp ve böbreklerinde anlamlı düzeylerde ölçülememiştir. Bunun yanı sıra, DOCA-tuz uygulanması CYP1A1 ekspresyonunu değiştirmemiştir (yayınlanmamış veri). Eksojen TMS nin reaksiyon karışımına eklenmesi, CYP1B1 etkinliğini aort, kalp ve böbrekte önlemiştir ve çalışmamızda görülmektedir ki; DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda OAB yi normalize eden TMS dozları, bu dokularda tamamen CYP1B1 etkinliğini ortadan 80

83 kaldırmaya yeterlidir. TMS nin plazma yarılanma ömrü ve metabolizması henüz bilinmemektedir. Ayrıca, TMS nin etkilerini doğrudan ve/veya bir veya daha fazla metabolitleri aracılığıyla gerçekleştirip gerçekleştirmediği henüz ortaya konulmamıştır. CYP1B1 etkinliği böbreklerde aort ve kalbe oranla çok daha yüksek bulunmuştur ve TMS her ne kadar azaltmış olsa da DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda böbrek işlevleri ile ilgili parametrelerindeki değişiklikleri tamamen önleyememiştir. TMS nin daha sık ve/veya daha yüksek dozda uygulanmasının CYP1B1 etkinliğini ve DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda böbrek işlevlerindeki bozulmayı tamamen önleyip önlemediğini belirlemek için ileride yapılacak çalışmalara gereksinim vardır. Ayrıca, TMS nin böbrek ve kalpte vasküler hipertrofi ve ilişkili vasküler reaktivitedeki artışı azaltıcı etkisinin kan basıncını azaltıcı etkisinden kaynaklanabileceği olasılığı da göz önünde bulundurulmalıdır. Ancak, daha önce yapılan ön çalışmalarda (Jennings BL, Malik KU, yayınlanmamış veri), TMS ye (10 µmol/l) 4 saatlik maruziyet normotansif sıçanlardan elde edilen izole aorta ve mezenterik halkalarında fenilefrin, ET-1 ve anjiyotensin II ile oluşturulan kasılmaları önlemiş ve bu da TMS nin vasküler reaktiviteyi CYP1B1 etkinliğini öneyerek azaltabileceğini düşündürmüştür. CYP1B1 in DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyona katkısının mekanizması, FLA 2 etkinliğini uyararak AA salınımına neden oldukları bilinen katekolaminler, vazopresin ve/veya ET-1 düzeylerindeki artışlardan kaynaklanabilmektedir (Bonventre ve ark., 1988; Muthalif ve ark., 1996; Trevisi ve ark., 2002). AA in in vitro CYP1B1 süperzomları tarafından DDKH büyümesini uyaran ve hipertansiyonda yer alan 12- ve 20-HETE (Choudhary ve ark., 2004) dahil orta zincirli ve terminal HETE lere metabolize edildiği gösterilmiştir. Bunun yanı sıra, bu HETE lerin plazma düzeyleri SHR de ve böbrek vasküler hastalığı olan kişilerde artmıştır (Minuz ve ark., 2008). Ancak çalışmamızda TMS 12- veya 20-HETE nin plazma düzeylerini değiştirmemiştir. Son zamanlarda, sıçan damar düz kaslarında, TMS veya adenovirüs CYP1B1 kısa hairpin (sh)rna nın AA nın HETE lere metabolize olmasını değiştirmediğini gösterilmiştir (Yaghini ve ark., 2010). 81 Bunun yanı sıra, TMS uygulanması sıçanların femoral arterlerinde AA nın 12- ve 20-HETE ye dönüşümünü etkilememiştir (yayınlanmamış veri). Ancak, TMS nin kan basıncını normalize edici ve DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon ile ilişkili patofizyolojik değişiklikleri azaltıcı etkilerdeki rolünün netleşebilmesi için TMS nin DOCAtuz uygulanan sıçanların dokularında 12- ve 20-HETE düzeylerini belirleyecek ek çalışmalara gereksinim duyulmaktadır. AA metabolizmasının ayrıca ROT üretimi (Schiffrin ve ark., 1995) ve NADPH oksidaz etkinliği (Smith ve ark., 1980) ile ilişkili olduğu gösterilmiş ve ROT nin DOCA- veya aldosteron-tuz ile oluşturulan hipertansiyon gibi çeşitli hipertansiyon modellerinde ve/veya ilişkili endotel işlev bozukluğunda yer aldığı gösterilmiştir (Malik ve ark., 2011). DDKH den elde ettiğimiz son bulgularda, anjiyotensin II ile başlatılan ROT üretimi, AA salıverilmesi ve yapısal etkin CYP1B1 aracılığıyla gerçekleştirildiğinin gösterilmesi (Yaghini ve ark., 2010), ROT un AA ve/veya diğer yağ asitlerinden vazoaktif maddelerin etkisiyle ve CYP1B1 aracılığıyla üretilmesi, DOCA-tuzun neden olduğu patofizyolojik değişikliklere katkısı olabileceği olasılığını artırmaktadır. Aort ROT üretimindeki artışın, SNP ile elde edilen endotel bağımlı gevşemede değil, ancak asetilkolin ile elde edilen endotele bağımlı gevşemedeki azalmanın ve aorta ile mezenterik arterdeki vasküler reaktivitedeki artışın TMS ile önlenmesi bu görüşü desteklemektedir. Bunun yanı sıra, DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda, aort, kalp ve böbrekte NADPH oksidaz etkinliği ve NOX-1 ekspresyonu TMS ile önlenmiştir. CYP1B1 ve NADPH oksidaz ve diğer ROT üreten sistemler arasındaki ilişki bilinmemektedir. CYP1B1 süperzomlarının in vitro AA den ROT üretebildiğini daha önce gösterilmiştir (Yaghini ve ark., 2010). Ayrıca, damar düz kas hücrelerinde anjiyotensin nin neden olduğu NADPH oksidaz etkinliğinin sitozolik FLA2 ve CYP1B1 etkinliğine bağlı olduğu da gösterilmiştir (Song ve ark., 2010). CYP1B1 tarafından AA ve/veya diğer yağ asitlerinin metabolizması aracılığıyla oluşan ROT ve/veya diğer lipit peroksidasyon ürünlerinin NADPH oksidaz etkinliğine ve ROT üretimine katkısının olup olmadığının araştırılması gerekmektedir. ROT un kendi üretimlerini, NADPH oksidazı veya ksantin oksidazı etkinleştirerek, demirin hücre içine

84 alımını ve/veya enos uncoupling i artırarak (Cai, 2005), artırabileceği bildirilmiştir. CYP1B1 tarafından oluşturulan ROT üretimindeki artışın DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyondaki kalp, böbrek ve vasküler hipertrofiyi ERK1/2 veya p38 gibi sinyal molekülleri aracılığıyla tetikleyebilmektedir (Malik ve ark., 2011). DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonun, aort, kalp ve böbrekte artmış ERK1/2 etkinliği ile ilişkili olduğu ve bunun TMS ile önlendiği gösterilmiştir. Son zamanlarda, anjiyotensin II ve AA ile oluşturulan ERK1/2 ve p38 MAPK etkinliğindeki artışlar ve DDKH büyümesinin TMS ile veya adenovirüs CYP1B1 short-hairpin RNA yerleştirilen hücrelerde önlendiği gösterilmiştir (Yaghini ve ark., 2010). TMS nin idrar çıkışı, idrarda protein miktarı ve K + atılımındaki artışları ile idrar ozmolalitesi, Na + atılımı ve GFR deki azalmaları minimize edici etkilerinin, CYP1B1 etkinliği sonucunda ROT üretimindeki ve/veya ERK1/2, p38 MAPK etkinliklerindeki azalmaya bağlı olup olmadığı ve altta yatan mekanizmaların ne olduğunun ortaya konması gerekmektedir. UNX ve DOCA-tuz uygulanan sıçanlardan elde edilen böbreklerde bazal CYP1B1ve NADPH oksidaz etkinlikleri diğer dokularda daha yüksek bulunmuştur. Ancak, DOCA-tuz uygulanan hayvanların böbreklerinde UNX hayvanlara kıyasla CYP1B1 de değil, NADPH oksidaz etkinliğinde artış gözlenmiştir. Bununla birlikte, DOCA-tuz uygulanan sıçanlara TMS uygulanması; kısmen CYP1B1 etkinliğini önlemiş, kontrol UNX hayvanların böbreklerindeki etkinliği etkilemeden NADPH oksidaz etkinliğindeki artışı ortadan kaldırmıştır. Bundan dolayı, DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyondaki böbrek işlevlerindeki değişikliklerden TMS ye duyarlı olmayanların diğer mekanizmalar aracılığıyla oluşan ROT tarafından veya ROT den bağımsız olarak DOCA nın minerelokortikoit reseptörler üzerindeki genomik veya genomik olmayan etkiler aracılığıyla oluşturuluyor gibi görünmektedir (Fuller ve ark., 2005). Bulgularımız, TMS nin DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonu, CYP1B1 etkinliğini geri çevirmesi ve böbrek işlevlerindeki değişiklikleri tamamen önlemeden kan basıncını normalize edici etkisinin yalnızca kısmen böbrek işlevlerindeki değişikliklere bağlı olduğunu 82 düşündürmektedir. TMS nin DOCA-tuz hipertansiyonunda rol alan katekolaminlerin, vazopresin ve/veya ET-1 in (Crofton ve ark., 1979; de Champlain ve ark., 1987; Schiffrin ve ark., 1995) düzeylerini etkileyip etkilemediği de araştırılmalıdır. Aldosteron ve/veya DOCA-tuz un kan basıncını, santral sinir sistemi üzerindeki doğrudan etkileri ile veya renin anjiyotensin ve sempatik sinir sistemi etkinliği ile ROT üretimini artırarak yükselttiği bilinmektedir (Gómez-Sánchez, 1997). Bunun yanı sıra, son bir çalışmada süperoksit üretimi aracılığıyla T hücrelerinin (Th17) DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyona katkıda bulundukları gösterilmiştir. Bu yüzden, beyin (Rieder ve ark., 1998) ve lenfositler (Spencer ve ark., 1999) eksprese edilen CYP1B1 in ROT üretimi aracılığıyla DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyona katkıda bulunması olasıdır. Sonuç olarak, bu çalışma, CYP1B1 in DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyona ve ilişkili kalp, damar ve böbrek dokularında hipertrofiye, endotel işlev bozukluğuna, artmış vasküler reaktiviteye ve bozulmuş böbrek işlevlerine, daha çok NADPH oksidaz etkinliği, ROT üretimi ve ERK1/2 ve p38 MAPK etkinliğindeki artışa bağlı olarak katkıda bulunduğunu gösteren ilk çalışmadır. CYP1B1, tuz ve mineralokortikoit fazlalığı ile oluşan hipertansiyonun tedavisinde geliştirilebilecek ilaçlar için yeni bir hedef olarak görülmektedir. Destek Bu çalışma, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Grant R01-HL tarafından desteklenmiştir. Seyhan ŞAHAN FIRAT, TUBİTAK tarafından Doktora sonrası araştırma bursu desteklenmiştir. Teşekkür Bu çalışmanın yürütülmesinde katkı ve desteklerini benden esirgemeyen başta değerli hocalarım Prof. Dr. Bahar TUNÇTAN ve Prof. Dr. Kafait U. MALİK ve çalışma arkadaşım Yrd. Doç. Dr. C. Kemal BUHARALIOĞLU na çok teşekkür ederim.

85 KAYNAKLAR Alonso-Galicia, M., Maier, K.G., Greene, A.S., Cowley, Jr. A.W., Roman, R.J. (2002) Role of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid in the renal and vasoconstrictor actions of angiotensin II. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 283: R60 R68. Bao, W., Behm, D.J., Nerurkar, S.S., Ao, Z., Bentley, R., Mirabile, R.C., Johns, D.G., Woods, T.N., Doe, C.P.A., Coatney, R.W., Ohlstein, J.F., Douglas, S.A., Willette, R.N., Yue, T.L., (2007) Effects of p38 MAPK inhibitor on angiotensin II-dependent hypertension, organ damage, and superoxide anion production. J Cardiovasc Pharmacol 49: Bonventre, J.V., Swidler, M. (1988) Calcium dependency of prostaglandin E2 production in rat glomerular mesangial cells. Evidence that protein kinase C modulates the Ca2_- dependent activation of phospholipase A2. J Clin Invest 82: Cai, H. (2005) NAD(P)H oxidase-dependent self-propagation of hydrogen peroxide and vascular disease. Circ Res 96: Capdevila, J.H., Falck, J.R. ve Harris, R.C. (2000). Cytochrome P450 and arachidonic acid bioactivation. Molecular and functional properties of the arachdonate monooxygenase. J Lipid Res 41: Choudhary, D., Jansson, I., Stoilov, I., Sarfarazi, M. ve Schenkman, J.B. (2004) Metabolism of retinoids and arachdonic acid by human and mouse cytochrome p450 1B1. Drug Metabol Disp 32: Crofton, J.T., Share, L., Shade, R.E., Lee- Kwon, W.J., Manning, M., Sawyer W.H. (1979) The importance of vasopressin in the development and maintenance of DOC-salt hypertension in the rat. Hypertension 1: de Champlain, J., Bouvier, M., Drolet, G. (1987) Abnormal regulation of the sympathoadrenal system in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Can J Physiol Pharmacol 65: Drolet, G., Bouvier, M., de Champlain, J. (1989) Enhanced sympathoadrenal reactivity to haemorrhagic stress in DOCA-salt hypertensive rats. J Hypertens 7: Fatima, S., Yaghini, F.A., Malik, K.U. (2004) Cytosolic phospholipase A 2 translocation to the nuclearenvelope by neurohumoral agents in vascular endothelial and smooth muscle 83 cells. Biochemistry of Lipids in Vascular Function Fuller, P.J., Young, M.J. (2005) Mechanisms of mineralocorticoid action. Hypertension 46: Gómez-Sánchez, E.P. (1997) Central hypertensive effects of aldosterone. Front Neuroendocrinol 18: Hong, H.J., Hsiao, G., Cheng, T.H., Yen, M.H. (2001) Supplementation with tetrahydrobiopterin suppresses the development of hypertension in spontaneously hypertensive rats. Hypertension 38: Imig, J.D., Hammock, B.D. (2009) Soluble epoxide hydrolase as a therapeutic target for cardiovascular diseases. Nat Rev Drug Discov 8: Korashy, H.M., El-Kadi, A.O.S. (2006) The role of aryl hydrocarbon receptor in the pathogenesis of cardiovascular diseases. Drug Metab Rev 38: Landmesser, U., Dikalov, S., Price, S.R., McCann, L., Fukai, T., Holland, S.M., Mitch, W.E., Harrison, D.G. (2003) Oxidation of tetrahydrobiopterin leads to uncoupling of endothelial cell nitric oxide synthase in hypertension. J Clin Invest 111: McGiff, J.C. (1981) Prostaglandins, prostacyclin, thromboxanes. Annu Rev Pharmacol Toxicol 21: Medhora, M., Chen, Y., Gruenloh, S., Harland, D., Bodiga, S., Zielonka, J., Gebremedhin, D., Gao, Y., Falck, J.R., Anjaiah, S., Jacobs, E.R. (2008) 20-HETE increases superoxide production and activates NAPDH oxidase in pulmonary artery endothelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294: L902 L911. Minuz, P., Jiang, H., Fava, C., Turolo, L., Tacconelli, S., Ricci, M., Patrignani, P., Morganti, A., Lechi, A., McGiff, J.C. (2008) Altered release of cytochrome P450 metabolites of arachidonic acid in renovascular disease. Hypertension 51: Miyata, N., Roman, R.J. (2005) Role of 20- hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE) in vascular system. J Smooth Muscle Res 41: Muthalif, M.M., Benter, I.F., Uddin, M.R., Malik, K.U. (1996) Calcium / calmodulin-dependent protein kinase II_ mediates activation of

86 mitogen-activated protein kinase and cytosolic phospholipase A2 in norepinephrine-induced arachidonic acid release in rabbit aortic smooth muscle cells. J Biol Chem 271: Muthalif, M.M., Benter, I.F., Khandekar, Z., Gaber, L., Estes, A., Malik, S., Parmentier, J.H., Manne, V., Malik, K.U. (2000) Contribution of Ras GTPase/MAP kinase and cytochrome P450 metabolites to deoxycorticosterone-salt-induced hypertension, 35(1 Pt 2): Nakao, J., Ooyama, T., Ito, H., Chang, W-C., Murota, S. (1982) Comparative effect of lipoxygenase products of arachidonic acid on rat aortic smooth muscle cell migration. Atherosclerosis 44: Nasjletti, A. (1998) The role of eicosanoids in angiotensin-dependent hypertension. Hypertension 31: Natarajan, R., Gonzales, N., Lanting, L., Nadler, J. (1994) Role of the lipoxygenase pathway in angiotensin II-induced vascular smooth muscle cell hypertrophy. Hypertension 23: I142 I147. Omata, K., Abraham, N.G. ve Schwartzman, M.L. (1992) Renal cytochrome P450 arachidonic acid metabolism: localization and hormonal regulation in spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol 262: F591- F599. Reddy, M.A., Thimmalapura, P-R., Lanting, L., Nadler, J.L., Fatima, S., Natarajan, R. (2002) The oxidized lipid and lipoxygenase product 12(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid induces hypertrophy and fibronectin transcription in vascular smooth muscle cells via p38 MAPK and camp response element-binding protein activation: mediation of angiotensin II effects. J Biol Chem 277: Rieder, C.R.M., Ramsden, D.B., Williams, A.C. (1998) Cytochrome P450 1B1 mrna in the human central nervous system. Mol Pathol 51: Roman, R.J. (2002) P-450 Metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function. Physiol Rev 82: Roman, R.J., Ma, Y.H., Frohlich, B. ve Markham, B. (1993) Clofibrate prevents the development of hypertension in Dahl saltsensitive rats. Hypertension 21: Sacerdoti, D., Escalante, B., Abraham, N.G., McGiff, J.C., Levere, R.D. ve Schwartzman, 84 M.L. (1989) Treatment with tin prevents the development of hypertension in spontaneously hypertensive rats. Science 243: Sánchez, M., Galisteo, M., Vera, R., Villar, I.C., Zarzuelo, A., Tamargo, J., Pérez-Vizcaíno, F., Duarte, J. (2006). Quercetin downregulates NADPH oxidase, increases enos activity and prevents endothelial dysfunction in spontaneously hypertensive rats. J Hypertens 24: Sasaki, M., Hori, M.T., Hino, T., Golub, M.S., ve Tuck, M.L. (1997) Elevated 12- lipoxygenase activity in thespontaneously hypertensive rat. Am J Hypertens 10: Schiffrin, E.L., Sventek, P., Li, J.S., Turgeon, A., Reudelhuber, T. (1995) Antihypertensive effect of an endothelin receptor antagonist in DOCA-salt spontaneously hypertensive rats. Br J Pharmacol 115: Smith, R.L., Weidemann, M.J. (1980) Reactive oxygen production associated with arachidonic acid metabolism by peritoneal macrophages. Biochem Biophys Res Commun 97: Song, C.Y., Ghafoor, H.U.B., Yaghini, F.A., Fang, X.R., Malik, K.U. (2010) Angiotensin IIinduced reactive oxygen radical production by NAD(P)H oxidase is mediated by arachidonic acid metabolism via cytochrome P4501B1 in vascular smooth muscle cells (Abstract). FASEB J 24: Spencer, D.L., Masten, S.A., Lanier, K.M., Yang, X., Grassman, J.A., Miller, C.R., Sutter, T.R., Lucier, G.W., Walker, N.J. (1999) Quantitative analysis of constitutive and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxininduced cytochrome P450 1B1 expression in human lymphocytes. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 8: Stec, D.E., Gannon, K.P., Beaird, J.S., Drummond, H.A. (2007) 20- Hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE) stimulates migration of vascular smooth muscle cells. Cell Physiol Biochem 19: Su, P., Kaushal, K.M. ve Kroetz, D.L. (1998). Inhibition of renal arachidonic acid omegahydroxylase activity with ABT reduces blood pressure in the SHR. Am J Physiol 275:, R Trevisi, L., Bova, S., Cargnelli, G., Ceolotto, G., Luciani, S. (2002) Endothelin-1-induced

87 arachidonic acid release by cytosolic phospholipase A2 activation in rat vascular smooth muscle via extracellular signalregulated kinases pathway. Biochem Pharmacol 64: Touyz, R.M., Cruzado, M., Tabet, F., Yao, G., Salomon, S., Schiffrin, E.L. (2003) Redoxdependent MAP kinase signaling by Ang II in vascular smooth muscle cells: role of receptor tyrosine kinase transactivation. Can J Physiol Pharmacol 81: Uddin, M.R., Muthalif, M.M., Karzoun, N.A., Benter, I.F., Malik, K.U. (1998) Cytochrome P-450 metabolites mediate norepinephrineinduced mitogenic signaling. Hypertension 31: Viedt, C., Soto, U., Krieger-Brauer, H.I., Fei, J., Elsing, C., Kübler, W., Kreuzer, J. (2000) Differential activation of mitogen-activated protein kinases in smooth muscle cells by angiotensin II. Involvement of p22phox and reactive oxygen species. Arterioscler Thromb Vasc Biol 20: Wang, J.S., Zhang, F., Jiang, M., Wang, M.H., Zand, B.A., Abraham, N.G., Nasjletti, A. ve Laniado-Schwartzman, M. (2004) Transfection and functional expression of CYP4A1 and CYP4A2 using bicistronic vectors in vascular cells and tissues. J Pharmacol Exp Ther 311: Yaghini, F.A., Song, C.Y., Lavrentyev, E.N., Ghafoor, H.U.B., Fang, X.R., Estes, A.M., Campbell, W.B., Malik, K.U. (2010) Angiotensin II-induced vascular smooth muscle cell migration and growth are mediated by cytochrome P450 1B1- dependent superoxide generation. Hypertension 55: Zhang, F., Wang, M-H., Krishna, M., Falck, J.R., Schwartzman, M.L. ve Nasjletti, A. (2001) Modulation by 20-HETE of phenylephrine-induced mesenteric artery contraction in spontaneously hypertensive and wistarkyoto rats. Hypertension 38: Zhao, W., Parrish, A.R., Ramos, K.S. (1998) Constitutive and inducible expression of cytochrome P450IA1 and P450IB1 in human vascular endothelial and smooth muscle cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim 34: ÖZGEÇMİŞ 1. KİMLİĞİ: Adı, soyadı: Seyhan ŞAHAN-FIRAT Doğum yeri ve tarihi: Kastamonu, 1976 Haziran Medeni hali: Evli, 2 çocuklu İş adresi: Mersin Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı, 33169, Mezitli, Mersin Telefon: + (324) Fax: + (324) e-posta: seyhansahan06@gmail.com; seyhansahan@mersin.edu.tr 2. EĞİTİM ÖYKÜSÜ: Ortaöğrenim: ; Gazi Anadolu Lisesi, Ankara Lisans: ; Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Ankara Doktora: ; Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Farmakoloji ve Toksikoloji Anabilim Dalı, Ankara 3. MESLEKİ DENEYİMLERİ: ; Farmakoloji ve Toksikoloji Doktoru; Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Farmakoloji ve Toksikoloji Anabilim Dalı, Ankara ; Yardımcı Doçent; Mersin Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı, Mersin 2009 Şubat-2010; Haziran Doktora Sonrası Araştırıcı, Department of Pharmacology, College of Medicine, Health Science Center, University of Tennessee, Memphis, Tennessee, USA 4. DOKTORA TEZİ: Hidrate Sodyum Kalsiyum Aluminosilikatla Beslenen Etlik Piliçlerde Enrofloksasinin Farmakokinetiği, Ankara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Ankara (2005). * * * * * 85

88 5. PROJELER: 1. Şahan Fırat, S., Gilik, D., Kaçan, M., Sarı, A.N., Buharalıoğlu, C.K., Tunçtan, B., Korkmaz, R.B., Sıçanlarda Zimosan ile Oluşan Hipotansiyona Dalak Tirozin Kinazının Katkısının Araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje no: BAP-SBE (DG) YL, Yürütücü, (Eylül 2011; devam ediyor). 2. Buharalıoğlu, C.K., Kaçan, M., Gilik, D., Sarı, A.N., Tunçtan, B., Şahan Fırat, S., Korkmaz, R.B., Sıçanlarda Endotoksin ile Oluşan Hipotansiyona Dalak Tirozin Kinazının Katkısının Araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP-SBE (MK) YL, Araştırıcı, (Eylül 2011; devam ediyor). 3. Tunçtan, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Korkmaz, B., Cüez, T., Sarı, A.N., Kaçan, M., Gilik, D., Endotoksemik sıçanlarda NO oluşumundaki artmaya 20- HETE düzeylerinde azalmanın eşlik ettiği hipotansiyona COX-2 ürünlerinin katkısının araştırılması. Novartis Sağlık, Gıda ve Tarım Ürünleri Sanayi ve Ticaret A.Ş., Mersin, Araştırıcı, (1 Temmuz Ocak 2012; devam ediyor). 4. Tunçtan, B., Serin, M.S., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Korkmaz, B., Sarı, A.N., Endotoksemik sıçanlarda dayanıklı 20-HETE analoğu 5,14-HEDGE'nin CYP2C23'e bağımlı renal epoksijenaz ile çözünebilir epoksit hidrolaz ekspresyon ve etkinliği üzerindeki etkisinin proinflamatuvar sitokin oluşumu ve MEK1/ERK1/2/NF- B yoluyla ilişkilendirilerek araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP- ECZ F FB (BT) B, Araştırıcı, (9 Kasım Kasım 2012; devam ediyor). 5. Tunçtan, B., Buharalıoğlu, C.K., Serin, M.S., Şahan Fırat, S., Korkmaz, B., Cüez, T., Sari, A.N., Endotoksemik sıçanların kardiyak, renal ve vasküler dokularında nitrik oksit sentaz, siklooksijenaz ve sitokrom P450 4A enzimleri arasındaki etkileşmelerin mekanizmasının moleküler düzeyde araştırılması. TÜBİTAK Projesi, SBAG, Mersin, Proje No: 109S121, Araştırıcı, (1 Kasım Kasım 2012;, devam ediyor) Sucu, N., Urhan Küçük, M., Şahan Fırat, S., Aytaçoğlu, B.N., Canacankatan, N., Tunçtan, B., ADE inhibisyonunun kardiyopulmoner bypass sırasında ortaya çıkan miyokardiyal hasar üzerindeki etkisinin ADE gen polimorfizmi ile ilişkilendirilmesi. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP-TF CTB (NS) , Araştırıcı, (11 Mayıs Mayıs 2012; devam ediyor). 7. Urhan Küçük, M., Şahan Fırat, S., Sucu, N., Aytaçoğlu, B.N., Tunçtan, B., Vezir, O., Canacankatan, N., ACE inhibitörü alan hastalarda, kardiopulmoner bypass sırasında oluşan miyokardiyal hasarın IL-6, IL-8 ve TNF alfa gen polimorfizmleri ile ilişkilendirilmesi. Adıyaman Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Adıyaman, Proje No: FEFBAP , Araştırıcı, ( ; devam ediyor). 8. Şahan Fırat, S., CYP1B1 nın sıçanlarda hipertansiyon gelişimi ve sürdürülmesindeki rolü. TÜBİTAK 2008 yılı 2219-Yurtdışı Doktora Sonrası Araştırma Burs Programı 1. Dönem Projesi, Memphis, Tennessee, ABD, Araştırıcı, (Şubat 2009-Haziran 2010) (Malik, K.U., Principal Investigator). 9. Tunçtan, B., Cüez, T., Korkmaz, B., Şahan Fırat, S., 20-HETE agonisti N-[20- hidroksieikoza-5(z),14(z)-dienoil] glisinin endotoksin ile oluşan hipotansiyonu önleyici etkisinin mekanizmasının araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Doktora Tez Projesi, Mersin, Proje No: BAP SBE EMB (TC) DR, Araştırıcı, (8 Eylül Eylül 2010). 10. Tunçtan, B., Sarı, A.N., Korkmaz, B., Cüez, T., Canacankatan, N., Vezir, Ö., Sucu, N., Ayaz, L., Tamer, L., Yılmaz, N., Şahan Fırat, S., Seçici Rho-kinaz inhibitörü Y-27632'nin periferik iskemi/reperfüzyona bağlı hedef organ iskelet kası ve uzak organ böbrek hasarı üzerine etkisi. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP SBE EMB (ANS) YL, Araştırıcı, (22 Aralık Aralık 2009). 11. Canacankatan, N., Görür, A., Doran, F., Algül, Ö., Tunçtan, B., Şahan Fırat, S., Hepatosellüler karsinomda apoptozis

89 mekanizması ve bazı benzimidazol türevlerinin hepatosellüler karsinom üzerine etkisi. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Yüksek Lisans Tez Projesi, Proje No: BAP-SBE BA (AG) YL (12 ay), Araştırıcı, (27 Kasım Kasım 2009). 12. Tunçtan, B., Cüez, T., Korkmaz, B., Şahan Fırat, S., Selektif 20-HETE agonisti N-[20-hidroksieikoza-5(Z),14(Z)- dienoil]glisinin endotoksin ile oluşan nitrik oksit aracılıklı hipotansiyon ve vasküler hiporeaktiviteyi önleyici etkisinin mekanizmasının araştırılması. Novartis Sağlık, Gıda ve Tarım Ürünleri Sanayi ve Ticaret A.Ş., Mersin, Araştırıcı, (Ağustos 2008-Haziran 2009). 13. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Endotoksemik sıçanlarda ekstraselüler sinyal ile düzenlenen kinaz 1/2 ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz yolu aracılıklı vasküler hiporeaktivitenin mekanizmalarının araştırılması. TÜBİTAK Projesi, SBAG, Mersin, Proje No: 106S299 (SBAG- 3508), Araştırıcı, (1 Şubat Şubat 2009). 14. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Demiryürek, A.T., Endotoksemik sıçanlarda mitojen ile aktive edilen protein kinaz kinaz 1/ekstraselüler sinyal ile düzenlenen kinaz 1/2 yolu aracılıklı vasküler hiporeaktivitenin mekanizmalarının araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Doktora Tez Projesi, Mersin, Proje No: BAP SBE EMB (RBK) DR, Araştırıcı, (24 Kasım Kasım 2008). 15. Tunçtan, B., Özbaşoğlu, O., Korkmaz, B., Şahan Fırat, S., Yalçın, A., Buharalıoğlu, C.K., Endotoksin ile oluşturulan inflamatuvar hiperaljezide talidomidin etkilerinin incelenmesi. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP SBE EMB (OÖ) YL, Araştırıcı, (24 Kasım Mayıs 2008). 16. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Endotoksin ile oluşan nitrik oksit aracılıklı hipotansiyona sitokrom P450 ve siklooksijenaz-2 ürünlerinin katkısı. Mersin Üniversitesi 87 Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP ECZF EMB (BT) , Araştırıcı, (22 Kasım Mayıs 2008). 6. BURSLAR: TÜBİTAK 2008 yılı 2219-Yurtdışı Doktora Sonrası Araştırma Bursu (Şubat Haziran 2010); CYP1B1 nın sıçanlarda hipertansiyon gelişimi ve sürdürülmesindeki rolü. ; Department of Pharmacology, College of Medicine, Health Science Center, The University of Tennessee, Memphis, Tennessee, USA. 7. ÜYELİKLER: Türk Farmakoloji Derneği Veteriner Farmakoloji ve Toksikoloji Derneği Mersin Veteriner Hekimleri Odası 8. YABANCI DİL: İngilizce (KPDS: 72; ÜDS: 76) YAYIN LİSTESİ Science Citation Index-Expanded Kapsamındaki Dergilerde Yer Alan Araştırma Makaleleri 1. Canacankatan, N., Sucu, N., Aytacoglu, B., Gul, O.E., Gorur, A., Korkmaz, B., Sahan-Firat, S., Antmen, E.S., Tamer, L., Ayaz, L., Vezir, O., Kanik, A., Tunctan, B. Affirmative effects of Iloprost on apoptosis during ischemiareperfusion injury in kidney as a distant organ. Renal Failure 34, (2012). 2. Malik, K.U., Jennings, B.L., Yaghini, F.A., Sahan-Firat, S., Song, C.Y., Estes, A.M., Fang, X.R. Contribution of cytochrome P4501B1 to hypertension and associated pathophysiology: A novel target for hypertensive agents. Prostaglandins & Other Lipid Mediators Dec 20 [Epub ahead of print] (2011). 3. Buharalioglu, C.K., Korkmaz, B., Cuez, T., Sahan-Firat, S., Sari, A.N., Malik, K.U., Tunctan, B., Piroxicam reverses endotoxin-induced hypotension in rats: contribution of vasoactive eicosanoids

90 and nitric oxide. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, 109, (2011). 4. Korkmaz, B., Buharalioglu, K., Sahan- Firat, S., Cuez, T., Tunctan, B., Activation of MEK1/ERK1/2/iNOS/sGC /PKG pathway associated with peroxinitrite formation contributes to hypotension and vascular hyporeactivity in endotoxemic rats. Nitric Oxide: Biology and Chemistry, 24(3), (2011). 5. Tunctan, B., Korkmaz, B., Cuez, T., Buharalioglu, C.K., Sahan-Firat, S., Falck, J., Malik, K.U., Contribution of vasoactive eicosanoids and nitric oxide production to the effect of selective cyclooxygenase-2 inhibitor, NS-398, on endotoxin-induced hypotension in rats. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, 107(5), (2010). 6. Cuez, T., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Sahan-Firat, S., Falck, J., Malik, K.U., Tunctan, B., A synthetic analog of 20-HETE, 5,14-HEDGE, reverses endotoxin-induced hypotension via increased 20-HETE levels associated with decreased inos protein expression and vasodilator prostanoid production in rats. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, 106(5), (2010). 7. Jennings, B.L., Sahan-Firat, S., Estes, A.M., Das, K., Farjana, N., Fang, X.R., Gonzalez, F.J., Malik, K.U., Cytochrome P450B1 contributes to angiotensin IIinduced hypertension and associated pathophysiology. Hypertension, 56(4), (2010). 8. Sahan-Firat, S., Jennings, B.L., Yaghini, F.A., Song, C.Y., Estes, A.M., Fang, X.R., Farjana, N., Khan, A.I., Malik, K.U., 2,3,4,5 -Tetramethoxystilbene prevents deoxycorticosterone-salt-induced hypertension: contribution of cytochrome P-450 1B1. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology, 299 (6), H (2010). 9. Tunctan, B., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Sahan-Firat, S., Anjaiah, S., Falck, J., Roman, R.J., Malik, K.U., A 20-HETE agonist, N-[20-hydroxyeicosa-5(Z),14(Z)- dienoyl]glycine, opposes the fall in blood 88 pressure and vascular reactivity in endotoxin-treated rats. Shock, 30(3), (2008). 10. Büyükafşar, K., Yalçın, İ., Kurt, H., Tiftik, R.N., Şahan-Fırat, S., Aksu, F., Rho kinase inhibitor, Y has an antinociceptive effect in mice. European Journal of Pharmacology, 541, (2006). 11. Büyükafşar, K., Akça, T., Tiftik, R.N., Şahan-Fırat, S., Aydın S., Contribution of Rho-kinase in human gallbladder contractions. European Journal of Pharmacology 540, (2006). 12. Şahan-Fırat, S., Tiftik, R.N., Nacak, M., Büyükafşar, K., Rho kinase expression and its central role in ovine gallbladder contractions elicited by a variety of excitatory stimuli. European Journal of Pharmacology, 528, (2005). Science Citation Index-Expanded Kapsamındaki Dergilerde Yer Alan ve Uluslararası Toplantılarda Sunulan Poster Özetleri 1. Buharalioglu, C.K., Korkmaz, B., Cuez, T., Sahan-Firat, S., Sari, A.N., Malik, K.U., Tunctan, B., A selective cyclooxygenase-1 inhibitor, piroxicam, reverses endotoxin-induced hypotension in rats: contribution of vasoactive eicosanoids and nitric oxide. 10 th World Congress on Inflammation, Paris, France, June 25-29, Inflammation Research 60 (Suppl. 1), P-203 (2011). 2. Jennings, B.L., Sahan-Firat, S., Estes, A.M., Malik, K.U., Contribution of cytochrome (CYP) P450 1B1 in various models of hypertension in rats and mice: a novel target for the development of antihypertensive agents. Experimental Biology 2010, Anaheim, CA, USA, April 24-28, Program/Abstract No:786.21/3473, FASEB J 24, (2010). 3. Sahan Firat, S., Jennings, B.L., Estes, A.M., Farjana, N., Khan, A.H., Fang, X.R., Malik K.U., DOCA/Salt-induced hypertension and associated increase in vascular reactivity and cardiac and vascular hypertrophy are mediated by cytochrome P450 1B1. Experimental Biology 2010, Anaheim, CA, USA, April

91 24-28,Program/Abstract No: / 2765, FASEB J 24, (2010). 4. Sahan-Fırat, S., Korkmaz, B., Cuez, T., Ayaz, L., Tamer, L., Buharalioglu, C.K., Sarı, A.N., Tunctan, B. Prostaglandins contribute to endotoxin-induced increase in lipid peroxidation via nitric oxide production during endotoxemia in rats. Experimental Biology 2009, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: LB368/656, FASEB J 23, LB368 (2009). 5. Korkmaz, B., Buharalioglu, K., Demiryürek, T.A., Sahan-Firat, S., Cuez, T., Tunctan, B., Activation of MEK1/ERK1/2/iNOS/sGC/PKG pathway contributes to the fall in blood pressure and vascular reactivity in endotoxemic rats. Experimental Biology 2009, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: 932.5/1009, FASEB J 23, (2009). 6. Buharalioglu, K., Ozbasoglu, O., Korkmaz, B., Cuez, T., Sahan-Firat, S., Yalcin, A., Tunctan, B., Thalidomide potentiates analgesic effect of COX inhibitors on endotoxin-induced hyperalgesia by modulating TNF-a, PGE and NO synthesis in mice. Experimental Biology 2009, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: 742.4/1561, FASEB J 23, (2009). 7. Tunctan, B., Korkmaz, B., Cuez, T., Sahan-Firat, S., Yildirim, H., Tamer, L., Buharalioglu, K., Falck, J.R., Malik, K.U., Increased production of 20-HETE contributes to the effects of COX inhibitors to prevent the decrease in lipid peroxidation and increase in catalase activity during endotoxemia. Experimental Biology 2009, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: /658, FASEB J 23, (2009). 8. Tunctan, B., Korkmaz, B., Buharalioglu, CK., Sahan-Firat, S., Anjaiah, S., Falck, JR., Yildirim, H., Tamer, L., Roman, RJ., Malik, KU., 20-HETE agonist, N-[20- hydroxyeicosa-5(z),14(z)-dienoyl]glycine, opposes the endotoxin-induced fall in blood pressure and the decrease in vascular reactivity and lipid peroxidation and increased catalase activity via inhibition of NO production in rats. Experimental Biology 2008, San Diego, 89 CA, USA, April 5-9, Abstract No: 6051, FASEB J 22, (2008). 9. Sahan-Fırat, S., Canacankatan, N, Korkmaz B, Yıldırım, H., Tamer, L., Buharalioglu CK., Sarı, AN., Tunctan, B., Differential regulation of oxidative stress by NO in vascular and nonvascular tissues of endotoxemic rats. Experimental Biology 2008, San Diego, CA, USA, April 5-9, Abstract No: 5981, FASEB J 22, (2008). Science Citation Index-Expanded Kapsamındaki Dergilerde Yer Alan ve Uluslararası Toplantılarda Yapılan Sözlü Sunumlar 1. Tunctan, B., Korkmaz, B., Cuez, T., Sarı, A.N., Kacan, M., Gilik, D., Buharalioglu, C.K., Sahan-Firat, S., Schunck, W.H, Serin, M.S., Falck, J.R., Malik, K.U., Contribution of inos, COX-2 and CYP4A1 to the protective effect of a synthetic analog of 20-HETE, 5,14- HEDGE, against endotoxin-induced hypotension and mortality in experimental model of septic shock in rats and mice. 10 th World Congress on Inflammation, Paris, France, June 25-29, OC-059, Inflammation Research 60 (Suppl. 1), S55 (2011). 2. Jennings, BL., Das K., Sahan-Firat, S., Estes, AM., Malik, KU., Contribution of cytochrome P450 1B1 to angiotensin IIinduced hypertension. 63rd High Blood Pressure Research Conference 2009, Chicago, IL, USA, September 23-26, Abstract No: O87, Hypertension, (2009). Ulusal/ Uluslararası Toplantılarda Sunulan Poster Özetleri 1. Görür, A., Canacankatan, N., Gül, O.E., Algül, Ö., Erdoğan, S., Korkmaz, B., Şahan-Fırat, S., Tunçtan, B., Doran, F. Hepatoselüler karsinom gelişim sürecinde bazı benzimidazol türevlerinin antioksidan kapasite üzerine etkisi. XXIII. Ulusal Biyokimya Kongresi, Hilton Hotel, Adana, 29 Kasım-2 Aralık, Program ve Bildiri Özetleri Kitabı, s. 278, Bildiri No: P-09, Türk Biyokimya Dergisi (2011). 2. Buharalıoğlu, C.K., Sarı, A.N., Kaçan, M., Gilik, D., Korkmaz, B., Cüez, T., Şahan Fırat, S., Malik, K.U., Tunctan, B.,

92 Endotoksemik sıçanlarda piroksikamın hipotansiyonu önleyici etkisine MEK1/ERK1/2/iNOS/NADPH oksidaz yolunun katkısı. 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Eskişehir, Ekim, Bildiri Kayıt No: 159, Sunum Kodu: P-9 (2011). 3. Canacankatan, N., Sucu, N., Sahan- Firat, S., Gorur, A., Antmen, S.E., Korkmaz, B., Tunctan, B., Gul, O.E., Tamer, L., Ayaz, L., Vezir, Ö., Kanik, A., Attenuation of ischemia-reperfusion injury by Iloprost on apoptosis and antioxidant capacity in kidney as a distant organ. 3 rd International Congress on Cell Membranbes and Oxidative Stress: Focus on Calcium Signalling and TRP Channels, Poster No 54, Isparta, June 22-27, Turkey (2010). 4. Sarı, A.N., Şahan Fırat, S., Vezir, Ö., Yılmaz, Ş.N., Korkmaz, B., Cüez, T., Canacankatan, N., Sucu, N., Ayaz, L., Tamer, L., Görür, A., Tunçtan, B., Seçici Rho-kinaz inhibitörü Y-27632'nin sıçanlarda oluşturulan periferik iskemi/reperfüzyona bağlı hedef organ gastroknemius kası ve uzak organ böbrek zedelenmesi üzerindeki etkisi. 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kızılağaç, Manavgat, Antalya, 4-7 Kasım, Özet Kitabı, s. 278, Bildiri No: P-097 (2009). 5. Cüez, T., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Falck, J., Malik, K.U., Tunçtan, B., Endotoksemik sıçanlarda N-[20-hidroksieikoza- 5(Z),14(Z)-dienoil]glisinin enos, inos ve hsp90 protein ekspresyonu ile prostanoit ve 20-HETE düzeyleri üzerindeki etkisi. 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kızılağaç, Manavgat, Antalya, 4-7 Kasım, Özet Kitabı, s. 262, Bildiri No: P-082 (2009). 6. Şahan-Fırat, S., Canacankatan, N., Korkmaz, B., Yıldırım, H., Tamer, L., Buharalıoğlu, C.K., Tunçtan, B., Endotoksemik sıçanların karaciğerinde artan oksidatif stres üzerinde indüklenebilir nitrik oksit sentaz inhibisyonunun etkisi. 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Trabzon, Ekim, Özet Kitabı, s. 378, Bildiri No: P104 (2007). 7. Şahan-Fırat, S., Tiftik, R.N., Nacak, M., Büyükafşar, K., Central role of Rho/Rhokinase pathway in the neurogenic 90 contractile activity of the sheep gallbladder smooth muscle. 4th National Congress of Neuroscience, Mersin, Turkey, March 29-April 2, Abstract Book, p , Abstract No: P-75, (2005). 8. Şahan, S., Kaya, S., The Pharmacokinetics of Enrofloxacin in broiler chickens fed with feed containing hydrate sodium calcium aluminosilicate. Birinci Ulusal Veteriner Farmakoloji ve Toksikoloji Kongresi (Uluslararası katılımlı), Ankara, Eylül, Kongre Kitabı, s , (2005). Ulusal / Uluslararası Toplantılarda Yapılan Sözlü Sunumlar 1. Sarı, A.N., Kaçan, M., Gilik, D., Şahan Fırat, S., Buharalıoğlu, C.K., Vezir, Ö., Korkmaz, B., Cüez, T., Sucu, N., Tunctan, B., Sıçanlarda oluşturulan periferik iskemi/reperfüzyona bağlı hedef organ gastroknemius kası ve uzak organ böbrek zedelenmesine RhoA/Rho- Kinaz/ERK1/2/iNOS/NADPH oksidaz yolunun katkısı. 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Eskişehir, Ekim, Bildiri Kayıt No: 158, Sunum Kodu: S-3 (2011). 2. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Cüez, T., Sarı, A.N., Kaçan, M., Gilik, D., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Schunk, W.H., Serin, M.S., Falck, J.R., Malik, K.U., Sıçan ve farelerde oluşturulan deneysel septik şok modelinde 20-HETE analoğu 5,14-HEDGE nin hipotansiyonu ve mortaliteyi önleyici etkisine inos, COX-2, CYP4A1 ve NADPH oksidazın katkısı. 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Eskişehir, Ekim, Bildiri Kayıt No: 163, Sunum Kodu: S-4 (2011). 3. Tunçtan, B., Cüez, T., Korkmaz, B., Şahan Fırat, S., Buharalıoğlu, C.K., Yıldırım, H., Sarı, A.N., Tamer, L., Falck, J., Malik, K.U., Endotoksemik sıçanlarda NO oluşumundaki artmaya 20-HETE düzeylerindeki azalmanın eşlik ettiği oksidatif stres ve inflamasyon üzerinde yapay bir 20-HETE analoğu olan N-[20- hidroksieikoza-5(z),14(z)-dienoil]glisinin etkisi. 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kızılağaç, Manavgat, Antalya, 4-7 Kasım, Özet Kitabı, s. 129, Bildiri No: SS-01 (2009).

93 4. Korkmaz, B., Cüez, T., Buharalıoğlu, C.K., Demiryürek, A.T., Şahan Fırat, S., Sarı, A.N., Tunçtan, B. Endotoksemik sıçanlarda gelişen kaspaz-3 aracılıklı apoptoza ve oksidatif strese MEK1/ERK1/2/iNOS yolunun katkısı. 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kızılağaç, Manavgat, Antalya, 4-7 Kasım, Özet Kitabı, s. 141, Bildiri No: S-01 (2009). 5. Tunctan, B., Korkmaz B, Cuez, T., Buharalioglu, CK., Sahan-Firat, S., Falck, J., Malik, KU., Interactions between cytochrome P450A, cyclooxygenase and nitric oxide synthase during endotoxemia: therapeutic implications for inflammatory diseases. EHRLICH II, 2nd World Conference on Magic Bullets, Nurnberg, Germany, October 3-5, Program/Abstract No: 829 (2008). 6. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan-Fırat S., Anjaiah, S., Falck, J., Roman, R.J., Malik, K.U., Endotoksin ile olusan nitrik oksit aracılıklı hipotansiyon ve vasküler hiporeaktivite üzerinde selektif 20-hidroksieikoza tetraenoik asit agonisti N-[20-hidroksi eikoza-5(z),14(z)-dienoil]glisinin etkileri. 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Trabzon, Ekim, Özet Kitabı, s. 212, Bildiri No: S-02 (2007). 7. Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Demiryürek A.T., Şahan-Fırat S., Tunçtan, B., Endotoksemik sıçanların torasik aortasında gelişen vasküler hiporeaktiviteye indüklenebilir nitrik oksit sentaz/çözünebilir guanilil siklaz/protein kinaz G yolunun katkısı. 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Trabzon, Ekim, Özet Kitabı, s. 211, Bildiri No: S-01 (2007). 8. Büyükafşar, K., Akça, T., Tiftik, R.N., Şahan-Fırat, S., Aydın, S. İnsan safra kesesinde Rho-kinaz enzim ekspresyonu ve kontraktil aktivitedeki esaslı rolü. Türk Farmakoloji Derneği 18. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Desem, İzmir, 28 Eylül-1 Ekim, Bildiri Özetleri Kitabı, s. 220, Bildiri No: S-11 (2005). * * * * * NOTLAR 91

94 Serin/Treonin Kinaz Geni Transfekte Edilmiş Kardiyak Projenitor Hücrelerin Elektrofizyolojik Özellikleri ve Ko-kültür Ortamında Kardiyak Miyozitler ile İnteraksiyonu Hale TUFAN GİRİȘ VE AMAÇ Embriyonik kök hücreler (embryonic stem cells, ESC), indüklenebilir pluripotent kök hücreler (induced pluripotent stem cells, ipsc), fetal miyozitler, endoteliyal projenitör hücreler, kemik iliği kök hücreleri gibi birçok hücre tipi hasarlanmıș kalp kasının rejenerasyonu için denenmektedir (Dimmeler, 2001). Son yıllarda fare, köpek ve insan erișkin kardiyak kök hücreleri (cardiac stem cells, CSC) üzerinde gerçekleștirilen araștırmalar kalpte, multipotent, c-kit + ve/veya Sca-1 + özellik gösteren, kendini yenileyebilen, koloni olușturabilen kardiyak projenitör hücrelerden (cardiac progenitor cells, CPC) olușan bir CSC rezervuarının varlığını göstermiștir. Bu özellikleri ile kardiyak projenitör hücreler, hasarlanmıș ya da yetmezlik gelișmiș kalbin onarılmasında önemli bir potansiyale sahip gibi görünmektedir (Beltrami, 2003; Torella, 2005; Dawn, 2005; Han, 2010; Barile, 2007). CSC ler uzun süreli kültür ortamında tek hücreden köken alan klon formasyonu olușturma, kardiyak miyozit, damar düz kası ve endotel hücrelere diferansiye olabilme gibi kök hücre benzeri özellikler göstermiș, bunun yanı sıra in-vitro șartlarda kardiyak miyozitlerin hayatta kalma süresini de uzatmıștır (Miyamoto, 2010). Ancak, CPC lerin kalp dokusuna transplantasyonu sonrasında dokunun kendi miyozitleri ile elektrofizyolojik ve mekanik bağlantısı netlik kazanmamıștır (Murry, 2005, Anversa, 2007). Doku içerisine nakledilen kök hücrelerin sağ kalım süresinin kısalığı ve dokunun kendi miyozitleri ile fonksiyonel bir integrasyonunun gösterilememiș olması, CPC kullanılan kök hücre tedavilerinin önünde önemli bir engel olmaya devam etmektedir. Son yıllarda, serin/treonin kinaz (Pim-1) ekspresyonunu artıracak șekilde genetik olarak modifiye edilen CPCeP (Engineering of CPC with the serine/threonine kinase Pim-1) ler ile kalbin rejenerasyon ve remodeling kapasitesinin arttığı, infark olușmuș miyokardiyumda hemodinamik parametrelerin iyileștiği ve nakledildiği fare kalbinde dokunun kendi miyozitlerinin sağkalım süresinin 32 haftaya kadar uzadığı rapor edilmiștir (Fischer, 2009). Yine de, CPCeP lerin rejenerasyon sürecinde esansiyel olan kardiyak miyozitlerle elektromekanik bağlantıları ve elektrofizyolojik özellikleri henüz tanımlanmamıștır. Kardiyak gelișim, riyanodin reseptörleri (RyR), sarkoplazmik retikülum Ca 2+ pompası (SERCA), fosfolamban (PLB) ve L-tipi Ca 2+ kanallarını (DHPR) da kapsayan Ca 2+ ișleme proteinlerinin programlanmıș bir dizinde gerçekleșmesini içermektedir. Bu süreçte Na + -Ca 2+ değiș-tokuș sistemi (NCX) seviyeleri ise aynı kalmakta ya da hafifçe bir azalma göstermektedir (Liu, 2002). Kalsiyum akım yoğunluğu fetal gelișimden doğuma kadar giderek artmakta, sarkoplazmik retikülum maturasyonu ise biraz daha geride kalmaktadır (Tohse, 2004). 1-2 günlük yenidoğan kardiyak miyozitlerinde tam olarak gelișmiș, kalsiyumla indüklenen kalsiyum salınım (Ca 2+ -induced Ca 2+ release, CICR) depolarının varlığı gösterilmiștir (Janowski, 2006). DHPR lerden Ca 2+ giriși ile RyR lerden Ca 2+ salınımı kardiyak miyozit gelișiminin erken evrelerinde ortaya çıkmakta ve yetișkin miyozitlerde CICR için primer tetikleyici haline gelmektedir (Janowski, 2010). Farklı kök hücre tiplerinde Ca 2+ sinyalleme ve elektrofizyolojik olaylar da farklılık göstermektedir. Örneğin, diferansiye olmamıș insan ESC lerinde ve insan ESC lerinden köken alan kardiyak miyozitlerde potasyum (I Kr ), hiperpolarize edici (I f ) ve L-tipi Ca 2+ (I Ca ) akımlarının varlığı gösterilmiștir (Sartiani, 2007). Yine diferansiye olmamıș fare kemik iliği mezenșimal kök hücrelerinde (Mesenchimal stem cells, MSC) (Tao, 2007) ve farelerden elde edilen diferansiye olmamıș kardiyak c- kit + projenitör hücrelerde fonksiyonel I KDR, I Kir ve I Clvol varlığını göstermiștir (Han, 2010). Diğer bir grup çalıșmacı da diferansiye olmamıș fare kemik iliği c-kit + kök hücrelerinde yalnızca dıșa yönelik akımların bulunduğunu, bu kök hücrelerin yenidoğan 92

95 kardiyak miyozitleri ile birlikte kültür yapıldığında ise voltaj-bağımlı Na + ve Ca 2+ kanalları eksprese ettiklerini ancak, bu kanalların elektrofizyolojik anlamda fonksiyonel olmadıklarını bildirmiștir. Bunun yanı sıra, yine bu hücreler arasında fonksiyonel gap bağlantılarının varlığı gösterilememiștir (Lagostena, 2005). Fischer ve ark. CPC ve CPCeP lerin miyokard içine transplantasyonundan 12 hafta sonra bir gap bağlantı proteini olan Connexin (Cx43) bulundurduğunu rapor etmișlerdir (Fischer, 2009). Miyamoto ve ark. CPC nin kardiyomiyozitler ve miyokardiyal yapılanma üzerindeki yararlı etkilerinin direkt hücreler arası elektromekanik bağlantıdan, parakrin etkilerden veya her ikisinden birden kaynaklanabileceği bildirilmiștir (Miyamoto, 2010). Güney Karolina Üniversitesi, Güney Karolina Tıp Üniversitesi ve Clemson Üniversitesi bünyesinde hizmet veren Kardiyak Sinyalleme Merkezi nde gerçekleștirilen bu çalıșmada, CPCeP lerde fonksiyonel Ca 2+ kanallarının varlığı, Ca 2+ ișleme özellikleri ve hücreler arası elektrofizyolojik integrayon, tek bașlarına kültür ortamında ve yenidoğan sıçan kardiyomiyozitleri ile birlikte kültür edilerek araștırılmıștır. GEREÇ VE YÖNTEM Hücre Kültürü Güney Karolina Tıp Üniversitesi yerel etik kurulunun onay ve takibi altında, 4-6 günlük yenidoğan sıçanlar dekapite edildikten sonra toraks açıldı, kalp eksize edildi, ana damarlar ve atriumlar ayrıldı. Ventriküller jilet kullanılarak kıyıldı ve 50 µg/ml tripsin içeren HBSS ile saat boyunca +4 C de bekletildi. Ardından 20 dk boyunca tripsin inhibitörü (200 µg/ml) ne maruz bırakıldı. Tek tek hücreler halinde yenidoğan sıçan kardiyak miyozitleri (NRCM) elde etmek amacıyla kollajenaz (100 U/ml) 30 dk boyunca uygulandı, filtrelendikten ve ardından 1000 rpm de 3 dk santrifüj edildikten sonra %10 FBS, %1 penisilinstreptomisin ve %1 non-esansiyel amino asit içeren DMEM solüsyonunda yeniden süspanse edildi. Fibroblastları elimine etmek amacıyla petr kutularında 60 dakika inkübatörde bekletildi. Izole edilen hücrelerin yaklașık %80 oranında sağlıklı oldukları gözlendi. Cam lameller üzerinde elektrofizyolojik deneylerde kullanılmak üzere hazırlandı. Bir grup NRCM (10 5 hücre/ml) ise koșullu medyum (conditioned medium) elde etmek üzere 37 C de 7 gün boyunca inkübe edildi, süpernatantı toplandı, santrifüj edildi ve %10 FBS ilave edilerek -20 C de depolandı, CPCeP ler için kültür solüsyonu olarak kullanıldı. San Diego Devlet Üniversitesi, Kalp Enstitüsü, Moleküler Biyoloji Laboratuvarı nda geliștirilen kontrol CPC ler, yeșil flosesan protein (Green Fluorescent Protein, GFP) (+) CPC ler ve GFP (+) CPCeP ler %10 FBS, %2 ITS, 0.4 μg/ml EGF, 0.2 ng/ml bfgf ve 0.01 μg/ml LIF içeren DMEM-F12 solüsyonunda pasajlandı. Pasajlanan hücrelerin %70-80 inde belirgin GFP sinyalinin varlığı saptandı. Hücreler tripsin kullanılarak yeniden süspanse edildi, elektrofizyolojik çalıșmaya uygun cam lameller üzerine konuldu. Bir grup CPCeP ise NRCM ve/veya koșullu medyum (1/4 koșullu medyum + 3/4 DMEM-F12 solüsyonu içerisinde 1-3 gün ya da 4-7 gün kültüre edildi. CPCePlerin μm çaplı, bașlangıçta yuvarlak șekilli, daha sonra proliferasyonla birlikte sivri uzantılara sahip oldukları gözlendi. 7 günlük kültürden sonra hücrelerin yuvarlak șeklini kaybettiği, μm çapında, yassı, multilateral șekilli ve dendrit benzeri uzantılara sahip oldukları saptandı. Elektrofizyolojik çalıșmalar için, yeni büyümekte olan, yuvarlak șekilli ve sivri uzantılarla homojen sitoplazmaya sahip, yumușak ve elastik hücre membranı olan, tek bașına yerleșim gösteren, sağlıklı hücreler seçildi. Gözlemsel olarak NRCM ile bitișik olarak yerleșmiș CPCePler, NRCM nin her kontraksiyonu ile senkronize șekilde çekiliyorlarsa fiziksel olarak birbirlerine bağlı oldukları düșünüldü ve elektriksel bağlantı için test edilmeye uygun olduklarına karar verildi. Elektrofizyolojik Ölçümler Hücreler banyo ortamında Tyrode solüsyonu (mm; NaCl 137, KCl 5.4, CaCl 2 2, HEPES 10, MgCl 2 1, Glukoz 10 (ph 7.4, NaOH ile) ile perfüze edildi. Whole-cell patch-clamp ölçümleri DAGAN voltaj-klamp amplifikatör ve pclamp 10.2 yazılım (Molecular Devices Corporation, CA) kullanılarak kaydedildi, Clampfit 10.2 (Molecular Devices Corporation, CA) ve Origin v8.0 (OriginLab, Northampton, MA) programları ile 93

96 değerlendirildi. 3-5 MΩ dirence sahip borosilikat pipetler ise P-87 model (Sutter Instruments, CA) horizontal pipet çekici kullanılarak hazırlandı ve pipetler, hazırlanan zayıf Ca 2+ tamponlu (Sol-1: mm; NaCl 15, CsCl 100, TEACl 20, MgCl 2 0.5, Ca 2 Cl 0.1, EGTA 0.2, HEPES 10, Glukoz 10, MgATP 5 and camp 0.1, 290 mosmol, ph 7.15, CsOH ile) ya da güçlü Ca 2+ tamponlu (Sol-2: mm; NaCl 15, CsCl 94, TEACl 10, Ca 2 Cl 6.2, EGTA 14, HEPES 10, Glukoz 10, MgATP 5 and camp 0.1, 300 mosmol, ph 7.2, CsOH ile) solüsyon ile dolduruldu. Hücre içi serbest Ca 2+ konsantrasyonu ([Ca 2+ ] i ) Sol-1 için 173 nm, Sol-2 için ise 100 nm olarak hesaplandı. İlaç ve kimyasalların yaklașık 20 ms içerisinde hücreye ulașmasını sağlamak üzere elektronik kontrollü mikroperfüzyon sistemi kullanıldı. Bütün deneyler C de gerçekleștirildi. Hücreler Arası Floresan Boya Transferi CPCeP ve NRCM arasındaki gap bağlantılarının varlığı, pipet solüsyonuna floresan boya (Lucifer yellow, 150 μm) ilave edilerek patch lenmiș CPCeP ler aracılığıyla değerlendirildi. Boya transferi sırasında membran kapasitansı ile kalsiyum (I Ca ) ve sodyum (I Na ) akımları da simultane olarak kaydedildi. CPCeP ve NRCM arasında güçlü fiziksel bağlantı gözlenen deneylerin çoğunda CPCeP den NRCM ye boya transferi, hücrenin 5 dk lik diyalizi sonrasında görüntülenmeye bașlandı. Veri analizi için Con2 yazılımı ve Origin v8.0 programı kullanıldı. İmmünhistokimya Ko-kültür ortamındaki CPCeP ve NRCM lerde bir gap bağlantı protein olan Cx43 ün varlığı immünhistokimyasal yöntemle araștırıldı. Kültür medyumu alındı, hücreler PBS ile yıkandı ve %4 paraformaldehit içerisinde oda sıcaklığında 10 dk boyunca fikse olması beklendi. Ardından hücreler 3 kez PBS ile yıkandı, %1 BSA, %0.1 Triton içeren PBS ile +4 C de gece boyunca bloklandı. Bloklama solüsyonunun dıșarı alınmasının ardından primer antikor (1:2,000 anti Cx43, Sigma) oda sıcaklığında 2 saat boyunca uygulandı, sonrasında %0.05 Triton içeren PBS de 2 saat daha +4 C de tutuldu. Hücreler 3 kez PBS ile yıkandı, sekonder antikor anti-rabbit Alexa Fluor 555 (1:2,000) PBS içerisinde 2 saat boyunca oda sıcaklığında uygulandı. Sekonder antikorun dıșarı alınmasından sonra ProLong Gold ile DAPI hücrelerin bulunduğu lamel üzerine uygulanarak oda sıcaklığında 24 saat boyunca bekletildi ve -20 C de deney zamanına kadar muhafaza edildi. Görüntüleme için Leica TCS SPS AOBS konfokal mikroskop sistemi kullanıldı. GFP ekspresyonunu 488 nm dalga boyu Argon Lazer ile görüntülendi. 555 nm dalga boyu Helium Neon Lazer ise Cx43 ekspresyonunu görüntülemek için kullanıldı. Cx43 veri değerlendirmesi için adobe photoshop ve imagej v1.45 kullanıldı. Membran Kapasitansı Tek bașına veya NRCM ye tutunmuș haldeki CPCeP nin membran kapasitans ölçümleri için, membran potansiyeli -60 mv da tutuldu, membran kapasitansı 10 mv luk bir depolarizasyonla olușan kapasitatif akımın bir fonksiyonu (V (mv) x Cm (pf) = I (pa) x Δt (ms)) olarak gösterildi. Ayrıca evrensel bir dönüșüm faktörü (Cm (pf) = 1μF / 1cm2) kullanılarak hücrelerin yüzey alanlarından da membran kapasitansı hesaplandı. CPCeP de I Na ve I Ca Ölçümü CPCeP, NRCM, NRCM lere tutunmuș CPCeP ve CPCeP lere tutunmuș NRCM lerde I Na ve I Ca aktivasyonu için Sol-1 veya Sol-2 kullanıldı. Membran potansiyeli sırasıyla -80 veya -40 mv da tutularak hücrelere yine sırasıyla 50 ya da 70 ms süresince 10 mv intervallerle depolarizan basamaklı voltaj klamp uygulandı, voltajakım ilișkisi büyüklük (pa), yoğunluk (pa/pf) ve maksimum akıma ulașma süresi (pik zamanı, ms) açısından değerlendirildi. CPCeP lerde I Na ve I Ca saptanamaması üzerine, bu hücrelerde uygulanan protokol değiștirildi ve fonksiyonel Na + ve Ca 2+ kanallarının olup olmadığı ms süreli - 80 den +80 mv artan voltaj uygulamaları ile testedildi. Ölçümler sırasında hücrelere 2-5 mm Ca 2+ ya da 10 mm Ba 2+ uygulandı. Deneyler 10 μm nifedipin varlığında tekrarlandı. Ca 2+ akımları hem tek bașına, hem koșullu medyum ortamında hem de NRCM ile birlikte kültüre edilen CPCeP lerde araștırıldı. CPCeP de I NCX ve I ATP Ölçümü NCX akımlarını (I NCX ) ölçmek için patchlenmiș ve membran potansiyeli -60 mv da tutulan hücreye 200 ms boyunca +80 mv depolarizan, hemen ardından ms boyunca -120 mv a kadar giderek azalan 94

97 voltaj klamp uygulanarak olușan akımlar kaydedildi. Deney 5 mm Ni 2+ varlığında tekrarlandı ve Ni 2+ e duyarlı I NCX değerlendirildi. ATP ile indüklenen akımların (I ATP ) araștırılması için ise patchlenmiș hücrenin membran potansiyeli -80 mv da tutuldu, hücreler bu süre içerisinde 1s boyunca 100 μm ATP ye maruz bırakıldı. İki Boyutlu Konfokal Görüntüleme CPCeP ve NRCM ye ait hücre içi Ca 2+ salınımları 20 μm Fluo-4 AM kullanılarak Noran Odyssey XL iki boyutlu hızlı lazer tarayıcılı konfokal mikroskobi sistemi (Noran Instruments, Madison, WI) tutturulmuș suimmersiyonlu objektif lensi bulunan Zeiss Axiovert TV135 inverted mikroskop ile ölçüldü. Argon iyon lazerin eksitasyon dalga boyu 488 nm ye ayarlandı ve 515 nm ve daha büyük dalga boyunda floresan emisyonu ölçüldü. Deney protokolüne göre kare/s görüntü alındı. Ca 2+ a ait floresan sinyalleri 2 s süresince uygulanan 100 µm ATP, 10 mm kaffeine ya da 100 mm KCl ile aktive edildi. Görüntüler ortalama 3 x 3 piksel ile filtrelendi ve hesaplanan floresan yoğunluğu F/F 0-1 (F; pik değer, F 0 ortalama dinlenim floresan yoğunluğu) olarak ifade edildi. Veri analizi için Con2 yazılımı ve Origin v8.0 (OriginLab, Northampton, MA) programı kullanıldı. ATP (100 µm), kafein (10 mm) ve KCl (100 mm) Tyrode solüsyonu içerisinde uygulandı, KCl eșit ekimolar konsantrasyonlarda Tyrode içerisindeki Na + ile değiștirildi. Lucifer Yellow (150 µm) pipet solüsyonu içerisinde hazırlandı. Nifedipin (10 µm) DMSO içerisinde hazırlanıp stoklandı ve K + suz Tyrode solüsyonunda seyreltilerek kullanıldı. Fluo-4 AM (20 µm) DMSO içerisinde çözüldü ve Tyrode solüsyonunda dilüe edildi. Deneylerde kullanılan bütün ilaç ve kimyasallar günlük olarak hazırlandı. Veri Analizi Sonuçlar Ortalama ± Standart hata olarak verildi. Deneye alınan hücre sayısı n ile ifade edildi. İstatistiksel değerlendirme için eșleștirilmemiș Student s t-testi, ikiden fazla grup karșılaștırmalarında ise tek yönlü varyans analizi post hoc Neuman Keuls kullanıldı. P <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. İstatistiksel anlamlılıklar, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 ve **** p < ile gösterildi. BULGULAR 1. Membran Kapasitansı Ve Gap Bağlantılar NRCM ye tutunmuș haldeki CPCeP patchlenip 10 mv depolarizan voltaj uygulandığında, geniș, bi-eksponansiyel bir kapasitatif akım izlendi (Șekil 1, siyah trase). Sonrasında NRCM ler CPCeP den ayırıldı, ortadan kaldırıldı ve voltaj uygulaması tekrarlandı. CPCeP nin tek bașına kaldığı durumda ise daha dar, mono-eksponansiyel bir kapasitatif akım oluștuğu tesbit edildi (Șekil 1, kırmızı trase). Hücrelerin membran kapasitansları hem yüzey alanına göre hem de kapasitatif akımın bir fonksiyonu olarak așağıdaki gibi hesaplanarak karșılaștırıldı. Yüzey alanına göre; Cm (pf) = 1μF / 1cm 2 CPCeP Cm = 10 μm x 110 μm x 2 = 22 pf Üç adet NRCM Cm = 80 μm x 80 μm x 2 = 128 pf Akımın bir fonksiyonu olarak; Cm (pf) = I(pA) x Δt (ms) / ΔV (mv) CPCeP Cm = 500 pa x 0.5 ms / 10 mv = 25 pf Üç adet NRCM Cm = 500 pa x 2.5 ms / 10 mv = 125 pf CPCeP nin NRCM ile elektriksel olarak bağlantı kurduğu, bu nedenle de NRCM ye tutunmuș halde iken CPCeP üzerinde daha fazla bir membran kapasitansı ölçüldüğü sonucuna varıldı ve daha detaylı incelemelere geçildi. 95

98 Șekil 1. Membran kapasitans ölçümleri. A; evrensel dönüșüm faktörü (Cm=1μF/1cm 2 ) ne göre hücre yüzey alanı üzerinden ve B; membran potansiyeli -60 mv da tutulmuș iken 10 mv luk depolarizyona cevap olarak olușan akımın bir fonksiyonu olarak membran kapasitansları hesaplandı. Kırmızı çizgi bașlangıç noktasını, mavi çizgi tek bașına CPCeP nin, yeșil çizgi ise CPCeP ve NRCM nin depolarizasyon uygulamasından sonra istirahat potansiyeline dönüș süresini göstermektedir. NRCM ye tutunmuș veya tek bașına olan CPCeP ve NRCM lerin membran kapasitansları ölçüldü, CPCeP lerde ortalama membran kapasitansı 52.7 ± 2.3 pf (n= 219), NRCM lerde ise 45.5 ± 7.7 (n=15) olarak hesaplandı, NRCM ye tutunmuș haldeki CPCeP lerde ise ortalama membran kapasitansının (110.6 ± 14.5 pf, n= 25) tek CPCeP de ölçülene göre anlamlı derecede (p <0.001) yüksek olduğu görüldü (Șekil 2.A). Șekil 2. A; NRCM ve CPCeP lerin tek bașına veya birbirine tutunmuș halde ölçülen membran kapasitansları. B; NRCM e elektromekanik olarak tutunmuș olduğu Floresan boya transferi ile saptanmıș CPCeP lere ait ortalama membran kapasitansı ayrı olarak gösterildi. CPCeP ile NRCM arasındaki elektromekanik bağlantının varlığı bir grup patchlenmiș hücrede (n=6) membran kapasitans ölçümü ile simultane olarak gerçekleștirilen hücreler arası floresan boya transferi ile doğrulandı (Șekil 3.). Floresan boya transferi yapılan ve yapılmayan NRCM ye tutunmuș CPCeP lerin membran kapasitansları arasında anlamlı bir fark olmadığı görüldü. 96

99 Șekil 3. CPCeP ve NRCM arasındaki gap bağlantılarının floresan boya transferi ile görüntülenmesi. A: CPCeP floresan boya (Lucifer Yellow, 150 μm) içeren pipet solüsyonu ile patchlendi ve diyaliz edildi. B: Floresan yoğunluğundaki değișiklik zaman bağımlı olarak gösterildi. Floresan boyanın transferi, CPCeP membranının rüptüründen 5 dk sonra görüntülenmeye bașladı ve 15 dk da neticelendi. Floresan yoğunluğu F/F max (F max pik değeri, F ise bazal floresan yoğunluğunu) olarak ifade edildi. Gap bağlantı proteini Cx43 ün varlığıni göstermek için ise immünhistokimya yöntemi kullanıldı. Cx43 partiküllerinin hücre yüzeyinde dağınık halde yerleștiği izlendi. Hücre bașına düșen Cx43 partikül sayısı CPCeP lerde 28 ± 6 (n=12) iken, NRCM ye bağlandığı durumda (67 ± 5, n=15) anlamlı (p <0.0001) bir yükselme gösterdi. Partikül büyüklükleri açısından CPCeP nin tek bașına ya da NRCM ye tutunmuș hali arasında bir fark görülmedi. (Șekil 4) 2. CPCeP lerdeki İyon Akımları NRCM, CPCeP ve NRCM ye tutunmuș haldeki CPCeP ile CPCeP ye tutunmuș haldeki NRCM de membran potansiyeli -40 ve -80 mv da tutulup, 70 ve 50 ms süresince depolarizan basamaklı voltaj klamp uygulaması ile sırasıyla I Ca ve I Na akımları test edildi. Yukarıda belirtilen protokol kullanılarak, toplamda 68 adet CPCeP üzerinde çalıșıldı ancak, hiçbirinde fonksiyonel Na + ve Ca 2+ akımları saptanamadı (Șekil 5). Buna karșılık, NRCM, CPCeP ye tutunmus haldeki NRCM ve NRCM ye tutunmuș haldeki CPCeP lerden hem I Ca hem de I Na akımları elde edildi (Șekil 6.A ve Șekil 7.A). Ca 2+ akımının -40 mv da aktive olduğu, pik değerinin 0 mv da, reversal potansiyali ise +40 mv civarında oluștuğu görüldü (Șekil 6.C). NRCM ye tutunmuș olan CPCeP de maksimum Ca 2+ akım büyüklüğü ortalaması ± pa, NRCM de ve CPCeP ye tutunmuș halde ise sırasıyla ± pa ve ± pa olarak kaydedildi. Maksimum akım görülen voltaj basamağındaki pik zamanı, NRCM ye tutunmuș olan CPCeP lerde (22.7 ± 5.1 ms), NRCM nin tek bașına (5.6 ± 0.7 ms) veya CPCeP ile tutunmuș haldekinden (4.9 ± 0.4 ms) anlamlı olarak daha uzundu (Șekil 6.B). Akım yoğunlukları değerlendirildiğinde en düșük değere sahip grubun NRCM ye tutunmuș haldeki CPCeP ler (1.13 ± 0.20 pa/pf) olduğu görüldü. NRCM lerde Ca 2+ akım yoğunluğu 3.36 ± 0.70 pa/pf, CPCeP ye tutunmuș NRCM de ise 4.02 ± 0.18 pa/pf olarak hesaplandı (Șekil 6.C ve D). 97

100 Șekil 4. CPCeP tek bașına (A) ve NRCM ile bağlanmıș durumda iken (B) Cx43 ekspresyonunun immünhistokimyasal yöntemle görüntülenmesi. CPCeP ve NRCM beyaz oklarla, Cx43 e ait partiküller ise turuncu oklarla gösterildi. C; Cx43 partikül boyutu (μm) ve hücre bașına düșen ortalama partikül sayısı tablo halinde verildi. Șekil 5. CPCeP lerde I Ca ve I Na na ait trase örnekleri. A; Ca 2+ akımlarını test etmek için hücre membran potansiyeli -40 mv da tutuldu. 70 ms süreli depolarizan basamaklı voltaj klamp 10 mv artıșlarla uygulandı. B; Na + akımları için ise membran potansiyeli -80 mv da tutuldu ve 50 ms süreli basamaklı depolarizan voltaj klamp yine 10 mv artıșlarla uygulandı. Uygulamalarda her iki pipet solüsyonu (Sol-1 ve Sol-2) da denendi. 98

101 Șekil 6. Tek bașına ya da CPCeP ye tutunmuș NRCM de ve NRCM ye tutunmuș haldeki CPCeP de I Ca ölçümü. Hücre membran potansiyeli -40 mv da tutuldu ve 70 ms süreli depolarizan basamaklı voltaj klamp 10 mv aralıklarla uygulandı. Her grup için; elde edilen I Ca a ait örnek traseler (A), pik zamanı (ms) ortalamaları (B), Akım Voltaj ilișkisi (C) ve 0 mv voltaj klamp ile elde edilen Ca 2+ akım yoğunluklarının ortalamaları (D) görülmektedir. Na + akımlarının aktivasyonu için membran potansiyeli -80 mv da tutuldu ve akımın pik değerine -40 mv da ulaștığı görüldü. Reversal potansiyeli ise +30 mv civarındaydı (Șekil 7.C). NRCM ye tutunmuș olan CPCeP lerde büyüklüğü ± pa olan I Na da kaydedildi. Na + akım büyüklüğünün NRCM lerde ± pa, CPCeP ye tutunmuș NRCM lerde ise ± pa olduğu saptandı. -40 mv da görülen pik zamanı ise NRCM ye tutunmuș CPCeP lerde (5.08 ± 0.93 ms), NRCM de (3.1 ± 0.17 ms) ve CPCeP ye tutunmuș olan NRCM de (2.43 ± 0.17 ms) ölçülene göre anlamlı derecede daha uzundu (Șekil 7.B). NRCM ye tutunmuș CPCeP lerde Na + akım yoğunluğu ± 5.61 pa/pf iken, NRCM lerde ± pa/pf ve CPCeP ye tutunmuș NRCM lerde ise ± pa/pf olarak hesaplandı (Șekil 7.C ve D). Elde edilen sonuçlar, CPCeP lere uygulanan elektriksel pulse ın NRCM ye iletildiğini ve NRCM lerde voltaj bağımlı kanalları tetiklediğini, Na + ve Ca 2+ akımlarının da bu yolla CPCeP ler üzerinden ölçülebildiğini, bir bașka değișle CPCeP ve NRCM arasında elektriksel bir bağlantı bulunduğunu gösterdi. Depolarizan basamaklı voltaj klamp uygulaması ile CPCeP lerde Na + ve Ca 2+ akımları saptanamaması üzerine, akımların çok küçük olabileceği ve/veya hızla inaktive edildikleri düșünülerek farklı bir protokol denendi. -80 ile +80 mv arasında ms süreli giderek artan voltaj klamp uygulandı. Bu uygulama ile CPCeP lerde (n=58) Na + akımını yine kaydedilemedi. Ancak belirgin Ca 2+ akımı izlendi. Elde edilen akımın hızla inaktive olmasını engellemek için perfüzyon solüsyonundaki Ca 2+, 10 mm Ba 2+ ile değiștirildi ve 10 μm nifedipine duyarlı Ca 2+ akımları elde edilerek değerlendirildi (Șekil 8). 99

102 Șekil 7. Tek bașına ya da CPCeP ye tutunmuș NRCM de ve NRCM ye tutunmuș haldeki CPCeP de I Na ölçümü. Hücre membran potansiyeli -80 mv da tutuldu ve 50 ms süreli depolarizan basamaklı voltaj klamp 10 mv aralıklarla uygulandı. Her grup için; elde edilen I Na a ait örnek traseler (A), pik zamanı (ms) ortalamaları (B), Akım Voltaj ilișkisi (C) ve -40 mv voltaj klamp ile elde edilen Na + akım yoğunluklarının ortalamaları (D) görülmektedir. Șekil 8. CPCeP lerde Ca 2+ akımının ölçülmesi. A; ms süreli, -80 ile +80 mv arasında giderek artan depolarizan voltaj klamp uygulamasına ait protokol ve örnek trase görülmektedir. Uygulamada Ca 2+ yerine 10 mm Ba 2+ kullanıldı ve deney 10 μm nifedipin varlığında tekrar edildi. Yeni büyümekte olan (1-2 günlük, B) ve yașlı (5-7 günlük, C) CPCeP lere ait fotoğraflar alt panelde izlenmektedir. 100