ÜNİVERSİTE ÖĞRENCİLERİ YURT İÇİ / YURT DIŞI ARAŞTIRMA PROJELERİ DESTEKLEME PROGRAMI SONUÇ RAPORU

Transkript

1 ÜNÜ 2209 ÜNİVERSİTE ÖĞRENCİLERİ YURT İÇİ / YURT DIŞI ARAŞTIRMA PROJELERİ DESTEKLEME PROGRAMI SONUÇ RAPORU PROJE BAŞLIĞI: Meme Kanseri Hücre Hattında Kızılçam (Pinus brutia) Kabuk Ekstratının Antikanserojen Etkisinin İncelenmesi PROJE YÜRÜTÜCÜSÜNÜN ADI: Mehmet KİRAZLAR DANIŞMANININ ADI: Prof. Dr. Sevinç İNAN

2 GENEL BİLGİLER PROJENİN KONUSU PROJE YÜRÜTÜCÜSÜNÜN ADI DANIŞMANIN ADI Meme Kanseri Hücre Hattında Kızılçam (Pinus brutia) Kabuk Ekstratının Antikanserojen Etkisinin İncelenmesi Mehmet Kirazlar Prof. Dr. Sevinç İNAN PROJE BAŞLANGIÇ VE BİTİŞ TARİHLERİ Eylül 2013 Eylül 2014 Sonuç Raporu Formatı: 1. Giriş Proje konusu hakkında kısa bilgi 2. Rapor dönemlerinde yapılan çalışmalar I. Dönem... II. Dönem Sonuç: 4. Çıktılar [Yayınlar, sunumlar v.b.] PROJE YÜRÜTÜCÜSÜNÜN ADI SOYADI - İMZA DANIŞMANIN ADI SOYADI - İMZA Tarih Mehmet KİRAZLAR Prof. Dr. Sevinç İNAN

3 1.GİRİŞ Meme kanseri tüm kadınlarda, özellikle endüstriyel ülkelerdeki kadınlarda çok sık görülen kanser türüdür (Charles et al., 1995). Heterojen ve karmaşık yapıda bir kanser türü olup genetik, diyet ve çevresel faktörlerin etkisi altında kalabilmektedir (Russo and Russo 2000). Kadınlarda görülme olasılığı en yüksek kanser sıralamasındadır. Histolojik olarak meme karsinomlar in situ ve invaziv karsinomlar olmak üzere iki ana gruba ayrılmaktadır. İn situ karsinomda malign epitelyal hücreler bazal membranla çevrili duktus ve asinuslar içinde sınırlı iken, invaziv karsinomda neoplastik hücreler bazal membranı aşarak stromaya invazyon göstermektedir. Bu nedenle invaziv karsinomlar, lenfatik ve kan damarlarını invaze ederek bölgesel lenf düğümlerine ve uzak organlara metastaz yapabilme kapasitesine sahiptir (İlhan ve ark., 2006). Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7) östrojen reseptör negatif olması nedeni ile MDA-MB 231 ile karşılaştırıldığında dana az malign olan bir hücre dizinidir. Bu iki dizin hücre meme kanseri araştırmalarının büyük çoğunluğunda kullanılan dizin hücre hatlarıdır (Lacroix et al., 2006). MDA-MB 231 invaziv bir adenokarsinom olup meme kanseri olup östrojen negatif bir hücre hattıdır (Brinkley et al., 1980). Pinus familyasının genel farmakolojik özelliklerinin antiinflamatuar (Rohdewald P. 2002), antioksidan (Guri et al., 2006), antineoplastik (Vuorela S. 2005) ve immunomodulatör (Li et al., 2007) olduğu bilinmektedir. Bu özellikleri Pinus familyasının siklooksijenaz aktivitesi, prostoglandin E2 (PGE2) üretimi (Karonen et al., 2004), nitrik oksit sentaz (NOS) aktivitesi (Virgili F. 1998) ve kanser (Li et al., 2007) ile ilişkilerini değerlendirme çalışmalarına önem kazandırmıştır. Pinus cinsinin Türkiye deki en önemli türlerinden olan kızılçam (Pinus brutia Ten, Syn.: Pinus pityusa Stev.) Sylvestris alt seksiyonuna ait diploxylon çam türüdür. Bu çam türü Doğu Akdeniz bölgesinin bir türü olup dünyada Türkiye de akdeniz iklimi hakim olan bölgelerde geniş yayılım göstermektedir (Kasaplıgil B 1999). Kızılçam bitkisinin uçucu ekstraksiyonlarının gaz kromatografisi ve kütle spektometresi ile analizinde 422 ayrı etken içerdiği anlaşılmıştır (Mateus et al., 2010). Kızılçam metre boylarında kalın dallı bir ağaçtır. Genç sürgünleri kalın ve kızıl renktedir. Hızlı büyüme siklusu ile ürün eldesi açısından verimli bir türdür. Kuraklığa dayanıklı olup ılık hava yaşam şartları ortamı genel aurasıdır. Genellikle sahil kesimlerinde yayılış yapmasına rağmen 1200 m yükseltilere değin çıkabilmektedir. Kızılçam Türkiye orman envanterlerine göre 5,4 milyon hektar alanı ile ülkemizde en geniş yayılış

4 alanına sahip türlerin başında gelmektedir. Toplam ormanlık alanın %15 kızılçam ormanları ile kaplıdır (Sarıbaş ve Ekici 2004). Kızılçam Türkiye de ağaçlandırmalarda en yaygın olarak kullanılan türdür. Türkiye de yapılan ağaçlandırmalarda kızılçamın payı %40 a yaklaşmaktadır. Kızılçamın ağaçlandırma potansiyelinin yüksek olması genetik ıslah çalışmalarının daha düşük maliyetle gerçekleştirilmesi açısından önemli bir özelliktir (Usta 1991). Kızılçam kabuğu ekstraktının, insan sağlığı açısından çok değerli polifenol maddeleri içermektedir. Bu maddelerin başında oligomerik proantosiyanidin (OPC) denilen çok değerli bir polifenol gelmektedir. OPC veya fenoller, ilk olarak üzüm tohumundan ya da çam kabuğundan izole edilmiş ve ayrıca yeşil çay, üzüm, soğan, bezelye ve maydanozda da bulunur. OPC, farmakolojik olarak tanen denen flavonoid lere yakın karmaşık polifenol bileşikleri olarak sınıflandırılmıştır. OPC şimdiye kadar kılcal damar stabilitesi ve lenfatik drenajı pekiştirmek için kullanılmıştır. OPC, güçlü antioksidandırlar ve damar koruyucu etkilidir (Çetin ve ark 2013). OPC, lipooksigenaz ve siklooksigenazı inhibe eder (Cretu et al., 2013) ve bu da kanserin engellenmesinde faydalı olması muhtemeldir. Yapılan bir çalışmada, OPC'nin prostat kanserinde kemoterapi etkisi ile önemli bir ajan olduğu bildirilmiştir (Neuwirt et al., 2008). Kızılçam kabuk ekstratından polifenollerin yanında tanen ve lignin eldesi de mümkündür. Lignin hücre membran yapısında dayanıklılığı artırdığı gösterilmiştir (Lebo et al., 2001). Kabuğun en önemli bileşenlerinden biri tanenlerdir. Tanenler çok eski zamanlardan beri bilinen ve dericilikte sepi maddesi olarak kullanılan makromolekül bileşiklerdir. Hayvan derisindeki proteinler ile etkileşime sokulan tanenler derideki proteini çöktürerek derinin bozulmayan, esnek ve bakteri etkilerine karşı stabil hale getirilmesini sağlamaktadır. Ayrıca geleneksel olarak yerel halkın ihtiyaçları için bitkisel ilaçlarda; antiviral, antimikrobiyal ve antikansorejen etkileri nedeni ile tıpta ve farmakolojide doğal hammadde olarak bitki tanenleri kullanılmaktadır (Kwak et al., 2006, Scalbert 1991). Son yıllarda doğal koruyucu maddeler arasında çevreye zararlı etkileri bulunmayan bitkisel ekstraktlar içinde tanenler önemli yer tutmaktadır. Çalışmamızda kızılçam kabuk ekstratı 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml ve mg/ml dilüsyonlarında toksik etkisi MDA-MB231 meme kanseri dizin hücrelerinde sitotoksisite ve hücre ölümü (apoptozis) açısından değerlendirildi.

5 2. RAPOR DÖNEMLERİNDE YAPILAN ÇALIŞMALAR I. DÖNEM: Proje kabul edildikten sonra deneyde kullanılacak olan malzemelerin temini ve laboratuar ortamı sağlandı. Bitkisel materyal: Bu çalışmada Balıkesir Kale Naturel Ltd Şti. nden temin edilen Pinus brutia kabuk ekstratı kullanıldı. Hücre kültürü: Çalışmamızda Celal Bayar Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Histoloji-Embriyoloji Anabilim dalı öğretim üyesi Prof.Dr. M.İbrahim Tuğlu dan temin edilen MDA-MB 231 hücre dizini kullanıldı. Hücrelerin çoğalması ve konfluent olmasını sağlamak için %1 penisilin-streptomisin %1 L-glutamin ve % 10 fötal sığır serumu (FBS) içeren RPMI1640 ile kültür ortamına bırakılarak 370C sıcaklıkta, yaklaşık % nem orana sahip etüvde inkübe edildi. İki günde bir kültür mediumları değiştirildi. Çoğaltılan hücrelerin bir kısmı çalışmada kullanılmak üzere %10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren kültür mediumunda -800C de dondurularak saklandı. MDA-MB 231 hücrelerinin inverted ikroskop görüntüsü. X100. MDA-MB 231 hücrelerinin inverted mikroskop görüntüsü. X400.

6 II. DÖNEM Dondurularak saklanan hücreler dondurucudan çıkarılarak uygun koşullarda yaşatıldı. Kızılçam kabuk ekstraktı farklı dozlarda hazırlanarak MDA-MB 231 meme kanseri hücrelerine uygulandı ve ekstraktın sitotoksik etkisi MTT ve TUNEL yöntemleri ile değerlendirildi. Hücrelerin çoğaltılması: Hücreler dondurucudan çıkarılarak %1 penisilin-streptomisin %1 L-glutamin ve % 10 fötal sığır serumu (FBS) içeren RPMI-1640 ile kültür ortamında, 37 0 C sıcaklıkta, yaklaşık % nem orana sahip etüvde inkübe edildi. İki günde bir kültür mediumları değiştirildi. Sitotoksisite testi: Hücreler çoğaltıkdıktan sonra MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) sitotoksisite testi yapıldı. Bunun için hücreler 96 kuyucuklu kültür kabına ekilerek hücrelerin yapışması için 24 saat inkübe edildi. Ertesi gün kızılçam (Pinus brutia) kabuk ekstraktı DMSO ile dilue edilerek 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml ve mg/ml doz uygulaması 24 saat süreyle yapıldı. Her dilusyon üçer kez tekrarlandı. 24 saat sonra ekstrakt içeren kültür mediumu çekilip atıldı. 100 μl yeni medium konularak üzerine 10 μl MTT (M-6494, İnvitrogen) solusyonu eklendi ve 37 0 C de 4 saat süre ile inkübe edildi. Süre sonunda medium ve MTT solusyonu atılarak her bir kuyucuğa 50 μl DMSO konularak 10 dakika sonra spektrofotometrede okutuldu.

7 Hücrelere olan toksik etkinin anlaşılması için yapılan MTT testinde artan dilüsyonlarda toksik etkinin çoğalmayı durdurduğunu ancak hücre ölümünü fazlaca etkilemediğine işaret etti (Resim 1 ve Tablo 1). Kızılçam kabuk ekstraktı uygulanan meme kanseri hücrelerinde hücre ölümü ve boşluklu alanlar. X400. Resim 1. Kültür ortamında Kızılçam kabuk ekstraktına maruz kalmış MDA-MB 231 hücrelerinin davranışları. Tablo 1. Kızılçam ekstresinin meme kanseri dizin hücresine toksik etkisinin MTT analizi ve kültür ortamında MTT formazon reaksiyonunun fotoğrafı.

8 Apoptotik hücre varlığı: TUNEL yöntemi ile apoptotik hücre varlığına bakıldı. Bunun için ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (S7101, Millipore) kullanıldı. Hücreler 24 kuyucuklu hücre kültür kaplarına ekildi ve hücrelerin yapışması için bir gece inkübe edildi. Ertesi gün kızılçam kabuk ekstraktı 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml ve mg/ml olacak şekilde uygulandı ve 24 saat bekletildi. Süre sonunda medium atılarak hücreler % 4 lük paraformaldehit ile tespit edildikten sonra fosfat tamponu (PBS) ile yıkandı. Yıkandıktan sonra 20-µg/ml Proteinaz-K 37 0 C de 15 dak. süre ile uygulandı. 5 şer dakika 3 kez PBS ile yıkamayı takiben 5 dak. % 3 lük hidrojen peroksit ile muamele edildikten sonra yeniden 5 şer dakika 3 kez PBS ile oda ısısında yıkandı. Örnekler 5 dak. Equilibration buffer ile oda ısısında tutulduktan sonra TdT-enzimi ile nemli atmosferik ortamda 37 0 C de 60 dak. plastik slipler kesitleri kapatacak şekilde bekletildi. Sürenin ardından Stop Wash Buffer ile 10 dak. bekletildikten sonra Antidioksigenin Peroksidaz Konjugatı ile 30 dak. muamele edilen örnekler 5 şer dakika 3 kez PBS ile yıkandı. Ardından DAB (Diaminobenzidin) ile boyama yapıldı, birkaç kez distile su ile yıkandı. Hücre çekirdek boyaması Mayer s Hematoksileni ile yapıldı. Kör yöntemle TUNEL pozitif hücreler saptandı ve ortalamalar istatiksel olarak değerlendirildi. İstatistiksel Analiz: Tüm MTT analizine ait absorbans sonuçları ve apoptotik hücre sayıları graphpad yazılım programında ortalama ± Standart hata olarak hesaplandı. MDA-MB 231 hücrelerinin kızılçam kabuk ekstraktı içinde PBS kullanılmış kontrol boyamalarında negatif boyanma. X200 MDA-MB 231 hücrelerinin kızılçam kabuk ekstraktı içinde toksik etkiye bağlı TUNEL pozitif boyanma. X200

9 MDA-MB 231 hücrelerinin kızılçam kabuk ekstraktı içinde PBS kullanılmış kontrol boyamalarında negatif boyanma. X400 MDA-MB 231 hücrelerinin kızılçam kabuk ekstraktı içinde toksik etkiye bağlı TUNEL pozitif boyanma. X400 Resim 2. kızılçam kabuk ekstratının MDA-MB 231 dizin hücresine toksik etkisinin TUNEL immunohistokimyasında az miktarda hücrenin pozitif boyandığı bulundu. Tablo 2. Kızılçam kabuk ekstraktının MDA-MB 231 dizin hücresine toksik etkisinin TUNEL immunohistokimyasında skorlama yapılarak gerçekleştirilen morfometrik analizinde gruplar arasında anlamlı fark olmadığı izlendi.

10 3. SONUÇLAR Hazır halde gelen ekstraktlar katlı dilüsyonlar olarak MDA-MB 231 hücrelerinin semikonfluent aşamasında üzerine konuldu. Hücreler kontrol olarak kullanılan sadece besiyeri (BY) ve DMSO çözücüler içinde normal davranışlarını göstererek sıkı şekilde birbirine yapışarak üremeye devam ettiler. Her kuyucuğa hücre yerleştirilerek başlatılan kültürlerde yaklaşık 3 gün içerisinde konfluent olan hücrelerde kullanılan ekstraktın dilüsyonlarına bağlı olarak bozulmalar ve kayıplar gözlendi (Resim 1). Ekstraktlar hücrelerin ölüm mekanizması olarak kullandıkları apoptoz için boyandıklarında (TUNEL) bazı hücrelerin pozitif boyandıkları gözlendi (Resim 2). TUNEL pozitif görülen hücrelerin skorlama ile yapılam morfometrik değerlendirmesinde çok fazla hücrenin boyanmadığı ve gruplar arasında farkın fazla olmadığı görüldü (Tablo 2). Biz bu çalışmada kızılçam ekstresinin meme kanseri dizin hücrelerinde toksik etkisini araştırıp tedavi açısından kullanılacak bir ürün olması ihtimalini inceledik. Ekstraktın hücre çoğalmasına etki etmediğini ve hücre ölümüne neden olmadığını saptadık. Biz bu çalışmada kızılçam ekstresinin meme kanseri dizin hücrelerinde toksik etkisini araştırıp tedavi açısından kullanılacak bir ürün olması ihtimalini inceledik. Ekstraktın hücre çoğalmasına etki etmediğini ve hücre ölümüne neden olmadığını saptadık. Kızılçam kabuğu ekstraktı içerisinde özel bir etken olarak oligomerik proantosiyanidin (OPC) başta olmak üzere fenolik bileşikler ve flavanoidlerin bulunduğu birçok çalışma ile gösterilmiştir (Apak ve ark., 2004). Kızılçam ağacı ekstrelerin MTT analizinde çoğalan hücreyi durdurdukları ve antiproliferatif etki gösterdikleri önceki çalışmalarda saptanmış olup bir çalışmada pinusun bir başka türünde de bu etkinin var olduğu ayrıca apoptozuda arttırdığı görülmüştür (Zhang et al., 2012). Uzun yıllardır Çin tıbbında etkin olarak kullanıldığı bilinmekte olup in vivo olarak servikal kanser tanısı konmuş hastalara 158 ve 250 mg/kg dozunda verildiğinde tümör hacmini azalttığı görülmüş ve bu antitümör etkisi, çoğalma belirteçlerini ile birlikte oksidatif stres belirteçlerini (süperoksit dismutaz, malondialdehit) ve apoptoz belirteçlerini (p53, Bcl-2) azaltması ile ilişkilendirilmiştir (Li et al., 2007).

11 Yapılan bir çalışmada faklı pinus türüne (Pinus massonian) ait kabuk ekstraktı farklı çözücülerde hazırlanmış ve antitümörojenik etkisi, meme (MDA-MB-231), servikal (Hela), akciğer(a549) ve karaciğer (BEL-7402) kanser dizinlerinde araştırılmıştır. Etil asetat fraksiyonu ile elde edilen ekstraktın servikal ve karaciğer kanser hücreleri üzerine zayıf etki gösterirken suda hazırlanan ekstrakt servikal kanserde zayıf etkiye sahip olduğu diğer kanser hücrelerine etki etmediği saptanmıştır (Shen et al., 2010). Benzer şekilde Eggenschwiler ve arkadaşları, farklı cinslerdeki ağaçlara ait ekstraktların farklı meme kanseri dizinleri (Kpl-1, MCF-7, Mfm-223) üzerine sitotoksik etkisini çalışmışlar ve meşe ve elma ağacı ekstraktlarının çam ve göknar ekstratlarına oranla daha etkili olduğu, kanser hücrelerini öldürdüğü ve immun ve stress yanıtına ait mrna seviyelerinin daha iyi olduğu belirlenmiştir (Eggenschwiler et al., 2006). Çalışmamızın sonucunda kızılçam kabuk ekstraktı ile yapılan denemelerde MDA-MB-231 dizin hücrelerinde çoğalmaya ve hücre ölümüne etkisi belirgin olmadığı ve kanser tedavi edici yönünde etkisinin bulunmadığı saptandı. Kızılçam kabuk ekstraktının etkisinin diğer hücre dizinleri ile karşılaştırılması ve önceki çalışmalarda görülen farklı hücre dizinlerinde farklı etki göstermesi incelenmelidir. Kızılçam kabuk ekstraktı ile yapılan çalışmalarda gösterildiği üzere oksidatif stres ile ilişkisi ortaya konmalıdır. Hem farklı kanser hücrelerinde hem de farklı mekanizmalarda olan etkisi İleri tekniklerle araştırılması gerekir. TÜBİTAK 2209-A Üniversite Öğrencileri Yurt İçi Araştırma Projeleri Programı na desteğinden dolayı teşekür ederiz.

12 KAYNAKLAR Apak R, Güçlü K, Ozyürek M, Karademir SE. Novel total antioxidant capacity index for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric ion reducing capability in the presence of neocuproine: CUPRAC method. J Agric Food Chem. 2004; 52(26): Brinkley BR, Beall PT, Wible LJ, Mace ML, Turner DS, Cailleau RM. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Res. 1980, 40(9): Cetin EO, Yesil-Celiktas O, Cavusoglu T, Demirel-Sezer E, Akdemir O, Uyanikgil Y. Incision wound healing activity of pine bark extract containing topical formulations: a study with histopathological and biochemical analyses in albino rats Pharmazie Jan; 68 (1) : Charles,M.H. Susan, ML. Breast cancer, In "Cancer Treatment", Eds. Charles M Haskell and Jcmathen S. Berek W. B. Saunders Company, 4th edition, Philadelphia, 1995, p Cretu E, Miron SD, Miron A. Bioactivity screening of Pinus brutia bark extracts: superoxide dismutase-like and nitric oxide scavenging effects. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2013, 117(2): Eggenschwiler J, Patrignani A, Wagner U, Rehrauer H, Schlapbach R, Rist L, Ramos MH, Viviani A. Gene expression profiles of different breast cancer cells compared with their responsiveness to fermented mistletoe (Viscum album L.) extracts Iscador from oak (Quercus), pine (Pinus), white fir (Abies) and apple tree (Malus) in vitro. Arzneimittelforschung. 2006; 56(6A): Guri A, Kefalas P, Roussis V. Antioxidant potential of six pine species. Phytother Res. 2006, 20(4):263-6.

13 Ilhan G, Karakus S, Andic N. Risk factors and primary prevention of acute leukemia. Asian Pac J Cancer Prev. 2006, 7(4): Karonen M, Hämäläinen M, Nieminen R, Klika KD, Loponen J, Ovcharenko VV, Moilanen E, Pihlaja K. Phenolic extractives from the bark of Pinus sylvestris L. and their effects on inflammatory mediators nitric oxide and prostaglandin E2. J Agric Food Chem. 2004; 52(25): Kasaplıgil, B.1999.Türkiye nin Geçmişteki ve Bugünkü Çam Türleri. O.G.M. Yayını No: 674, 99s., Ankara. Kwak CS, Moon SC, Lee MS. Antioxidant, antimutagenic, and antitumor effects of pine needles (Pinus densiflora). 2006; 56(2): Lacroix, M, Toillon RA, Leclercq G. (2006). "p53 and breast cancer, an update". Endocrine-Related Cancer 13 (2): Lebo, Stuart E. Jr.; Gargulak, Jerry D. and McNally, Timothy J. (2001). "Lignin". Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology. John Wiley & Sons, Inc Erişim tarihi: Li K, Li Q, Li J, Zhang T, Han Z, Gao D, Zheng F. Antitumor activity of the procyanidins from Pinus koraiensis bark on mice bearing U14 cervical cancer. Yakugaku Zasshi Jul;127(7): Mateus E, Barata RC, Zrostlíková J, Gomes da Silva MD, Paiva MR. Characterization of the volatile fraction emitted by Pinus spp. by one- andtwodimensional chromatographic techniques with mass spectrometric detection. J Chromatogr A. 2010, 1217(11): doi: /j.chroma Neuwirt H, Arias MC, Puhr M, Hobisch A, Culig Z. Oligomeric proanthocyanidin complexes (OPC) exert anti-proliferative and pro-apoptotic effects on prostate cancer cells. Prostate Nov 1;68(15): doi: /pros

14 Rohdewald P. A review of the French maritime pine bark extract (Pycnogenol), a herbal medication with a diverse clinical pharmacology. Int J Clin Pharmacol Ther. 2002;40(4): Russo J, Russo IH. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2000,(2): Sarıbaş M, Ekici B, Kızılçam (Pinus brutia Ten.) in Batı Karadeniz Bölgesindeki Doğal Yayılışına Katkı. Bartın Orman Fakültesi Dergisi Sayı 1-2, s , Bartın. Scalbert A. Antimicrobial properties of tannin. Phytochem : Shen X, Wang Y, Wang F. Characterisation and biological activities of proanthocyanidins from the barks of Pinus massonian and Acacia mearnsii. Nat Prod Res. 2010; 24(6): doi: / Usta HZ, Kızılçam (Pinııs brııtia Ten.) Ağaçlandırma alarında hasılat Araştırmaları, Ormancılık Araştırma Enstitüsü Yayınları, Teknik Bülten Serisi N o.219, s. 1-36, Ankara. Virgili F, Kobuchi H, Packer L. Procyanidins extracted from Pinus maritima (Pycnogenol): scavengers of free radical species and modulators of nitrogen monoxide metabolism in activated murine RAW macrophages. Free Radic Biol Med. 1998, 24(7-8): Vuorela S, Kreander K, Karonen M, Nieminen R, Hämäläinen M, Galkin A, Laitinen L, Salminen JP, Moilanen E, Pihlaja K, Vuorela H, Vuorela P, Heinonen M. Preclinical evaluation of rapeseed, raspberry, and pine bark phenolics for health related effects. J Agric Food Chem J;53(15): Zhang JH, Feng DR, Ma HL, Liu B, Wang HB, Xie H, Li RD, Wang JF. Antitumor effects of Pinus massoniana bark extract in murine sarcoma S180 both in vitro and in vivo. Am J Chin Med. 2012;40(4): doi: /S X