PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FERROSENİL DİTİYOFOSFONAT İÇEREN İLETKEN POLİMERLERİN SENTEZİ VE BİYOSENSÖR UYGULAMALARI

Transkript

1 PAMUKKALE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FERROSENİL DİTİYOFOSFONAT İÇEREN İLETKEN POLİMERLERİN SENTEZİ VE BİYOSENSÖR UYGULAMALARI YÜKSEK LİSANS TEZİ Tuğba SOĞANCI Anabilim Dalı : Kimya Programı : Fizikokimya Tez Danışmanı: Prof. Dr. Halil CETİŞLİ Eş Danışman: Doç.Dr. Metin AK

2 ARALI

3 v

4 TEŞEKKÜR Bu tez çalışmasında desteğini her zaman hissettiğim danışman hocam Prof.Dr. Halil CETİŞLİ ye, tez çalışmamın başlangıcından sonuna kadar ilgi, desteklerini benden esirgemeyen, hem maddi hem manevi olarak her zaman yanımda olan ve bilimsel katkılarıyla yol gösteren eş danışman hocam Doç.Dr. Metin AK a, tez kapsamında sentezlenecek malzemelerin sentezinde bilgisini esirgemeyen hocam Doç.Dr. Mehmet KARAKUŞ a, tecrübeleriyle ve desteğiyle her zaman yanımda olduğunu hissettiren hocam, manevi ablam Yrd.Doç.Dr. Gülbanu KOYUNDERELİ ÇILGI ya, bilgi ve desteğiyle yol gösteren hocam Dr. Mine SULAK a, sentezlenen maddelerin analizinde yardımını esirgemeyen ve tüm yüreğiyle yanımda olan Gülbin KURTAY a teşekkür ederim. Tezin biyosensör uygulamalarında laboratuvarını bize açarak çalışmalarımıza izin veren ve bilgisiyle katkılarda bulunan Prof.Dr. Suna TİMUR a, Doç.Dr. Dilek ODACI DEMİRKOL a ve biyokimya laboratuvarında çalışan tüm arkadaşlarıma teşekkür ederim. 111T074 nolu Tübitak Projesine ve 2011FBE073 no lu Pamukkale Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Projesine, Pamukkale Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümünde tüm tez çalışmam boyunca katkılarını gördüğüm tüm hocalarıma, arkadaşlarıma teşekkür ederim. Çalışmalarım boyunca maddi ve manevi desteklerini benden birgün bile esirgemeyen arkamdaki koca çınarım babam Mehmet Ali SOĞANCI ya, sabrı ve sevgisiyle her an yanımda olan annem Gülten SOĞANCI ya ve canım ablam Demet KILIÇ a teşekkürü borç bilirim. ARALIK 2013 Tuğba SOĞANCI (Kimyager) vi

5 İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... xv SUMMARY... xvi 1. GİRİŞ İLETKEN POLİMERLER Polimerlerde İletkenliğin Açıklanması İletken Polimerlerde Band Teorisi İletken Polimer Hazırlamada Doping İşlemi Soliton, polaron ve bipolaron yapıları Atlama (hopping) olayı İletken Polimerlerin Polimerleşme Mekanizmaları İletken Polimerlerin Sentez Yöntemleri Kimyasal Polimerizasyon Elektrokimyasal Polimerizasyon Koordinasyon Polimerleri Polimer Metal Komplekslerinin Sınıflandırılması Metal İyonu ile Polimer Ligandının Komplekleşmesi Asılı Duran Metal Kompleksleri Polimer Zinciri İçerisinde veya Polimer Zincirleri Arasında Metal Polimer Kompleksleri Elektroanalitik Teknikler Voltametrik Metodlar Dönüşümlü Voltametri (CV) Kronoamperometri (CA) Kare Dalga Voltametrisi (SWV) Elektrokromizm Elektrokromik Materyallerin Çeşitleri Elektrokromik Polimer Çalışmalarında Deneysel Metodlar Spektroelektrokimya Elektrokromik Karşıtlık Switching Time (Tepkime Zamanı) BİYOSENSÖRLER Enzim Enzimlerin Yapısı Aktif Merkez vii

6 3.1.2 Enzimlerin Sınıflandırılması Enzim İmmobilizasyonu Enzim İmmobilizasyonu Yöntemleri Taşıyıcı Bir Yüzeye Bağlama Çapraz Bağlama Tutuklama Enzim Kinetiği Enzim Aktivitesi Michelis ve Menten Kinetiği Glukoz Oksidaz Glukoz Oksidazın Genel Özellikleri Glukoz Oksidazın Reaksiyon Mekanizması Enzim Elektrodu Amperometrik Enzim Elektrodu Jenerasyonları Enzim Elektrodu Karakteristikleri Kararlılık Seçicilik Cevap Süresi Amperometrik Glukoz Elektrodu Amperometrik Glukoz Elektrodunun Kullanım Alanları DENEYSEL ÇALIŞMALAR Kullanılan Kimyasal Maddeler, Cihazlar ve Teknikler Kimyasal Maddeler Kullanılan Alet ve Cihazlar Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi (FT-IR) Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) Potensiyostat UV-VIS Spektrofotometre Biyosensör Çalışmasına Yönelik Sistemler Deneysel Prosedür TPFc in Sentezi (((1S)-2-((4-(1H-pirol-1- yl)fenoksi)(merkapto)fosforotiyol)siklo penta-2,4-dien-1-yl)(siklo-2,4-dien-1- yl)demir)) Biyosensör çalışmasında kopolimer oluşturmak için kullanılan TPA'nın Sentezi Elektrokimyasal Polimerizasyon TPFc ile Pirol ün DCM İçerisindeki Kopolimerizasyonu TPFc ile TPA nın DCM İçerisindeki Kopolimerizasyonu İletken Polimerin Elektrokromik Özellikleri Spektroelektrokimya Kinetik Çalışmalar Enzim Elektrodu Hazırlanması Enzimin Kovalent Bağlanması TPFc-co-TPA/Glukoz Oksidaz Enzim Sensörünün Hazırlanması viii

7 4.5.3 P(TPFc-co-TPA/GOx) Enzim Sensörleri ile Ölçüm İlkesi Elektrot Performans Çalışmaları Ferrosenin Redoks Özelliğinden Faydalanarak Amperometrik Olarak Sensör Cevabının İzlenmesi Optimum ph TPFc-co-TPA/Glukoz Oksidaz Enzim Sensörünün Karakterizasyonu Doğrusal Tayin Aralığı Analiz Sonuçlarının Tekrarlanabilirliği ve Yeniden Üretilebilirlik Örnek Uygulama Girişimci Testi BULGULAR ve TARTIŞMA Monomer Karakterizasyonu TPFc Monomerine Ait 1 H-NMR, 13 C-NMR ve 31 P-NMR Spektrumu (2,5-di(tiyofen-2-yl)-1H-pirol-1-yl)bütan-1-amin (TPA) Monomerine Ait 1 H-NMR Spektrumu Sentezlenen Polimerlerin Elektrokimyasal ve Elektrokromik Özellikleri P(TPFc-co-Py) nin DCM İçerisindeki Elektrokimyasal Özellikleri P(TPFc-co-Py) nin DCM İçerisindeki Elektrokromik Özellikleri P(TPFc-co-Py) nin CH 3 CN İçerisindeki Elektrokimyasal Özellikleri P(TPFc-co-Py) nin CH 3 CN İçerisindeki Elektrokromik Özellikleri P(TPFc-co-TPA) nın DCM İçerisindeki Elektrokimyasal Özellikleri Elektrot Performans Çalışmaları Elektrot Yüzeyine Kaplanan Kopolimer Oranının Optimizasyonu ph Optimizasyonu Enzim Elektrodunun Kalibrasyonu Analiz Sonuçlarının Tekrarlanabilirliği Örnek Uygulama SONUÇ Kaynakça EKLER ix

8 KISALTMALAR 3-AAF PF CH 3 CN Ag/AgCl c.v CA CC CV DCE DCM ES Fc FT-IR GA Glu GOx HOMO ITO I max L LUMO M Med NMR P(Py) P(TPFc-co-Py) Pt Py S.D S TPA TBAPF 6 TPFc TPFc-co-TPA P(TPFc-co-TPA/GOx) UV V max :3-Asetamidofenol :4-(1-H-Pirol-1-yl) fenol :Asetonitril :Gümüş/Gümüş Klorür elektrodu :Varyasyon katsayıları :Kronoamperometri :Kronokulometri :Dönüşümlü Voltametri :Damlayan Civa Elektrotu :Diklorometan :Enzim-Substrat kompleksi :Ferrosen :Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi :Glutaraldehit :Glukoz :Glukoz oksidaz :En Yüksek Enerjili Molekül Orbitali :İndiyum Kalay Oksit :Reaksiyona Ait Maximum Akım Değeri :Ligant :En Düşük Enerjili Molekül Orbitali :Metal :Medyatör :Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi :Polipirol :Poli TPFc-Pirol Kopolimeri :Platin Elektrot :Pirol :Standart Sapma Değeri :Substrat :4-(2,5-di(tiyofen-2-yl)-1H-pirol-1-yl) bütan-1-amin :Tetrabütilamonyumhegzaflorofosfat : (((1S)-2-((4-(1H-pirol-1-yl) fenoksi) (merkapto)fosforotiyol) siklo penta-2,4-dien-1-yl)(siklo- 2,4-dien-1-yl) demir) :TPFc ve TPA nın Kopolimeri :Poli TPFc-TPA Kopolimerine Ait GOx Enzim Elektrodu :Ultra Viyolet :Reaksiyonun Maksimum Hızı x

9 TABLO LİSTESİ Tablolar Tablo 1. Doping edilmiş bazı konjuge polimerlerin yapıları ve iletkenlikleri... 9 Tablo 2. P(Py), P(TPFc), P(TPFc-co-Py) ve Fc nin DCM içerisinde indirgenme yükseltgenme potansiyelleri Tablo 3. P(Py), P(TPFc), P(TPFc-co-Py) ve Fc nin CH 3 CN içerisinde indirgenme yükseltgenme potansiyelleri Tablo 4. P(Py), P(TPFc), P(TPFc-co-TPA) ve Fc nin DCM içerisinde indirgenme yükseltgenme potansiyelleri Tablo 5. P(TPFc-co-TPA/GOx) enzim sensörü için hesaplanan standart sapma ve varyasyon katsayısı Tablo 6. P(TPFc-co-TPA/GOx) enzim sensörü ve spektrofotometrik yöntem kullanılarak iki farklı örnekte glukoz analizi Tablo 7. Etanol ve 3-asetamido fenol bileşiklerinin P(TPFc-co-TPA/GOx) ait enzim sensör cevabına etkisi xi

10 ŞEKİLLER LİSTESİ Şekiller Şekil 1. Pirolün polimerleşmesi... 1 Şekil 2. Polimer molekülünde bağ ve karşı bağ orbitallerinin oluşumu... 4 Şekil 3. Yalıtkan, yarı iletken ve iletken maddelerin elektronik davranışları... 5 Şekil 4. π bağına sahip bileşiklerin moleküler orbital diyagramı... 7 Şekil 5. Polaron ve bipolaronların oluşumu Şekil 6. a) Doplanmamış, b) Az doplanmış ve c) Çok doplanmış iletken Şekil 7. a) Kristal bir yapıda zincir üzerinde, b) Kristal bir yapıda zincirden zincire, c) Amorf bir bölgede zincirden zincire Şekil 8. Pirol için alfa ve beta pozisyonlarından gerçekleşen polimerleşme Şekil 9. Pirol, tiyofen ve furan bileşiklerinin polimerleşme mekanizmalarının başlangıç safhası ve akabinde meydana gelen dimerleşme olayı Şekil 10. Pirolün kimyasal ve elektrokimyasal polimerizasyonu için önerilen mekanizma Şekil 11. Asılı duran metal iyonu kobalt kompleksine örnek Şekil 12. İki polimer zinciri arasındaki polimer-metal kompleksi Şekil 13. İki polimer zinciri içindeki polimer-metal kompleksi Şekil 14. Polimer zinciri arasındaki polimer-metal kompleksi Şekil 15. Dönüşümlü voltametride akım-potansiyel eğrisi Şekil 16. EC mekanizmasını gösteren çoklu tarama yapılmış dönüşümlü voltametri grafiği örneği Şekil 17. ECE mekanizması gösteren çoklu tarama yapılmış dönüşümlü voltametri örneği Şekil 18. Kronoamperometride çalışma elektrotuna uygulanan potansiyelin zamanla değişimi Şekil 19. Kare Dalga Voltametrisi için potansiyel-zaman dalga şekli ve akım ölçümü Şekil 20. Tersinir bir reaksiyon için uyarma sinyaline akım cevabı, i 1 ileri akım, i 2 ters akım, i 1 i 2 akım farkı Şekil 21. Katalizor mekanizması. E a, katalizlenmemiş reaksiyonun aktivasyon enerjisi; E a, katalizlenmiş reaksiyonun aktivasyon enerjisi; ΔG, reaksiyonun serbest enerjisindeki değişim Şekil 22. Taşıyıcı yüzeye bağlı enzimin şematik gösterimi Şekil 23. Çapraz bağlı enzimin şematik gösterimi Şekil 24. Glutaraldehite ait kimyasal yapı Şekil 25. Tutuklanmış enzimlerin şematik gösterimi Şekil 26. Michelis Menten grafiği Şekil 27. Lineweaver-Burk Eğrisi Şekil 28. GOx reaksiyonunun şematik gösterimi Şekil 29.Bir enzim elektrodunun temel elemanları Şekil 30. Amperometrik enzim elektrodu jenerasyonları a) I. Nesil Amperometrik elektrotlar, b) II. Nesil Amperometrik elektrotlar, c) III. Nesil Amperometrik elektrotlar Şekil 31. TPFc sentezi xii

11 Şekil 32. 1,4-di(tiyofen-2-yl)bütan-1,4-dion sentezi Şekil (2,5-di(tiyofen-2-yl)-1H-pirol-1-yl)bütan-1-amin (TPA) sentezi Şekil 34. TPFc ile Py Kopolimerizasyonu Şekil 35. TPFc ile TPA Kopolimerizasyonu Şekil 36. Ferrosenin elektrokimyasal özelliğinin enzim biyosensörlerindeki görevine ilişkin reaksiyonlar Şekil 37. TPFc maddesinin 1 H -NMR Spektrumu Şekil 38. TPFc maddesinin 13 C -NMR Spektrumu Şekil 39. TPFc maddesinin 31 P -NMR Spektrumu Şekil 40. TPA maddesinin 1 H -NMR Spektrumu Şekil 41. DCM/TBAPF 6 içerisinde 250 mv/s tarama hızıyla alınan a) P(Py), b) P(TPFc), c) P(TPFc-co- Py) kopolimeri, d) Ferrosen e ait dönüşümlü voltametri grafikleri Şekil 42. Farklı tarama hızlarında (0,05 0,7 V/s) DCM/TBAPF 6 içerisinde a) P(TPFc-co-Py) kopolimerine ve b) P(Py) e ait dönüşümlü voltametri grafikleri Şekil 43. a) P(TPFc-co-Py) ve b) P(Py) ait spektroelektrokimya grafikleri Şekil 44. DCM/TBAPF 6 içerisinde, a) Potansiyel-Zaman, b) P(TPFc-co-Py) ve c) P(Py) ait tepki süresinin izlendiği absorbans-zaman ve d) P(TPFc-co-Py) akımzaman grafikleri Şekil 45. CH 3 CN/TBAPF 6 içerisinde 250 mv/s tarama hızıyla alınan a) P(Py), b) P(TPFc), Şekil 46. Farklı tarama hızlarında (0,1-0,7 V/s) CH 3 CN/TBAPF 6 içerisinde a) P(TPFc-co-Py) kopolimerine ve b) P(Py) ait dönüşümlü voltametri grafikleri. 70 Şekil 47. a) P(TPFc-co-Py)ve b) P(Py) ait spektroelektrokimya grafikleri Şekil 48. CH 3 CN/TBAPF 6 içerisinde, a) Potansiyel-Zaman, b) P(TPFc-co-Py), c) P(Py) ait tepki süresinin izlendiği absorbans-zaman ve d) P(TPFc-co-Py) akımzaman grafikleri Şekil 49. DCM/TBAPF 6 içerisinde 250 mv/s tarama hızıyla alınan a) P(TPA), b) P(TPFc), c) P(TPFc-co-TPA) kopolimeri ve d) Ferrosen e ait dönüşümlü voltametri grafikleri Şekil 50. Farklı tarama hızlarında (0,02 0,3 V/s) DCM/TBAPF 6 içerisinde a) P(TPFc-co-TPA) kopolimerine ve b) P(TPA) e ait dönüşümlü voltametri grafikleri Şekil 51. a) P(TPFc-co-TPA) ve b) P(TPA) ait spektroelektrokimya grafikleri Şekil 52. DCM/TBAPF 6 içerisinde, a) Potansiyel-Zaman, b) P(TPFc-co-TPA), c) P(TPA) ait tepki süresinin izlendiği absorbans-zaman ve d) P(TPFc-co-TPA) akım-zaman grafikleri Şekil 53. P(TPFc-co-TPA/GOx) enzim elektrodunun Lineweaver-Burk eğrisi Şekil 54. P(TPFc-co-TPA/GOx) enzim sensörüne ph ın etkisi Şekil 55. P(TPFc-co-TPA/GOx) enzim elektrodunun kalibrasyon eğrisi (Sodyum Asetat Tamponu, ph 4,5) xiii

12 SEMBOL LİSTESİ Es :Kare Dalgalar Arasındaki Yükseklik Farkına Basamaklı Adım Yüksekliği i :Her Bir Kare Dalganın Net Akımı % T :Optik Kontrast A :Elektrotun Yüzey Alanı (cm 2 ) C A :Analit Derişimi (mol/cm 3 ) C O :Elektroaktif Türün Başlangıçtaki Derişimi (mol/cm 3 ) E :Potansiyel Değerleri E :Her Bir Taşıyıcının Üzerindeki Yük E 1/2 :Yarı Dalga Potansiyeli E a :Aktifleşme enerjisi (camsı geçiş sıcaklığına (T g ) yakın bir değerdeki enerji) E a :Katalizlenmemiş Reaksiyonun Aktivasyon Enerjisi E a :Katalizlenmiş Reaksiyonun Aktivasyon Enerjisi E g :Bant Aralığı E pa :Anodik Pik Potansiyelleri E pc :Katodik Pik Potansiyelleri E sw :Kare Dalga Genliği f :Frekans I :Akım i 1 :Sınır Akım Değeri i pa :Anodik Pik Akımları i pc :Katodik Pik Akımları k :Boltzman sabiti (1,38x10-23 J / K) K m :Michelis Menten sabiti k s :Standart Heterojen Elektron Transfer Hız Sabiti n :Aktarılan Elektron Sayısı N :Birim Hacim Başına Düşen Taşıyıcı Sayısı n α :Aktarılan Toplam Elektron Sayısı Q çift :Çift Tabaka Biriken Yük Miktarı T :Mutlak sıcaklık (K) V :Tarama Hızı (V/s) Γ :Elektrot Yüzeyine Adsorbe Olmuş Madde Konsantrasyonu (mol/cm 3 ) δ :Sigma Bağı ΔG :Reaksiyonun Serbest Enerjisindeki Değişim μn :Negatif Yük Taşıyıcının Hareketliliği μp :Pozitif Yük Taşıyıcının Hareketliliği π :Pi Bağı Σ :İletkenlik (S/cm) Τ :Periyod xiv

13 ÖZET FERROSENİL DİTİYOFOSFONAT İÇEREN İLETKEN POLİMERLERİN SENTEZİ VE BİYOSENSÖR UYGULAMALARI Bu çalışmada, giderek önemi artan ve birçok araştırmaya konu olan, literatürde benzer türevleri bulunmayan, tiyofen, pirol gibi elektrokimyasal ve kimyasal yollar ile polimerleştirilen grup içeren ve inorganik ferrosenil ditiyofosfonat ile fonksiyonlandırılmış hibrit monomerler ve iletken polimerler sentezlenmiş ve bu iletken polimerlerin biyosensör olabilme kapasiteleri araştırılmıştır. Bu amaçla, [FcP(=S)( -S)] 2 (FcPF) ile 4-(1-H-Pirol-1-yl) fenol ün (PF) reaksiyonuna dayanarak TPFc ((((1S)-2-((4-(1H-pirol-1-yl)fenoksi) (merkapto) fosforotiyol) siklopenta-2,4-dien-1-yl)(siklo-2,4-dien-1-yl)demir)))hibrit monomeri elde edilmiştir. Ayrıca kopolimer oluşturmak amacıyla serbest amino gruplarına sahip 4-(2,5-di(tiyofen-2-yl)-1H-pirol-1-yl)bütan-1-amin (TPA) sentezlenmiş ve FT- IR, 1 H-NMR, 31 P-NMR analizleri ile sentezlenen maddelerin yapısı aydınlatılmıştır. Diğer bir çalışma olarak tezin kapsamı gereği, organik çözücülerde çözünen TPFc nin Pirol ve TPA ile kopolimerleri (P(TPFc-co-Py)),( P(TPFc-co-TPA)) elektrokimyasal olarak elde edilmiştir ve kopolimerlerin elektrokimyasal davranışları dönüşümlü voltametre ile araştırılmıştır. Her iki kopolimerin, dönüşümlü voltametri (CV), FT-IR, UV-Vis spektrofotometrisi ile karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Polimerlerin elektrokromik özellikleri spektroelektrokimya, kinetik ve renk değişim analizleri ile tanımlanmıştır. Biyosensör uygulamaları için, glukoz oksidaz (GOx) bazlı enzim elektrodu oluşturulması amaçlanmıştır. Bu amaçla, mediatör olarak görev yapan ferrosen içeren TPFc ve stabil bir enzim immobilizasyonu sağlayan serbest amino grupları içeren TPA monomeriyle kopolimerizasyon gerçekleştirilmiştir. TPFc/TPA kopolimeri ile modifiye edilen yüzeye glukoz oksidaz (GOx) enzimi immobilize edilerek P(TPFc-co-TPA/GOx) enzimatik biyosensörü hazırlanmıştır. Biyosensörün hazırlama ve çalışma koşulları optimize edilerek, analitik karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Anahtar Kelimeler: İletken Polimerler, Hibrit Polimerler, Biyosensörler xv

14 SUMMARY SYNTHESIS OF CONDUCTING POLYMERS CONTAINING FERROCENYL DITHIOPHOSPHONATE AND THEIR BIOSENSOR APPLICATIONS In this study, which has an increasingly important and is the subject of several investigations in the literature, new thiophene and pyrrole containing groups which are polymerize by electrochemical and chemical route and functionalized with inorganic ferrocenyl dithiophosphonate hybrid monomers and conductive polymers were synthesized and their capacities to be biosensor were investigated. For this purpose, on the based of reaction of 4-(1-H-pyrrol-1-yl) phenol (PF) with [FcP(=S)( -S)] 2 (FcPF), TPFc (((1S)-2-((4-(1H-pyrrol-1-yl)phenoxy) (mercapto) phosphorothioyl) cyclopenta-2,4-dien-1-yl)(cyclopenta-2,4-dien-1-yl)iron) hybrid monomer was obtained. Furthermore, free amino groups on the copolymer to form4- (2, 5-di (thiophen-2-yl)-1h-pyrrol-1-yl) butane-1-amine (TPA) was synthesized. Structure of all substances synthesized was characterized with analysis of FT-IR, 1 H- NMR, 31 P-NMR. As another study by the scope of the thesis, structure of copolymer with Pyrrole and TPA of TPFc, ((Poly(TPFc-Py), (Poly(TPFc-TPA)), which were soluble organic solvent, were obtained electrochemically and electrochemical behaviors of copolymers were studied by cyclic voltametry. Both of the structure of copolymers were characterized by various techniques including cyclic voltammetry, FT-IR, UV- Vis Spectrophotometer. The electrochromic properties of the polymers were investigated via spectroelectrochemistry, kinetic and switching studies. For applications of biosensors, the design of glucose oxidase (GOx)-based enzyme electrode was aimed. For this purpose, ferrocene containing TPFc which used mediator and free amino groups containing TPA which is provided stable enzym immobilization were copolymerized. P(TPFc-co-TPA/GOx), enzymatic biosensor was obtained by way of immobilizing glucose oxidase (GOx) on the surfacemodified with copolymer TPFc/TPA. Analytical characterization of biosensor was carried out by optimizing preparation and working conditions. Key Words: Conducting Polymers, Hybrid Polymers, Biosensor xvi

15 1. GİRİŞ Polimer, çok sayıda küçük molekülün kovalent bağlarla birbirlerine bağlanarak oluşturduğu makromoleküldür. Monomer adı verilen küçük moleküller uygun koşullarda polimerizasyon tepkimesi sonucu birbirleriyle kimyasal bağ yaparlar ve polimer moleküllerine dönüşürler. Pirolün, polimerleşerek polipirole dönüşümü basitçe, Şekil 1. Pirolün polimerleşmesi şeklinde gösterilir.(1) Bileşiklerin kaynağına göre polimerler, sentetik (yapay) ve doğal olmak üzere iki şekilde gruplandırılır. Endüstride sentezlenen polipirol, polipropilen, poliester, poliamid gibi organik polimerler yapaydır. Tabiatta bulunan, protein, pamuk, ipek, selüloz gibi polimerler ise doğaldır. Kimyasal yapılarına göre polimerler organik ve anorganik olmak üzere ikiye ayrılır. Sentetik ve doğal polimerlerin çoğu organik kökenli iken metal ve ametalleri içeren polimerler ise anorganiktir. Yapay polimerler, kondenzasyon ve katılma polimerizasyonu olarak iki farklı kimyasal reaksiyon ile sentezlenebilmektedir. -NH 2, -OH, -COOH gibi fonksiyonel gruplara sahip monomerlerin ester değişimi, Diels-Alder katılması, aromatik nükleofilik yerdeğiştirme ve üretan oluşumu gibi reaksiyonlar neticesinde, küçük moleküllerin ayrılması kondenzasyon polimerizasyonu ile gerçekleşir. Katılma polimerizasyonu ise monomerler üzerinde aktif merkezler oluşturularak gerçekleştirilir. Ortama radikaller verebilecek azo, azoperoksidik ve peroksidik yapılar eklenir (2). Bu polimerizasyon sadece radikaller ile değil monomerlerde de iyon aktif merkezler oluşturarak katyonik ya da anyonik olarak gerçekleşir. Polimerlerin ısısal davranışları da kullanım açısından önem arz etmektedir. Termoplastik olarak adlandırılan polimerler ısıtıldığı zaman erirler ve yumuşama özelliklerinden dolayı şekillendirilebilir. Termosetler ise çapraz bağlı polimerler olup yumuşamazlar, aşırı ısıtıldığında yanarak bozunurlar. 1

16 Yaşantımızın büyük bir parçasını oluşturan eşya ve aletlerin büyük kısmı polimerik maddelerden oluşmuştur. Polimerik maddeler, fiziksel bakımdan dayanıklı olmaları, mikroorganizmalara ve bakterilere karşı mukavemetleri, hafif, kolay işlenebilme ve ucuz olmaları gibi özelliklerinden dolayı büyük önem taşımaktadır. Ayrıca polimer yerine kullanılan doğal maddelerin, doğal kaynaklarının tükenme tehlikesi de bunların önemini arttırmaktadır. Günümüzde polimer konusunda çalışan bilim adamlarının ilgi alanı, yeni polimer madde sentezinden ziyade polimerin mekanik, termal dayanıklılığı, çözücülere karşı direncin arttırılması ve endüstride işlenebilme kolaylığının sağlanabilmesi gibi fiziksel ve kimyasal özelliklerinin iyileştirilmesi yönündedir. Bilim ve teknolojinin gelişmesi ile kullanım alanlarının artması ve bu alanların bazılarında polimerin iletken olabilme özellikleri de araştırılmış ve bunun sonucunda konjuge π bağlarına sahip olan pirol gibi az sayıda organik maddelerden değişik koşullarda iletken polimerler sentezlenmiştir (3). İletken polimerlerin iletkenliklerini sentez koşullarını ve sentez yöntemlerini değiştirerek kontrol altına almak en önde gelen çalışmalardandır. Bu amaçla yapılan çalışmalarda son yirmi yılda kimyasal ve elektrokimyasal yöntemlerle pek çok iletken polimer sentezlenmiştir. 2. İLETKEN POLİMERLER 2.1 Polimerlerde İletkenliğin Açıklanması Son zamanlarda, bilim ve teknolojideki gelişmeler fiziksel ve kimyasal özellikleri açısından farklı malzemeleri ihtiyaç haline getirmiştir. Bu açıdan doğal, yalıtkan, polimerik, sentetik, organik materyallere, metalik ya da yarı iletken özellik kazandırabilmek adına çalışmalar artmıştır. İletken polimerlere olan ilginin büyük bir kısmı, metalik iletkenler ve anorganik yarı iletkenler yerine kullanılabilir olmalarındandır (4). Kendi yapısı içindeki elektronlarla elektriksel iletkenlik sağlayan, başka bir ifadeyle uygun elektron vericiler ve alıcılarla yük transferinin sağlandığı konjuge sistemler, iletken polimer olarak adlandırılırlar. Monomerik ya da polimerik yapıdaki bu organik malzemeler, sentetik modifikasyona karşı duyarlı olması nedeniyle, sentetik metal ya da organik metal olarak da tanımlanır. Konjuge sistemden dolayı bu tür polimerler birbiri ile benzerlik gösterir. Polimer zinciri boyunca, zincirdeki atomları bir arada tutan δ bağları ile bu bağlardan daha zayıf olan π bağları bulunur. π bağları, sistemdeki bütün atomlar üzerine delokalize olabilir. İletkenliğe neden olan da bağlarındaki elektronlardır. Polimer sisteminde bulunan elektronlar, kimyasal ve elektrokimyasal yükseltgenme ve indirgenme ile yer değiştirebilir. 2

17 Bunun sonucu olarak da n - tipi veya p - tipi iletken formunu oluştururlar (5). p - tipi ; Yükseltgenme [P] x + xya - - xye [P y+ A - ] x n-tipi ; İndirgenme [P] x + xyc + +xye [P y+ C + ] x (C + : katyon, A - : anyon, y: polimer başına düşen yük miktarı). Polimerlerin büyük çoğunluğu esas olarak karbon atomlarından oluşur. İletken olmayan organik polimerler, ana zincirde doymuş karbon atomlarının düzgün dört yüzlü (tetrahedral) geometride birleşmesi ile oluşur. Karbonlar arasındaki tekli bağları uyarmak oldukça zordur. Çünkü geniş band aralığına sahiptir ve 7-10 ev enerji gerektirmektedir. Bu sebeple, yalıtkan olarak nitelendirilir. İletken polimerlerde, karbona ait üç değerlik elektronu 120 lik açıyla düzlemsel üç δ bağı yapar, dördüncü değerlik elektronu ise düzleme dik olarak yerleşir. Temel zincirdeki karbon atomlarının düzleme dik yerleşen orbitallerin bitişik iki tanesi, örtüşerek π bağlarını oluşturur. Bu aşamada kararlı hale geçtiğinden enerjisi azalır (6) ve π bağı polimer segmentleri üzerinde delokalizasyona sebep olur. Böylece, değerlik ve iletkenlik bandları arasında enerji boşluğunun azalmasını sağlar. Bu band boşluğu 1,5 3,0 ev değeriyle yarı iletkenlerine benzerlik gösterir (7). Diğer bir ifadeyle C-C tek bağına sahip yapıda sp 3 hibritleşmesi yapan karbon atomunun, değerlik elektronları dört hibrit orbitaline yerleşir, bu yapılar yalıtkandır. Çünkü C-C bağındaki elektronları uyarmak oldukça yüksek enerji gerektirir ve bu bileşikler oldukça geniş band aralığına sahiptirler. Oysa sp 2 ve sp hibritleşmesinin görüldüğü C=C, C C bağlı bileşiklerde, hibrit orbitallerinden başka hibritleşmeye katılmayan elektron içeren p orbitalleri de bulunur. Uzun konjugasyona sahip polimerlerde p orbitallerinin düşey örtüşmesiyle π bağları meydana gelir. π bağındaki π elektronları metalik iletkenliğe neden olur. 2.2 İletken Polimerlerde Band Teorisi İletken, yalıtkan, yarıiletken ve polimerlerde iletkenlik mekanizması, Band Kuramı ile de açıklanmaktadır. Elektriksel iletkenliği, metaller ve yarı iletkenlere göre daha düşük olan organik maddeler yalıtkandır. Bu teoriye göre, atom veya moleküller katı halde bir araya geldiklerinde, değerlik 3

18 elektronlarının bulunduğu dış orbitaller, bağ yapan ve bağ yapmayan orbitaller olarak ayrılır. Bu orbitaller de birbirleriyle karışarak sıkı istiflenmiş iki enerji seviyesi oluşturur. Bunlar, değerlik bandı ve iletkenlik bandı olarak tanımlanır (Şekil 2). Polimerlerde çok sayıda atomlardan oluştuğu için bağ ve karşı bağ sayısı dolayısıyla oluşan molekül orbital sayısı da fazladır. Bağ orbitallerinin kaynaşması sonucu oluşan değerlik bandı, karşı bağ orbitallerinin kaynaşması sonucu oluşan iletkenlik bandıdır. Yani, organik polimerlerde de delokalize elektronlar tarafından sağlanan elektriksel iletkenlik, band teorisi ile ifade edilmektedir (8). Şekil 2. Polimer molekülünde bağ ve karşı bağ orbitallerinin oluşumu Değerlik bandı, mevcut elektronlar ile kısmen doldurulmuş veya iki band örtüşmüş ise iki band arasında hiçbir enerji boşluğu kalmaz. Bunlara dışarıdan bir potansiyel uygulandığında elektronların bir kısmı boş seviyelere doğru hareket edecek, buralarda serbest hareket edebilecek ve akım üretecektir. Bu da bize iletkenliği ifade etmiş olacaktır. Eğer değerlik bandı dolu ve boş iletkenlik bandından bir boşluk ile ayrılmışsa dışarıdan uygulanan potansiyel sonucu elektronların net hareketi gözlenmez. Eğer çok fazla enerji verilirse iletkenlik bandına geçiş olur. Bu tür olaylarda, yarı iletken ya da yalıtkan malzemelerde olur. Değerlik ve iletkenlik bandı arasında boşluk ne kadar büyükse yalıtkanlık özelliği o kadar fazladır. Bu nedenle çoğu polimerler yalıtkandır (Şekil 3). Bu teorinin diğer bir kabülünde, elektronların dekolize olarak yapı içerisinde serbest olarak hareket edebildikleri söylenir. 4

19 E E E iletkenlik Bandı Yasak Bölge İletkenlik Bandı Elektron Dağılımı iletkenlik Bandı Değerlik Bandı Yalıtkan Değerlik Bandı Yarı iletken Değerlik Bandı iletken Şekil 3. Yalıtkan, yarı iletken ve iletken maddelerin elektronik davranışları Yarı iletkenler ikiye ayrılır: İntrinsik Yarı İletkenler: Değerlik ve iletkenlik bandı arasndaki enerji boşluğu az olduğundan uygulanan ışık etkisi ve ısı artışı ile elektronlar değerlik bandından iletkenlik bandına geçebilir. Bu tür yarı iletken polimerlerin iletkenliği, e[ -(T o / T) -1/2 ] denklemine göre sıcaklıkla üssel olarak artmaktadır (9). Sıcaklık artışı ile değerlik bandından iletkenlik bandına geçen elektronların hepsi, iletkenlik bandına geçen elektron yani negatif taşıyıcı, değerlik bandında bu elektronun iletkenlik bandına ulaşması ile oluşan pozitif boşluk oluşturmak üzere iki yük taşıyıcı oluşturur. Bu iki yük taşıyıcının ortamdaki hareketliliği ve yükü, intrinsik malzemenin iletkenliğini etkiler. n.e.µn n.e.μp e: Her bir taşıyıcının üzerindeki yük n: Birim hacim başına düşen taşıyıcı sayısı μp: Pozitif yük taşıyıcının hareketliliği μn: Negatif yük taşıyıcının hareketliliği Entrinsik Yarı iletkenler: Dolu değerlik orbitallerinden elektron çıkarılması ya da iletkenlik bandına elektron eklenmesi sonucu oluşurlar. Bunu oluşturabilmek için farklı element atomları gerekmektedir. Isıl ya da fotolik olarak elektron veren veya alan değişik atomlar ile 5

20 yarı iletken malzeme üzerinde pozitif veya negatif hatalar oluşturulur. Bu boşluklar nedeniyle net akım oluşur. Bu tür malzemenin iletkenlik bandına dış kaynaktan bir elektron girerse n- tipi yarı iletkenlik, değerlik bandından dış kaynağa elektron aktarılıyorsa p- tipi yarı iletkenlik oluşturulmuş olacaktır. Entrinsik yarı iletkenlerde iletkenlik; n.e.µn denklemi ile ifade edilmektedir. Yarı iletken ve konjuge polimerler için iletkenlik, Arrhenius tipindeki eşitlikte görüldüğü gibi, değiştirilebilen elektrik alanında zamanın bir fonksiyonu olarak, sıcaklıkla üssel olarak değişmektedir. exp Ea/kT = İletkenlik (s/cm) = Sabit k= Boltzman sabiti 1,38x10-23 J / K T= Mutlak sıcaklık (K) E a = Aktifleşme enerjisi (camsı geçiş sıcaklığına (T g ) yakın bir değerdeki enerji) Metallerde ise sıcaklığın artması ile iletkenlik azalmaktadır. Bu şekilde sıcaklık ile iletkenliğin değişimi, en önemli farklardan biridir. İletken polimerleri, iletkenlik yönünden diğer organik maddelerden ve polimerlerden ayıran en önemli özellik sahip oldukları delokalize olmuş elektronlardır. Konjuge polimerlerin moleküler orbital diyagramında enerji seviyeleri birbirinden ayrılmaz (bant oluşur) ve HOMO (En Yüksek Enerjili Molekül Orbitali) ve LUMO (En Düşük Enerjili Molekül Orbitali) seviyeleri arasındaki fark normal π sistemlerine göre daha azdır. Küçük moleküllü π sistemli bileşikler ile konjuge polimerlerin moleküler orbital diyagramları arasındaki fark Şekil 4 de gözlenmektedir. 6

21 Şekil 4. π bağına sahip bileşiklerin moleküler orbital diyagramı 2.3 İletken Polimer Hazırlamada Doping İşlemi Elektronik yapısı bakımından polimerler, yalıtkan ya da yarıiletken özelliğindedir. Polimerin elektriksel iletkenlik gösterebilmesi için yapı içindeki elektronların zincir boyunca iletimini sağlayan uygun bölgelere sahip olması gerekmektedir. Bunun için polimer zincirinde konjuge bağları olmalıdır. Fakat yüksek iletkenlik için konjuge sistem tek başına yeterli değildir. İletkenliği arttırmak için doping adı verilen teknik uygulanır. Bu proseste, ortamda kullanılan karşıt iyonlar dopant olarak adlandırılır. Bu teknik kimyasal ve elektrokimyasal olarak uygulanır. Yapıdan elektron koparılmasıyla örgüde pozitif yüklü boşluklar oluşturularak yükseltgenmeye karşılık gelen p- türü doping, yapıya elektron verilerek örgüde negatif yüklü bölgeler oluşturularak indirgenmeye karşılık, n-türü doping işlemi gerçekleştirilir ve yarıiletkenlerdeki yaklaşımla elektron ve boşlukların hareketi neticesinde iletkenliğin artması sağlanır. Bir başka tanım olarak, doping polimer maddeye donör (verici) veya akseptör (alıcı) bir maddenin ilave edilmesidir. Kimyasal doping prosesinde sık kullanılan dopantlar; AsF 5, I 2, SbF 5, AlCl 3, ZrCl 4, FeCl 4, FeCl 3, Br 2, IF 5, O 2, NO 2 PF 6,NO 2 SbF 6, (FSO 3 ) 2, MOCl 5, WCl 6 dır. Elektrokimyasal doping prosesinde ise yükseltgenme ve indirgenme için gerekli enerji dış voltaj kaynağından sağlanırken, oluşan iyonlaşmış polimerin karşıt iyonu destek elektrolitten sağlanır. Yükseltgenmeyi oluşturmak için uygulanan voltaj pozitif potansiyeldir. Yükseltgenmiş polimeri daha da yükseltgemek için voltaj yeterli olmazsa elektrokimyasal 7

22 doping işlemi devam edemez. Doping derecesinin kontrolüyle, yarıiletken bir malzeme metal özelliğinde veya kararlı bir ara ürüne dönüştürülebilir. Örneğin; doplanmamış poliasetilenin iletkenliği band teorisi ile açıklanmaktadır. Poliasetilenin trans durumu için enerji seviyeleri arasında 1,8 ev enerji farkı olan değerlik ve iletkenlik bandı bulunur (10). Isı veya ışık ile uyarılma sonucu elektronların band aralığını geçerek iletkenlik bandına yerleşmesiyle iletkenlik sağlanabilir. Bu durumda doplanmamış poliasetilenin iletkenliği 1x10 8 S/cm değeriyle (11) yarı iletkenlerin düzeyindedir. Poliasetilen AsF 5 ile katkılandığında (kimyasal dop edildiğinde) iletkenliği kat arttırılarak metalik iletkenlik seviyesine çıkarılmıştır (12) ve iletkenliği 1x10 5 S/cm değerine ulaştırılmıştır (13). Doping tekniğinde, polimer örgüsünde kolaylıkla hareket edebilecek zayıf bağlarla bağlanmış yük taşıyıcıları eklenebilmekte böylece eklenen dopant polimere arzu edilen mekanik ve termal özellikleri yanında yüksek iletkenlik de kazandırmış olur (14). Anorganik maddeleri yarıiletken durumuna ulaştırmak için, kütlece %10-%50 aralığında dopant ilave etmek gerekirken, polimeri iletken hale getirmek için ppm seviyesinde dopant ilave etmek yeterlidir. Polimer için dopant miktarını daha da arttırılırsa, yüksek iyonik yapı oluşurken işlenebilme güçlüğü ile karşılaşılır (15). Dopant yapısı içinde bulunduğu polimerin iletkenlik değeri yanında zincirin geometrisini belirler. Bu aşamada şu tanımlama yapılmaktadır: π elektron konjugasyonu yanında dopant derişimi içeren polimerlere iletken organik polimer denir (16). Tablo 1 de çeşitli kimyasal maddelerle doping edilmiş bazı iletken polimerlerin iletkenlik değerleri verilmiştir. 8

23 Tablo 1. Doping edilmiş bazı konjuge polimerlerin yapıları ve iletkenlikleri Katkılama yoluyla iletkenlik şöyle özetlenebilir: Polimerlerde değerlik kabuğundaki elektronlar ya yükseltgen bir reaktif ile koparılabilir ve değerlik kabuğu pozitif hale gelir ya da indirgen bir reaktif ile boş iletkenlik bandına bir elektron verilebilir. Bu işlemler, yükseltgenmeye karşılık olmak üzere p-türü katkılama, indirgenmeye karşılık olmak üzere n- türü katkılama olarak isimlendirilir Soliton, polaron ve bipolaron yapıları Polimerlerin iletkenlikleri yükseltgen/indirgen sübstitüentlerle veya elektron alıcı/verici radikallerle doping yapılarak birkaç kat arttırılabilir (17). Bir polimerin doping edilmesi, polimerin kimyasal yöntemle uygun bir reaktif kullanılarak tuzunun hazırlanması ile veya elektrokimyasal yöntemle potansiyel uygulayarak katyon ve anyonlarını oluşturmak suretiyle olur. Yükseltgenme reaksiyonu genellikle şu şekilde gösterilebilir (11). Burada P n : Polimer zincirinin bir kısmını, P m : polimeri gösterir. Buna göre ilk basamak, polaron veya soliton olarak adlandırılan bir katyon veya anyon radikalinin oluşumunu, ikinci basamak ise ikinci elektron transferinin gerçekleştiği bir dikatyon veya dianyonun 9

24 oluşturduğu bipolaron oluşumu gösterir. Ayrıca; ilk redoks reaksiyonundan sonra polimerin yüklü veya nötral kısımları arasında bir yük transfer kompleksleri oluşabilir. Polimerlerde doping sonucu değerlik veya iletkenlik tabakalarının tam dolu olması veya tam boş olmaması sağlanarak, polimerin doping yapma yoluyla iletkenliği arttırılabilir (18). Polimerin iskelet yapısına doping yapmak üzere verilen elektrik yükü, polimerin elektronik durumunda bir değişme sağlar. Bu değişme ile yük boşluklarından birisi ortaya çıkar. Bunlar tek değerlikli (polaron veya soliton), iki değerlikli (bipolaron) olarak bilinmektedir (19). Örneğin polipirolde, yükseltgenmeye bağlı olarak yapısal değişiklikler meydana gelir. Polipirolde polimer zinciri yükseltgendiğinde (p tipi doping), elektronun değerlik bandından uzaklaşması ile bir radikal katyon oluşur. Polaron olarak isimlendirilen bu radikal katyon, yapıdaki birkaç birim üzerinde kısmen delokalize olur. Polimer zincirinde ikinci polaranın oluşmasıyla bipolaran bantları oluşur. Şekil 5 de polaron ve bipolaronların oluşumu gösterilmiştir. Şekil 5. Polaron ve bipolaronların oluşumu 10

25 Özetle; radikal katyonlar (pozitif polaron) ise yükseltgenme ile oluşur. Daha ileri yükseltgenme ile bipolaron (pozitif bisoliton) oluşumu gerçekleşir. Bipolaronları oluşturmak üzere polaronlar birbiri ile etkileşim içindedir. Bu etkileşim sonucu, iki radikal birleşir ve bipolaronlar oluşur. Enerji bakımından, oluşan bağı iki radikal katyonun bağlarından daha kararlıdır ve iletkenliğe asıl katkıda bulunan bipolaron yapıların olduğu bilinmektedir. Çünkü bipolaronlardaki pozitif yüklerin hareketliliği daha fazladır (20). Polimerin yükseltgenmesine devam edildiğinde bipolaron bantlarının çoğalması ile enerji düzeyleri üst üste örtüşerek, polimerin bant boşluğu azalmaya başlayacaktır. Hem polaron hem bipolaronlar elektrik alanda polimer zincir boyunca hareket edebilirler ve böylece elektriksel iletkenlik sağlanmış olur. Şekil 6. a) Doplanmamış, b) Az doplanmış ve c) Çok doplanmış iletken 2.4 Atlama (hopping) olayı Son yıllarda, iletken polimerlerde iletkenliğin yalnızca uzun konjuge zincirler sayesinde oluşmadığı, fakat polimer zincirinde elektronik yükün hareketini açıklayan başka bir faktörün rol oynadığı belirlenmiştir. Buna atlama (hopping) denilmektedir (21). Polimer zincirinde elektronik yükün hareketi üç şekilde olmaktadır: a) Kristal bir yapıda zincir üzerinde b) Kristal bir yapıda zincirden zincire c) Amorf bir bölgede zincirden zincire 11

26 Şekil 7. a) Kristal bir yapıda zincir üzerinde, b) Kristal bir yapıda zincirden zincire, c) Amorf bir bölgede zincirden zincire Buradan yola çıkılarak ve konjuge sistemlerden biraz taviz verilerek, yukarıda bahsedilen hopping olgusunun arttırılmasına çalışılmaktadır. Bu ise, son yıllarda aşı ve karışım türü polimerlerin ele alınmasına yol açmıştır. 2.5 İletken Polimerlerin Polimerleşme Mekanizmaları Konjuge polimerlerdeki (polipirol gibi) doping işlevi, aslında polimerin kısmen yükseltgenmesiyle (nadiren indirgenmesi) meydana gelen bir yük değişim reaksiyonudur. İletken polimerlerde, delokalize band yapısıyla yüzey boyunca yük iletiminin sağlandığı düşünülmektedir. Bununla beraber, polimer zincirleri ile çözelti içindeki türler (karşıt iyonlar, çözücü molekülleri) arasındaki etkileşimden kaynaklanan iyonik iletkenliğinde polimerlerin elektronik iletkenliğini arttırdığı bilinmektedir (22). Şekil 8. Pirol için alfa ve beta pozisyonlarından gerçekleşen polimerleşme 12

27 Şekil 9. Pirol, tiyofen ve furan bileşiklerinin polimerleşme mekanizmalarının başlangıç safhası ve akabinde meydana gelen dimerleşme olayı 2.6 İletken Polimerlerin Sentez Yöntemleri İletken polimerler, π sisteminin yükseltgenmesi veya indirgenmesiyle yüksek iletkenlik vermek üzere dop edilirler (23). Bu nedenle iletken polimerin sentezinde, monomer yapısında yer alan π elektronları, önemli bir noktayı teşkil eder. Monomeri, aromatik yada daha çok karbon-karbon bağ yapısında olan iletken polimerler değişik yöntemlerle sentezlenir. İletken polimerlerin sentezinde, başlangıçta kullanılan monomerler, sonuçta oluşan polimerin yapısında korunabilen tipik aromatik veya çoklu konjuge bağ yapısına sahiptirler. Örneğin, asetilenin polimerizasyonu sonucu konjuge etilen birimlerini içeren polietilen oluşmaktadır. Benzenin polimerizasyonunda ise birbirine kovalent bağlı aromatik zincirli poli(p-fenilen) oluşur. Bu şekilde elde edilen iletken polimerlerin yapısında π konjugasyonunun uzatılması çok önemlidir. İletken polimerler, birçok teknik kullanılarak sentezlenebilir (24). Bu polimerizasyon metodlarından sıkça kullanılanları kimyasal ve elektrokimyasal polimerizasyondur Kimyasal Polimerizasyon Bu yöntemde monomer uygun bir çözücüde çözülüp, katalizör ve bir yükseltgeme veya indirgeme aracı kullanılarak polimerleştirilir. Kimyasal polimerleşme için, yükseltgenme olayı çözeltideki kimyasal bir tuz tarafından sağlanır. Doping yapıcı maddeler veya dopantlar 13

28 ya güçlü indirgen veya güçlü yükseltgen maddelerdir. Dopantların yapısı iletken polimerlerin kararlılığında önemli bir rol oynar. Tüm sentez yöntemleri arasında, kimyasal polimerleşme büyük miktarlarda iletken polimer sentezlemek için kullanışlı bir metottur. Bu avantajına rağmen yükseltgenme basamağını kontrol edememek ve elde edilen ürünün safsızlıklar içermesi gibi dezavantajları bulunmaktadır. Kimyasal polimerleşmede, monomerlerin radikal katyonlar oluşturarak bunların birbirleri ile birleşmeleri gerçekleşmektedir. Kimyasal polimerizasyon, çözünebilen ve kolay işlenebilir iletken polimer sentezi bakımından elektrokimyasal polimerizasyondan daha avantajlıdır Elektrokimyasal Polimerizasyon Elektropolimerizasyon, kısaca elektroda dışardan bir potansiyel uygulanarak, bir destek elektrolit çözeltisi içerisinde çözünen monomerin yükseltgenmesiyle radikal katyonların oluşumunu kapsamaktadır. Elektrokimyasal polimerizasyon elektriksel olarak iletken konjuge polimerler hazırlamak için standart yükseltgeme metodudur. Bu yöntemle kolaylıkla düzgün polimer filmler elde edilebilir. İlk yükseltgenmeden sonra polimer oluşumu iki basamakta gerçekleşmektedir. Birincisi; bir monomer katyon radikalinin nötral monomerle birleşmesidir ve ikinci yükseltgenmeden sonra iki proton kaybıyla bir nötral dimer oluşturmasıdır (25). İkincisi ise, nötral dimer oluşumunu sağlayan iki proton kaybını takiben iki katyon radikalinin birleşmesini kapsamaktadır (26). Daha sonra nötral dimerin yükseltgenmesiyle, bu proses elektroaktif polimer film elektrot üzerinde birikene kadar tekrarlanmaktadır. Elektrokimyasal yöntemle sentezlenen polimerler yükseltgenmiş durumdadır. Polimerizasyonun etkinliği, monomerden elektron uzaklaştırılabilmesiyle yakından ilgilidir. Tiyofen ve pirol gibi elektronca zengin monomerler daha kolay bir şekilde elektron kaybetmektedir. Bu tür monomerler, benzen gibi bileşiklerden daha iyi π elektronu rezonansına sahip olduğu için, nihai katyon radikali kolaylıkla kararlı kılınabilir (27). Elektropolimerizasyon ile elektronca zengin heterosiklik bileşiklerden, elektroaktif polimerler oluşturulmaktadır. İletken polimerlerin kimyasal polimerizasyonu ve elektrokimyasal polimerizasyonunun aynı olduğu, ancak sentezlenen polimerlerin morfolojisinin farklı olduğu savunulmaktadır. 14

29 Şekil 10. Pirolün kimyasal ve elektrokimyasal polimerizasyonu için önerilen mekanizma 2.7 Koordinasyon Polimerleri Organometalik polimerler, karbon-metal bağları içeren polimerlerdir. Yapılarının çeşitliliği geniş araştırma alanının olduğunu gösterir. Koordinasyon polimerleri, tekrarlayan birimde koordine kovalent bağlara sahip polimerlerdir. Metal iyonunu tam olarak çevreleyen koordinasyon halkası ile birlikte ikili köprüleşen ligandlar basamaklı metal koordinasyonu sentezleri organometalik polimerlerdir. Köprüleşebilmek için kolay köprüleşebilen iyonlar gibi, dianyon ve dialkol veya hidroksibenzoik asit çok dişli ligandlar gibi iki köprü oluşturabilen ligandlar metalin etrafını çevirerek tam bir koordinasyon küresi oluştururlar. Bir koordinasyon bileşiği merkezinde uygun sayıda iyon ya da molekül bulunduran ve çevresinde molekül ve iyonların bulunduğu bir bileşik olarak tanımlanabilir. Merkez atomuna sistematiksel bir düzende bağlı olan gruplara da ligand denir. Ligandlar, koordine veya koordine kovalent bağla merkez atomuna bağlanırlar. Uzun zamandır, koordinasyon bileşikleri özel bir sınıfta incelenmektedirler, fakat sonradan çok yönlü olarak ele alınmışlardır. Koordinasyon kimyası günümüzde çok hızlı bir şekilde gelişmektedir. Bu gelişmelerle birlikte birçok biyolojik alanda kullanımları ortaya çıkmıştır. Metal şelatları, canlı madde kimyasında çok önemli rol oynamaktadır. Örneğin klorofil Mg(II) kompleksleri, hemoglobin Fe(II) kompleksleri gibi. Metal proteinleri ile başka biyolojik metal kompleksleri üzerinde önemli ve geniş çalışmalar vardır. Biyolojik alandan başka, koordinasyon bileşikleri 15

30 kimya endüstrisinde önemli rol oynamaktadır. Bunun için polimer metal kompleksleri çalışmalarda öncelikli konuma gelmiştir. Birçok metal kompleksi polimer sentezinde katalizör olarak kullanılmaktadır. Polimer metal kompleksleri, otuz yılı aşkın araştırmalar sonucunda birçok değişik alanda kullanılmaktadırlar. Organik sentezlerde, atık suların iyileştirilmesinde hidrometalürjide, polimer ilaç kapsüllerinde, metal iyonların geliştirilmesinde, nükleer kimyada ve enzimlerin modellerinde bu komplekslerin kullanımı araştırılmaktadır. Bir polimer-metal kompleksi sentetik bir polimer ve metal iyonu içerir. Polimer ligandlar metal iyonlarına koordine bağlarla bağlıdırlar. Bir polimer ligandı koordine kabiliyeti düşük molekül ağırlıklı bir bileşik ile bir polimerin reaksiyonundan oluşmaktadır. İnorganik metal fonksiyonlarla organik polimerin birleşmesiyle oluşurlar. Metal iyonları karekteristik kataliz davranışı sergileyerek polimerlerle birleşirler. Birçok sentetik polimer-metal kompleksinin yüksek kataliz etkisi bulunmuştur. Bunların etkin olarak yarıiletken ısıya dayanıklı ve tıbbi biyolojide kullanımları vardır. Polimer metal kompleksleri, içerdikleri metal ve uygulanan metodun özelliğine göre sınıflandırılırlar. Bu metodlar metal iyonu ve polimer yapılarının fonksiyonu metal içerikli monomer polimerizasyonu ve ligand metal iyonunun çok fonksiyonlu reaksiyonlarını içerir Polimer Metal Komplekslerinin Sınıflandırılması Metal İyonu ile Polimer Ligandının Komplekleşmesi Polimerin şelatlanmasının analitik kullanımda birçok faktörü vardır. Su içerisindeki bir metal iyonunun (hidrat iyonu) veya komplekslerininde azda olsa bir polimer şelatına transfer eğilimi vardır. Ekstraksiyon sistemlerinde bu eğilim göz önüne alınmaktadır. Genellikle metal kompleksleri, polimerik ligand ile reaksiyona girer ve molekül köprüsü oluşturur. Bu tipte polimer-metal kompleksleri metal iyonu ve polimerik ligandların kimyasal reaksiyonlarından hazırlanırlar. Genel olarak bu reaksiyonlar, polimerik ligand ve metal iyonlarının kararlı metal kompleksleri, polimer zincirleri arasında veya polimer zinciri içinde köprüleşen polimer metal kompleksi ve asılı haldeki farklı grupların metallerle kompleksleşmesi olarak sınıflandırılabilir. 16

31 Asılı Duran Metal Kompleksleri Bu komplekslerde, polimer ligand fonksiyonu (fonksiyonel grubu) molekül iyonuna saldırarak kompleks oluşturur. Bu komplekslerde aralarında tek dişli ve çok dişli olarak ikiye ayrılır. Metal kompleksi veya metal iyonu iki kararsız ligandlardan fazla ise onun uygun bir reaksiyon koşulu seçimi ile tek dişli formda çoğunlukla oluşması mümkündür. Polimer ana yapısında (ana zincirde) bulunan çok dişli ligandlar koordinasyon tipindeki polimer-metal kompleksini oluştururlar. Çok dişli ligandlar çoğunlukla kararlı köprü tipinde metal kompleksi ürünleri verirler. Şekil 11. Asılı duran metal iyonu kobalt kompleksine örnek Polimer Zinciri İçerisinde veya Polimer Zincirleri Arasında Metal Polimer Kompleksleri Bu tip polimer-metal kompleksleri, metal iyonunun veya kompleksinin polimer zinciri içerisinde ligandlarla bağ yapması sonucunda yada ayrı polimer zinciri arasındaki metalin zincire bağlı fonksiyonel gruplarla kompleks oluşturması ile meydana gelirler. Genellikle dört veya altı koordine kovalent bağla oluşurlar. 17

32 Şekil 12. İki polimer zinciri arasındaki polimer-metal kompleksi Şekil 13. İki polimer zinciri içindeki polimer-metal kompleksi Şekil 14. Polimer zinciri arasındaki polimer-metal kompleksi 2.8 Elektroanalitik Teknikler Elektroanalitik Kimya, analit çözeltisi bir elektrokimyasal hücrenin parçası olduğundan, çözeltinin elektrokimyasal özelliklerine dayanan bir grup kantitatif analitik yöntemi kapsar. Elektroanalitik teknikler, çok düşük tayin sınırlarına ulaşabilirler ve elektrokimyasal yöntemlerin uygulanabilirliği sistemler hakkında, ara yüzeylerdeki yük aktarımının stokiyometrisi ve hızı, adsorpsiyon ve kemisorpsiyonun derecesi, kimyasal reaksiyonların hız ve denge sabitleri gibi bilgileri de içeren, çok fazla sayıda sistemi karakterize eden bilgiler verir. Elektroanalitik tekniklerin sınıflandırılmalarında izlenen çeşitli yollar vardır. Elektroanalitik teknikler ara yüzeyde gerçekleşen teknikler ve tüm analiz ortamında 18

33 gerçekleşen teknikler olmak üzere iki ana sınıfa ayrılırlar. Ara yüzey yöntemleri, elektrot yüzeyleri ve bu yüzeylere hemen bitişik olan ince çözelti tabakası arasındaki ara yüzeyde olan olaylara dayanmaktadır. Tüm analiz ortamı yöntemleri aksine, çözeltinin tamamında oluşan olaylara dayalıdır ve ara yüzey etkilerinden kaçınmak için her yola başvurulur. Ara yüzey yöntemleri, elektrokimyasal hücrelerin, akımın varlığında veya yokluğunda işleyişine göre statik ve dinamik olmak üzere iki sınıfa ayrılırlar. Potansiyometrik ölçmeleri içeren statik yöntemler, hızları ve seçicilikleri sebebiyle ayrı bir öneme sahiptirler. Elektrokimyasal hücrelerdeki akımların hayati bir rol oynadığı dinamik ara yüzey yöntemlerinin çeşitli tipleri vardır. Bu tekniklerde, ölçme işlemleri yapılırken, hücre potansiyelinin kontrol edilmesi esastır. Genellikle duyarlılığı fazla olan bu tekniklerde, oldukça geniş bir çalışma aralığı vardır ( M). Ayrıca bu analizlerin çoğu mikrolitre, hatta nanolitre seviyesindeki numune miktarlarıyla gerçekleştirilebilir Voltametrik Metodlar Voltametri, elektrot potansiyelinin değiştirilmesi ile elektrolitik hücreden geçen akımın değişmesine dayanan elektroanalitik metotların genel adıdır. Voltametri Çekoslavak kimyacı Jaroslav Heyrovsky tarafından 1920 lerin başında bulunan, voltametrinin özel bir tipi olan polarografi den geliştirilmiştir. Voltametrinin önemli bir dalı olan polarografi, diğer voltametri tiplerinden çalışma mikroelektrodu olarak bir damlayan civa elektrotu (DCE) kullanılması bakımından farklılık gösterir. Voltametri, çeşitli ortamlarda meydana gelen yükseltgenme indirgenme olaylarının, yüzeylerdeki adsorpsiyon olaylarının ve kimyasal olarak modifiye edilmiş elektrot yüzeylerindeki elektron aktarım mekanizmalarının temel çalışmalarını kapsayan ve çok başvurulan duyarlı ve güvenilir bir yöntem durumuna gelmiştir. Voltametride, bir mikroelektrot içeren elektrokimyasal hücreye değiştirilebilir bir potansiyel uyarma sinyali uygulanır. Bu uyarma sinyali yöntemin dayandığı karakteristik bir akım cevabı oluşturur. Klasik voltametrik uyarma sinyali, hücreye uygulanan doğru akım potansiyelinin zamanın bir fonksiyonu olarak doğrusal olarak arttığı doğrusal bir taramadır. Bu hücre, analiti ve destek elektrolit adı verilen reaktif olmayan elektrolitin aşırısını da içeren bir çözeltiye daldırılmış üç elektrottan yapılmıştır. Üç elektrottan biri, zamanla potansiyeli doğrusal olarak değişen mikroelektrot veya çalışma elektrodudur. Çok çeşitli tür ve şekilde çalışma elektrot kullanılır. Bunlar civa, platin, altın, camsı karbon vb. elektrotlardır. 19

34 Genel olarak, kullanılan çalışma elektrotları, polarizasyonu arttırmak için yüzey alanları küçük tutulur. İkinci elektrot, potansiyeli deney süresince sabit kalan bir referans elektrottur. Referans elektrot genellikle Ag/AgCl veya doymuş kalomel elektrottur. Üçüncü elektrot ise elektriğin, sinyal kaynağından ve çözeltinin içinden geçerek mikroelektroda aktarılmasını sağlayan karşıt elektrottur. Karşıt elektrotta genellikle helezon şeklinde bir platin tel veya bir civa havuzudur. Uygulanan potansiyele karşı, akım grafiği voltamogram adını alır. Voltametride akım, çalışma elektrotu üzerinde maddelerin indirgenmesi veya yükseltgenmesi sonucunda oluşur. İndirgenmeden dolayı oluşan akıma katodik akım, yükseltgenmeden dolayı oluşan akıma ise anodik akım adı verilir. Geleneksel olarak, katodik akımlar daima pozitif, anodik akımlar ise negatif işaretlerle gösterilir. Belli bir potansiyelden sonra akımın sabit kaldığı bir plato bölgesine ulaşılır. Bu akıma sınır akımı, i l adı verilir. Elektrot üzerinde henüz reaksiyon olmadığı zaman küçük de olsa bir akım gözlenir. Bu akıma artık akım denir. Sınır akımı ile artık akım arasındaki yükseklik dalga yüksekliğidir. Dalga yüksekliği, elektroaktif maddenin konsantrasyonu ile doğrusal olarak artar. Sınır akımı, analitin kütle aktarım işlemiyle elektrot yüzeyine tanınma hızındaki sınırlamadan kaynaklanır. Sınır akımları genellikle analitin derişimi ile doğru orantılıdır. i l = k. C A Burada, C A analit derişimi ve k ise bir sabittir. Kantitatif doğrusal taramalı voltametri bu ilişkiye dayanır. Akımın, sınır akımı değerinin yarısına eşit olduğu potansiyel yarı dalga potansiyeli olarak tanımlanır. Yarı dalga potansiyeli E 1/2 ile gösterilmektedir. E 1/2 değeri, genellikle elektroaktif maddenin konsantrasyonuna bağlı değildir ve standart yarı hücre potansiyeli ile yakından ilişkilidir. Bir voltametrik çalışmada analit bir elektrot yüzeyine üç şekilde taşınır; birincisi, elektrik alanı etkisi altında göç, ikincisi karıştırma veya titreşim sebebiyle konveksiyon ve üçüncüsü, elektrot yüzeyindeki sıvı filmi ile ana çözelti arasındaki derişim farkından kaynaklanan difüzyondur. Göç, voltametride elde edilen sonuçların açıklanmasını güçleştirir, bu nedenle onun etkisini ihmal edilecek ölçüde küçültülmeye çalışılır. Bunun için elektroliz çözeltisi içine destek elektrolit adı verilen elektrot reaksiyonlarına girmeyen ve onları engellemeyen elektrolitten aşırı miktarda eklenir. Destek elektroliti çoğu kez, yükseltgenme veya indirgenmesi güç olan alkali metal tuzları veya (Et 4 N)+(BF 4 ), (n Bu) 4 N+BF 4, (n Bu 4 N)+PF 6 gibi anyonu ve katyonu kararlı iyonik bileşikler kullanılır. Çözeltide bulunan bütün iyonlar elektriği taşıdıkları için, destek elektrolitine oranla indirgenen veya yükseltgenen iyonun katkısı ihmal edilir ve reaksiyon veren iyonun göçü ihmal edilmiş olur. Sabit potansiyeldeki voltametride elektroliz 20

35 hücresinden geçen akım zamanın fonksiyonu olarak ölçülür. Sürekli değişen potansiyeldeki voltametriye potansiyel tarama yöntemi (potansiyel süpürme yöntemi) denir. Burada sistemin potansiyeli dışarıdan kontrol edilerek değiştirilir; buna bağlı olarak da akım kaydedilir. Bu değişme genellikle sabit hızdadır. Potansiyel tarama yöntemi potansiyel değişme hızına göre yavaş ve hızlı tarama olarak ikiye ayrılır: Yavaş Tarama Yöntemi: Bu yöntem mv/s lik tarama hızlarını kapsayan yarı kararlı hal yöntemi olup, tarama hızının kararlı hal kinetiğinin kurulmasına yetecek kadar yavaş, safsızlıkların elektrot yüzeyinde toplanıp akım potansiyel değişiminin etkisini önleyecek kadar hızlı olduğu varsayılır. Buradan çıkarılacak sonuçlar, kinetik parametrelerin hıza bağlı olmadığı bir tarama hızı aralığında çalışıldığında geçerlidir. Gerekli potansiyel değişme hızı çalışılan sistemin tipine ve saflık durumuna da bağlıdır. Hızlı Tarama Yöntemi: Potansiyel tarama hızının 100 mv/s den büyük olduğu bir yöntemdir. Tarama hızı mv/s civarında tutulursa ve belli bir potansiyelden sonra ilk taramanın tersi yönde tarama yapılırsa buna dönüşümlü voltametri (CV) denir Dönüşümlü Voltametri (CV) Dönüşümlü voltametri (CV), karıştırılmayan bir çözeltideki, küçük bir durgun elektrotun akım cevabının, potansiyel ile uyarılmasıyla ölçülmesi esasına dayanır. Potansiyelin zamanla değişme hızına tarama hızı adı verilir. Potansiyel taramasının E 1 ve E 2 potansiyel değerleri arasında yapılması durumunda metot, doğrusal taramalı voltametri; E 2 potansiyeline ulaşıldıktan sonra, aynı tarama hızıyla, ilk tarama yönüne göre ters yönde tarama yapılması durumunda ise, dönüşümlü voltametri (CV) olarak adlandırılır. Ters taramada potansiyel E 1 de sonuçlanabileceği gibi, farklı bir E 3 potansiyeline de götürülebilir. İleri tarama esnasında oluşan ürün, ters taramada tekrar reaktife dönüştürülebilir. İleri taramada indirgenme olmuşsa, ters taramada yükseltgenme meydana gelir. CV de akım, potansiyele karşı grafiğe geçirilir. Tarama hızı pratikte 10 mv/s den birkaç yüz V/s ye kadar değiştirilebilir. Çok yüksek tarama hızlarında (birkaç bin V/s) çift tabaka yüklenmesi ve IR problemleri ortaya çıkar. Ancak mikroelektrot kullanıldığı zaman bu tür problemler minimuma indirilir. Dönüşümlü voltametri tekniğinde, tarama hızı önemli parametrelerden biridir ve tarama hızı pik akımı değişiminden faydalanılarak adsorpsiyon, difüzyon ve heterojen elektrot reaksiyonunu takip eden kimyasal reaksiyonların özellikleri incelenebilir. Ayrıca bu teknikte, tarama yönünün değiştirilmesi ile reaksiyon mekanizması ve kinetik veriler hakkında fikir edinilebilir. 21

36 Tersinir Reaksiyonlar: Elektrot çözelti ara yüzeyinde meydana gelen heterojen reaksiyonunun; şeklinde gerçekleşen tersinir indirgenme reaksiyonu olduğu ve elektrot reaksiyonu başlamadan önce, çözelti ortamında sadece indirgenebilir O türünün bulunduğu kabul edilsin. Elektrokimyasal olayın öncesinde ve sonrasında, bu olaya eşlik eden herhangi bir kimyasal reaksiyonun da oluşmadığı düşünüldüğünde, tarama hızının çok yavaş olması durumunda, akım potansiyel grafiği belli bir potansiyelden sonra sınır akımına ulaşır ve akım potansiyelden bağımsız hale gelir. Tarama hızı arttıkça, akım-potansiyel grafiği bir pik haline gelir ve bu pik yüksekliği tarama hızı ile doğrusal olarak artar. Elektrokimyasal sistemde, sabit şartlar altında ve tarama hızının yavaş olması durumunda, çözeltide, elektrot yüzeyinden belli uzaklıktaki analit derişimi sabittir. Ayrıca Nernst Difüzyon Tabakası nda derişimde meydana gelen değişme doğrusaldır. Difüzyon tabakasında meydana gelen tersinir bir reaksiyon için, [O]/[R] oranı Nernst eşitliği ile potansiyele bağlıdır. Sisteme, negatif yönde potansiyel uygulandıkça, analitin elektrot yüzeyindeki konsantrasyonu ([O]) azalır ve buna bağlı olarak derişimdeki farklanma yani akım artar. Uygulanan potansiyelin bir sonucu olarak, analitin elektrot yüzeyindeki derişimi belli bir süre sonra sıfır olur. Analit derişiminin sıfıra düştüğü bu potansiyelden sonra O ve R türleri için derişim farklanması ortadan kalkar ve bu durumun sonucu olarak akım sabit hale gelir. Uygulanan potansiyelin zamanla değişme hızının yüksek olması durumunda, çözeltiden elektrot yüzeyine kütle aktarım hızı, denge koşullarının sağlanmasına yetecek kadar yüksek değildir. Böyle bir durumda, difüzyon tabakasındaki derişim farklanması doğrusallıktan sapma gösterir ve uygulanan potansiyel ile [O]/[R] ilişkisi Nernst eşitliğine göre ifade edilemez. Uygulanan potansiyel, çözeltideki O türünü indirgemeye yetecek büyüklüğe eriştiğinde, elektrot yüzeyindeki analit derişimi ile çözeltideki analit derişimi birbirine eşittir. Elektrot yüzeyinde O türü indirgenmeye başladığı andan itibaren, elektrot yüzeyi ile ana çözeltideki O derişimi arasında bir fark oluşacaktır. Bu derişim farklılığına bağlı olarak, elektrot yüzeyi ile bulk çözelti arasında meydana gelen derişim farklanmasının bir sonucu olarak, elektroaktif tür elektrot yüzeyine doğru difüzlenecek ve bir akım oluşacaktır. Potansiyel negatife doğru kaydıkça, elektrot yüzeyindeki O türünün derişimi, çözeltideki O türü derişimine göre daha az olacaktır. Uygulanan negatif potansiyelin bir sonucu olarak, 22

37 belli bir süre sonunda, O türünün elektrot yüzeyindeki derişimi sıfır olacaktır. Hızlı taramada, herhangi bir potansiyelde, elektrot yüzeyindeki derişim farklanması, kararlı haldeki derişim farklanmasına göre daha büyük ve bunun sonucu olarak da, akım daha fazla olacaktır. Elektrot yüzeyindeki O türü derişimi sıfır olduğunda, derişim farklanmasının azalmasıyla birlikte akım da azalacaktır. Bu etkilerin bir sonucu olarak, akım-potansiyel grafiği pik haline dönüşecek ve pik yüksekliğide (pik akımı) tarama hızındaki artmaya bağlı olarak artacaktır. Potansiyel tarama yönü ters çevrildiğinde ve hızlı bir tarama yapıldığında, elektrot yüzeyinde yeteri kadar indirgenmiş R türü bulunacağından, daha pozitif potansiyellerde R yükseltgenmeye başlayacaktır. Bu yükseltgenmeye bağlı olarak, ters taramada da akım oluşacaktır. İndirgenme mekanizmasında gerçekleşen olaylar, yükseltgenme meydana gelirken de aynı şekilde tekrarlanacaktır. Ancak indirgenme sırasında elektrot yüzeyinde oluşan R türü, çözeltiye doğru difüzleneceğinden zıt yöndeki pik akımı (anodik akım) katodik akımdan biraz daha düşük olacaktır. Tersinir bir reaksiyonunun dönüşümlü voltamogramı Şekil 15 deki gibidir. Şekil 15. Dönüşümlü voltametride akım-potansiyel eğrisi Elektrokimyasal sistemde, kütle aktarımının yalnızca difüzyonla gerçekleştiği düşünülürse (olayın difüzyon kontrollü olması, CV tekniğinde en çok tercih edilen durumdur), O ve R türleri için, Fick yasaları geçerlidir. Böyle koşullarda, pik akımı (Ip), Randles Sevcik eşitliği ile verilir. 23

38 Bu eşitlik, 25 o C için eşitliği aşağıdaki şekle dönüşür: Bu eşitlikte A elektrotun yüzey alanı (cm 2 ), n aktarılan elektron sayısı, C O elektroaktif türün başlangıçtaki derişimi (mol/cm 3 ) ve v, tarama hızıdır (V/s). Fick yasalarından türetilen Randles Sevcik eşitliğinin en önemli göstergelerinden biri, pik akımının, tarama hızının kareköküyle doğru orantılı olarak değişmesidir. Potansiyel taraması boyunca, bir redoks sistemi dengede kalıyorsa, böyle redoks prosesleri tersinir olarak adlandırılır. Söz konusu denge, O ve R türlerinin yüzey derişimlerinin Nernst bağıntısına uyan değerlerde, sabit tutulmasını gerektirir. Bir dönüşümlü voltametri grafiği, aşağıdaki parametre değerlerini sağlıyorsa, tersinirdir. Bütün tarama hızlarında ve 25 C de, katodik ve anodik pik potansiyelleri arasındaki fark ΔE p = (E pc E pa ) = (59 n) mv. Bütün tarama hızlarında pik akımları oranı = i pa / i pc =1 Pik akım fonksiyonu (i p / v 1/2 ), tarama hızından (v) bağımsız Tersinmez Reaksiyonlar: Tersinir sistemleri karakterize eden en önemli özellik, bütün potansiyel değerlerinde, elektron aktarım hızının, kütle aktarım hızından büyük ve Nernst eşitliğinin elektrot yüzeyi için geçerli olmasıdır. Tersinirlik, Nernst eşitliğine uyan değerlerde, O ve R türü derişimlerini sabit tutmaya yetecek hızda elektron transfer kinetiğini gerektirir. Bu sebeple tersinirlik, standart heterojen elektron transfer hız sabiti (k s ) ve potansiyel değişme hızına (tarama hızı) bağlıdır. k s /v oranı, Nernst derişimlerini sabit tutamayacak kadar küçükse, böyle elektrot prosesleri yarı tersinir olarak adlandırılır. Yarı tersinir prosesleri karakterize eden parametre, tarama hızı arttıkça, katodik ve anodik pik potansiyelleri arasındaki farkın 58/n mv tan büyük olmasıdır. Sistemin tamamen tersinmez olduğunu gösteren parametre ise, katodik pik akımının karşılığı olan bir anodik pikin bulunmamasıdır. Tersinmez sistemler için, 25 C de, Fick yasalarından türetilen pik akımı eşitliği aşağıdaki gibidir. I p = (2.99x10 5 ) n (α c n α ) 1/2 C o D 1/2 o v 1/2 Bu eşitlikte n α aktarılan toplam elektron sayısıdır. Tersinmez proseslerde de pik akımı, elektroaktif türün derişimi ve potansiyel değiştirme hızının karekökü ile doğru orantılıdır. Dönüşümlü voltametri deneyinden elde edilen voltamogramların, tarama hızı ile değişimi, elektrot çözelti ara yüzeyinde meydana gelen olayın tabiatı hakkında önemli bilgiler verir. Örnek olarak, elektrokimyasal olaya eşlik eden bir kimyasal olayın varlığı, kimyasal olayın 24

39 elektrokimyasal olaydan önce veya sonra olduğu veya elektrokimyasal olayı takip eden kimyasal olaydan sonra tekrar bir elektrokimyasal olayın gerçekleşip gerçekleşmediği, farklı tarama hızlarında alınan dönüşümlü voltametri grafiklerinden kolayca anlaşılabilir. Bir dönüşümlü voltametri grafiğinin şekli, elektron aktarım basamağına (önce veya sonra) eşlik eden bir kimyasal olayın varlığından önemli ölçüde etkilenir. Reaksiyonun kimyasal yapısından kaynaklanan komplikasyonlar, tersinirliğin derecesi, elektrokimyasal prosesin hız ve denge sabitleri, elde edilen grafiklerin son şeklinde önemli rol oynarlar ve bütün bunlar, yapılacak bir seri deney ile tespit edilebilir. Genel olarak, elektrokimyasal olaya eşlik eden kimyasal olay C harfiyle, elektrokimyasal olayın kendisi ise E harfi ile belirtilir. Mekanizmada bu harflerin yazılış sırası önemlidir. Meselâ, ECE mekanizması ile işaretlenen bir proseste, önce elektron aktarım basamağının gerçekleştiği, bunu bir kimyasal olayın takip ettiği ve kimyasal olaydan sonra tekrar bir elektrokimyasal olayın oluştuğu anlaşılır. Kimyasal basamak, sistemde bulunan çalışma elektrotuna veya çalışma elektrotundan sisteme, elektron transferinin olmadığı basamaktır. Böyle bir basamakta, elektroda veya elektrottan herhangi bir yük akışı meydana gelmez. EC mekanizması: EC mekanizması, adından da anlaşıldığı gibi, elektron aktarım basamağından sonra, bir kimyasal olayın gerçekleştiği proseslerdir. Olayın aşağıdaki şekilde genelleştirildiği düşünülürse; İlk basamakta (E), indirgenmiş tür R, elektrot yüzeyinde O türüne yükseltgenir. Elektrokimyasal basamağın ürünü olan O türü kararsızdır ve elektrokimyasal basamağı takiben başka bir O türüyle, komşu moleküllerle veya çözücü ile kimyasal reaksiyona girerek (C), A türünü oluşturur. A türü, elektroaktif olmadığı gibi, sadece çalışılan potansiyel aralığında da elektroaktif olmayabilir. Şekil 16 da EC mekanizmasının bulunduğu bir proseste, pik akımlarının, çoklu tarama ile nasıl değiştiğini gösterilmektedir. 25

40 Şekil 16. EC mekanizmasını gösteren çoklu tarama yapılmış dönüşümlü voltametri grafiği örneği Çok hızlı gerçekleştiği kabul edilen elektrokimyasal reaksiyon, heterojen hız sabiti k het ile kimyasal reaksiyon ise, homojen birinci mertebeden hız sabiti k f ile karakterize edilir. ECE mekanizması: Dönüşümlü voltametri tekniğinde yaygın olarak karşılaşılan başka bir mekanizma şekli de ECE mekanizmasıdır. ECE harfleri, mekanizmanın üç basamakta gerçekleştiğini gösterir. İlk basamak, elektrot yüzeyinde elektron aktarımını içeren elektrokimyasal prosesten oluşur. Bu basamakta oluşan ürün karasız olup, kimyasal reaksiyon ile ikinci bir türe dönüşür ve oluşan bu yeni tür, çalışılan potansiyel aralığında elektroaktiftir. Potansiyel tarama yönü, başlangıç değerine doğru ters çevrildiğinde, oluşan bu yeni türe ait yeni bir pik tespit edilir. 26

41 Şekil 17. ECE mekanizması gösteren çoklu tarama yapılmış dönüşümlü voltametri örneği Kimyasal basamakta oluşan tür, başlangıçta çözeltide bulunan türden daha zor yükseltgeniyorsa, ikinci elektrokimyasal reaksiyon ileri taramada da gözlenebilir. Şekil 17 de ECE mekanizmasının bulunduğu bir elektrokimyasal olayda, pik akımlarının, çoklu tarama ile değişimi görülmektedir Kronoamperometri (CA) Kronoamperometride çalışma elektrodunun potansiyeli aniden değiştirilir ve durgun ortamda akım zaman ilişkisi gözlenir. Bir elektrot yüzeyinde; reaksiyonun olduğunu ve başlangıçta çözeltide yalnız O maddesinin bulunduğunu varsayalım. Kronoamperometride çözeltiye daldırılan çalışma elektrotuna uygulanan potansiyel zaman grafiği Şekil 18 de gösterildiği gibidir. Önce çalışma elektrotuna herhangi bir indirgenmenin olmadığı E 1 potansiyeli uygulanır. Sonra potansiyel ani olarak E 2 ye değiştirilir. E 2 potansiyeli, indirgenme difüzyon kontrollü olacak şekilde seçilir. 27

42 Şekil 18. Kronoamperometride çalışma elektrotuna uygulanan potansiyelin zamanla değişimi E 1 potansiyelinde reaksiyon olmaz, E 2 potansiyelinde ise akım difüzyon kontrollüdür. E 1 ve E 2 potansiyeli seçilirken önce maddenin CV si alınır. Akım henüz gözlenmediği artık akım bölgesindeki potansiyel başlangıç potansiyeli (E 1 ) olarak seçilir. CV nin pik potansiyelinin daha ötesinde bir potansiyelde E 2 potansiyeli olarak alınır. Potansiyel E 2 değerinde belirli bir süre sabit tutulur. Bu potansiyelde oluşan akımın zamanla değişimi aşağıda Cottrell eşitliğinde verildiği gibidir. Bu eşitliğe göre akım, t 1/2 ile ters orantılı olarak değişir. Cottrell eşitliğine göre akım, t -1/2 ye göre grafiğe geçirildiği zaman orijinden geçen bir doğru elde edilir. Bu grafik yardımıyla bir elektrot reaksiyonunun difüzyon kontrollü olup olmadığı test edildiği gibi elektroaktif maddenin difüzyon katsayısı ve aktarılan elektron sayısı da bulunabilir. Ancak deneyin güvenilir olması için, zaman aralığının geniş tutulması gerekir ms lik zaman aralığı bu deney için yeterlidir. Pratikte ms arasındaki zaman aralığında tarama yapılır Kare Dalga Voltametrisi (SWV) Kare dalga voltametrisi ilk defa Barker tarafından geliştirilen son derece hızlı ve duyarlı bir metottur. Kare dalga voltametrisinin sabit elektrotlarda potansiyel-zaman dalga şekli Şekil 20 de görülmektedir. Şekilden de görüldüğü gibi, potansiyel-zaman dalga şekli simetrik kare dalgalardan oluşur. Bir kare dalganın tamamlanma süresi olan periyod, τ ile gösterilir. Birbirini takip eden kare dalgalar arasındaki yükseklik farkına basamaklı adım yüksekliği adı 28

43 verilir ve E s ile gösterilir. Kare dalga genliği (E sw ), her bir dalganın alt ve üst noktaları arasındaki farkın yarısına eşittir. Puls genişliği (t p ), τ/2 ye eşittir. Genellikle periyod yerine 1/τ a eşit olan frekans (f) kullanılır. Frekansın artması ve buna bağlı olarak periyodun azalması ile kare dalga pik akımı ve hassasiyet artar. Kare dalga voltametrisinde deneysel parametreler belirli aralıklarda seçilir. Deneylerde frekans genellikle 10 f 1000 Hz veya periyod 1 τ 100 ms aralığında olmalıdır. Basamaklı adım yüksekliği ise aktarılan elektron sayısına (n) bağlı olarak Es=10 n/mv eşitliğinden bulunur. E sw ise genelde n, 50 mv dur. Şekil 19. Kare Dalga Voltametrisi için potansiyel-zaman dalga şekli ve akım ölçümü Kare dalga voltametrisinde akım ölçümleri, ileri ve geri pulsların sonuna doğru, bir zaman aralığında yapılır. İleri puls için ölçülen akım i 1, geri puls için ölçülen akım i 2 olmak üzere, her bir kare dalganın net akımı i= i 1 -i 2 ye eşittir ve ileri fark akımı olarak adlandırılır. i farkı potansiyele karşı grafiğe geçirildiğinde, voltametri grafiği Şekil 20 den de görüldüğü gibi tek pik şeklinde elde edilir. 29

44 Şekil 20. Tersinir bir reaksiyon için uyarma sinyaline akım cevabı, i 1 ileri akım, i 2 ters akım, i 1 i 2 akım farkı i farkı konsantrasyonla doğru orantılı olarak değiştiğinden dolayı, kare dalga voltametrisi kantitatif tayinlerde kullanılan bir metottur. Kare dalga voltametrisinde ölçüm son derece hızlı yapıldığından, birkaç voltametrik taramanın sinyal ortalaması alınarak analizin kesinliğini arttırmak mümkündür. Bu metodun tayin sınırları 10-8 ile 10-7 M arasında olduğundan dolayı bu teknik en hassas ve hızlı elektroanalitik teknikler arasındadır. 2.9 Elektrokromizm Elekrokromizm, elektrokimyasal reaksiyonların (yükseltgenme-indirgenme) neden olduğu iki yapı arasındaki, A ve B, absorpsiyon spektrumunun tersinir değişimidir. Bu kromizm çeşidi, kromizmin en önemli ticari kullanım alanını oluşturur. Elektrokromik maddeler 1968 yılından beri bilinmektedir ve üç sınıfı olduğu bulunmuştur. Bunlar, metal oksit filmleri, moleküler boyalar ve polimer davranışında olanlardır. Bu sistemlerin bazıları tamamen çözelti halinde iken, bazı elektrokromikler çözelti-katı halinde, bazı elektrokromiklerde ki çoğu bunu oluşturur, tamamen katı sistemlerdir. Bu sistemlerin potansiyel kullanım alanları; akıllı yansıtıcılarda ve pencerelerde, aktif optik filtrelerde, ışık gösterimlerinde ve bilgisayar veri depolamalarını, içermektedir Elektrokromik Materyallerin Çeşitleri Elektrokromik malzemenin kendi açısından elektronik olarak uygun optik üç temel tipi vardır. Birinci tip, en az bir renkli ve bir şeffaf (ağartılmış) duruma sahip maddeleri içerir. Bu tür malzemeler, akıllı camlar ve optik kepenklerin yapımı için kullanışlıdır. Metal oksitler, Polietilendioksitiyofen gibi polimer malzemeler, bu türe örnek olarak verilebilir. İkinci tip malzemelerin iki farklı renkli durumları vardır. Bu malzemelerin iletken hali yoksa da, farklı 30

45 redoks hali olan farklı renklerin gerekli olduğu durumdaki ekran tipi uygulamalar için kullanılmaktadır. Politiyofenin oksidasyonu mavi-kırmızı arasında geçer ki bu tip malzemeler için politiyofen en iyi örnektir. Üçüncü tip malzemeler, malzemenin redoks durumuna bağlı olarak en fazla iki renkli duruma sahiptir Elektrokromik Polimer Çalışmalarında Deneysel Metodlar İletken polimerler çalışma elektrodu üzerine kaplanır. Çalışma elektrodu genel olarak, cam ya da bir esnek plastikten imal edilir, örneğin; poli(etilen tereftalat), bir optik olarak transparan elektriksel olarak iletken film ile kaplı levha, örneğin; kalay katkılı indiyum oksit (ITO), antimon katkılı kalayoksit veya flor katkılı kalay oksittir. Madde çalışma elektrodu üzerine biriktirildikten sonra, monomer-free çözeltisi içine alınır ve maddenin spektroelektrokimya, optik kontrast, tepki zamanı incelenir Spektroelektrokimya Nötr durumda, iletken polimerler yalıtkan sistemlerdir ve valans bandı (HOMO) ile iletkenlik bandı (LUMO) arasında enerji boşluğuna (E g ) sahiptir. Polimer oksitlendiğinde ya da doplandığında, düşük enerjili geçiş bandı ve yük taşıyıcılar oluşur (polaran ve bipolaran) ve böylece polimerin bant yapısı değişir. Bu değişikliğin sonucu olarak polimerin iletkenliği artar. π-π* geçişinin belirlenmesi için, bant boşluğu enerjisi hesaplandığında, polaronik ve bipolaronik geçişler spektroelektrokimyasal sonuçlarının yardımı ile hesaplanabilmektedir Elektrokromik Karşıtlık Elektrokromik malzemeleri değerlendirmek için kullanılan en önemli faktör, elektrokromik karşıtlıktır. Elektrokromik karşıtlık genellikle, elektrokromik malzemenin en yüksek geçirgenliği olan dalga boyunda ölçülür (% T) Switching Time (Tepkime Zamanı) Elektrokromik materyalin renkli hali ve geçirgen hali arasında geçen gerekli zaman tepkime zamanıdır. Bu parametre, dinamik ekran ve değiştirilebilir ayna gibi uygulamalar için önemlidir. Elektrokromik materyallerin tepkime hızını etkileyen birçok parametre vardır. Bu durum elektrolitin iyonik iletkenliği, uygulanan potansiyel büyüklüğüyle, elektroaktif alandaki iyonların erişilebilirliği (ince filmlerde iyon difüzyonu), film kalınlığı ve ince filmlerin morfolojisi şeklinde sıralanabilir. 31

46 3. BİYOSENSÖRLER 3.1 Enzim Birçok kimyasal reaksiyon kendiliğinden gerçekleşir. Diğer bazı reaksiyonların belirli bir hızda gerçekleşebilmeleri için ise katalizlenmeye ihtiyaçları vardır. Katalizörler, substratın kimyasal olarak başka bir maddeye dönüşümünü sağlamak için, gerekli enerji bariyerini indirgeyen moleküllerdir. Termodinamik olarak bu enerji bariyeri, serbest enerjideki değişim olarak da ifade edilebilir. Katalizörler, aktifleşmiş geçiş kompleksini oluşturarak ürün oluşumunu sağlamak için gerekli enerji bariyerini azaltırlar (Şekil 21). Katalizörler, reaksiyon sırasında harcanmazlar ya da değişime uğramazlar. Prensipte substratın ürüne dönüşümünde sınırsız olarak kullanılırlar, ancak pratikte bu katalizörün kararlılığıyla sınırlıdır. Katalizörlerin kararlılığı, reaksiyon koşullarına göre aktif yapılarını muhafaza edebilme kapasiteleridir (28). Şekil 21. Katalizor mekanizması. E a, katalizlenmemiş reaksiyonun aktivasyon enerjisi; E a, katalizlenmiş reaksiyonun aktivasyon enerjisi; ΔG, reaksiyonun serbest enerjisindeki değişim Canlı organizmada meydana gelen birçok biyokimyasal reaksiyon, protein yapılı spesifik biyokatalizörler olan enzimler tarafından katalizlenir. Metabolizmada elektron aktarımı, hidroliz, yapım, yıkım gibi olaylardan sorumludurlar. Kimyasal katalizörlere göre spesifiklik ve katalitik güç bakımından üstün moleküllerdir. Sadece in vivo olarak değil, belirli koşullar sağlandığında in vitro olarak da etkin oldukları için birçok alanda kullanılmaktadırlar (29). Enzimlerin 19. yüzyıldan sonra ortaya çıktığı bilinmektedir yılında şekeri alt birimlerine parçalayan aktif madde izole edilmiş ve bu maddeye diastaz, daha sonra mide 32

47 suyundan ekstrakte edilmiş maddeye ise pepsin adı verilmiştir. Bunlara ve diğer aktif maddelere genel olarak fermentler denilmiştir de Kuhne tarafından Yunanca maya anlamına gelen enzume kelimesinden türeyen enzim teriminin kullanılması önerilmiştir. Bucheners canlı hücrenin olmadığı ortamlarda bile, maya hücresi ekstraktının ilave edildiği her yerde şeker fermantasyonunun gerçekleştiğini göstermiştir yılında Sumner, fasulyeden üreaz enzimini izole etmiş ve kristalleştirebilmiştir. Bu çalışmasıyla 1947 yılında Nobel ödülünü almaya hak kazanmıştır (30) Enzimlerin Yapısı Enzimlerin karakteristik özellikleri, moleküler yapılarındaki farklılıklardan gelir. Enzimler yüzlerce aminoasidin meydana getirdiği proteinlerdir. Bu aminoasitler, birbirlerine bir aminoasidin karboksil grubundaki karbon atomu ile bir sonraki aminoasidin α-amino grubundaki N atomunun peptid bağı oluşturması ile kovalent olarak bağlanmışlardır. Radikal grubunun özelliğine göre aminoasitler hidrofilik ya da hidrofobik özellik gösterebilirler. Bu aminoasitlerin protein molekülü üzerindeki dağılımları ise molekülün davranışını belirler. Proteinlerin birincil yapısını aminoasit dizilimi belirler. Birincil yapıyı belirleyen aminoasitlerin dizilimi ise yapıdaki deoksiribonükleotid dizilimi ile belirlenir. DNA zinciri ilk olarak mrna molekülüne kopyalanır ve bu bilgiye göre ribozomda aminoasit dizisi oluşturulur. Son olarak sentezlenen polipeptid zinciri doğal yapı olarak bilinen üç boyutlu yapıya çevrilir. Proteinin üç boyutlu yapısı, genetik olarak belirlenir fakat çevresel faktörlerden de etkilenir. Çünkü protein molekülü ortamdaki moleküllerle de etkileşim içindedir. Proteinin ikincil üç boyutlu yapısı ise birincil yapıdaki aminoasitlerin birbirleri ile etkileşimleri sonucu oluşur. Bu etkileşimler genelde amid grupları arasında hidrojen bağları oluşumudur. Tersiyer üç boyutlu yapı ise birincil yapıda yer alan aminoasitlerin etkileşimleri ile sıkı ve sarmal bir konfigurasyon oluşturmaları sonucu oluşur. Bu yapıda çoğunlukla yüzeyde hidrofilik aminoasitler yer alır iken iç kısımda hidrofobik aminoasitler yer almaktadır. Proteinin biyolojik fonksiyonu için tersiyer yapı temeldir. Bazı enzimler kuaterner üç boyutlu yapıya sahiptir. Özellikle düzenleyici proteinler bu grup içindedir. Kuaterner yapı farklı polipeptid zincirlerinin etkileşimi sonucunda oluşur (31). Üç boyutlu yapının oluşması için temel etkileşimler aşağıdaki gibidir; Hidrojen bağları: Protonlanmış bir elektronegatif atom ile bir diğer elektronegatif atomun etkileşimi sonucu oluşur. Hidrojen bağı kovalent bağda depolanan enerjinin onda birine sahiptir. Bu da globuler proteinlerin heliks yapısının oluşumunda belirleyicidir. Ayrıca bu özellik, tersiyer yapı oluşumu için de önemlidir. 33

48 Apolar etkileşimler: Hidrofobik aminoasit uçlarının su gibi polar çözücüler karşısında ortak itme kuvvetlerinin sonucu oluşurlar. Kuvvetli kimyasal bir bağ değildir ancak proteinin üç boyutlu yapısının stabilizasyonuna katkısı vardır. Disülfit köprüleri: Sistein moleküllerinin oksidasyonu sonucu oluşurlar. Özellikle düşük molekül ağırlıklı proteinlerin üç boyutlu yapısının stabilizasyonunu sağlarlar. Yüklü aminoasit birimleri arasındaki iyonik bağlar: Aminoasitlerinin bulunduğu ortamdaki iyonlarla etkileşimi sonucu oluşur. Proteinlerin üç boyutlu yapısının oluşumuna katkı sağlarlar. Diğer zayıf etkileşimler: Van der Waals gibi proteinin üç boyutlu yapısında çok önemli rolü olmayan kuvvetlerdir Aktif Merkez Enzimatik reaksiyonların gerçekleşebilmesi için substratın enzime bağlanması gerekir. Enzimler, tek substrata spesifik olabileceği gibi birden fazla substratla da bağlanarak bir veya daha fazla reaksiyon ürünü oluşturabilirler. Enzimatik reaksiyonlarda, substrat bir metabolitken diğer reaktant su molekülü gibi başka bir metabolit ya da metal iyonu olabilir ancak her durumda diğer reaktant bir koenzimdir. Substratlara ek olarak enzimler inhibitör, aktivitör, allosterik aktivitör ya da inhibitör gibi spesifik moleküllerle de bağlanabilirler. Metal iyonları gibi inorganik ya da organik bileşenler olabilen koenzimler, enzimlerin reaksiyonları katalizlemesini sağladıkları için reaksiyonlarda oldukça önemli rol oynarlar. Enzim substrat kompleksindeki stabilizasyonu sağlayan kovalent olmayan etkileşimler, protein yapısının stabilizasyonu sağlayan etkileşimlerle aynıdır. Enzimlerin üzerinde spesifik substratların bağlanabilmesi için aktif merkez de denilen bir bölüm yer alır. Enzim ve substratı arasında boyut olarak büyük farklılık vardır. Bunun sebebi substratın, koenzimin, metal iyonlarının ve protonların bağlanmasından sorumlu olan aktif bölgenin çok küçük olmasıdır. Aktif merkez, enzim yüzeyi üzerinde girinti ya da cep şeklinde bulunur. Substrat tamamlayıcısı yapısındadır. Substrat ile enzimin protein kısmı arasında oluşan hidrojen bağları ve substratın apolar kısmı ile proteinin apolar kısmı arasında yüklü moleküllerden dolayı meydana gelen etkileşimler enzim substrat kompleksinin oluşumunda rol oynarlar. Enzimler tarafından katalizlenen tüm reaksiyonlar, reaktantların enzim yüzeyi üzerindeki aktif merkeze adsorplandığı yerde gerçekleşir. Bundan dolayı aktif bölge, enzim kinetiği ve enzimolojideki kinetik ve mekanik kavramlar açısından çok önemlidir. Bu kavram, 34

49 moleküllerin çarpışmasına dayalı kimyasal reaksiyonlar ile adsorpsiyona dayalı enzimatik reaksiyonlar arasındaki temel farkı oluşturur (31) Enzimlerin Sınıflandırılması Enzimler, Uluslararası Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Biriminin (IUBMB) İsimlendirme Komitesi nin verdiği kararla katalizledikleri reaksiyon türüne göre 6 kategoride sınıflandırılmaktadır. IUBMB nin Enzim Komitesi (EC) tarafından her enzime 4 haneli bir numara verilmiştir. İlk numara sınıfı, ikinci numara alt sınıfı, üçüncü numara alt grubu, dördüncü numara ise alt grup ile ilişkisini ifade etmektedir (30). Uluslararası sınıflandırmaya göre enzimler altı sınıfa ayrılmıştır: 1. Oksidoredüktazlar: Elektronların hidrojen ya da oksijen atomlarının transferini kapsayan indirgenme yükseltgenme reaksiyonlarını katalizlerler. 2. Transferazlar: Bir donörden uygun bir akseptöre fonksiyonel grup transferini katalizlerler. 3. Hidrolazlar: Kimyasal bağların su varlığında hirolizini katalizlerler. 4. Liyazlar: Kimyasal bağların hidrolitik ve oksidatif olmayan ayrılma reaksiyonlarını katalizler. 5. İzomerazlar: Bir substratın bir izomere dönüşümü reaksiyonlarını katalizler 6. Ligazlar: İki molekülün kovalent bağlanma reaksiyonlarını katalizler 3.2 Enzim İmmobilizasyonu Biyosensörler alanında gelişmeler arttıkça, enzim aktivitesi kaybı, enzim ömrü ve stabilitesiyle ilgili problemler de artmaktadır. Bunlara ek olarak, enzimatik cevap süresinin kısalığı ve tek kullanımlık cihazlara olan ihtiyacın artması da söz konusudur. Bu problemlerin üstesinden gelebilmek için farklı immobilizasyon yöntemleri geliştirilmiştir. İletken bir yüzey üzerine enzim immobilizasyonu yapılırken uygulanan yöntem oluşturulan elektrokimyasal cihazın performansıyla birinci dereceden ilişkilidir (32). Bu sebeple enzim molekülünün etkin bir şekilde yüzeyde tutunabilmesi için uygulanan immobilizasyon yönteminin; Enzimin çevirici yüzey üzerine etkili ve kararlı bir şekilde tutunmasını sağlaması, Enzimin biyolojik özelliklerini etkilememesi, Biyouyumlu ve kimyasal olarak inert olması gerekmektedir. Enzim, bir yüzey üzerine immobilize edilirken, seçilen yöntem çok önemlidir. Uygulanan yöntem enzimin aktif merkezindeki kimyasal yapıyı ya da reaktif grupları değiştirerek enzim aktivitesinde bir kayba sebep olmamalıdır. Bir başka deyişle enzim immobilizasyonu, enzime 35

50 olabildiğince az hasar vererek yapılmalıdır. Enzimin aktif merkezi hakkındaki bilgilerin fazla olmasıyla bu hasar minimuma indirilebilir Enzim İmmobilizasyonu Yöntemleri Taşıyıcı Bir Yüzeye Bağlama Taşıyıcı bir yüzey üzerine bağlama bilinen en eski enzim immobilizasyon yöntemidir. Bu yöntemde bağlanan enzim miktarı ve immobilize enzim aktivitesi taşıyıcı yüzeyin özelliklerine bağlıdır. Şekil 22 de taşıyıcı yüzey üzerine bağlı enzim molekülünü şematize edilmektedir. Şekil 22. Taşıyıcı yüzeye bağlı enzimin şematik gösterimi Taşıyıcı yüzey seçilirken enzimin bazı özellikleri dikkate alınmalıdır. Bunlar aşağıdaki gibi sıralanabilir. Partikül büyüklüğü Yüzey alanı Hidrofilik ve hidrofobik grupların molar oranı Kimyasal bileşim Genel olarak hidrofilik grupların oranı ve enzim miktarındaki artış, immobilize enzimin daha yüksek aktiviteye sahip olmasıyla sonuçlanmaktadır. Enzim immobilizasyonu için yaygın olarak kullanılan taşıyıcı yüzeyler arasında selüloz, dekstran, agaroz ve poliakrilamid jel bulunmaktadır (33). Bağlanma şekline göre, taşıyıcı yüzey üzerine bağlama yöntemleri çeşitlilik göstermektedir. Fiziksel Adsorbsiyon Bu method, enzim proteininin suda çözünmeyen bir taşıyıcı üzerine fiziksel adsorbsiyonunu temel almaktadır. Enzim molekülünde ve aktif bölgede hemen hemen hiçbir hasara ve konformasyonal değişime yol açmayan bir immobilizasyon yöntemidir. Eğer uygun bir taşıyıcı yüzey bulunursa hem ucuz hem de kolay olabilmektedir. Ancak enzim ve taşıyıcı arasında oluşan kuvvetlerin zayıflığından dolayı kullanım sırasında, adsorbe olmuş enzim 36

51 taşıyıcı yüzey üzerinden ayrılabilmektedir. Enzimlerin fiziksel adsorbsiyonu için uygulanan bazı yöntemler aşağıdaki gibidir. Statik işlem Elektro-boşalım Reaktörde bekletme Çalkalama ya da karıştırma banyosunda bekletme Genel bir immobilizasyon methodu olan adsorbsiyonun, ana avantajı bağlama için kimyasal madde kullanılmaması ve aktivasyon için minimum basamağa ihtiyaç duyulmasıdır. Adsorbsiyon kimyasal bağlama yöntemlerine göre enzim proteinine daha az zarar vermektedir. Çünkü adsorbsiyonda bağlanma, hidrojen bağları, çoklu tuz köprüleri ve Van der Waal s kuvvetleriyle olmaktadır. Oluşan zayıf bağlardan dolayı ortam ph sının, sıcaklığın, iyonik kuvvetlerin değişimiyle ve substrat varlığıyla enzim proteininin taşıyıcı yüzey üzerinden desorbsiyonu gözlenmektedir. Bir diğer dezavantaj ise, çok spesifik bir yöntem olmamasından dolayı, diğer proteinlerin ve maddelerin immobilize edilecek enzim gibi kullanılmasıdır. Bu durum immobilize enzimin özelliklerini değiştirmekte ve reaksiyon hızını düşürmektedir (33). İyonik Bağlama İyonik bağlama yöntemi, enzim proteininin suda çözünmeyen iyon değişimini sağlayan maddeler içeren bir taşıyıcı yüzey üzerine iyonik olarak bağlanmasına dayanmaktadır. İyon değişim merkezleri içeren polisakkaritler ve sentetik polimerler, bu amaçla yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Enzimin taşıyıcı yüzey üzerine bağlanması kovalent bağlamada olduğu gibi ortam koşullarına çok bağlı olmadığından kolaylıkla gerçekleştirilebilmektedir. Ayrıca bu yöntem konformasyonda ve enzimin aktif bölgesininde çok az değişime sebep olmaktadır. Bu sebeple yüksek aktivite görülmektedir. Enzimin taşıyıcı yüzey üzerinden ayrılması gibi durumlar yüksek iyonik kuvvete sahip substrat çözeltilerinde ve ph değişimlerinde olmaktadır. Bunun sebebi, taşıyıcı yüzey ile enzim arasında oluşan bağlayıcı kuvvetlerin kovalent bağlamada olduğu kadar kuvvetli olmamasıdır. İyonik bağlanma ve fiziksel adsorbsiyon arasındaki ana fark iyonik bağlamada taşıyıcı yüzey ile oluşturulan bağların daha kuvvetli olmasıdır (33). Kovalent Bağlama Kovalent bağlama, enzim ve taşıyıcı matriks arasında kovalent bağların oluştuğu, en sık kullanılan immobilizasyon yöntemidir. Proteinin immobilize edileceği reaksiyon tipi seçilirken, 37

52 1) Bağlanma reaksiyonunun gerçekleştiği koşullarda enzim aktivitesinin kaybolmamasına, 2) Kullanılan kimyasallardan dolayı enzimin aktif bölgesinin etkilenmemesine dikkat edilmelidir. Kovalent bağlama yöntemi, enzim ve suda çözünmeyen bir taşıyıcı yüzeyin, kovalent bağlanması temeline dayanmaktadır. Bu bağlama yönteminde oluşabilecek bazı fonksiyonel gruplar karboksil, amino, hidroksil ve sülfidril gruplarıdır. Oluşan bağlara göre bu yöntem, diazo, peptid ve alkilasyon yöntemleri gibi alt gruplara ayrılabilir. Kovalent bağlama fiziksel adsorbsiyon ve iyonik bağlama gibi yöntemlere göre daha komplekstir ve immobilizasyon için gerekli şartlar daha fazladır. Bu sebeple kovalent bağlama enzimin konformasyonunu değiştirebileceği gibi, enzimin aktif bölgesini de etkileyerek aktivite kaybına sebep olabilir. Ancak enzim ve taşıyıcı yüzey arasındaki bağlanma kuvvetleri çok güçlü olduğundan, yüksek iyonik güçteki bir çözeltide bile enzimin taşıyıcı yüzey üzerinden desorbsiyonu gibi bir durum kovalent bağlamada söz konusu olamaz Çapraz Bağlama Bu yöntemde enzim immobilizasyonu, enzim proteinlerinin diğer protein moleküllerine ya da fonksiyonel gruplara moleküller arası çapraz bağlanmasıyla gerçekleşir. Enzim moleküllerinin birbirlerine çapraz bağlanması, hem pahalı hem yetersiz bir yöntemdir çünkü protein molekülleri ana destek maddesi yerine geçeceklerdir. Bu da düşük enzim aktivitesine sebep olacaktır. Genel olarak çapraz bağlama, diğer yöntemlerle sıkça kullanılmaktadır. Özellikle adsorbe olmuş enzimlerin kararlılığını sağlamak için ve poliakrilamid jellerden enzimin ayrılmasını engellemek için kullanılır. Şekil 23 de çapraz bağlı enzim molekülü şematik olarak gösterilmiştir. Şekil 23. Çapraz bağlı enzimin şematik gösterimi 38

53 Çapraz bağlamada en sık kullanılan bağlayıcı ajan gluteraldehittir. Bağlanma reaksiyonları ağır koşullarda gerçekleşir. Bu koşullar enzimin aktif bölgesinde konformasyon değişikliklerine yol açabileceği gibi enzim aktivitesine de sebep olabilmektedir. Şekil 24 de glutaraldehite (GA) ait kimyasal yapı gösterilmektedir. Şekil 24. Glutaraldehite ait kimyasal yapı Tutuklama Enzim tutuklama yöntemi, enzim molekülünün polimer ya da membran matrisinin örgü yapısının içerisine lokalizasyonunu temel almaktadır. Bu tutuklama işlemi, enzim substratının difüzyonuna izin verecek şekilde yapılır. Difizyonu sağlayan bu yapı kafes (lattice) ve mikro kapsül olmak üzere ikiye ayrılır. Şekil 25 de tutuklanmış enzim molekülleri şematik olarak gösterilmiştir. Şekil 25. Tutuklanmış enzimlerin şematik gösterimi Bu yöntem, enzimin bir jel ya da membran matrisine bağlanmamasından dolayı kovalent bağlama ve çapraz bağlamaya göre farklılık göstermektedir. Bu da geniş kullanım alanı sağlamaktadır. Ancak kimyasal polimerizasyon reaksiyonlarında, uygulanan koşullar enzim aktivitesini düşürebilmektedir. Bundan dolayı enzim immobilizasyonu için uygun koşulların sağlanması çok önemlidir. 39

54 3.3 Enzim Kinetiği Enzim Aktivitesi Birçok enzimatik reaksiyonunun başlangıç aşamasında, enzimin meydana getirdiği değişim sadece substrat konsantrasyonuyla orantılıdır. Kullanılan yöntem, enzim çözeltisi konsantrasyonundan bağımsız sonuçlar vermelidir. Enzim aktivitesi, enzimin optimum ph, sıcaklık, subtrat konsantrasyonunda ve aktivitör maddelerin varlığında belirlenir. Enzimin kullanıldığı uygulama alanlarında en önemli bilgi, onun aktivitesidir. Aktivite, belirli koşullar altında enzimin reaksiyonu katalizleyebilme özelliğidir. Bu da birim zamanda enzimin miktarı başına üretilen ürün ya da reaksiyona giren substrat miktarının bir ölçüsüdür (34). Enzim aktivitesi birim olarak ifade edilir. Belirli koşullar altında belirli bir miktarda substratın değişime ya da yıkıma uğradığı miktar birim aktivite olarak adlandırılır. Birim sayısı, toplam enzim-polimer konjugatının miligramında, dakikada ürüne dönüşen substratın mikromol cinsinden miktarı olarak tanımlanır Michelis ve Menten Kinetiği Enzimin katalitik etkinliği, genellikle kimyasal reaksiyon hızına yaptığı etkinin ölçülmesiyle belirlenir. Enzim katalizli reaksiyonlar ilk olarak 19. yüzyılın sonlarında çalışılmıştır yılında Michelis ve Menten substrat konsantrasyonu değişirken, enzim konsantrasyonu, ph, sıcaklık gibi parametreleri sabit tutarak sükrozun invertaz katalizli hidroliz reaksiyonunun başlangıç hızını ölçmüşlerdir. Bunun sonucunda, bir enzim-substrat kompleksi oluştuğu bulunmuş ve substrat konsantrasyonu arttıkça reaksiyon hızının da hiperbolik olarak maksimuma ulaştığı görülmüştür. Michelis ve Menten tek substrat, tek ara ürün ve serbest enzim-enzim substrat kompleksi arasında denge içeren enzim katalizli reaksiyonlar için bir hız eşitliği türetmişlerdir. Aşağıdaki reaksiyon mekanizması önerilmiştir. E, serbest enzim; S, substrat, ES enzim-substrat kompleksi ve P reaksiyon ürünüdür. ES nin ürüne yıkım hızının, ES nin enzim substrat içine dağılmasından çok daha yavaş olduğu varsayılmaktadır. 40

55 Michelis ve Menten, eşitliklerini bu varsayımı baz alarak oluşturmuşlardır, bundan dolayı; k 2 << k 1 Ancak Michelis ve Menten in formülasyonu, enzim katalizinin ilk basamağını ilgilendirdiğinden, hız sabitleri açısından gereksiz ve yersiz varsayımlardır. Bu konuda Briggs ve Haldane başlangıç reaksiyon hızı açısından daha geçerli bir önermede bulunmuşlardır. Buna göre, reaksiyon başladıktan hemen sonra, ara ürün (enzim-substrat kompleksi) konsantrasyonunun sabit kaldığı durgun hale ulaşılır. d[es]/ dt = k 1 [E][S] - k -1 [ES] - k 2 [ES] = 0 Toplam enzim konsantrasyonu, [E] o ; [E] ve [ES] nin toplamı olarak yazılabilir. d[es]/dt=k +1 [E] o [S] - (k 1 [S] + k -1 + k 2 ) [ES] = 0 Eşitlik, k 1 e bölünerek [ES] için çözülür, Aşağıdaki eşitlik elde edilir.. K m, Michelis sabiti olarak bilinir, enzim substrat kompleksinin dağılımı için bir denge sabiti ve tersinir olarak etkili olan enzimin substrata affinitesiyle ilgilidir. TH max, reaksiyonun maksimum hızıdır. Tüm enzimler, enzim-substrat kompleksi formunda olduğunda elde edilir. Görülmektedir ki bu teori ve eşitlik tüm enzim kinetik ölçümleri için standart olan deneylerin kesinliğinden dolayı, invertazla ilgili sonuçları oldukça kesin olarak hesaplayabilmektedir. Bugün Michelis ve Menten modern enzimolojinin kurucuları olarak bilinmektedir. Genellikle eşitlik Michelis Menten eşitiliği olarak bilinmektedir. 41

56 Michelis Menten eşitliğine uyan sabit enzim konsantrasyonunda substrat konsantrasyonunun fonksiyonu olan başlangıç reaksiyon hızı Şekil 26 da verilmiştir. Şekil 26. Michelis Menten grafiği Şekil 26 da da görüldüğü gibi, çok düşük substrat konsantrasyonlarında hız, [S] ile orantılıdır. Bundan dolayı anlaşılmaktadır ki S de reaksiyon birinci derecedendir. Çok yüksek substrat konsantrasyonlarında ise hız TH max a yaklaşır ve reaksiyon S de sıfırıncı derecedendir. Bu durumda enzimin substratla doygunluğa ulaştığı söylenebilir. Farklı substrat konsantrasyonlarında bir dizi başlangıç hızları ölçülecekse, Michelis ve Menten eşitliğinin grafiksel gösterimi uygundur. Bu şekilde K m ve TH max kinetik parametreleri belirlenebilir. Ancak S ye karşı TH grafiği çizildiğinde dikdörtgensel bir hiperbol elde edilir ki bu hiperbolun çizim zorluğundan ve asimptotların tahmin zorluklarından dolayı istenmez. Bu nedenle kinetik parametrelerin belirlenmesi için, enzim katalizli reaksiyonlarda lineer bir ilişki daha yararlı olacaktır. Lineweaver ve Burk, Michelis ve Menten in eşitliğini düz bir doğru üzerinde işaretlemeye imkan tanıyan bir formda tekrar yazmışlardır. 1/S ye karşı 1/TH grafiği çizildiğinde düz bir doğru elde edilmektedir. Bu doğrunun eğimi, K m /TH max, y eksenindeki kesim noktası ise 1/TH max ı vermektedir (Şekil 27). 42

57 Şekil 27. Lineweaver-Burk Eğrisi 3.4 Glukoz Oksidaz Glukoz Oksidaz enzimi (GOx), (EC , β-d-glukoz:oksijen oksidoredüktaz) β-dglukopiranoz a (6 karbonlu glukozun hemiaketal formu) bağlanır ve şeker molekülünün moleküler oksijen ile yükseltgenip glukono-δ-lakton (glukono-1,5-lakton) ve hidrojen peroksidin (H 2 O 2 ) oluştuğu reaksiyonun katalizlenmesini sağlar (35) Glukoz Oksidazın Genel Özellikleri Katalizledikleri reaksiyonlar aynı olsa da, değişik kaynaklardan saflaştırılan GOx molekülleri farklı kimyasal özellikler gösterir. Örneğin, A. Niger, kaynaklı GOx molekül ağırlıkları 80 kd olan, birbirine disülfit köprüleri ile bağlı 2 eş değer alt üniteden meydana gelmiştir. A. Niger GOx un her alt ünitede 1 mol FAD içermektedir. GOx molekülünde yaklaşık olarak % 74 protein, % 16 nötral şeker ve %2 amino şekeri bulunmaktadır. FAD molekülü ile apoprotein arasında kovalent bağ bulunmadığından, enzim tamamen denatüre edilerek FAD molekülü enzimden uzaklaştırılabilir. Enzimin yapısında bulunan karbonhidrat tamamen uzaklaştırılsa bile, aktivite göstermeye devam eder; ancak termal stabilitesi azalır. GOx, β-d-glukoz için oldukça spesifik olup, β-d-glukoz u α-d-glukoza göre 157 kez daha hızlı okside eder. Ayrıca enzim 2-deoksi-D-glukoz, D-mannoz ve D-galaktoz için çok düşük de olsa aktivite göstermektedir. GOx nun başlıca inhibitörleri Ag +, Hg + ve Cu +2 olarak belirlenmiştir (35). 43

58 3.4.2 Glukoz Oksidazın Reaksiyon Mekanizması GOx, β-d-glukozu elektron alıcısı olarak moleküler oksijeni kullanarak, D-glukono-δ-laktona ve H 2 O 2 ye oksidasyonunu katalizleyen bir flavo proteindir. Bu reaksiyon, indirgeyici ve yükseltgeyici basamak olmak üzere 2 ye ayrılır. İndirgeyici yarı reaksiyonda, GOx, β-d-glukozun, D-glukono-δ-laktona oksidasyonunu katalizler. Reaksiyon Şekil 28 de gösterilmiştir. Bunun sonucunda GOx ın FAD halkası FADH 2 ye indirgenir. Yükseltgeyici yarı reaksiyonda ise, indirgenmiş GOx oksijenle yeniden yükseltgenerek, H 2 O 2 açığa çıkar (36). Şekil 28. GOx reaksiyonunun şematik gösterimi 3.5 Enzim Elektrodu Enzim elektrodu, üzerine ince bir tabaka halinde enzim modifiye edilmiş elektrokimyasal bir sensördür (37). Genellikle enzim tabakası ve çözelti arasına, enzim tabakası ve elektrot arasına ya da ikisi arasına da yarı geçirgen bir membran modifiye edilmişitir. Örnek, herhangi bir ön işleme tabi tutulmadan, direk olarak ölçüm yapılır. Prob, analit çözeltisiyle temas ettiğinde substrat enzim tabakasının içine doğru difüzlenir. Birçok enzimatik reaksiyon sonucunda elektrotla ölçülebilen üretilen ya da tüketilen türler olur. Enzimatik reaksiyonun sonucu olarak, substrat ve ürün konsantrasyonu değişir ve belirli bir süre sonunda ürün üretimi ve substrat tüketimi hızının eşit olduğu kararlı konuma ulaşılır. Elektroaktif türlerin konsantrasyonları potansiyometrik ya da amperometrik olarak kontrol edilir ve elektrokimyasal sinyal, substrat konsantrasyonunun ölçülmesi için ilişkilendirilebilir (28). Enzim elektrotlarının en temel iki unsuru enzim ve elektrot materyalidir. Enzim elektrodunda, elektrot materyali seçilirken elektriksel iletkenlik ve sertliğe önem verilmelidir. Bu sebeple, enzim elektrotlarda kullanılan elektrotlar genelde yaprak ya da çubuk şeklinde; platin, altın karbon gibi katı destek materyallerinden oluşturulmaktadır. Kullanılacak enzimin seçimi ise, gerçekleşecek tepkime ve analite göre yapılır (38). Oksidoredüktaz enzimleri, amperometrik enzim elektrodu tasarımlarında yaygın olarak kullanılan enzimlerdir. Glukoz oksidaz, üreaz, alkol dehidrogenaz, peroksidaz, katalaz, 44

59 billirubin oksidaz ve laktat oksidaz bu enzimlerden bazılarıdır. Enzim modifiye edilmiş elektrot sistemleri çok bileşenli sistemlerde hızlı analize imkan tanıdıklarından ve yüksek hassasiyette ölçüm yapmalarından dolayı çevre, tıp, analitik kimya gibi alanlarda uygulama alanı bulmaktadır. Enzim bazlı bir amperometrik elektrot, kimyasal seçici tabaka olarak bir enzimden, çevirici olarak bir elektrottan, elektrodun bağlı olduğu bir amplifikatörden ve sonuçların okunacağı bir ekrandan oluşur (39) (Şekil 29). Şekil 29.Bir enzim elektrodunun temel elemanları Amperometrik Enzim Elektrodu Jenerasyonları Amperometrik biyosensörlerin tasarımı için, redoks enzimi ve elektrotlar arasındaki elektronik bağlantı; enzim substratının ya da ürünün elektroaktivitesini (I.nesil), redoks medyatörlerinin serbest halde ya da immobilize olarak biyomolekülle kullanımını (II. nesil), ya da enzimin redoks aktif bölgesi ile elektrot yüzeyi arasında direk elektron transferini (III. nesil) baz alır. Şekil 30 da amperometrik elektrotların gelişimindeki farklı yaklaşımlar, şematik olarak gösterilmektedir (40). 45

60 Şekil 30. Amperometrik enzim elektrodu jenerasyonları a) I. Nesil Amperometrik elektrotlar, b) II. Nesil Amperometrik elektrotlar, c) III. Nesil Amperometrik elektrotlar I. Nesil biyosensörlerde çok yüksek potansiyel uygulanması, en büyük eksikliktir. Bu sorun küçük redoks aktif moleküller olan, enzimin redoks aktif merkezi ile elektrot yüzeyi arasında elektron transferini sağlayan medyatörlerin (ferrosen türevleri, ferrosiyanid, iletken organik tuzlar ve kinonlar) kullanılmasıyla aşılmaktadır (II. Nesil). Birçok redoks enzimi bazlı elektrotlar için medyatörlerin kullanımı uygulanan potansiyeli düşürür. Buna ek olarak, medyatörler kullanıldıkları elektrotlarda lineer cevap aralığını arttırmaktadır. Ayrıca glukoz elektrotlarında, tahmin edilen elektrot ömrünü uzatırlar çünkü enzim için zararlı olan hidrojen peroksit medyatör kulanıldığı durumda üretilmemektedir. Ne yazık ki, medyatörler sadece redoks enzimleri ile bağlanarak enzim ve elektrot arasında elektron transferini sağlamaz aynı zamanda çeşitli reaksiyonlara da sebep olurlar (41). Redoks medyatörlerinin elektrot ve enzim molekülleri arasında kullanımı için birçok yaklaşım bulunmaktadır. Ancak, uygulanan birçok immobilizasyon yönteminin kinetik açıdan dezavantajları bulunmaktadır. Kinetik kısıtlamaların çoğu, enzim ve medyatörün elektrot yüzeyine asimetrik yüklenmesi ve immobilize konumda medyatörün hareketliliğinin kısıtlanmasından kaynaklamaktadır. Tasarlanan elektrot kullanılmadan önce, enzim medyatör oranı sabittir ancak elektrokimyasal işlem boyunca bu oran immobilize formdaki medyatörün anyonik ve katyonik formlarının stabilitesine bağlı olarak değişmektedir. Bu değişim sebebi, elektron medyatörlerinin çözünürlüğüdür (42). Uygulanan immobilizasyon yaklaşımlarının tümünün hedefi, redoks medyatörlerinin çözünürlüğünden dolayı elektrot yüzeyinden desorbe olmasını önlemektir. Bu amaçla, redoks medyatörlerinin elektrot yüzeyine absorbe ve immobilize edilmesi de medyatörlerin çözünürlük sorununu tamamen çözememektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalar redoks medyatörlerinin iletken polimerler ve iyon-değişimli membranlarla birlikte kullanılmasının bu sorunu büyük oranda çözdüğünü göstermektedir (43). III. Nesil biyosensörlerde elektron transferi substratın ürüne katalitik dönüşümüyle ilgilidir. Redoks enzimi elektrot ve substrat molekülü arasında medyatör olmadan elektron transferini arttırarak, bir elektro katalizör görevi görür. Bu tür biyosensörler, genellikle daha iyi seçicilik gösterirler, çünkü başka reaksiyonlara sebep olmadan enzimin redoks potansiyeline yakın potansiyelde çalışabilirler. Biyomolekül ve elektrot yüzeyi arasındaki bağlantının güçlü olması bu tür biyosensörlerin hassaslığını arttırmaktadır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar 46

61 yüksek performanslı amperometrik biyosensörler için redoks enzimi ve elektrot arasında elektron transferinin geliştirilmesi üzerine yoğunlaşmıştır. Bu sistemlerin başka bir geleceği ise, direk elektron transferine dayalı enzim bazlı amperometrik cihazlara dayanmaktadır (40) Enzim Elektrodu Karakteristikleri Bir enzim elektrodunun kullanılabilirliğine, karakteristik özelliklerinin belirlenmesinden sonra karar verilebilir Kararlılık Kararlılık, bir enzim elektrodunun pratik kullanım açısından uygunluğunu belirlediği gibi, elektrodun raf ömrünü de belirler. Uzun ömürlü bir elektrot ile çok sayıda analiz yapılabileceği için maliyet açısından avantajlıdır. Elektrot ömrü, çalışma ve depolama koşulları açısından incelenmektedir. Depolama ve kullanım sürecindeki elektrot ömrü farklılık göstermektedir. Enzimin immobilizasyon yöntemi, saflık derecesi ve kaynağı gibi faktörler enzim ve elektrodunun kararlılığını etkileyen önemli parametrelerdir. Örneğin, fiziksel yöntemlerle immobilize edilen bir enzim elektrodunun ömrü kimyasal olarak immobilize edilmiş bir enzim elektroduna göre daha kısadır (44) Seçicilik Kullanılan elektrodun yüksek seçiciliğe sahip olmasıi bir enzim elektrodundan beklenen en temel özelliktir. Enzimler genel olarak antikor ve nükleik asitlerden sonra seçicilik sıralamasında yer almalarına karşı, mutlak özgül enzimler söz konusu olduğunda bu durum geçersizdir. Seçicilik üzerine etki eden başlıca parametreler ph, sensördeki girişimler ve biyokatalizördeki girişimlerdir. Girişimi engellemenin en iyi yolu sadece analiz edilecek maddeye spesifik bir biyokatalizör kullanmaktır. Amperometrik enzim elektrotları, potansiyometrik elektrotlara göre daha seçicidirler ancak yine de çalışma potansiyelinde girişimde bulunan elektroaktif maddeler bulunabilir. Seçiciliği etkileyen bir diğer faktör ise, kendi içerisinde yarışmalı substratlar ve enzimi aktive ya da inhibe eden maddeler olarak ayrılan biyokatalizördeki girişimdir. Eğer kullanılan enzim alkol oksidaz gibi grup özgüllüğüne sahip bir enzim değil de, yalnızca bir substratla tepkime verme özelliğine sahip bir enzim ise, yarışmalı bir başka substrat girişimi söz konusu olamaz. Ortamdaki inhibitör ve aktivitörler de enzim aktivitesini etkilemektedir. Ag +, Hg 2+, Cu 2+ gibi 47

62 metal iyonları, tiyol bileşikleri ve organofosfatlar da birçok enzimin aktif bölgesinde yer alan serbest tiyol gruplarını inhibe eden önemli inhibitörlerdendir. Seçiciliği etkileyen bir diğer değişken ise, ortam ph dır. Enzimin optimum çalıştığı ph, immobilizasyon sonucu ve yüklü substrat varlığı gibi durumlarda kaymalar gösterebilir. Bu nedenle elektrodun çalışacağı optimum ph, teorik zorlamalara göre değil, deneysel çalışmalara göre belirlenmelidir. Ölçüm aralığının da seçicilik üzerine önemli etkisi bilinmektedir. Hedef substratın dışında girişimde bulunabilecek maddelerin elenmesi için, düşük değerlere inebilen bir ölçüm aralığına sahip elektrotta, örnekteki hedef madde seyreltilerek girişimde bulunabilecek maddelerin konsantrasyonları ölçüm sınırları dışına çıkarılabilir (44) Cevap Süresi Cevap süresi, elektrodun analizlenecek madde ortamına değmesinden, ölçme sisteminden sonucun okunmasına kadar geçen süre anlamına gelmektedir. Cevap süresinin kısa olması, bir enzim elektrodundan beklenen temel özelliklerden biridir. Özellikle rutin analizlerde, kısa cevap süresi pratiklik açısından büyük önem taşır. Genellikle bir biyosensörün cevap süresi birkaç saniye ile birkaç dakika arasında değişir. Bir enzim elektrodunun cevap süresini etkileyen faktörler; Substratın zar yüzeyine difüzyon hızı Substratın biyokatalizörün aktif bölgesi ile verdiği tepkimenin hızı Oluşan ürünün elektrot yüzeyine difüzyon hızı Bu üç faktorü de etkileyen unsurlar substrat konsantrasyonu, enzim derişimi, sıcaklık, ph, karıştırma hızı, biyoaktif tabaka üzerinde zar kullanılıp kullanılmadığıdır. Bu etkenlerden optimum ph ve sıcaklık, karıştırma cevap süresini kısaltırken, substrat derişimdeki artış, biyoaktif tabaka üzerinde zar bulunması, cevap süresinin uzamasına yol açar (44). 3.6 Amperometrik Glukoz Elektrodu Amperometrik glukoz elektrodunda, indirgeyici reaksiyonda, GOx enzimi analiti olan D- glukozun, D-glukono-δ-laktona oksidasyonunu katalizler. Bunun sonucunda GOx ın FAD halkası FADH 2 ye indirgenir. Yükseltgeyici yarı reaksiyonda ise, indirgenmiş GOx oksijenle yeniden yükseltgenerek, H 2 O 2 açığa çıkar. Böylece sistemde oluşan elektron taşınımı, elektrokimyasal bir çevirici tarafından elektrokimyasal olarak ölçülür. Tercihen elektrokimyasal çevirici ve enzim birbirine olabildiğince yakın olmalıdır. Bu sebepten dolayı enzim çalışma elektroduna immobilize edilir (45). 48

63 3.6.1 Amperometrik Glukoz Elektrodunun Kullanım Alanları Tanı Diyabet hastalarının kan şekeri ölçümleri için daha ucuz ve basit glukoz tayini yapan cihaz ihtiyaçlarının doğması üzerine, glukoz elektrotları üzerine yapılan araştırmalar artmıştır. Diyabet, vücudun kan şekerini sabit tutması için insulini üretememesi ya da etkin kullanamamasından dolayı ortaya çıkar. İki çeşit diyabet vardır. Tip 1 ya da insuline bağlı diyabet (IDDM) olarak bilinen diyabet hastalığında, vücut insulin üretemez. Tip 2 ya da insuline bağlı olmayan diyabette (NIDDM) ise vücut insulini yeterince kullanamaz. Amerikan diyabet derneğine göre, Amerika da 15,7 milyon (toplam nüfusun %5,9 u) diyabet hastası bulunmakta ve her gün yaklaşık 2200 insana diyabet teşhisi konmaktadır. Diyabet Amerika da yedinci ölüm sebebidir. Körlük ve böbrek hasarlarına yol açtığı gibi kalp ve sinir sistemi üzerinde de hasarlara sebep olduğu bilinmektedir. Araştırmalar göstermektedir ki; IDDM hastaları yoğun bir bakımla, kandaki glukoz seviyesi normale yakın tutulduğunda, diyabet hastalığının sebep olduğu hasarlar azaltılabilmektedir. Aynı sonuçtan, NIDDM hastaları için de söz edilebilir. Bu sebeple, eş zamanlı olarak kandaki glukoz seviyesini ölçen cihazların varlığı temeldir. Elektrokimyasal enzim sensörleri, yüksek hassasiyetleri, yüksek seçicilikleri, düşük maliyet ve kullanım kolaylıklarından dolayı ilgi odağı olmuşlardır. Bu tür enzim elektrotları, son zamanlarda ticari glukoz analizi yapan sistemlerde ya da evde kullanılabilen finger stick tipi glukoz ölçerlerde çevirici olarak kullanılmakta ve klinik olarak kesin sonuçlar vermektedirler. Bu glukoz ölçerler, küçük bir iğne yardımıyla deriyi delerek kan örneği alırlar. Sürekli kan örneği alınması gereken diyabet hastalarında, bu durum deri tahrişine ve daha fazla acıya sebep olacağından, sürekli glukoz ölçen sistemler kullanılmaktadır. Bu sistemlerin ise sadece implantasyon ve kalibrasyon periyotları acıya sebep olurlar (46). Proses Kontrol Fermantasyon işleminde, glukoz konsantrasyonunun ayarlanması önemli bir noktadır. Çünkü fazla miktardaki glukoz, laktat oluşumuna sebep olur bu da verimliliği olduğu gibi biyokütleyi de azaltır. Glukoz izleme sistemleri, devre dışı ya da bağlantılı izleme olarak ikiye ayrılırlar. Enzimatik glukoz elektrotları, her iki yöntemde de yüksek hassasiyet ve seçicilikte sonuç vererek kullanılmaktadırlar. Bu elektrotların kullanımı kimyasal ya da enstrumental analiz yöntemleriyle karşılaştırıldığında, oldukça basit ve düşük maliyetlidir. Geleneksel devre dışı glukoz izleme yönteminde, örnek alma ve laboratuvar analizi işlemleri manuel olarak 49

64 gerçekleştirilir. Örnek alma ve analiz aşaması arasında geçen zaman, fermentasyon işleminin kontrolü açısından sonuçları daha az anlamlı kılar. Bağlantılı glukoz izleme yöntemi ise, glukoz konsantrasyonu hakkında eş zamanlı bilgi vererek optimum reaksiyon koşulları için eş zamanlı müdaheleye olanak sağlar. Glukoz sensörleri, bu sistemlerde direk olarak fermentasyon ortamına yerleştirilebileceği gibi, sistemin dışında proses akışının üzerinde olan bir dış enstrumana da yerleştirilebilirler. Kullanılan glukoz elektrotların özellikle fermentasyon ortamında kullanılanların, sterilizasyonu etkilememesi ve karmaşık fermentasyon ortamında yalnızca glukoza seçici olarak hassas ölçüm yapabilmesi gerekmektedir (46). 4. DENEYSEL ÇALIŞMALAR 4.1 Kullanılan Kimyasal Maddeler, Cihazlar ve Teknikler Kimyasal Maddeler Monomer sentezi için, AlCl 3 (Merck), 4-(1-H-Pirol-1-yl) fenol (PF) (Sigma-Aldrich), toluen (Sigma-Aldrich) kullanılmıştır. Pirol monomeri Alfa Aesar firmasından temin edilmiştir. Elektrokimya deneyleri için çözücü olarak Diklorometan (DCM) (Merck), 50

65 Asetonitril (CH 3 CN) (Sigma Aldrich), destek elektrolit olarak Tetrabütilamonyum hegzaflorofosfat (TBAPF 6 ) (Aldrich) kullanılmıştır. Biyosensör çalışmaları kısmında, enzimlerin kendi aralarında kovalent bağlanması için çapraz bağlayıcı ajan olarak kullanılan glutaraldehit (GA), (%25) D-Glukoz, Glukozoksidaz (Aspergillus niger. 200 U/mg, %36 α-d-glukoz %64 β-d-glukoz) Sigma (St. Louis, MO, ABD) firmasından temin edilmiştir Kullanılan Alet ve Cihazlar Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi (FT-IR) Elde edilen polimer örneklerinin FT-IR spektrumları, KBr ile pelet yapılarak, bilgisayar kontrollü Perkin Elmer (USA) model FT-IR cihazı kullanılarak incelenmiştir Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi (NMR) NMR analizleri Bruker Ultra Shield Plus ile yapılmıştır. 1 H-NMR spektrumu için CDCl 3 solvent olarak kullanılmış ve tetrametilsilan referansına göre kimyasal kayma (δ) değerleri verilmiştir Potensiyostat İletken polimerin sentezinde ve elektrokromik özelliklerinin incelenmesinde, elektropolimerizasyon düzeneği kullanılmıştır. Düzenek Elektrokimyasal Potansiyostat- Galvanostat Cihazına (Iviumstat, Hollanda) bağlı hücre ve üçlü elektrot sisteminden oluşmaktadır. Deneylerde elektrolitik bir hücre içinde çalışma elektrodu olarak indiyum kalay oksit ile kaplanıp bir yüzü iletken hale getirilmiş ITO cam, referans elektrodu olarak gümüş tel ve karşıt elektrot olarak da platin tel kullanılmıştır UV-VIS Spektrofotometre Spektroelektrokimyasal çalışmalarda Agilent 8453-UV Görünür Bölge Spektrofotometri Gamry Referans 600 model potansiyostat cihazı ile birlikte kullanılmıştır Biyosensör Çalışmasına Yönelik Sistemler Denemeler sırasında, Voltalab PGP 201 potansiyostat (Radiometer/Fransa), Palmsens (Hollanda) elektrokimyasal ölçüm sistemi kullanılmıştır. Biyosensör sistemlerine ait cevaplar akım (I, A) olarak elde edilmiştir. Amperometrik ölçümler de, glukoz oksidaz enzim sensörü 51

66 için, içerisinden azot gazı geçirilmiş 50 mm, ph 4,5 sodyum asetat tamponu kullanılmıştır. Enzimin katalizlediği reaksiyonda tüketilen oksijenin izlenmesi, -0,7 V çalışma potansiyelinde gerçekleştirilmiştir. Ölçümler; çalışma elektrodu olarak grafit, karşıt elektrot olarak platin (Metrohm) ve referans elektrot olarak Ag/AgCl (Metrohm) kullanılarak 3 lü elektrot sistemi ile gerçekleştirilmiştir. 4.2 Deneysel Prosedür TPFc in Sentezi (((1S)-2-((4-(1H-pirol-1-yl)fenoksi)(merkapto)fosforotiyol)siklo penta-2,4-dien-1-yl)(siklo-2,4-dien-1-yl)demir)) TPFc, [FcP(=S)( -S)] 2 ile 4-(1-H-Pirol-1-yl)fenol ün toluen içindeki reaksiyonu ile sentezlenmiştir (Şekil 32). Detaylı sentez bilgileri şu şekildedir. 0,25 g (0,446 mmol) [FcP(=S)(m-S)] 2, 10 ml toluen içerisinde 0,142 g (0,892 mmol) 4-(1-H-Pirol-1-yl) fenol ile (1:2 mol oranında) reaksiyona sokulmuş böylece TPFc bileşiği elde edilmiştir. Reaksiyon karşımı tüm katı bileşenler çözülüp sarımsı bir çözelti elde edilinceye kadar ısıtılmıştır. Sarıturuncu renkli kristal süzülmüş ve kurutulmuştur. 0,40 g ürün elde edilmiştir. Verim %39,6 olarak bulunmuştur. Şekil 31. TPFc sentezi Biyosensör çalışmasında kopolimer oluşturmak için kullanılan TPA'nın Sentezi 1,4-di(tiyofen-2-yl)bütan-1,4-dionSentezi 100 ml lik balona 16 ml DCM çözücüsü ve AlCl 3 (16g, 0,12 mol) eklenmiştir. Damlatma hunisine, tiyofen ( 9,6 ml, 0,12 mol), süksinil diklorid ( 5,6 ml, 0,5 mol) ve 10 ml DCM çözücüsü eklenip scaklık 20 o C yi geçmeyecek şekilde 4 saat boyunca karıştırma işlemi uygulanmıştır. Karıştırmanın sonunda, karışıma 7 ml HCl eklenmiştir ve karışım sırasıyla DCM, 2M HCl ve %5 lik NaHCO 3 çözeltileriyle ekstrakte edilmiştir. Çözücüsü uçurulan madde, etanolde kristallendirilmiştir ve % 53 verimle Şekil 32 de gösterilen 1,4-di(tiyofen-2-52

67 yl)bütan-1,4-dion başlangıç maddesi sentezlenmiştir ve erime noktası 120 C olarak ölçülmüştür. Şekil 32. 1,4-di(tiyofen-2-yl)bütan-1,4-dion sentezi 4-(2,5-di(tiyofen-2-yl)-1H-pirol-1-yl) bütan-1-amin sentezi (TPA); Bir balon içerisine, sentezlenen diketon (1g, 4x10-3 mol) ve toluen (20 ml, 7,5x10-3 mol) konulup, literatürde belirtilen hesaplara göre üzerine propiyonik asit ( 0,00755 ml, 0,0077 g, 1,04x10-4 mol) ve 1,4-diaminobutan (0,593 ml, 0,528 g, 6x10-3 mol) eklenerek geri soğutuculu düzenek altında deney başlatılmıştır. 5. günün sonunda madde oluştuğu gözlenmiş ve deney sonlandırılmıştır. Çözeltinin çözücüsü uzaklaştırılmak üzere, vakum destilasyonu uygulanmıştır. Tamamen tolueni uzaklaştırılıp kuruyan madde, flash kromatografisine tabi tutulmuştur. Flash kromatograsinden alınan maddelerin, çözücüleri uzaklaştırılmış ve kristallenmeye bırakılmıştır. Buna göre tüm işlemler sonucunda %15,20 verimle Şekil 33 de gösterilen 4- (2,5-di(tiyofen-2-yl)-1H-pirol-1-yl)bütan-1-amin sentezlenmiş ve erime noktası ise 163,1 0 C olarak ölçülmüştür. Şekil (2,5-di(tiyofen-2-yl)-1H-pirol-1-yl)bütan-1-amin (TPA) sentezi 53

68 4.2 Elektrokimyasal Polimerizasyon Sentezlenen TPFc monomeri farklı iki monomer ile (Py, TPA), destek elektrolit olarak Tetrabütilamonyumhegzaflorofosfat (TBAPF 6 ) ve çözücü olarak da DCM ve CH 3 CN kullanılarak kopolimerleştirilmiştir TPFc ile Pirol ün DCM İçerisindeki Kopolimerizasyonu Karşıt elektrot olarak Pt telin, referans elektrot olarak gümüş telin ve çalışma elektrodu olarak da ITO camın kullanıldığı hücre içinde 0,15 gram TPFc maddesi, pirol ile kopolimer oluşturularak, destek elektrolit Tetrabütilamonyumhegzaflorofosfat (TBAPF 6 ) ın kullanıldığı DCM ve CH 3 CN çözücüsü içerisinde polimerleştirme gerçekleştirilmiştir. Polimerleştirme işlemi, dönüşümlü voltametri ile farklı potansiyeller arasında, farklı tarama hızlarında yapılmış ve renk değişimleri kaydedilmiştir. Ayrıca tarama hızları değiştirilerek tarama hızının polimerleşmeye etkisi incelenmiştir. Şekil 34. TPFc ile Py Kopolimerizasyonu Elektroliz hücresinde bulunan karışıma 20 saniye boyunca 1,8 V luk sabit potansiyel uygulanarak kopolimer sentezlenmiş ve sentezlenen kopolimer FT-IR ile karakterize edilmiştir. Ayrıca sentezlenen kopolimer için tarama hızlarının polimerleşmeye etkisi incelenmiştir TPFc ile TPA nın DCM İçerisindeki Kopolimerizasyonu Polimerleşme, DCM içerisinde, TPA ve TBPF 6 destek elektroliti kullanılarak gerçekleştirilmiştir. TPFc-co-TPA bileşiğinin -0,5 ile +1,8 V potansiyel aralığında, 250 mv/s tarama hızında döngülü voltametrisi alınmış ve renk değişimi kaydedilmiştir. Kopolimerizasyon reaksiyonu Şekil 35 de verilmiştir. 54

69 Şekil 35. TPFc ile TPA Kopolimerizasyonu Tek başına TPFc ile hazırlanan elektrotta monomer serbest amino gruplarına sahip olmadığı için, stabil bir enzim immobilizasyonu gerçekleştirilememiş, tek başına TPA ile hazırlanan elektrotta ise biyosensör cevabını oluşturan ferrosenin bulunmadığından dolay akımda farklanma gözlenmemiştir. Bu nedenle, stabil enzim immobilizasyonu için, serbest amino grubuna ve ferrosen gibi katalitik redoks özelliği gösteren bir medyatöre ihtiyaç olduğundan dolayı, TPFc ve TPA ile kopolimerizasyon gerçekleştirilmiş ve hazırlananan P(TPFc-co- TPA/GOx) enzim elektrodu ile önemli parametrelerin karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. 4.4 İletken Polimerin Elektrokromik Özellikleri Spektroelektrokimya Spektroelektrokimya, aynı anda çalışılabilen elektrokimyasal ve spektroskopik tekniklerin bir arada kullanılmasıdır. Yaygın olan tekniklerle karşılaştırıldığında, bir elektrokimyasal reaksiyonun karakteristik optik özellikleriyle birlikte, elektrokimyasal cevabı hakkında bilgi edilnilmesini de sağlamaktadır. Spektroelektrokimyasal çalışmalar, platin tel karşıt elektrot, Ag tel referans elektrot ve ITO çalışma elektrotu olarak kullanılarak yapılmıştır. Potantiostat cihazı ile farklı potansiyel uygulanan iletken polimerin uygulanan her potansiyel değeri için UV spektrumu alınmıştır. 55

70 4.4.2 Kinetik Çalışmalar Kinetik çalışmalar belli bir uygulamayı gerçekleştirmek için elektrokromik malzemelerin durumu hakkında değerli bilgiler sağlar. Bu yöntem sayesinde, optik spektroskopiyle, absorbans değişikliklerinin izlenmesi ve kare dalga potansiyel uygulamasıyla bir malzemenin uzun süreli absorbans değişiklikleri, tepki süresi ve kararlılığı belirlenebilir. Yüzde geçirgenlikteki değişim (% T) optik kontrastın belirlenmesinde, tepki süresi ise istenen zamanda, maksimum potansiyel ile en düşük potansiyel arasındaki absorpsiyon değişikliklerinin belirlenmesinde kullanılır. 4.5 Enzim Elektrodu Hazırlanması Bu çalışmada, enzim biyosensörlerinin ana bileşeni olarak GOx enzimini içeren, medyatörlü glukoz enzim sensörü tasarımı gerçekleştirilmiştir. Enzim elektrodu tasarımında, elektrot malzemesinin elektriksel olarak iletken ve sert yapıda olması, enzim immobilizasyonu için iletken polimer ve medyatör ile modifiye edilebilir olması istenen özelliklerdir. Literatür araştırmasına dayanarak, bu özellikleri sağlayan karbon yapılı elektrotlar, elektrot malzemesi olarak seçilmiş ve enzim immobilizasyonu için kullanılmıştır. Bu amaçla, ilk olarak TPFc ve TPA monomerlerinin, dönüşümlü voltametri ile kopolimeri oluşturularak, grafit elektrotlarının yüzeyi modifiye edilmiştir. Daha sonra GOx, çapraz bağlayıcı olan GA vasıtasıyla modifiye elektrot yüzeyine immobilize edilmiştir. Hazırlanan P(TPFc-co- TPA/GOx) glukoz enzim sensörünün performansını etkileyen önemli parametrelerin optimizasyonu sonrasında, analitik karakterizasyonu yapılmıştır Enzimin Kovalent Bağlanması Bu yöntemde elektron aktarım medyatörü olarak kullanılan TPFc ve TPA içeren kopolimer elektrokimyasal olarak karbon elektrodu üzerinde oluşturulmuş ve GOx enzimi iletken polimerler ile modifiye edilen grafit elektrotların yüzeyine çapraz bağlayıcı ajan olan GA ile çapraz (kovalent) olarak bağlanmıştır. GOx ile hazırlanan enzim elektrotların kullanımıyla yapılan ölçümlerde, enzim substratının oksidasyonu sonrasında, medyatörün yani ferrosenin indirgenmesinin ölçümü temel alınmıştır TPFc-co-TPA/Glukoz Oksidaz Enzim Sensörünün Hazırlanması Enzim immobilizasyonu için fonksiyonel grup yaratmak amacıyla, elektrot yüzeylerinin modifiye edilmesinde iletken polimerlerin oluşumu için elektrokimyasal polimerizasyon yöntemi uygulanmıştır. 56

71 Glukoz Oksidaz (GOx) tabanlı enzim elektrodu hazırlanmasında izlenen yol şöyledir; Öncelikle grafit (karbon) elektrot yüzeyi iyice temizlenmiştir. Daha sonra 0,1 M TBAPF 6, 1 mg/ml TPA ve 4 mg/ml TPFc, DCM çözeltisi içinde hazırlandıktan sonra, dönüşümlü voltammetri tekniğiyle, -0,5 ile 1,8 V arasında 0,25 V/s tarama hızında 5 döngü ile elektropolimerizasyon işlemi uygulanarak elektrot yüzeyi modifiye edilmiştir. Son olarak 1 mg GOx enziminin 5 L ph 7,5 olan 50 mm sodyum fosfat tamponundaki çözeltisinden 2,5 µl elektrot yüzeyine damlatılmıştır, üzerine 2,5 µl %1 lik GA çözeltisi eklenmiştir. Elektrot yüzeyi kuruması için 2 saat boyunca oda sıcaklığında bekletilmiştir. Deney boyunca substrat olarak kullanılan glukoz çözeltisi 1 M olacak şekilde hazırlanmıştır. Fakat kullanılan glukoz çözeltisinin 24 saat öncesinden hazırlanmış olması istenmektedir, çünkü kullanılan GOx, β-d-glukoza seçimli olduğu için glukozun mutorotasyonun gerçekleşmiş olması gerekmektedir P(TPFc-co-TPA/GOx) Enzim Sensörleri ile Ölçüm İlkesi GOx temelli enzim sensörleriyle yapılan çalışmalarda, ölçüm yapılmadan önce hazırlanan tampon çözeltisi azot gazından geçirilerek çalışmalar oksijensiz ortamda yapılmıştır. Enzim sensörü, 10 ml tampon bulunan reaksiyon hücresine alınmış, manyetik karıştırıcı yardımıyla oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bekletilmiştir V da izlenen çalışmada substrat (glukoz) ilavesi öncesinde sistemin dengeye gelmesiyle belirlenen akım değeri kaydedilmiş ve ardından substrat (glukoz) ilavesi yapılmıştır. Oluşan enzimatik reaksiyon 70 saniyede tamamlanmış, yeni oluşan bu denge durumuna ait akım değeri okunarak kaydedilmiştir. Deneysel çalışmalarda, substrat eklenmeden önceki ve substrat eklendikten sonraki denge durumunda okunan akım değerlerinin farkı alınmıştır. Söz konusu farklanma, substrat konsantrasyonuyla orantılıdır ve µa/cm 2 olarak belirlenmektedir. Yapılan çalışmalarda öncelikle glukoz konsantrasyonu ile akım miktarındaki farklanmalar arasında grafikler çizilmiş ve çeşitli parametrelerin sensör cevabına etkileri incelenmiştir. 4.6 Elektrot Performans Çalışmaları Enzim elektrodunun tasarımı sırasında kullanılan ve sonrasında da performansının incelendiği sistem, elektroliz hücresi ve elektrotları muhafaza eden hücre standından oluşmaktadır. Deneyler üçlü elektrot sistemi ile yürütülmüştür. Karbon elektrotların modifiye edilmesiyle oluşturulan enzim elektrodu, sisteme çalışma elektrodu olarak bağlanmış; referans elektrodu olarak gümüş/gümüş klorür (Ag/AgCl) elektrot ve karşıt elektrot olarak da platin (Pt) elektrot kullanılmıştır. 57

72 4.6.1 Ferrosenin Redoks Özelliğinden Faydalanarak Amperometrik Olarak Sensör Cevabının İzlenmesi Amperometrik glukoz elektrodunda, glukoz oksidaz enzimi prostetik grup olarak FAD içerir ve glukozun, glukonik aside yükseltgenmesi sırasında, glukozdan FAD ye elektronların aktarımı olur. Oluşan FADH 2 nin tekrar FAD ye yükseltgenmesi elektronların oksijene aktarımıyla gerçekleşir (I. Nesil). II. Nesil biyosensörlerde bu görevi medyatör gerçekleştirir. Oksijen yerine başka bir elektron alıcısı (medyatör) kullanılarak reaksiyonun oksijene bağımlılıgına son verilir. Medyatör kullanılması durumunda gerçekleşen reaksiyon aşağıdaki şekildedir: Tercihen elektrokimyasal çevirici ve enzim birbirine olabildiğince yakın olmalıdır. Enzimlerin çalışma elektroduna immobilize edilmesi bu açıdan da önemlidir. İletici sistem olarak bir amperometrik sensörün kullanılması durumunda, potansiyometrik sensörlerden en büyük fark; ürünlerden sinyal oluşturan türün elektrot yüzeyinde tüketilmesidir. Ferrosenin elektrokimyasal özelliğinin enzim biyosensörlerindeki görevine ilişkin reaksiyonlar Şekil 36 da verilmiştir. Şekil 36. Ferrosenin elektrokimyasal özelliğinin enzim biyosensörlerindeki görevine ilişkin reaksiyonlar 58