İMMÜNOHEMATOLOJİK TESTLER

Transkript

1 Klinik mikrobiyoloji uzmanının sorumluluğunda kan hizmet birimleri İMMÜNOHEMATOLOJİK TESTLER Dr.A.Esra KARAKOÇ S.B.Ankara EAH TKMTD, TKV KLİMUD-EGE Sürekli Tıp Eğitimi, Sürekli Mesleki Gelişim Etkinliği,

2 İmmünohematolojik Testler Kan gruplama Çapraz Karşılaştırma Antikor tarama Antikor tanımlama

3 ISBT Kan Gruplama Sistemleri Adı ABO MNS P Rh Lutheran Kell Lewis Duffy KiddJ Diego Cartwright XG Scianna Dombrock Colton Landsteiner-Wiener Chido/Rodgers Hh Kx Gerbich Cromer Knops Indian Ok Raph JMH Kısaltma ABO MNS P RH LU KEL LE FY K DI YT XG SC DO CO LW CH/RG H XK GE CROM KN IN OK RAPH JMH

4 ABO Kan Grup Sistemi ABO sistemi iki özellik nedeniyle farklı Serumda aglutinin varlığı ABH ag leri bir çok dokuda ve sekresyonlarda bulunur Serumda antikor gösterilme prensibine dayanan karşıt gruplamanın yapıldığı tek kan grup sistemi

5 Eritrosit Transfüzyonu

6 Plazma Transfüzyonu

7 KAN GRUPLARININ BELİRLENMESİ 7

8 REVERSE FORWARD KAN GRUPLARI 8

9 Kan Gruplarının Saptanması 1. Hemaglütinasyon Lam (Slide) yöntemi Tüp yöntemi Jel Santrifügasyon yöntemi Mikroplak yöntemi 2. RİA 3. EİA 4. PCR 9

10 Hemaglütinasyon Sonuçlarını Etkileyen Faktörler 1. Fiziksel Koşullar İnkübasyon ısısı IgM tipi antikorlar 4-27ºC (oda ısısı) IgG tipi antikorlar 30-37ºC (inkübatör) İnkübasyon süresi Santrifüj hız ve süresi Ortam: ph, LISS solüsyonu, enzimler, makromoleküller 2. Eritrositler 3. Yüzey antijenlerinin tipi, sayısı, lokalizasyonu ve immünojenitesi Homozigot veya heterozigot olmaları Serum: Protein içeriği ve antikorların yapı ve türleri 10

11 Hasta Örneği 11

12 TÜP YÖNTEMİ 12

13 13

14 14

15 Aglütinasyonun Değerlendirilmesi Aglütinasyon Değerlendirme ++++ Bir tek büyük küme, serbest hücre yok +++ Birkaç büyük küme, serbest hücre yok ++ Çok sayıda büyük ve küçük küme, serbest hücre yok + Çok sayıda küçük küme, zeminde serbest hücre var Mikroaglütinasyon Makroskobik negatif, mikroskobik bazı alanlar 6-8 hücreli kümeli Şüpheli Makroskobik negatif, çok nadir mikroskobik 6-8 hücreli küme Rulo Oluşumu Mikroskobik olarak kümeler para dizisi şeklinde Negatif Makroskobik ve mikroskobik küme yok Mixed Field Çok sayıda büyük ve küçük küme, zeminde serbest eritrosit var 15

16 Forward Gruplama 16

17 Temiz ve etiketli test tüplerine birer damla anti-a, anti-b, anti-ab, anti-d ve hasta serumu damlatılır 17

18 Her bir tüpe bir damla test edilecek eritrositlerin en az 3 kez yıkanmış % 2-5 lik süspansiyonundan (SF, serum veya plazma ile hazırlanmış) damlatılır 18

19 Tüp içerikleri yavaşça karıştırılır ve yaklaşık x g de sn santrifüj edilir (Alternatif olarak tüpler santrifüj edilmeden 1 saat oda ısısında bırakılır) 19

20 Tüplerin dibindeki eritrosit birikintileri tekrar yavaşça süspanse edilir ve makroskobik olarak aglütinasyon açısından incelenir. Test sonuçları okunur, yorumlanır ve kaydedilir 20

21 hemoliz agglütinasyon 21

22 Reverse Gruplama 22

23 Reverse gruplama Hasta serumu Test eritrositleri 23

24 hemoliz agglütinasyon 24

25 SONUÇLANDIRMA Forward Reverse A Ag pozitif D Ag negatif Anti-B Ab pozitif A grubu Rh negatif A grubu 25

26 JEL YÖNTEMİ 26

27 27

28 28

29 29

30 Aglütinasyonun Değerlendirilmesi

31 31

32 MİKROPLAK YÖNTEMİ 32

33 Mikroplak ABD Gruplama 33

34

35

36 ÇAPRAZ KARŞILAŞTIRMA (Cross-Match) 36

37 Transfüzyon sırasında veya sonrasında oluşabilecek Ag-Ab reaksiyonunun laboratuvar ortamında yapılan ön denemesidir. Alıcı serumuyla verici eritrositleri karşılaştırılır Alıcı ve verici ABO uyumunun son kez doğrulanması Panel dışı Ab varlığı durumunda bu Ab ların belirlenmesi Majör CRM; alıcı serumu verici eritrositleri Minör CRM; verici serumu alıcı eritrositleri 37

38

39 Çapraz Karşılaştırma ABO ve Rh sistemleri dışında bulunan kan grupları nedeniyle önemli Kan transfüzyonu öncesi yapılması gerekir Lewis; Lea - Le - Leb MN; M - N - S - s U P; P1 - P2 - p Luteren; Lua - Lub Kell; K - k Duffy; Fya - Fyb İi; İ - i

40 Çapraz Karşılaştırma ABO Rh uygun kan % 98 uyum Antikor tarama -tanımlama Çapraz karşılaştırma % 2 ek uygunluk

41 Çapraz Karşılaştırma Aglutinasyon yok ~ uyumlu Aglutinasyon ~ uyumsuz Verici Eritrositi Hasta Serumu

42 42

43 Çapraz Karşılaştırma

44 Acil Cross-Match (Immediate Spin) Klinisyene göre, normal CRM prosedürünün uygulanması için geçecek süre hayati bir zaman kaybına neden olacaksa IS CRM Acil durumlar dışında kullanılmamalıdır Acil bir durumda IS CRM yapılarak kan kliniğe gönderildiğinde, mutlaka standart CRM işlemi de yapılıp sonuç klinisyene bildirilmelidir!.. 44

45 Aglütinasyonun Kolaylaştırılması 1. Eritrositler arası uzaklığı kısaltma 2. Proteolitik enzimler (papain, bromelin, ficin, neuroaminidase, trypsin vs) Albümin: Muhtemelen eritrosit yüzeyindeki negatif yükü nötralize etmekte Polikatyonlar (polybrene, protamine): Ortamın katyon yoğunluğunu artırarak eritrosit yüzeyindeki negatif yükü nötralize ederler LISS (Low Ionic Strength Solution): Ortamdaki iyon sayısını azaltır Santrifüj: Santrifüj gücü ile eritrositler birbirine yaklaşır İki eritrosit arasında köprü oluşturma: Coombs serumu 45

46 ANTİGLOBULİN TESTLER 46

47 Doğal ve İmmün Eritrosit Antikorlarının Özellikleri Doğal Antikorlar İmmün Antikorlar Eritrositlerin karbonhidrat antijenlerine yönelik Eritrositlerin protein antijenlerine yönelik Komplet İnkomplet Soğuk Sıcak Genellikle IgM Genellikle IgG Plasentadan geçmez Plasentadan geçer Komplet ve İnkomplet Antikorlar İzotonik tuzlu su ortamında eritrositleri kümeleştirebilen antikorlara komplet, kümeleştiremeyenlere inkomplet adı verilir. 47

48 48

49 Antiglobulin Testler Direkt Antiglobulin Test (DAT, Direkt Coombs Testi): Otoimmun hemolitik anemi, ilaca bağlı hemoliz, yenidoğanın hemolitik hastalığı ve yakın zamanda yapılmış kan transfüzyonuna bağlı alloimmünizasyon araştırılır İndirekt Antiglobulin Test (İAT, İndirekt Coombs Testi): Antikor tarama ve tanımlama, kan gruplama ve uygunluk testlerinde kullanılır 49

50 DAT POZİTİFLİK Eritrosit antijenlerine karşı oluşmuş otoantikorların komplemanla birlikte veya tek başına eritrosit yüzeyini kaplaması Transfüzyon sonrası alıcı antikorların donör eritrosit yüzeyini kaplaması Verici plazmasındaki antikorların alıcı eritrositlerin yüzeyini kaplaması

51 DAT 51

52 DAT 52

53 DAT Hasta eritrositlerinden SF içerisinde %2-5 lik eritrosit süspansiyonu hazırlanır. Bu süspansiyondan bir damla test tüpüne konur. SF ile eritrositler 4 kez yıkanır. Üstteki süpernatan tamamen döküldükten sonra 1-2 damla polispesifik AHG reageni ilave edilir 53

54 DAT 1000 x g de 1 dak. santrifüj edilir. Santrifüj sonrası aglütinasyon değerlendirilir ve sonuçlar kaydedilir 54

55 DAT 55

56 İAT 56

57 İAT 57

58 Bir tüpe 2-3 damla hasta serumu konur. Üzerine bir damla %2-5 lik test eritrosit süspansiyonu ilave edilir. Ortalama dk. Benmaride inkübe edilir İnkübasyon sonrası 1000 x g de 1 dak. santrifüj edilir Santrifüj sonrası tüpler hemoliz yönünden kontrol edilir. Daha sonra dibe çöken eritrositler resüspanse edilir, aglütinasyon olup olmadığı değerlendirilir 58

59 Aglütinasyon yoksa eritrositler %0.9 SF ile en az 4 kez yıkanır. Böylece eritrositlere bağlanmamış antikorlar ve serumda bulunan diğer proteinler uzaklaştırılmış olur. Yıkanmış eritrositlerin üzerine 2 damla AHG reageni eklenir 59

60 1000 x g de 1 dak. santrifüj edilir ve aglütinasyon değerlendirilir. Negatif AHG testini konfirme etmek için IgG kaplı kontrol eritrositlerinden 1 damla tüplere ilave edilir x g de 1 dak. santrifüj edilir. Santrifüj sonrası aglütinasyon değerlendirilir, en az 2+ aglütinasyon görülmelidir 60

61 Jel Yöntemi ile İAT 61

62 Jel Yöntemi ile İAT 62

63 Enzim 63

64 Enzim 64

65 Antikor Tarama - Tanımlama Antikor Tarama Testi Eritrosit antijenlerine karşı antikor olup olmadığını saptamak için yapılır Antikor Tanımlama Testi Varolan antikorun hangi kan grup sistemi ile ilişkili olduğunu ve hangi eritrosit antijenine karşı geliştiğini saptamak için yapılır

66 Antikor Tarama Klinik önemi olan antikorlar mutlaka araştırılmalı Klinik önem Antikorun 37oC de reaktif olması Hemoliz yapması Eritrosit yaşam süresini azaltması

67 Hücreler Fenotipik yapısı (tercihan homozigot) 2 veya 3 farklı donörden alınmış test hücreleri tarama, daha fazla sayıda test hücreleri ise tanımlama testlerinde kullanılmalı

68 IAT damla hücre + 2 damla hasta serumu

69 ANTİKOR TARAMA (IAT-ET) I ++++ II III I II + - III - Test Hücrelerinin Hazırlanması ( I, II, III ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir I II III I II Dağıtım III 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma Test Hücrelerinin Hazırlanması ( IP, IIP, IIIP ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir İnkübasyon 37 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.

70 ANTİKOR TARAMA - CA I ++++ * III I II III - - * I Test Hücrelerinin Hazırlanması ( I, II, III ) II Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir II III I II Dağıtım III 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 4 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika * Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin Kartı Kullanılır Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.

71 Test Hücreleri

72 Tüpte Antikor Tanımlama damla hücre + 2 damla hasta serumu

73 ANTİKOR TANIMLAMA - IAT Test Hücrelerinin Hazırlanması ( 11 li Normal Panel Hücresi ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 37 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.

74 ANTİKOR TANIMLAMA ET Adı Soyadı Tarih Test Hücrelerinin Hazırlanması ( 11 li Enzimli Panel Hücresi ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 37 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.

75 ANTİKOR TANIMLAMA CA Adı Soyadı Tarih * * Test Hücrelerinin Hazırlanması ( 11 li Normal Panel Hücresi ) Hücreler resüspanse edilerek oda ısısına getirilir Dağıtım 50 µl etiketine uyan test hücresi 25 µl hasta serumu veya plazma İnkübasyon 4 C de 15 Dakika Santrifüj 10 Dakika * Normal Hücre ve Nacl / Enzym / Cold Aglutinin Kartı Kullanılır Değerlendirme Test hücreleri ekindeki tablo değerlendirmede kullanılır. Hücre ve tablonun Lot numarası aynı olmalıdır.

76 Değerlendirme

77 Antikor Tanımlama Anti-E