T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI TAKSİM EĞİTİM VE ARAŞTIRMA HASTANESİ BİYOKİMYA VE KLİNİK BİYOKİMYA BÖLÜMÜ VEKİL ŞEF: UZM. DR. GÜVENÇ GÜVENEN

Transkript

1 T.C. SAĞLIK BAKANLIĞI TAKSİM EĞİTİM VE ARAŞTIRMA HASTANESİ BİYOKİMYA VE KLİNİK BİYOKİMYA BÖLÜMÜ VEKİL ŞEF: UZM. DR. GÜVENÇ GÜVENEN ATORVASTATİN KULLANAN DİSLİPİDEMİ HASTALARINDA TEDAVİ ÖNCESİ VE 3 AY SONRASI SERUM PARAOKSONAZ-1 VE OKSİDE LDL DÜZEYLERİ (Uzmanlık Tezi) As. GÜZİN YILMAZ İSTANBUL-2008

2 TEŞEKKÜR Uzmanlık eğitimim süresince bilgi ve deneyimlerinden yaralandığım değerli hocalarım İstanbul Eğitim ve Araştırma Hastanesi Biyokimya ve Klinik Biyokimya Şefi Uzm. Dr. Güvenç GÜVENEN e, Taksim Eğitim ve Araştırma Hastanesi Biyokimya ve Klinik Biyokimya Şef Muavini Uzm. Dr. Özden SERİN e, Dr. Lütfi KIRDAR Kartal Eğitim ve Araştırma Hastanesi Biyokimya ve Klinik Biyokimya Şefi Uzm. Dr. Asuman ORÇUN a ; Tezimi hazırlamada büyük desteği olan başasistanımız Uzm. Emel PEKGÖZ ve diğer uzmanlarıma, ayrıca; tez çalışmamda yol göstericiliğinden yararlandığım Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Biyokimya A.B.D. öğretim üyelerinden Prof. Dr. Dildar KONUKOĞLU ve As. Dr. Sinem FIRTINA ya, ihtisas süresi boyunca gösterdikleri dostluk ve yardımlarından dolayı birlikte çalıştığım tüm asistan arkadaşlarıma, tezimin laboratuvar çalışmalarında emeği geçen bölümümüz çalışanlarına ve aileme en içten teşekkürlerimi sunarım. As. Güzin YILMAZ ii

3 TEŞEKKÜR.ii İÇİNDEKİLER...iii KISALTMALAR iv 1-GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİLER Lipid ve Lipoprotein Metabolizması Lipoprotein Metabolizmasını Düzenleyen Başlıca Apolipoproteinler Lipoprotein Sınıfları Lipoprotein Metabolizma Bozuklukları Paraoksonaz Enzimleri Paraoksonaz 1 Enzimi Ateroskleroz Patogenezinde PON ve Okside LDL Arasındaki İlişki Hiperlipidemide Tedavi Hedefleri Koroner Kalp Hastalığı Riskinin Belirlenmesi Statinler Statinlerin Yan Etkileri MATERYAL VE METOD.36 4-İSATİSTİKSEL ANALİZ BULGULAR.40 6-TARTIŞMA ÖZET 52 8-SUMMARY KAYNAKLAR.54 iii

4 KISALTMALAR ACAT: Açil-Kolesterol Açil Transferaz APO: Apolipoprotein ATP III: Adult Treatment Panel III CETP: Kolesterol Ester Transfer Proteini CRP: C Reaktif Protein EDTA: Etilen Daimin Tetra Asetik Asit ET-1: Endotelin-1 HDL: Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein HDL-K: HDL kolesterol HL: Hepatik Lipaz HMG-CoA: Hidroksi Metil Glutaril-Koenzim A H 2 O 2 : Hidrojen Peroksit HOCL: Hipokloröz Asit ICAM-1: İntercellular Adhesion Molecule -1 IDL: Orta Yoğunluklu Lipoprotein IL İnterlökin KKH: Koroner Kalp Hastalığı LCAT: Lesitin Kolesterol Açil Transferaz LDL: Düşük Yoğunluklu Lipoprotein LDL-K: LDL Kolesterol Lp(a): Lipoprotein (a) LPL: Lipoprotein Lipaz MCP-1: Monocyte Chemotactic Protein-1 M-CSF: Macrophage Colony-Stimulating Factor MM-LDL: Minimal Modified-LDL NCEP: National Cholesterol Education Programme iv

5 NO: Nitrik Oksit NO 2 : Nitrojen Dioksit oxldl: Okside LDL PAF-AH: Platelet Aktive Edici Faktör-Asetil Hidrolaz PAI-1: Plazminojen Aktivatör İnhibitör-1 PDGF: Platelet-Derived Growth Factor PGI 2 : Prostasiklin PON1: Paraoksonaz 1 PUFA: Çoklu Doymamış Yağ Asidi sdldl: Küçük-Yoğun LDL SRA: Scavenger Reseptör A TF: Doku Faktörü TKD-KKHK: Türk Kardiyoloji Derneği Koroner Kalp Hastalığı Korunma Kılavuzu TNF- ümör Nekrotizan Faktör- tpa: Doku Plazminojen Aktivatör VCAM-1: Vascular Cell Adhesion Molecule-1 VLDL: Çok Düşük Yoğunluklu Lipoprotein WHO: Dünya Sağlık Örgütü v

6 1. GİRİŞ VE AMAÇ Kardiyovasküler hastalıklar ve inme gibi ateroskleroz kaynaklı hastalıklar, tüm dünyada, özellikle endüstrileşmiş toplumlarda en önemli morbidite ve mortalite nedenidir. Dislipidemi aterosklerotik hastalıkların major risk faktörlerindendir. Yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) düzeyleriyle ateroskleroz arasındaki zıt ilişki uzun süredir bilinmekte ancak HDL nin ateroskleroza karşı koruyucu etkisi ile ilgili araştırmalar devam etmektedir. HDL nin koruyuculuğu öncelikle ters kolesterol taşınımından sorumlu olmasıdır. Ancak bununla sınırlı değildir. HDL, nitrik oksit (NO) gibi bazı damar genişletici moleküllerin sentezini arttırır, inflamasyonu ve tromboz oluşumunu önleyici etki gösterir, adezyon moleküllerinin sentezini azaltır ve endotel onarımını uyarır. HDL nin bir diğer önemli etkisi de düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) deki oksidatif değişimleri önlemesidir. HDL yapısında bulunan ve antioksidan bir enzim olan paraoksonaz 1 (PON1) in, LDL oksidasyonunu önleyerek HDL nin koruyucu etkisine katkıda bulunduğu bildirilmektedir (1). PON 1, HDL nin apoa1 ve apoj proteinleriyle ilişkilidir. ApoJ (klusterin), birçok memelinin fizyolojik sıvı ve dokusunda bulunan bir glikoproteindir. Isı şok proteinlerine yapısal benzerliği ile apoj strese cevap olarak sekrete edilir (2,3). ApoA-1, HDL nin yapısal proteinidir ve PON1 in N-terminali ile HDL fosfolipidlerine bağlanmasını stabilize eder. Normal HDL seviyelerine rağmen düşük PON 1 serum aktivitesinin, HDL nin LDL yi oksidasyondan koruyucu etkisinin azalmasına, böylece ateroskleroz insidansının artmasına yol açacağı öne sürülmüştür. Bu nedenle gelecekte artmış ApoJ/PON1 oranının, ateroskleroz riskini belirlemede, total kolesterol/hdl kolesterol oranından daha iyi bir gösterge olacağı belirtilmiştir (4). İnsanda iki izoformu bulunan apob nin, B-100 izoformu LDL nin başlıca protein içeriğini oluşturur ve LDL reseptörü için ligand görevi yapar. Oksidatif değişimler sonucu LDL lipid ve proteinlerinin modifikasyonu ateroskleroz gelişiminde önemli rol oynar. LDL oksidasyonu sonucu oluşan okside LDL (oxldl), makrofajların köpük hücrelerine dönüşmesine neden olabilmektedir. oxldl sitotoksik özelliğe sahip olup vazokonstriksiyonu, adezyon moleküllerinin ekspresyonunu ve hücresel proliferasyonu artırmaktadır (5,6). 1

7 Diyet ve yaşam tarzı değişiklikleri hiperlipidemi tedavisinde vazgeçilmez temel yaklaşımı oluşturmakla birlikte, bunların etkisi sınırlı kalmakta ve çoğu kez istenen lipid değerlerine inilememektedir. Bu nedenle lipid düşürücü ilaçların kullanımı çoğu olguda gerekli hale gelmektedir. Lipid düşürücü ilaçlardan statinlerin (HMG-CoA redüktaz inhibitörleri) bir üyesi olan atorvastatin hiperlipidemi tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Dislipidemi ile ilgili yapılan çalışmalarda, lipid ve lipoprotein parametreleri, aterosklerotik risk faktörleri ve çeşitli lipid düşürücü ajanların PON1 ve oxldl düzeyine etkileri farklı coğrafyada yaşayan topluluklarda incelenmiş ve çeşitli sonuçlar elde edilmiştir (7-9). Biz de toplumumuzda ki dislipidemi hastalarında, atorvastatin tedavisi başlangıcı ve üç ay sonrasında PON1, oxldl, ApoA-1 ve ApoB düzeylerini incelemeyi amaçladık. 2

8 2. GENEL BİLGİLER Ateroskleroz tüm dünyada olduğu gibi ülkemizde de erişkinlerde başta gelen mortalite ve morbidite nedenidir (10). Ateroskleroz, hiperlipidemi, hipertansiyon, diyabet ve obezite gibi bazı risk faktörleri ile tetiklenen, çocukluk yaşlarda başlayan kompleks enflamatuvar bir süreçtir (10). Deneysel ve klinik çalışmalar, aterosklerozun önde gelen nedenlerinden birinin dislipidemi olduğunu göstermektedir. İnsanlarda hiperkolesterolemi varlığında endotel kaynaklı vasküler dilatasyonun bozulduğu bilinmektedir. Endotel disfonksiyonu sonucu azalmış NO üretiminin aterosklerotik sürecin başlaması ve ilerlemesinde merkezi rol oynadığı söylenmektedir (11). Ateroskleroz genel anlamda orta veya büyük müsküler ve elastik arterlerin kalınlaşma ve sertleşme şeklindeki lezyonlarını tanımlayan bir terimdir. Lezyon yeterince büyür ise arteri daraltır ve doku veya organlarda kan perfüzyonundaki azalma sonucu iskemi veya nekroz oluşur. Sonuçta miyokard enfarktüsü, serebral enfarktüs, ekstremitelerde gangren veya ani kardiyak ölüm gibi olaylar gerçekleşebilir (12). Aterosklerotik hastalıkların major risk faktörlerinden dislipidemi, anormal plazma lipid düzeyi olarak tanımlanır. Genel lipid bozukluğu total kolesterol, LDL kolesterol, lipoprotein(a), trigliserid ve küçük-yoğun LDL (sdldl) partiküllerinin yüksek, HDL kolesterolün ise düşük olmasıdır (13). Aterosklerozda risk faktörleri aşağıda gösterilmiştir. Majör Risk Faktörleri I. Değiştirilebilir risk faktörleri; 1. Dislipidemi Hiperkolesterolemi HDL kolesterol düşüklüğü 2. Hipertansiyon 3. Sigara 4. Diabetes Mellitus II. Değiştirilemeyen risk faktörleri; 3

9 1. Yaş 2. Cinsiyet 3. Kalıtım Minör Risk Faktörleri 1. Hipertrigliseridemi 2. Fiziksel aktivite azlığı 3. Obezite 4. Stresli kişilik yapısı Yeni Risk Faktörleri 1. Koagulasyon eğilimini arttıran faktörler Fibrinojen Plazminojen aktivatör inhibitör-1 (PAI-1) Hiperhomosisteinemi Lipoprotein (a) yüksekliği F-VII, F-VIII, V-WF yüksekliği 2. Enflamasyon göstergeleri (fibrinojen, CRP, Cu, Fe, IL-6, TNF-α gibi) (12) Lipid ve Lipoprotein Metabolizması Plazmadaki temel lipidler kolesterol, trigliserid, fosfolipid ve serbest yağ asitleridir. Plazmada yağ asitleri, serbest, albumine bağlı veya kompleks oluşturmak üzere diğer bazı organik moleküllerle esterleşmiş olarak bulunur. Kompleks lipidler trigliserid, kolesterol ve fosfolipid olarak üç grupta toplanır. Trigliseridler en fazla bulunan kompleks lipidler olup, yağ asitlerinin depo şeklidir. Bir gliserol molekülü ile esterleşmiş üç yağ asidi molekülünden oluşmaktadır. Dokularda yağ deposunun %95 ini oluşturur. Fosfolipidlerin yapısında ise 4

10 gliserolün üç hidroksil grubundan ikisi yağ asitleriyle, üçüncü grup ise fosfatla esterleşmiştir. Kolesterol, sekiz karbonlu bir yan zincir taşıyan steran halkasından oluşur. Plazmadaki kolesterolün üçte ikisi uzun zincirli yağ asitleriyle esterleşmiş, üçte biri ise serbest (esterleşmemiş) halde bulunur. Lipidlerin en karakteristik özelliklerinden biri suda az miktarda, eter, kloroform, benzen gibi çözücülerde kolaylıkla çözünebilir olmasıdır. Lipidler polar ve non-polar olmak üzere ikiye ayrılır. Polar lipidler az da olsa suda çözünebilme özelliği gösterir. Bu grup içerisinde fosfolipidler, glikolipidler, kolesterol ve yağ asitleri yer alır. Non-polar lipidler ise trigliserid ve kolesterol esterleridir. Suda çözünmeyen lipidlerin, çözünür lipid ve protein kompleksi şeklinde kanda taşınmalarını lipoprotein denen özel yapılar sağlamaktadır. Bir lipoprotein de dış kısmında protein (apolipoprotein) ve polar lipidler (fosfolipid ve serbest kolesterol) den oluşan bir tabaka ile iç kısmında hidrofobik ve nötral lipidler ( trigliserid ve kolesterol esteri) den oluşan çekirdek yapısı bulunur (14-17). İçerdiği lipidlerle hücre plazma membranına benzeyen dış tabaka, plazma ile çekirdekteki nötral lipidler arasında bir tabaka oluşturur. Böylece, bu polar yüzey, plazmada çözünmeyen kolesterol esterleri ve trigliseridlerin bir yerden başka bir yere taşınmasını olanaklı kılar (14) Lipoprotein Metabolizmasını Düzenleyen Başlıca Apolipoproteinler Lipoprotein yapısında yer alan proteinler apolipoprotein (apo) olarak adlandırılır. Yaklaşık on değişik protein partikülü çeşitli lipoproteinlerle ilişkilidir ve adlandırılmasında apoa, apob, apoc gibi harfler kullanılır (14). Apolipoproteinlerin başlıca üç fonksiyonu vardır. 1. Lipoprotein yapısındaki fosfolipidlerle birleşerek kolesterol esterlerinin ve trigliseridlerin çözünür hale gelmesine yardım eder. 2. Lesitin kolesterol açil transferaz (LCAT), lipoprotein lipaz (LPL) ve hepatik lipaz (HL) gibi enzimlerin aktivitelerinin düzenlenmesinde rol alırlar. 3. Lipoproteinlerin hücrelerdeki reseptörler tarafından tanınmasını sağlayarak, lipoproteinlerin reseptöre bağımlı endositoz ile hücre içine alınmasını kolaylaştırırlar (15,17,18). 5

11 HDL yapısında yer alan apod ve apoj bir yana bırakılırsa başlıca dört apolipoprotein kategorisi tablo I de gösterilmiştir. ApoD, glikoprotein yapısındadır ve kolesterol ester transfer proteininin (CETP) kofaktörü olduğu düşünülmektedir (17). ApoJ (klusterin), 449 amino asit içeren bir glikoproteindir. Olgunlaşmadan önceki molekül ağırlığı 60 kda dur. Glikozilasyon sonrası molekül ağırlığı kda olan ve olgunlaşan apoj sekrete edilir (19). Her biri yaklaşık 40 kda olan ve birbirine beş disülfit bağıyla bağlı bir α ve bir β zincirinden oluşan heterodimer yapıdadır (20). ApoJ; lipidler, immünoglobulinler, kompleman faktörleri ve amiloid proteinleri gibi birçok molekülü yapısında taşır. Bu nedenle hücresel koruma, üretim, adezyon, veya lipid transportu gibi çeşitli biyolojik süreçleri etkiler ve doku hasarı, ateroskleroz veya nörodejeneratif hastalıklar gibi fizyolojik rahatsızlıklarla ilişkilidir (2). Isı şok proteinleri, proteinlerin katlanma basamağında rol oynayan şaperonlardır. Şaperonlar (polipeptid zincir bağlayıcı proteinler), katlanma işlemi sırasında son basamağın hızını arttırarak katalizör gibi davranırlar. Isı şok proteinlerine yapısal benzerliği olan apoj nin protein agregasyonunu önlemek veya strese cevap olarak sekresyonunun arttığı gösterilmiştir (2,3). Bazı çalışmalarda da apoj nin sitotoksik ajanlara karşı koruyucu olduğu, epitel hücrelerini H 2 O 2 nin oksidatif hasarından koruduğu ileri sürülmüştür (21). Apolipoprotein A; HDL de bulunan major proteinlerdir, fakat şilomikronlarda da bulunurlar. ApoA-I : ApoA-I insan barsağında ve karaciğerde yapılır. ApoA-I, HDL üzerindeki serbest kolesterolü esterleştiren LCAT ı aktive edebilir. LCAT ın maksimum aktivasyonu için apoa- I / fosfolipid oranı 6:1 olmalıdır. ApoA-II : ApoA-II başlıca karaciğerde yapılır. ApoA-II nin HL aktivasyonu ve LCAT inhibisyonunda rol oynadığı düşünülmektedir (17). Fakat kesin metabolik rolü bilinmemektedir. ApoA-I / A-II oranı yaklaşık 3/1 dir. Kadınlarda apoa-i in konsantrasyonu erkeklere göre daha yüksek olduğu halde, apoa-ii düzeyleri her iki cinste de aynıdır (22,23). HDL2 nin yapısında apoa-i bulunurken, HDL3 ün yapısında apoa-i ve apoa-ii bulunur. Serum apo A-I konsantrasyonu ile ateroskleroz arasında negatif bir ilişki vardır (23). A apoproteinleri, karaciğer ve böbrek de yıkılırlar. ApoA-I ve apoa-ii nin katabolizma hızı 6

12 hemen hemen aynıdır. ApoA nın bir alt grubu olan apoa-iv normalde plazmada bulunmaz, lenf şilomikronlarının bir bileşiğidir. TABLO I: Başlıca plazma apolipoproteinleri ve fonksiyonları (14) Apolipoprotein Bulunduğu Üretim yeri Molekül lipoprotein ağırlığı(da) A-I A-II A-IV Şilomikron, HDL Şilomikron, HDL Şilomikron, HDL Barsak, karaciğer Barsak, karaciğer Barsak B-100 VLDL, IDL, LDL Karaciğer B-48 Şilomikron Barsak C-I C-II C-III Şilomikron, VLDL, IDL, HDL Şilomikron, VLDL, IDL, HDL Şilomikron, VLDL, IDL, HDL Karaciğer 5800 Karaciğer 9100 Karaciğer 8750 E-2 Şilomikron, Karaciğer, çevresel VLDL, IDL, HDL dokular E-3 Şilomikron, Karaciğer, çevresel VLDL, IDL, HDL dokular 7

13 Apolipoprotein B; HDL den başka diğer tüm lipoproteinlerin majör kısmını oluşturur. ApoB nin insanda iki izoformu bulunur. En fazla bulunan formu büyük B veya B-100, diğer formu ise küçük B veya B-48 olarak adlandırılır. ApoB-100, VLDL (çok düşük yoğunluklu lipoproteinler), IDL (orta yoğunluklu lipoproteinler) ve LDL nin başlıca protein içeriğini oluşturur. Yapısal rolüne ek olarak apob- 100 LDL reseptörü için ligand görevi yapar. ApoB-100 ün karboksil ucu reseptöre bağlanmayı sağlar. ApoB-100 ün LDL reseptörü ile ilişkisinde pozitif yüklü amino asitler arginin ve lizinin önemli olduğu ortaya konmuştur. ApoB-48 yapısal olarak ismini aldığı apob-100 amino terminalinin %48 ne eşittir ve böylece apob-100 karboksil terminalini içermediği için apob-48 LDL reseptörüne bağlanamaz (16-18). Serum apob düzeyi yüksek bulunan bireylerde fatal miyokard enfarktüsü geçirme riski artmıştır (24). Apolipoprotein E; Arjininden zengin apolipoprotein olarak da bilinen apoe, 299 amino asidli bir proteindir. En az dört polimorfik formu bulunan apoe nin bu major izoformlarının her biri, posttranslasyonel glikozilasyonun bir sonucu olarak meydana gelir. ApoE nin %75 den fazlası karaciğerde hepatositler de üretilir. Kolesterol ile yüklü olduklarında tüm vücuttaki makrofajlar bu proteini önemli miktarda sentez ederler ve hücre dışına salarlar (18). Apolipoprotein C; Başlıca karaciğerde sentez edilen apolipoprotein C ler, lipoproteinler arasında kolayca aktarılan düşük molekül ağırlıklı proteinlerdir. Bu grubun apoc-i, apoc-ii ve apoc-iii olarak adlandırılan üç farklı alt grubu LDL dışında ki tüm lipoproteinlerin yapısında bulunur. ApoC-III ün sialik asit içeriği bakımından farklı en az üç izoformu vardır (17,18). ApoC-II yağ dokusunda şilomikron ve VLDL yi hidroliz eden LPL nin kofaktörüdür. ApoC-I, apoe nin lipoprotein reseptörlerine bağlanmasını engelleyerek trigliseridden zengin lipoprotein alımını düzenler. ApoC-III ün tam olarak fonksiyonu bilinmemekle birlikte LPL yi inhibe ettiği, LCAT ı aktive ettiği ileri sürülmektedir. 8

14 Lipoprotein Sınıfları Saf yağın yoğunluğu sudan azdır. Dolayısıyla lipoproteinlerin yoğunluğu, içinde lipid oranı arttıkça azalır. Lipoproteinleri fiziksel ve kimyasal özelliklerine göre elektroforez ve ultrasantrifügasyon gibi yöntemlerle ayırmak mümkündür (14). Major plazma lipoproteinlerinin yoğunluğuna göre dizilim sıraları şöyledir: 1. Şilomikronlar 2. Çok düşük yoğunluklu lipoproteinler (VLDL) 3. Düşük yoğunluklu lipoproteinler (LDL) 4. Orta yoğunluklu lipoproteinler (IDL) 5. Yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) Şilomikronlar; Postprandial plazmada bulunan şilomikronlar, lipoproteinlerin en büyük olanıdır. Başlıca apolipoproteinleri A-I, A-II ve B-48 dir. ApoB-48, ince barsağın (duedenum ve proksimal jejunum) epitel hücreleri tarafından yapılan tek apob dir. ApoA-I ve A-II, HDL de bulunan C ve E apoproteinleriyle değişime uğrar. ApoC-II tarafından aktifleştirilen ekstrasellüler LPL enziminin şilomikron ve VLDL deki trigliseridlerin hidrolizi sonucu serbest yağ asitleri açığa çıkar. Dolaşımdaki şilomikronlar LPL etkisiyle trigliseridden fakir, kolesterolden zengin şilomikron artıklarına dönüşürler. Serbest yağ asitleri trigliserid olarak depolanmak, enerji kaynağı olarak oksitlenmek veya yeniden trigliserid yapımında kullanılmak üzere çeşitli dokular tarafından alınırlar. HL başlıca fosfolipaz gibi ve ikincil olarak da bir gliserid hidrolaz gibi hareket ederek şilomikron artıklarının hepatositler tarafından alınmasının son aşamasında da rol oynar. Şilomikron artıkları, kısa sürede apob-48 ve apoe yi tanıyan karaciğer parankim hücreleri tarafından plazmadan temizlenir (16,18). Diyetle yüksek düzeyde yağ alımı şilomikron yapımını arttırır. Absorbsiyon sonrası (12-15 saat açlıkta) şilomikron dolaşımda bulunmaz. Ayrıca yüksek karbonhidrat, düşük yağ alımı yapımını azaltır. Bu gibi durumlarda ince barsak vene VLDL sekrete eder ve trigliserid transportu bu yolla yapılır. Bu partiküller dolaşımdaki VLDL nin % kadarını oluşturur ve şilomikronlar gibi metabolize edilirler (25). 9

15 TABLO II: Major plazma lipoproteinlerinin özellikleri (14) Özellik Şilomikron VLDL IDL LDL HDL Dansite < (g/ml) Elektroforetik orjin pre-β β ve pre- β Β Α mobilite arası Moleküler x x x x x10 5 ağırlık (Da) Çap (nm) > Lipid/Protein 99/1 90/10 85/15 80/20 50/50 Major lipidler Eksojen Endojen Endojen Kolesterol Fosfolipid trigliserid trigliserid trigliserid, kolesterol esteri esteri Major proteinler AI B48 CI CII CIII B100 CI CII CIII E B100 E B100 AI AII Çok Düşük Yoğunluklu Lipoproteinler (VLDL); Yağ asidi hepatositlere geldiğinde karaciğerde VLDL üretimi uyarılır. Karaciğere yağ asidi girişinin artması yüksek yağlı diyet veya çeşitli metabolik bozukluklarda (örn. Diyabet) ya da açlık nedeniyle yağ dokusundan yağ asidi salınımını takiben ortaya çıkar. VLDL yapımında kullanılacak trigliserid ve fosfolipidlerin yapımı kaba ve düz endoplazmik retikulumda olur. VLDL kolesterolü de novo sentez edilir ya da lipoprotein yıkımından elde edilir. VLDL ler Disse Aralığına salınır, oradan da dolaşıma geçerler. VLDL plazmada HDL den apoc-i, C-II, C-III ve apoe proteinlerini alır. VLDL trigliseridleri LPL ve daha az oranda HL etkisiyle hidrolize edilir. VLDL, 10

16 trigliseridlerin kaybı ve apoc nin HDL ye transferi sonucu giderek küçülen partiküllere dönüşür ve kolesterolden zengin IDL yi oluşturur (18). Orta Yoğunluklu Lipoproteinler (IDL); Normal olarak plazmada çok düşük konsantrasyonlarda bulunur ve büyüklük ve içerik açısından VLDL ve LDL arasında yer alır. Başlıca proteinleri apob-100 ve E dir. VLDL nin katabolizma ürünü LDL nin öncülüdür. LDL reseptörü ile dolaşımdan uzaklaştırılır. Genellikle tek tip VLDL artığı olduğuna ve aterojenik olduğuna inanılır (18). Düşük Yoğunluklu Lipoproteinler (LDL); Total plazma kolesterolünün yaklaşık % 70 ini taşır (15,16). LDL yaklaşık % 75 lipid (% 35 kolesterol esteri, % 10 serbest kolesterol, % 10 trigliserid, % 20 fosfolipid) ve % 25 proteinden oluşur. Eser miktardaki apoe ve C dışında, çok miktarda apob-100 içerir. Total plazmadaki apob-100 ün %90-95 i LDL yapısındadır (15,18). Şekil 1 de LDL partikülünün yapısı görülmektedir. Fosfolipid Serbest kolesterol Ester kolesterol Polar yüzey Apolar yüzey Apolipoprotein B Şekil 1: LDL nin yapısı Sağlıklı kişilerde LDL kolesterolü total plazma kolesterolünün 2/3 sini oluşturur. VLDL nin önce IDL ye sonra LDL ye dönüşmesiyle plazmada kalma süresi birkaç saatten 11

17 2,5 güne çıkar. LDL nin uzun ömürlü olması dokular için kolesterol kaynağı olarak işlev görmesini sağlar (16). Premenopozal dönemdeki kadınlarda LDL düzeyi erkeklere göre biraz daha düşüktür (15). LDL nin yaklaşık 2/3 sinin hücre içine alımı reseptör aracılı endositoz ile gerçekleşir. LDL subendoteliyal bölgeye geçerek okside olabilir ve köpük hücre oluşumunu uyarabilir (18). LDL nin plazmadan temizlenmesi apob-100 e spesifik LDL reseptörleri aracılığıyla olur. LDL reseptörü, glikoprotein yapısında olup, negatif yüklü sisteinden zengin bölgeleri apob-100 deki pozitif yüklü arginin ve lizin amino asitleri ile etkileşir ve birlikte hücre içine alınırlar (16). Reseptör tekrar hücre yüzeyine gönderilirken LDL lizozomlara yönlendirilir ve hidrolize uğrar. Açığa çıkan serbest kolesterol başlıca üç temel fonksiyonda rol oynar (15,16,18): 1. Yeni kolesterol sentezinin hız sınırlayıcı enzimi HMG-CoA redüktazın baskılanması 2. Açil-kolesterol açil transferaz (ACAT) enziminin uyarılması 3. Hücre içi aşırı kolesterol birikiminin önlenmesi için plazma membranında LDL reseptör sayısının düzenlenmesi LDL birçok hücrede kolesterol kaynağı olarak kullanılır ve bütün hücreler, de novo kolesterol sentez edebilir. Karaciğer yüksek afiniteli reseptörler aracılığıyla LDL nin hemen hemen yarısını dolaşımdan alır ve aldığı kolesterolü membran biyosentezinde, VLDL biyosentezinde, safra asidi yapımında kullanabilir. Adrenal, ovaryum ve testisler LDL kolesterolünü hormon sentezinde, diğer dokular ise hücre onarımı ve proliferasyonunda kullanırlar (18). LDL glikozillenme ve oksidasyon gibi çeşitli modifikasyonlara uğrayabilir ve bu lipoproteinler ateroskleroz patogenezinde önemli rol oynar. Bu patogenezde üzerinde en çok çalışılan modifiye lipoprotein oxldl dir. oxldl sitotoksik etkisi ile vasküler endotelde hasara yol açabilir, T lenfositler ve monositler için kemotaktik etki gösterebilir, köpük hücre oluşumunu arttırabilir (5,6). Küçük-yoğun LDL (sdldl); LDL büyüklük ve yoğunluk bakımından farklı iki fenotipik özellik gösterir. sdldl nin (LDL boyutunun 25.5 nm ve altında olması) baskın olduğu şekil B patterni, büyük partiküllerin (LDL boyutunun 25.5 nm ve üstünde olması) baskın olduğu 12

18 şekil A patterni olarak adlandırılır. Çapı 25.5 nm ve altında olan sdldl nin dansitesi gr/ml dir (25). sdldl, koroner kalp hastalığı (KKH) riskini yaş, cinsiyet, vücut kitle indeksi, serum trigliserid, LDL ve HDL kolesterol konsantrasyonlarından bağımsız olarak artırmaktadır (26). KKH olan hastaların yarısından fazlasında, LDL kolesterolünün normal düzeyde olması sdldl içeriğinin çok olması ile açıklanabilir (27). Ayrıca sdldl nin karotis arter aterosklerozu ile ilişkili olduğu bildirilmiştir (28). sdldl aterojenitesinin nedeni; subintimal boşluk içine girme yeteneğinin artmış olmasına, daha fazla okside olmasına ve intimal proteoglikanlara bağlanmasındaki artışa bağlıdır. sdldl nin LDL reseptörüne afinitesi az, oksidasyona olan yatkınlığı yüksektir. Yarı ömrü daha uzun olup, dolaşımdan daha güç uzaklaştırılır. Plazmada daha uzun süre kalması nedeniyle oksidasyona uğrama olasılığı artar (29,30). sdldl nin serbest kolesterol içeriğinin düşük, çoklu doymamış yağ asidi (PUFA) içeriğinin ise daha yüksek olması oksidasyona olan yatkınlığına katkıda bulunabilir (31). sdldl oluşumundaki kilit nokta kanda trigliserid düzeyinin yüksekliğidir. HL ve CETP aktivitesi de sdldl oluşumunda rol oynar. Hafif veya orta derecede trigliserid yüksekliğinde, VLDL oranı artar. VLDL yıkımı ile oluşan LDL nin apob-100 konformasyonu değiştiğinden LDL reseptörüne bağlanma özelliği azalmış, dolaşımda kalma süresi uzamıştır. LDL, VLDL den trigliseridleri alır; karşılığında bu lipoproteinlere kolesterol esterleri ile fosfolipidleri transfer eder. Bu transfer, CETP aracılığı ile gerçekleşir. CETP düzeyi yüksek olan bireylerde LDL ye trigliserid transferi hızlanmıştır (29). Trigliseridden zengin hale gelen LDL, HL için substrat olur. HL ın hidrolizi ile yağ asitleri açığa çıkar ve apoprotein/lipid oranı yüksek sdldl partikülleri oluşur (28,29). B patternindeki kişilerin plazma trigliseridleri A patternindeki kişilere göre iki kat daha yüksektir. Ayrıca B patterninde apob, IDL düzeyi daha yüksek, HDL ve apoa-i düzeyi ise daha düşüktür (30). sdldl nin kandaki düzeyi, insülin direnci, Tip 2 diabetes mellitus, metabolik sendrom, renal hastalık ve preeklampside artmaktadır. Ayrıca yağdan fakir ve karbonhidrattan zengin beslenme bu fenotipe yatkınlığı olan kişilerde sdldl nin artmasına zemin hazırlar. Yine, ailesel kombine hiperlipidemide B fenotipinin sıklığı artar (29). 13

19 Yüksek Yoğunluklu Lipoproteinler (HDL); En küçük lipoprotein partiküllerdir. HDL nin % 50 si lipid (% 25 fosfolipid, % 15 kolesterol esteri, % 5 serbest kolesterol, % 5 trigliserid) ve % 50 si proteinden oluşur. Başlıca apoproteinleri apoa-i (% 65), apoa-ii (% 25) dir (11,14). ApoJ tüm HDL lerde bulunmaz. Daha çok proteini yüksek HDL 3 subfraksiyonunda bulunur. HDL alt grubunun (HDL 1 ) küçük bir bileşeni olan plazmadaki apoe nin yaklaşık % 50 si HDL de bulunur. HDL nin diğer sınıfları (HDL 2 ve HDL 3 ) apoe içermez ve böylece LDL reseptörü ile etkileşmez. HDL plazmada diğer lipoproteinlere apoe ve apoc sağlamak için depo işlevi görür. HDL alt grupları apoa-i veya apoa-i/ii kompleksi içerebilir. ApoA-I dolaşımda bulunan HDL ile LCAT enziminin etkinleşmesinde oldukça önemlidir. HDL molekülünün olgunlaşma sürecinde apoa-i ile LCAT birleşir. LCAT, HDL yapısında bir fosfolipid olan lesitinin ikinci karbonu ile linoleik asit arasındaki ester bağını kırarak buraya kolesterolün bağlanmasını ve böylece serbest kolesterolün ester kolesterole dönüşmesini sağlar (15,16,18). HDL karaciğer ve barsak hücreleri tarafından sentezlenir. VLDL de olduğu gibi HDL de de bir olgunlaşma süreci bulunur (şekil 2). Yeni sentezlenmiş HDL (nascent HDL) plazmada apoa-i, A-II ve fosfolipid içeren disk halinde bulunur. Nascent HDL ler, diğer lipoproteinlerden veya aşırı kolesterol içeren hücre zarlarından sınırlı olarak serbest kolesterol alırlar. Serbest kolesterol HDL de LCAT enzimi ile kolesterol esterine dönüştürülür ve biriktirilmeye başlanır. Böylece disk şeklinde ki olgunlaşmamış HDL küre biçimini almaya başlar ve en küçük formu HDL 3 oluşur (16,18). Gittikçe HDL 3 ün hacmi artar ve HDL 2a oluşur. HDL 2a kolesterol esterlerini CETP aracılığıyla VLDL deki trigliseridle değiştirerek HDL 2b ye dönüşür. HDL 2b nin içerdiği trigliseridler karaciğer de bulunan HL enziminin etkisi ile parçalanır ve yeniden HDL 3 oluşur. Böylece HDL döngüsü tamamlanır (16). HDL reseptör aracılı endositoz ile hepatosit tarafından alınır. Kolesterol esterlerinin hidrolizi ile açığa çıkan serbest kolesterol lipoproteinlerin sentezinde kullanılır, safra asitlerinin yapısına katılır veya safraya sekrete edilerek vücuttan uzaklaştırılır (15,16). Diğer Lipoprotein Fraksiyonları Lipoprotein (a), Lp(a); Lp(a) ilk olarak 1963 de Berg tarafından insan plazmasında β- lipoproteinin genetik bir varyantı olarak tanımlanmıştır (32). Karaciğerde sentez ve sekrete 14

20 edilir. Lp(a) % 27 protein, %65 lipid ve %8 karbonhidrat içerir ve bu yapısıyla LDL ye benzer. Ancak plazmada LDL den daha düşük konsantrasyonda bulunur ve oldukça farklı ek bir protein bileşeni olan apo (a) taşır (33). Apo (a), apob ye bir disülfit bağıyla kovalent bağlanmıştır. Lp (a) nın dansitesi yapısındaki apo (a) ile bağlantılı olup LDL ve HDL 2 dansiteleri arasındadır (33). Apo (a) nın moleküler kütlesi kda dur (14). Apo (a) yüksek düzeyde plazminojen ile benzerlik gösterir ve bu nedenle trombogenezde rol oynar. Lp (a) aynı zamanda düz kas hücre proliferasyonunu uyarması, köpük hücre oluşumunu arttırması, subendoteliyal yüzeyde monosit kemotaktik aktiviteyi indüklemesi ile aterojenezde rol oynar (15). HDL DÖNGÜSÜ Trigliserid hidrolizi LCAT ile kolesterol esterifikasyonu Şekil 2: HDL Döngüsü Kolesterol esterlerinin transferi Lipoprotein (x); Anormal bir lipoprotein olup genellikle %90 lipid, %10 protein içerir. Lipid içeriğinin büyük kısmını fosfolipidler ve serbest kolesterol oluştururken az miktarda kolesterol esteri içerir. Protein olarak apob, apoc ve albumin ihtiva eder. Karakteristik olarak, safra 15

21 kanalı tıkalı hastaların plazmasında görülür. Sağlıklı kişilerde saptanamayan Lipoprotein (x), kolestazda ve ailesel LCAT eksikliği olan hastalarda bulunur (15) Lipoprotein Metabolizma Bozuklukları Lipoprotein metabolizmasındaki herhangi bir bozukluk hastanın plazma lipid düzeyleri ve lipoprotein kolesterol konsantrasyonlarının ölçülmesiyle saptanır. Hiperlipidemi varlığının bir lipoprotein metabolizma bozukluğu mu, yoksa herhangi metabolik bir bozukluğu takiben mi geliştiği tespit edilmelidir. Plazma lipoproteinlerinin primer bozuklukları kalıtsaldır ve primer hiperlipoproteinemi teşhisi konulabilmesi için öncelikle sekonder nedenlerin varlığı araştırılmalıdır. Lipoprotein metabolizma bozuklukları ilk kez Fredrickson ve arkadaşları tarafından major plazma lipoproteinleri esas alınarak sınıflandırılmıştır (tablo III). Tip I: LPL eksikliği veya LPL nin inaktive olmasına neden olan apoc-ii eksikliğine bağlı hipertrigliserideminin görüldüğü tablodur. Şilomikronlar ve VLDL klirensinin yavaş, HDL ve LDL kolesterol düzeyinin düşük olduğu, koroner hastalık riskinde artışın olmadığı hiperlipoproteinemi tipidir. Yağ miktarı düşük, karbonhidrat düzeyi yüksek diyetle tedavi edilebilir. Teşhis plazmanın +4 Cº de bir gece bekletildikten sonra, yüzeyinde kremsi bir tabaka oluşması ile konur. Normalde endotel yüzeyinden LPL salınımına neden olan heparin enjeksiyonu sonrası plazma LPL seviyelerinin artmadığı gösterilerek doğrulanır. Düşük LPL seviyeleri apoc-ii eksikliğinden kaynaklanıyorsa jel elektroforeziyle apoc-ii nin yokluğu tespit edilebilir. Fazla miktarda apoc-ii içeren plazma transfüzyonundan sonra plazmada trigliseridlerin dramatik düşüşü ile tanı doğrulanır. LPL seviyeleri orta derecede hipertrigliseridemili mg/dl birçok hastada normal seviyelerdedir. Şiddetli hipertrigliseridemisi (trigliserid >750 mg/dl) olan hastaların % 5-10 nunda LPL geninde heterozigot mutasyon vardır. Bu hastalarda LPL aktivitesi % ye kadar düşebilir. Heterozigot LPL eksikliği olan hastalarda kontrol altına alınamayan diyabet, hamilelik, fazla miktarda alkol alımı, ekzojen östrojen alımı ya da obezite varsa hipertrigliseridemi ciddi seyir gösterebilir. 16

22 TABLO III: Lipoprotein metabolizma bozuklukları Fredrickson (WHO) Sınıflandırması (34) Tip Bozukluğun Yeri Lipid değişikliği Birincil neden İkincil neden Tip I Şilomikron Çok Yüksek Trigliserid Yüksek Kolesterol LPL, ApoC-II eksikliği Diabet, lupus, disglobulinemi Tip IIa Tip IIb LDL Yüksek Kolesterol Ailesel hiperkolesterolemi LDL - VLDL Yüksek Kolesterol Ailesel kombine hiperlipidemi Hipotiroidi, nefrotik sendrom, obezite Tip IIa ile aynı Tip III Tip IV Tip V VLDL, IDL ve Şilomikron kalıntısı Yüksek Kolesterol, Yüksek Trigliserid Ailesel disbetalipoproteinemi VLDL Yüksek Trigliserid Ailesel kombine hiperlipidemi Ailesel hipertrigliseridemi Şilomikron - Çok Yüksek Ailesel VLDL Trigliserid, Yüksek hipertrigliseridemi Kolesterol ApoC-II eksikliği Hipotiroidi, diabet, lupus, disglobulinemi, obezite Alkol, diabet, porfiri, renal yetmezlik, Cushing sendromu, beta blokerler, diüretikler, oral kontraseptifler Tip IV ile aynı 17

23 Tip II: LDL klirens hızında azalma nedeniyle serum LDL kolesterol düzeylerinde artışa ve hiperkolesterolemiye yol açar. Ateroskleroz ve koroner hastalık riskinin bulunduğu tip II nin iki şekli bulunur. Tip IIa, kusurlu LDL reseptörleri veya apob-100 ligand bölgesinde mutasyon sonucu görülür. Heterozigotlarda, total kolesterol mg/dl, LDL kolesterol >250 mg/dl düzeyindedir ve erken yaşta (kadınlarda 55, erkeklerde 45 yaş öncesi) koroner kalp hastalığı görülür. Homozigotlarda, total kolesterol >500 mg/dl, LDL kolesterol >450 mg/dl düzeyindedir. Hiperlipidemi doğumla başlar ve 20 li yaşlarda koroner kalp hastalığı görülür. Tip IIb de ek olarak VLDL düzeyinde artma görülür. Total kolesterol mg/dl, trigliserid mg/dl düzeyindedir. Tip III: ApoE nin üç izoformundan (E2, E3, E4) apoe2 nin reseptöre bağlanma kusuruyla ortaya çıkan nadir görülen ( 1/10000 kişi) bir hastalıktır. Şilomikronlar ve dansitesi < olan VLDL artıklarında artış, elektroforezde geniş β-bandı görülür. Trigliserid mg/dl, total kolesterol mg/dl düzeyindedir. Hiperkolesterolemi, ksantoma, periferik ve koroner arterlerde ateroskleroza neden olur. Aterosklerotik apoe eksikliği oluşturulan fareler üzerinde yapılan çalışmada, serum PON1 aktivitesi ve serum lipidlerinin oksidatif düzeyi arasında negatif korelasyon saptanmıştır. ApoE eksik olan farelerde hızlı ateroskleroz oluşumu ve oksidatif stres artışı belirgin olarak gözlenmiştir (35). Tip IV: Otozomal dominant geçişli olduğu düşünülmektedir. Hem VLDL nin aşırı üretimi ve hem de katabolizmasının azalmasına bağlı açlık plazma trigliserid seviyeleri mg/dl dir. Kolesterol düzeyi VLDL miktarına paralel olarak artar. Genellikle HDL ve LDL düzeyi normalden azdır. Ailesel hipertrigliseridemiye KKH, tip II diyabet, şişmanlık, alkolizm eşlik edebilir. Tip V: Şilomikronlar ve VLDL düzeyi artmış, HDL ve LDL kolesterolü ise azalmıştır. LPL veya apoc-ii nin eksikliğinden kaynaklandığı düşünülmekte ancak nedeni tam olarak bilinmemektedir. 18

24 2.2. Paraoksonaz Enzimleri İnsanda 7. kromozomun uzun kolunda q 21.3 ve q 22.1 arasında tanımlanabilen paraoksonaz gen ailesinin PON1, PON2 ve PON3 şeklinde 3 üyesi bulunur. PON proteinlerinin aminoasit dizilimleri arasında % 60 oranında benzerlik olduğu bildirilmektedir. PON l de 106. kodon da lizin bulunurken, PON2 ve PON3 de lizin bulunmamaktadır. Bu nedenle paraoksonu hidroliz edemedikleri ileri sürülmüştür (7). PON1 ve PON3 plazmada bulunmasına karşılık PON2 bulunmaz. PON1 özellikle, karaciğer, böbrek, ince barsak ve plazmada bulunur (36) Paraoksonaz 1 (PON 1) Enzimi Paraoksonaz (PON 1), ilk olarak 1953 yılında Aldridge W.N. (Aldridge W.N. ve ark., 1953) tarafından p-nitrofenil asetat, propiyonat ve bütüratı hidroliz eden esteraz olarak saptanmıştır. İnsan PON1 enziminin, günümüzde antioksidan fonksiyona sahip olduğu düşünülmektedir. Deneysel çalışmalar PON1 enziminin HDL nin apo AI ve apo J (clustrein) proteinleri ile ilişkili olduğunu göstermiştir (8,37,38). PON 1, hem arilesteraz (E.C ) hem de paraoksonaz (arildialkilfosfataz, organofosfat hidrolaz, paraokson hidrolaz; E.C ) aktivitesine sahip bir ester hidrolazdır. PON 1 enziminin aktif bölge özellikleri bilinmese de substratlarının (arilesteraz aktivitesinde fenilasetat, paraoksonaz aktivitesinde paraokson substratı) aktif bölgesine bağlanmak için yarışması aynı aktif merkezin özelliklerinin paylaşıldığını gösterir. PON1, molekül ağırlığı 44 kda olan 354 amino asitli bir glikoproteindir. Serumda HDL ye bağlı olarak bulunur (7,39). Total ağırlığının yaklaşık % 16 sını karbonhidrat zincirleri oluşturur. İzoelektrik noktası 5.1 dir. Yüksek miktarda lösin amino asidi içerir. Yapısında bulunan üç sistein amino asidinden 284. pozisyondaki serbest iken, diğer ikisi (Cys ) arasında disülfit bağı bulunur (şekil 3). Protein yapısındaki tek disülfit bağı, polipeptid zincirinin siklik yapıda olmasına neden olur. Serbest sistein substrat tanınması ve bağlanması için gereklidir (40) ve esteraz aktif merkezinin anahtar bileşenidir. 19

25 Şekil 3: İnsan serum paraoksonaz 1 (PON1) enziminin yapısı (41) Arg; Arginin, Cys; Sistein, Gln; Glutamin, Leu; Lösin, Lys; Lizin, Met; Metiyonin PON1 aktivitesi için kalsiyum (Ca +2 ) gereklidir. Bu özelliğiyle Co +2, Mn +2, Mg +2 kullanan diğer esteraz tipi enzimlerden ayrılır. Şekil 4 de PON1 in üç boyutlu yapısındaki kalsiyum iyonları küre şeklinde gösterilmiştir. Üç boyutlu yapıda β tabakaların merkezinde 7.4 A aralıklı iki adet kalsiyum iyonu bulunmaktadır (42). Bunlardan bir tanesi yapısal kalsiyum olup yapıdan uzaklaştırılması, tersinmez denatürasyona neden olmaktadır. Diğeri ise katalitik etkinlikte görev alan kalsiyumdur. 20

26 Şekil 4: PON 1 proteinin üç boyutlu yapısında kalsiyum iyonları PON l in en iyi bilinen koruyucu fonksiyonu; sinir ajanları, aromatik karboksilik asit esterleri ve insektisitler gibi organofosfatlara ters bağlanıp hidroliz ederek, dolaşıma giren organofosfatların nörotoksisitesini engellemektir. Organofosfat bileşiklerinden parationun aktif katabolik metaboliti olan paraokson (o,o-dietil-o-p-nitrofenil fosfat) asetilkolini yıkan kolinesterazların güçlü inhibitörüdür. PON l in paraoksona etkisi ile oluşan hidrolitik ürünler paraoksonun kendisine göre daha az zararlıdır. Memelilere kıyasla böceklerin de içinde bulunduğu omurgasızlar, kuşlar ve balıklarda serumda PON1 in bulunmamasına bağlı olarak organofosfat zehirlenmesine yatkınlığın daha yüksek olduğu gözlenmiştir (43). Katalitik etkinlikte yer alan kalsiyum iyonu bir su molekülü varlığında fosfat iyonunun oksijeni ile etkileşir ve paraoksonun P=0 bağını polarize ederek dietil fosfatın aktif alandan ayrılmasını kolaylaştırır (şekil 5). PON1 in organofosfat substratlarına karşı hidrolitik aktivitesi iki kalsiyuma da bağımlı iken, lipid peroksitlerin birikimini önlemede sadece yapısal kalsiyumun gerekli olduğu bildirilmektedir (40,44). Şekil 5: Paraoksonaz reaksiyonu 21

27 PON1 hidrofobik N-terminal bölgesi aracılığıyla HDL lipidlerine kolayca bağlanabilmektedir. HDL alt birimleri, apoa-1 ve apoj nin bağlanmada rol oynayabileceği ileri sürülmektedir (8,37,38,42). PON1 in sekresyon sonrası, oksidan hasar bölgelerine geçişi şu şekilde sıralanabilir (44). 1) PON1 sekresyondan sonra hepatosit plazma membranına bağlanır. PON1 in N-terminali, HDL fosfolipidlerine bağlanır ve apoa-i ile stabilize edilir. HDL hepatositlerden uzaklaştırılır. 2) PON1 intravasküler alana HDL ile beraber girer. 3) Plazmadaki PON1, HDL nin apo A1 aracılığıyla kolesterol toplanması esnasında N- terminali aracılığıyla endotel, interstisyum ve düz kas fosfolipidlerine diffüze olur. 4) Böylece LDL birikim ve oksidan hasar bölgelerine girer. PON l in genetik yapısı, kişiler, populasyonlar ve çevre şartları değiştikçe çeşitlilik gösterir. PON1, iki amino asit polimorfizmine sahiptir. Bunlardan biri 55. pozisyonda metionin ile lösin (M/L) amino asitlerinin yer değişmesiyle, diğeri 192. pozisyondaki arginin ve glutamin (R/Q) amino asitlerinin yer değiştirmesinden meydana gelir (8,37). Bazı kaynaklarda R yerine B alleli, Q yerine de A alleli kullanılmaktadır. PON l den saflaştırılmış PON1 192RR ve PON1 55LL nin paraokson hidrolitik aktivitesi en yüksekken, PON1 192QQ ve PON1 55MM de bu aktivite en düşüktür. R allelin kodladığı proteinin paraoksonu hidroliz aktivitesi Q alleline göre sekiz kat yüksektir (45). Paraoksonaz alloenzimlerin LDL yi oksidasyondan koruma kapasitesi paraokson hidrolitik aktivitesi ile tamamen terstir. PON1 55MM / PON1 192QQ alloenzimlerinin diazoxon, soman ve sarin gibi sinir gazlarını hidroliz etme kapasiteleri düşükken LDL yi oksidasyondan koruma da daha aktif rol üstlenirler (46). PON1 beslenme şeklinden etkilenir. Bir çok çalışmada antioksidan alımı ve aterojen şartlar arasındaki ilişki araştırılmıştır (47,48). Proaterojenik diyetin PON1 aktivitesini azalttığı, antioksidan vitamin (vitamin E ve C) alımının ise LDL yi oksidasyondan koruduğu gösterilmiştir (49). Van der ve ark. ılımlı alkol alımının enzim aktivitesini arttırdığını bununda HDL düzeyindeki artıştan kaynaklandığını açıklamışlardır (50). Ayrıca sigara içimi PON1 aktivitesini ve konsantrasyonunu azaltır. Son yıllarda, sigara kullanımının enzimin serbest tiyol gruplarını modifiye ederek, PON1 aktivitesini inhibe 22

28 ettiği gösterilmiştir (7,39,51). Yapılan çalışmalarda, PON1 enzim aktivitesinin yaş artışıyla azaldığı görülmüştür. PON1 aktivitesi, yeni doğanlarda ve prematüre bebeklerde yetişkin düzeyinin yarısı kadardır. Doğumdan yaklaşık bir yıl sonra yetişkin düzeyine ulaşır ve yaşam boyu değişmeye devam eder (7). Akut faz reaksiyonu sırasında PON1 aktivitesinin önemli derecede azaldığı görülmüştür (4). Tavşan ve insanlarda yapılan çalışmalar, akut faz reaksiyonunda HDL yapısında amiloid A ve seruloplazmin içeriğinde artış ve apoa-1, PON1, PAF-AH (Platelet Aktive Edici Faktör-Asetil Hidrolaz) ta belirgin azalmanın görülmesi HDL nin antienflamatuvardan proenflamatuvar bir moleküle dönüştüğünü göstermiştir (52). Mackness ve ark. serum PON1 aktivitesinin ve konsantrasyonunun miyokard enfarktüsü belirtilerinin başlamasından sonraki 2 saat içinde azaldığını, PON1 düzeyinin miyokard enfarktüsü sonrasındaki 42 gün boyunca akut faz reaksiyonu geçmiş olduğu halde değişmediğini göstermiş ve PON1 aktivitesindeki bu azalmanın akut olgunun öncesinde mevcut olabileceğini bildirmişlerdir (53) Ateroskleroz Patogenezinde PON ve Okside LDL Arasındaki İlişki Damarın intima tabakası, aterosklerotik lezyonların geliştiği yerdir. Aterosklerotik lezyonlar iki farklı tipte gelişebilir. Klinik hasar oluşturan tipinde, genellikle intimada asimetrik bir kalınlaşma vardır. Bu lümeni daraltarak kan akımını azaltır. İntimada kalınlaşmanın arterial dilatasyon ile birlikte olduğu diğer bir lezyon tipinde ise arter lümen çapında önemli bir değişiklik olmaz ve klinik hasar nadirdir. Ateroskleroz lezyonları üç farklı aşamada oluşur: 1. Yağlı çizgi 2. Fibröz plak 3. Komplike lezyon 1. Yağlı çizgi, her yaşta görülebilen, ilk oluşan aterosklerotik lezyondur (14). Makroskobik 23

29 olarak lümene doğru kabarıktır ancak obstrüksiyon oluşturmaz. Sarı renkte görülürler. Başlangıçta T lenfositlerle birlikte lipid yüklü makrofaj (köpük hücre) ve monositlerden oluşmakta, daha sonra yapısına değişik sayıda düz kas hücresi katılmaktadır. 2. Fibröz plak, arterin kalınlaşmasına ve sıklıkla lümenin obstrüksiyonuna neden olur. Fibröz plak kabarık ve soluk gri renkte görülür. En dışta endotel hücreleri, altında düz kas hücreleri, makrofajlar ve T lenfositler yer alır. Mediadan intimaya çekilen düz kas hücreleri bir fibröz başlık oluşturmak üzere dizilirler. Böylelikle, lümendeki kan ile lezyonun merkezindeki lipid çekirdeğini birbirinden ayırırlar. 3. Komplike lezyon, yaygın dejenerasyona ve çoğunlukla kalsifikasyona uğrayan fibröz plaktır. Ülserasyonlar ve yırtılmalar plak yüzeyine trombositlerin tutunmasına, bunların agregasyonuna ve trombüs oluşmasına neden olur. Trombüs damarın aniden tıkanmasına yol açabilir. Hiperkolesterolemi ateroskleroz patogenezinde rol oynayan en önemli faktördür. Plazma kolesterol düzeyinin düşürülmesiyle ateroskleroz zemininde gelişen klinik tabloların sıklığının azaldığı kanıtlanmıştır. Hiperkolesterolemide ilk aşamada gerçekleşen olay, endotel hücrelerinde ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule -1), VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule-1) gibi adezyon molekülleri ile monosit kemotaksisinde önemli rolü olan MCP-1 (Monocyte Chemotactic Protein-1) in üretimidir. Bunun sonucu, monositler endoteli geçip subendoteliyal alana yerleşirler. Aterosklerozun gelişiminde önemi olan diğer bir etken ise enflamasyondur. Son yirmi yılda yapılan çalışmalar monosit/makrofaj ve T-lenfositlerinin endotel ve düz kas hücreleri ile etkileşiminin aterosklerotik lezyonların gelişimindeki rolünü göstermiştir (54,55). Arter duvarındaki enflamatuvar süreci başlatan faktörlerin; oksitlenmiş LDL, mekanik hasar, immunolojik, toksik veya infeksiyöz etkenler (Chlamydia pneumoniae, herpesvirüsler) veya bunların bileşimi olduğu sanılmaktadır (15,16,55). Bu etkenler endotel hücrelerinin yüzey yapısını değiştirir ve endotel hücrelerinin LDL alımı artar. LDL oksidasyonunun mekanizması: Şekil 6' da görüldüğü gibi, LDL nin endotelde oksidasyona uğraması aterosklerozun gelişiminde başlatıcı etkendir (54-56). LDL, lipooksijenaz, miyeloperoksidaz, reaktif nitrojen türleri veya metal iyonlarıyla okside olabilir (şekil 7). 24

30 Adezyon molekülleri Monosit LDL Damar lümeni Sitokinler MCP-1 LDL Endotelyum Köpük hücre Makrofaj Modifiye LDL nin makrofaj tarafından alınması İntima Şekil 6: LDL oksidasyonun aterosklerozdaki rolü (56) LDL nin metal iyonlarıyla oksidasyonu üç basamaktan oluşur. 1. Başlangıç basamağı: Endojen antioksidanların tüketimi 2. İlerleme basamağı: Doymamış yağ asitlerinin lipid hidroperoksitlerine oksidasyonu 3. Sonlanma basamağı: Hidroperoksitlerin reaktif aldehitlere dönüşümü Aldehitler, apob-100 deki lizin kalıntılarıyla reaksiyona girerek LDL oksidasyonuna yol açabilir. NO bakırla oluşan oksidasyonu inhibe eder. Endotel hücreleri ve monosit/makrofajlarda üretilen lipooksijenaz enzimi, doymamış yağ asitlerinin lipid hidroperoksitlerine ve sonrasında oxldl ye dönüşümüne neden olabilir. Aktive makrofajlardan sekrete edilen miyeloperoksidaz, hipokloröz asit (HOCL), nitrojen dioksit (NO 2 ) gibi reaktif türler oluşturarak LDL lipid ve proteinlerini okside edebilir (57). NO aerobik şartlarda nitrite dönüşür. Nitrit, LDL nin miyeloperoksidazla okside olmasını inhibe eder. 25

31 hidroperoksitler hidroperoksitler Aktif metal iyonları (Cu, Fe) Lipooksijenaz Miyeloperoksidaz Nitrit 1) Endojen antioksidanların tüketimi 2) LDL lipidlerinin peroksidasyonu 3) Aldehit oluşumu Reaktif Türler: HOCL Kloramin Tirozil radikalleri NO 2 LDL nin protein ve lipidlerinin oksidasyonu ApoB-100 deki lizin kalıntılarıyla reaksiyon Scavenger reseptörleri Endoteliyal hücreler Makrofajlar Düz kas hücreleri Şekil 7: LDL oksidasyon mekanizmaları NO; Nitrik oksit, NO 2 ; nitrojen dioksit, HOCL; Hipokloröz asit oxldl, LDL nin bağlanamadığı çöpçü reseptörleri (Scavenger reseptör A) ve CD36 reseptörlerine bağlanır (24,54,55). Bu reseptörler hücre içindeki kolesterol düzeyi tarafından regüle edilemez ve subendotel yerleşimli makrofajlar oxldl yi kontrolsüz bir biçimde hücre içine alarak köpük hücrelerini meydana getirirler (15,24,55). Scavenger reseptör A (SRA) ve CD36 reseptörü bulunmayan farelerde aterosklerozun gelişiminin yavaşladığı bildirilmiştir (54). 26

32 Makrofaj, Endotel veya Düz Kas Hücreleri veya Doğal LDL Asetil LDL yavaş hızlı hızlı hızlı Doğal LDLR downregülasyon Asetil LDLR=SRA oxldlr=sra, CD36 Makrofaj Şekil 8: oxldl nin çöpçü reseptörleri ile makrofaj içine alınması (55) oxldl, MCP-1 sekresyonunu arttırarak daha fazla monositin endotel yüzeyine infiltrasyonuna, M-CSF (Macrophage Colony-Stimulating Factor) sekresyonu ile de daha fazla makrofaj üretilmesine böylece köpük hücre oluşumunun artmasına neden olur (58). oxldl nin düz kas hücrelerine migrasyonu, endotel hücreleri, makrofaj ve düz kas hücrelerinin PDGF (Platelet-Derived Growth Factor) salgılanmasını uyarmaları sonucu artar (59). Köpük hücrelerinin toplanması ve düz kas hücrelerinde migrasyon ve proliferasyonun artması intimanın kalınlaşmasına neden olur. Arteriyal lümenin daralması, vazodilatör kapasitenin daha fazla bozulmasına yol açar. oxldl vazokonstriktör endotelin-1 (ET-1) üretimini stimüle ederken (60), vazodilatör NO üretimini azaltır (61). Endotel ve düz kas hücrelerinin apoptozisi plak rüptürüne yol açar (62). Endotel disfonksiyonu, platelet adezyonu ile prokoagulan aktivitenin artması ve fibrinolizisin bozulmasıyla ilişkilidir (63). oxldl platelet adezyon ve agregasyonunu, endotelde NO üretimini azaltarak, PGI 2 (prostasiklin) üretimini arttırarak stimüle eder (64). Prokoagulan aktiviteyi endotel ve düz kas hücrelerinden doku faktörü (TF) sekresyonunu arttırarak sağlar (65). Ayrıca trombomodulin transkripsiyonunu azaltarak (66) ve protein C aktivasyonunu baskılayarak (67) prokoagulan aktiviteyi arttırır. oxldl, doku plazminojen aktivatör (tpa) sekresyonunu azaltarak ve PAI-1 sekresyonunu arttırarak 27

33 fibrinolitik aktiviteyi azaltır (68). oxldl nin, LDL den daha fazla aterojenik olmasının dört önemli nedeni vardır: 1. oxldl, arter duvarındaki hücreler için sitotoksiktir. Hücresel hasar, öncelikle endotel hasarı oluşturabilir. Böylece aterosklerotik olaylar zinciri başlatılır. 2. oxldl, arter intimasında kolesterol birikmesi sonucu down regülasyona uğramayan scavanger reseptörler aracılığıyla makrofaj içine alınır, böylece köpük hücre ve lezyon oluşumuna katılır. 3. oxldl, monosit kemotaksisi için düz kas hücre ve endotelden salınan faktörler gibi kimyasal çekici (kemoattraktan) maddedir. Onların damar intimasına göçünü hızlandırır. 4. oxldl, makrofajların intimadan plazmaya kaçışını önleyerek arter intimasındaki kalış sürelerini uzatır. HDL, LDL yi oksidasyondan koruyabilme yeteneğine sahiptir. LDL nin oksidasyondan korunmasında, PON1 in HDL üzerine katalizör etkisinin olabileceği düşünülmektedir. PON1, lipid peroksitlerinin aterojenik etkilerini nötralize ederek hücre membranlarını koruyucu etki gösterir (51). PON1, LDL yi bakır iyonunun ve serbest radikallerin indüklediği oksidasyondan korumaktadır (8,51). LDL oksidasyonu esnasında oluşan okside kolesterol esterleri ve lizofosfatidilkolinler PON1 enzimindeki serbest sülfidril grubu ile etkileşime girer ve enzimin inaktive olmasına yol açar. Oksidatif sistemlerdeki Cu +1 /Cu +2 iyonlarının oksidasyon esnasında, PON1 in paraoksonaz/arilesteraz aktivitesi için gerekli olan Ca +2 iyonunun yerine geçmesinin PON1 in kısmen inaktivasyonundan sorumlu olabileceği de düşünülmektedir. PON1 inhibitörlerinin, LDL oksidasyonunu artırması, hem PON1 inaktivasyonuna hem HDL lipidlerinin total lipid peroksit oluşumuna katılmasına bağlıdır (69). Kısmen okside olmuş fosfolipidlerin, PON l in ekspresyonunu azalttığı, enflamatuvar sitokinlerin (IL- 6) apoj yi arttırdığı ve IL-6 nın PON1 regülasyonu için kısa dönemde etkili olduğu bulunmuştur. MCP-l in okside olmuş fosfolipidlerin regülasyonu için gerekli olmadığı belirtilmiştir (70). PON1 in sadece LDL oksidasyonunu değil, aynı zamanda HDL oksidasyonunu da (geçiş metal iyonları ve serbest radikaller aracılığıyla oksidasyon indüklendiğinde) engellediği 28