Kromozom bantları ve in situ hibridizasyon. Rasime Kalkan,PhD

Transkript

1 Kromozom bantları ve in situ hibridizasyon Rasime Kalkan,PhD

2

3 Yöntemler

4 Konvasiyonel sitogenetik analiz

5

6 Kromozomlar büyüklük, sentromer pozisyonu ve bantlama paternine göre ayrılmaktadır 1 kromozom bandı : 5-10 Mega baz çifti(mbp).

7 Visualizing Metaphase Chromosomes (Banding)

8 Sayısal anomaliler

9 Yapısal anomaliler

10 High resolution karyotype Avantajlar Tüm genomu taramak Rölatif olarak daha ucuz Dezavantajları 5 mb kadar anomali saptamaktadır

11 Klasik sitogenetiğin limitleri Kromozom bantlama tekniklerine bağlı olarak hassastır İyi kromozom morfolojisi ve bölünen hücrelere ihtiyaç vardır 5 Mb rezolüsyon limiti

12 Konvansiyonel sitogenetiğin avantaj ve dezavantajları Avantajları 1 defada tüm genomun taranmasına imkan tanır. Spesifik anomali bilindiğinde saptanması ( ör KML de Philadelphia) ve ek kromozomal anomalilerin saptanması Dezavantajları Majör yapısal anomalilerin saptanması 1band = 5mb of DNA ~ 150 gen ).

13 Kromozomal anomali endikasyonları Kromozomal anomali süpesi Mukonjenital anomali ve gelişim geriliği Mental reterdasyon Gonadal disgenezi Infertilite Düşükler Ölü doğum öyküsü Malignensiler

14 Hangi durumlarda FISH önerilir? Metafaz kromozom elde edilememesi halinde Başarısız kültür hastadan alınan dokunun kültüre edilmesinin uygun olmaması (preimplantation analysis, rapid prenatal examinations, examinations of solid tumors or autopsy material) Komplike kromozomal anomalilerin analizi Marker kromozomun tanımlanması Sub mikroskobik, kriptik anomalilerin saptanması Mikrodelesyon sendromları Malignansilerde tümör baskılayıcı ve onkogenkerin amplifikasyonu

15 Fluorescence in situ hybridization (FISH) In situ hybridization spesifik nükleotid sekanslarının hücre süspansiyonu yada dokulardan saptanması. İlgili gen bölgesine spesifik prob un hücre yda doku süspansiyonuna hibridizasyonu prensibine dayanmaktadır.

16 Fluorescence in situ hybridization (FISH) In situ teknikler anomalinin görüntülenmesi için tanı amacı ile kullanılmaktadır veya hastalığa neden olan endojen veya ekzojen DNA veya RNA molekülünün saptanması için kullanılmaktadır.

17 Moleküler sitogenetik: Fluorescence in situ Hybridization (FISH) RNA ve DNA yapılarının, sayı ve lokasyonlarının yerlerinin hücrede ve in situ olarak tanımlanmasına dayanmaktadır FISH : Morfolojik olarak korunmus kromozom preperatlarında kullanılmaktadır (Metafaz). Fikse hücre veya dokular (Interfaz) Spesifik kromozom anomaliler görüntülenmektedir delesyon, amplifikasyon, translokasyon

18 Fluorescence in situ hybridization (FISH) Bölünen(metaphase) ve bölünmeyen (interphase nuclei) hücrelerdeki seçili genetik değişikliğin saptanması ISH hücresel ve moleküler seviyede bilgi veren bir metoddur. FISH hematolojik malignensilerin orjin ve progresyonunu belirlemek için kullanılabilmektedir

19 Aavantajları FISH Analysis Çok specific (100 kb) Microdelesyon/Microduplikasyon Dezavantajları Çok specific proba ihtiyaç vardır tüm genomu tarayabilmek için

20 Hedef- Target Metafaz kromozomları Interfaz nukleusu Entire Cells/RNA Doku kesitleri FISH deneyleri yeterli uzunkluktaki ve ilgili DNA dizisine komplementer floresan işaretli DNA/RNA probları ile yapılmaktadır.

21 FISH analizinde kullanılabilecek dokular Periferik kan Fibroblasts biyopsisi Epitel hücreler, buccal smear Kemik iliği (hemoblastosis) Solid tumor biyopsisi

22 Interpfaz FISH in avantajları Hücre kültürene ihtiyaç yoktur ve metafaz için hücrelerin bölünme stimüayonuna ihtiyaç yoktur interphase FISH metafaza göre daha hızlıdır Fikse edilmiş hücrelerin ve bölünmeyen hücrelerin analizine izin verir. Mikroskop kullanılarak FISH ile analiz edilebilir Metafaz prosedürlerine göre daha hassasdır Kemik iliği transplantasyonunda rezidüel hastyakığın moniterize edilmesinde kullanılabilir.

23 Moleküler Sitogenetiğin Kullanımı Kromozom tanımlama Aneploidi saptama Sentromer analizi Marker kromozom kökenini belirleme Tüm kromozom analizi, whole chromosome analysis (chromosome painting) Kromozom translokasyon analizi Benzersiz unique- sekansların analizi (single-copy sequence) Mikrodelesyon analizleri Gen amplifikasyon analizleri

24 FISH PROSEDÜRÜ Kromozom denatürasyonu Prob denatürasyonu Hibridizasyon Floresan boyma Slide ların analizi

25

26 Fluorescent in situ Hybridization (FISH) kullanımı Sayısal ve yapısal krozom anomlilerinin tanımlanması ve karekterizasyonu Mikroskobda görülemeyen delesyonların saptanamsı Sub relomerik anomalilerin saptanması. Prenatal tanı,bilinen sayısal kromozomlar için(interphase FISH).

27 FISH limitleri Probun bağlandığı bölgeler dışındaki anomaliler saptanamaması İnterfaz fısh için hücre preparasyonu önemlidir to permeabilize the cells for optimal probe target interaction to maintain cell morphology. Küçük mutasyonlar saptanamaz Uniparental dizomi saptanamaz. Inversiyonlar saptanamaz Tüm kromozomal bölgeler için problar tivcari olarak yoktur Pahalı bir yöntemdir

28

29 Problar Fluorescein Biotin Hedef nükleik asit dizisinin komplamenteri Problar floresan boyalar ile işaretlenmektedir biotin, fluorescein, Digoxigenin Büyüklükleri20-40 bp to 1000bp

30

31

32 Indirect Probe labeling, antikorlar aracılığı ile FISH prosedürü tamamlanmaktadır Haptens---BiotindUTP, digoxigenin-dutp Labeling-İşaretleme teknikleri: a) Nick translation b) Random priming c)pcr (Polymerase chain reaction) Direct Probe labeling, problar direkt olarak SpectralGreen veya SpectralOrange gibi florokromlar ile işaretlenmişlerdir One-step hybridization. DNase I makes nicks DNA Polymerase adds dntp, labeled dutp at 3 and remove dntp at Principle of Nick Translation

33

34 Denaturation Stringency Isı Faktörler Seviye Stringency Sonuçlar Tuz çözeltisi (SSC) konsantrasyonu Formamid Konsantrasyonu Yüksek Düşük Yüksek Düşük Yüksek Düşük Yüksek Düşük Düşük Yüksek Yüksek Düşük (if inappropriate) Düşük verim Yüksek arkaplan Yüksek arkaplan Düşük verim Düşük verim Yüksek arkaplan

35 Prob Tipleri Sentromer Probları Alpha ve Satellite III probes Sentromer gibi tekrarlayan dizilerde bulunmaktadırlar Sentromer bölgeleri parlak boyanmaktadır Tüm Kromozom Probları Tüm kromozom boyuna bağlanan prob kombinasyonlarının toplamıdır Multiple probe labels are used Tüm kromozom boyuna hibridiza olmaktadırlar Telomer Telomer bölgelerine spesifiktir Kromozom uçlarındaki 300 kb locus spesifiktir Lokus Delesyon Translokasyon probları Gen saptanama & lokalizasyon Gen amplifikasyon probları

36 Denatürasyon & Hibridizasyon Denatürasyon Isı veya alkali metodu ile olabilir Prob ve hedef DNA denatürasyonu Hibridizasyon için ön koşuldur Hibridizasyon İki komplementer nükleotid sekanısının dupleks oluşturmasıdır DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA Arasında l olabilmektedir

37 Detection & Visualization Saptama-Detection Direct İşaterleme: Prob direkt floresan isaretlidir Daha az hassastır Indirect İşaretleme: Saptanması için ek basamaklara ihtiyaç vardır Alkalin fosfotaz gibi konjuge antiboylere ihtiyaç vardır Sinyal amplifikasyonu ile saptanabilir Hibridizasyon Floresan prob hibridizasyon sırasında hedef sekansa bağlanmaktadır Bu uygun filtreler ile mikroskopta görüntülenebilmektedir.

38

39 Kromozomal sekansların sınıflandırılması Beta satellite Alpha satellite Classical satellite Telomeric sequences Unique gene sequences

40 Spesifik kromozom yapılarına özel Problar Kromozom spesifik sentromer probları(cep ) Sentromer bölgelerine hibridize olmaktadır İnterfaz ve metafazda anoploidilerin saptanması için kullanılmaktadır Chromosome painting probes (WCP) Tüm kromozoma hibridize olan problardır Metafaz üzerinde yapısal kromozom anomalilerin saptanması için kullanılmaktadır Unique DNA sequence probes (LSI ) Benzersiz DNA dizilerine hibridize olmaktadır Gen yeniden düzenlenmeleri, delesyon ve gen amplifikasyonlarının saptanması için kullanılmaktadır

41 Telomere-specific probes (TEL) Subtelomerik bölgelere hibridize olmaktadır Subtelomerik delesyon veya yenidendüzenlenmelerin saptanması için kullanılmaktadır

42 α-satellite DNA centromeres Sayısal anomalilerin saptanması, marker kromozomun sentromer orjininin belirlenemsi, kemik iliği transplantasyonu sonrası hücre görüntülemesi (opposite sex of donor and recipient)

43 Locus specific DNA probes: Kromozom üzerindeki genlerin görüntülenmesi ve yapısal kromozom anomalilerinin saptanması (translocations, deletions)

44 trizomi-21 kız fetus chromosomes 13 (green), and 21 (red) chromosomes 18 (aqua), X (green), and Y (red).

45 X ckromozomu için Satellite (centromeric) probe Karyotip? 45,X or 46,XY

46 X- and Y-centromeric probes Green = X Red = Y Determine probable karyotype. 46,XY

47 Interfaz FISH ile yapısal anomaliler LSI Probe (Fusion Probe) ile saptanmaktadır

48 Interfaz FISH ile yapısal anomaliler LSI Probe (Break Apart Probe)

49 Dual color break-apart Mb probes Translokasyonu saptamaktadır Translokasyon kırık noktalarına spesifik olarak tasarlanmıştır. Traslokasyon olması halinde prob birbirinden ayrılmakta ve sinyal vermektedir

50 FISH kullanılan mikrodelesyon Syndrome sendromları Chromosome Location Probe/Gene Locus DiGeorge 22q11.2 D22S75 Velocardiofacial 22q11.2 D22S76 Miller-Dieker 17p13.3 D17S379 Smith-Magenis 17p11.2 D17S29 Prader-Willi 15q11.2 SNRPN Angelman 15q11.12 D15S10 Williams 7q11.23 Elastin Cri du chat 5p15.2 D5S23 Wolf-Hirschhorn 4p16.3 D4S96

51 Microdeletion konfirmasyonu (1 kırımızı sinyalin kaybı) Deleted chromosome red signal absent Red signal TUPLE1 (HIRA) locus Green signal ARSA locus (control probe) normal chromosome red signal on HIRA locus is present Microdeletion 22q11.2 is associated with DiGeorge syndrome.

52 Chromosome painting probes: İlgili kromozom bölgesi veya tüm kromozama komplementer sekans hey contain sequences from whole chromosomes or chromosomal parts (partial probes) yapısal yenidendüzenlenmelerin saptanması (translocations and deletions of large extent), veya marker kromozomun kökeninin belirlenmesi için kullanılmaktadır

53

54 der 5

55 der SpectrumGold WCP 5 + SpectrumRed WCP 9 9 der 5

56 Multicolor FISH - mfish her kromozm çifti için farklı florersan kombinkeri kullanılmakta ve her kromozm çifti farklı floresan vermektedir Hematolojik malignensilerde kompleks kromozom anomalilerin saptanmasına imkan tanımaktadır kompleks yapısal anomaliler saptanabilmektedir

57

58 Spectral karyotyping and multifluor FISH paint each human chromosome in one of 24 colors (SKY)

59 Multicolor banding with high resolution - mband Klasik bant tekniklerine oranla daha yüksek çözünürlükte kromozom kırık noktaları saptanmaktadır

60 Kromozom 4 de küçük bir terminal delesyon var mı?

61

62

63 Hematolojide sitogenetik ve moleküler sitogenetiğin önemi Diyagnoz karyot,ip hakkında bilgi * Tanının spesifikleşmesi *prognoz hakkında bilgi * Tedavinin izlenmesi

64

65

66

67 Sık kullanılan florokromların Absorption Spectrası Fluorochrome Absorption Emission Cascade Blue Fluorescein Rhodamine Texas Red Cy

68 Diagnostic Potential For Karyotype, FISH, and Chromosomal Micro- array Analysis (CMA) For Selected Disorders Condition Locus studied Karyotype Disease specific FISH Telomere FISH CMA Aneuploidy various ~100% Not detected Detected by karyotype ~100% Large deletions, large dupllications, translocation of large segments various ~100% Not detected Detected by karyotype Karyotype better for present Cryptic Rearrangements of telomeres various Not detected Not detected ~100% ~100% for unbalanced 1p36 deletion 1p36.3 Few ~99% >95% ~99% Wolf-Hirschhorn 4p16.3 Most ~99% >95% ~99% Cri-du-chat 5p15.2 Most ~99% >95% ~99% Williams-Beuren 7q11.2 Almost none ~99% Not detected ~99% Prader-Willi 15q11-q13 Unreliable ~70% Not detected ~70% Angelman 15q11-q13 Unreliable ~70% Not detected ~70% Miller-Dieker lissencephaly 17p13.3 Few >90% Some detected >90% Smith-Magenis 17p11.2 Some >95% Not detected >95% Velocardiofacial/DiGeorage 1 22q11.2 Rarely >95% Not detected >95%

69 FISH vs. Karyotyping

70 2 yaşında, MR erkek Inborn cardiac defect supravalvular aortic stenosis. Case 1 Abnormal fenotipik özellikler mevcut

71 Case 1 hypertelorism irides stellatae low set ears abnormal teeth open mouth, thick lip elfin face

72 Case 1 Case 2 Williams-Beuren syndrome çağrıştırmakta Microdeletion sendromu, 7q11.23 %95 microdeletion FISH ile tanımlanabilmektedir Öncelikle konvansiyonel sitogenetik önerilmiştir Kromozom 7 microdeletion tanımlamak için hangi prob kullanılmalıdır?

73 Case 1 - karyotype Normal sonuç: 46,XY Microdeletion FISH analizi ile konfirme edilmelidir

74 7q11.23 MICRODELETION MOLECULAR SİTOGENETİK ANALİZ 180 kb ELN LIMK1 D7S613 CENTROMERE TELOMERE LOCUS SPECIFIC PROBE FOR THE CRITICAL REGION ELN/LIMK/D7S613 (labeled with the Spectrum Orange, red signal) CONTROL PROBE D7S522 (labeled with the Spectrum Green, green signal)

75 Case 1 molecular cytogenetic ardından sonuç 7q11.23 microdelesyon doğrulandı Tanı: Williams- Beuren syndrome

76 Case 2 Turner syndrome? 11 yaşında, 128 cm-kısa boy, zayıf okul performansı

77 Doğumda :900 gr Hormon seviyeleri: *FSH :106,1 uu/ml *LH: uu/ml *UE: <5,00 *G6PD: 0,4u/g Hb. 128 cm 35,5 kg.

78 Fenotipik Değerlendirme : Dismorfik özellikler: *simian çizgisi-her iki elde mevcut *klinodaktili-sağ elde *kısa ve hipoplastik tırnaklar *düşük ense saç çizgisi *düşük yerleşimli gözler * hipertelorizm *basık burun *uzun filtrum Abdominal USG yumurtalıklar gözlenmedi

79 Testler Karyotip analiz; *G/LTB *C-Bantlama *NOR Bantlama Karyotip: 45,X [95]/46,X,+mar[5] (5%) Moleculer Cytogenetic Tests: Multicolor FISH LSI AR and LSI SHOX and XIST

80

81

82 Androgen Receptor / SHOX gene/ XIST SHOX:sp red Cep X: Sp aqua AR, Xq11.2- Xq12 SHOX:sp red Cep X: Sp aqua XIST, Xq13.2

83