ULUSAL ANTİMİKROBİYAL DİRENÇ SÜRVEYANSI BAKTERİ TANIMLAMA VE ADT STANDART UYGULAMA PROSEDÜRLERİ

Transkript

1 ULUSAL ANTİMİKROBİYAL DİRENÇ SÜRVEYANSI BAKTERİ TANIMLAMA VE ADT STANDART UYGULAMA PROSEDÜRLERİ Revizyon No.1, Ocak 2014

2 Bu sayfa bilerek boş bırakılmıştır Ulusal Antimikrobiyal Direnç Surveyansı

3 İÇİNDEKİLER 1. BAKTERİ ve KLİNİK ÖRNEK SEÇİMİ ANTİMİKROBİYAL DUYARLILIK TESTLERİ (ADT) İÇİN SUP GENEL BİLGİLER Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae da ADT için SUP Disk Difüzyon Yöntemi Genişlemiş Spektrumlu -laktamaz (GSBL) Saptama Escherichia coli ve K.pneumoniae için çalışma protokolü Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Tablosu Sonuç Bildiriminde ve Yorumlu Sonuç Okumada Önemli Hususlar Pseudomonas aeruginosa ADT için SUP Disk Difüzyon Yöntemi P. aeruginosa için çalışma protokolü Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Tablosu Sonuç Bildiriminde ve Yorumlu Sonuç Okumada Önemli Hususlar Acinetobacter baumannii ADT için SUP Disk Difüzyon Yöntemi A. baumannii için çalışma protokolü Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Tablosu Sonuç Bildiriminde ve Yorumlu Sonuç Okumada Önemli Hususlar Streptococcus pneumoniae ADT için SUP Disk Difüzyon Yöntemi Streptococcus pneumoniae için çalışma protokolü Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Tablosu Sonuç Bildiriminde ve Yorumlu Sonuç Okumada Önemli Hususlar Staphylococcus aureus ADT için SUP Disk Difüzyon Yöntemi ve Tarama Testleri Staphylococcus aureus için çalışma protokolü Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Tablosu Sonuç Bildiriminde ve Yorumlu Sonuç Okumada Önemli Hususlar Enterococcus faecium/faecalis Disk Difüzyon Yöntemi ve Tarama Testleri Enterococcus faecium/faecalis için çalışma protokolü Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Tablosu Sonuç Bildiriminde ve Yorumlu Sonuç Okumada Önemli Hususlar DOĞAL DİRENÇ FENOTİPLERİ / BEKLENMEDİK FENOTİPLER DOĞAL DİRENÇ Tanımlar, Örnekler ENTEROBACTERIACEAE AİLESİ ENTEROBACTERIACEAE AİLESİ: Beklenmedik Direnç Fenotipleri NON-FERMENTER BAKTERİLER (Pseudomonas aeruginosa) GRAM POZİTİF BAKTERİLER: DOĞAL DİRENÇ BAKTERİ TANIMLAMA ENTEROBACTERIACEAE TANIMLAMA PSEUDOMONAS AERUGINOSA TANIMLAMA ACINETOBACTER SPP. TANIMLAMA STAPHYLOCOCCUS AUREUS TANIMLAMA STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE TANIMLAMA ENTEROCOCCUS FAECALIS/FAECIUM KAYNAKLAR *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: i

4 Değerli Katılımcımız, Ülkemizde klinik önemi olan bakterilerde antimikrobiyal direncinin izlenmesi ve böylelikle antimikrobiyal direncin önlenmesi için geliştirilecek politikalara yön vermek üzere Türkiye Halk Sağlığı Kurumu tarafından 2011 yılında 77 laboratuvarın katılımıyla başlatılan Ulusal Antimikrobiyal Direnç Sürveyans Sistemi (UAMDSS) sizlerin değerli katkılarıyla başarılı bir şekilde devam etmektedir. Çok teşekkür ederiz. Bu sürveyansta takip edilecek Antibiyotik Duyarlılık Testi Standart Uygulama Prosedürleri (SUP) revize (Revizyon No.1, Ocak 2014) haliyle sizlere sunulmuştur. Revize SUP ta EUCAST a geçiş süreci nedeniyle EUCAST standartlarında CLSI a göre farklılık gösteren noktalar belirtilmiştir. EUCAST daki güncellemeler adresinden takip edilebilir. Çalışmalarınızda bu dokümana uymanız, temel mikrobiyolojik uygulamalar için Ulusal Mikrobiyoloji Standartlarını kullanmanız ( sonuç gönderdiğiniz tüm izolatları stok kültürleriyle saklamanız (istendiğinde referans laboratuvara göndermek üzere) gerekmektedir. UAMDSS Bilimsel Komisyonu *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: ii

5 Kısaltmalar ADT BOS CLSI EUCAST E test GSBL MİK SUP THSK UAMDSS Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Beyin Omurilik Sıvısı Clinical Laboratory Standarts Institute European Committe of Antimicrobial Susceptibility Testing Epsilometer test (Gradiyent strip test) Genişlemiş Spekturumlu Beta-Laktamaz Minimum İnhibitör Konsantrasyon Standart Uygulama Prosedürleri Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Ulusal Antimikrobiyal Direnç Sürveyans Sistemi *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: iii

6 Açıklamalar Referans Laboratuvarı: Katılımcı laboratuvarın yapmadığı bir testi (tür düzeyinde bakteri tanımlama, E-test, sıvı dilüsyon, v.b.) göndereceği laboratuvardır. Katılımcı laboratuvarlar, hangi referans laboratuvarla iletişime geçecekleri ve izolatları nasıl gönderecekleri konusunda THSK ile irtibata geçmelidir. Veri Girişi: Katılımcı laboratuvarlar veri girişlerini bu SUP a göre yapacaklar, zon çapı veya MİK belirterek ve duyarlı S, orta-duyarlı I veya dirençli R olarak gireceklerdir. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: iv

7 1. BAKTERİ ve KLİNİK ÖRNEK SEÇİMİ Ulusal Antimikrobiyal Direnç Sürveyans Sistemi kapsamına giren bakteriler, izole edilecekleri klinik örnekler ve testlerde kullanılacak standart kökenler Tablo 1. de belirtilmiştir. Tablo 1. Bakteri Klinik Örnek Standart Köken Escherichia coli BOS / KAN E.coli ATCC Klebsiella pneumoniae BOS / KAN E.coli ATCC Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii BOS / KAN BOS / KAN E.coli ATCC25922 veya P.aeruginosa ATCC27853 Staphylococcus aureus BOS / KAN S. aureus ATCC Streptococcus pneumoniae BOS / KAN S. pneumoniae ATCC Enterococcus faecium/faecalis BOS / KAN S. aureus ATCC Her hastadan kan veya BOS örneklerinden üretilen ilk izolat bildirilmelidir. Antibiyotik duyarlılık paterni farklı olsa bile aynı hastadan ikinci izolat bildirilmemelidir. Eğer hem kan hem de BOS izolatları aynı gün üredi ise ikisi de bildirilmelidir. Sadece BOS izolatları veri tabanına alınacak, kan izolatları BOS ve KAN izolatları arasındaki direnç farklılıklarını belirlemek için kullanılacaktır. İzolatlar gereği halinde referans laboratuvara gönderilmek üzere mutlaka stoklanmalıdır. İzolatların referans laboratuvara ulaştırılması için biyogüvenlik kurallarına uygun üçlü taşıma kabına alınması, uamdss@thsk.gov.tr adresiyle irtibata geçilerek anlaşmalı kargo yoluyla gönderilmesi gereklidir. MİK belirleyemeyen (E-test veya sıvı dilüsyon veya agar dilüsyon yapmayan) laboratuvarlar izolatlarını referans laboratuvara gönderecektir İzolatların Saklanması ve Gönderilmesi Saklama besiyeri Besiyeri: Tercihen skim milk (yağsız süt) besiyeri kullanılmalıdır. Skim-milk in (%10 luk) hazırlanışı 1 g skim-milk, 10 ml distile su içinde eritilir ve otoklavda 10 dakika sterilize edilir. Skim milk e alternatif olarak %16 lık gliserollü buyyon kullanılabilir. Bu besiyerini hazırlamak için 1 g TSB (Trypticase Soy Broth-glukoz içermeyen) üzerine 10 ml gliserol ve 40 ml distile su eklenerek manyetik karıştırıcıda karıştırılır. ph sı 7.2 ye ayarlanır ve otoklavda 10 dakika sterilize edilir. Sterilite Kontrolu Besiyerleri hazırlandıktan sonar sterilite kontrolu yapılır. Bunun için 3 adet kanlı veya çikolata agar plağı alınır ve saklama besiyerinden (%10 luk skim-milk veya %16 lık gliserol buyyon) her bir plağa 100 μl yayma ekim yapılır. 35 C de *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 1

8 saat inkübe edilir. Hiç mikroorganizma ürememis olması beklenir. Üreme varsa besiyeri atılır Stok kültür hazırlanışı ve transportu Biyogüvenlik kabininde hazırlanması uygundur. Yoksa tüm işlemler bek ateşi yanında aseptik koşullarda yapılmalıdır. 1. Stok kültürler izolatın zengin besiyerlerindeki (%5 koyun kanlı agar, çukulata agar) taze yoğun ve saf olduğundan emin olunulan kültürlerinden hazırlanmalıdır. 2. Stok besiyerini içeren 2 tüp alınır ve izolatın zengin besiyerindeki, taze ve saf kültüründen öze yardımıyla yoğun miktarda bakteri alınarak her bir tüpteki stok besiyerine inokülasyon yapılır. Tüplerin kapakları kapatılır ve vortekslenir. 3. Tüpler etiketlenir (izolat no. ve tarih) ve kayıt defterine izolatla ilgili tüm kimlik bilgileri kaydedilir. 4. İnoküle edilen stok tüpleri, taşıyıcıya konur, taşıyıcı etiketlenir ve derin dondurucuya kaldırılır. Kayıt defterine izolatın hangi taşıyıcıda yer aldığı ve taşıyıcının derin dondurucadaki yeri belirtilerek kaydedilir. 5. Tüpler -80 C ye kaldırılır. Burada 8-10 yıl süre ile bakteriler canlılıklarını kaybetmeden saklanabilir. -80 C lik derin dondurucu yoksa stok kültürler - 20 C de saklanmalıdır. Bu durumda stoklanan bakteriler yaklaşık 1 yıl süreyle canlılıklarını korurlar. -20 C de saklanan stok kültürlerinin 6 ayda bir pasajlarının yapılıp tekrar stok kültürlerinin hazırlanması gereklidir. Stok kültürden taze kültür eldesi ve transportu 6. Belirli bir izolatın stok tüpü, antimikrobiyal duyarlılık test sonuçlarının konfirmasyonu gerektiğinde ya da laboratuvarda çalışılamayan bir duyarlılık testi söz konusu olduğunda referans laboratuvarına gönderilmek üzere derin dondurucudan çıkarılır. Stok kültürden zengin bir besiyerine (%5 koyun kanlı agar veya çukulata agar) pasajı yapılır. 35±2 C de bir gecelik inkübasyon sonrası üreyen mikroorganizmanın, kayıtlardaki stoklanmış izolat olduğu konfirme edilir, ve bakterinin zengin besiyerindeki saf taze kültüründen öze yardımıyla taşıma besiyerine yoğun transfer yapılır. Biyogüvenlik kurallarına uygun şekilde kutulanan ve etiketlenen izolat tüm kimlik ve kayıtlı bilgileri ile referans laboratuvarına gönderilir. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 2

9 2. ANTİMİKROBİYAL DUYARLILIK TESTLERİ (ADT) İÇİN SUP 2.1. GENEL BİLGİLER Katılımcı laboratuvarlar, antimikrobiyal duyarlılık testlerini, rutinde kullandıkları yöntemle (disk difüzyon, MİK bazlı otomatize sistem) yaptıktan sonra sonuçlarını UAMDSS ye gönderirler. Disk düfüzyon kullanıyorlarsa zon çaplarını, otomatize sistem kullanıyorlarsa MİK bazlı değerlerini ve de mikroorganizmanın duyarlılık kategorisini duyarlı (S), dirençli (R), orta duyarlı (I) olarak belirtmekle yükümlüdürler. Burada sadece disk difüzyon yöntemi ve bazı ek testler (GSBL, yüksek düzey aminoglikozit direnci, vankomisin direnci saptama, v.b.) için SUP lar, sonuç değerlendirmede kullanılmak üzere söz konusu bakteriler için disk difüzyon ve MİK sınır değerlerini içeren özet tablolar verilmiştir. Tablolar esas olarak CLSI baz alınarak hazırlanmış olmakla birlikte EUCAST a geçiş süreci nedeniyle EUCAST önerileri de aynı tabloda belirtilmiştir. Ancak katılımcı laboratuvar verilerini, UAMDSS tarafından belirtilene kadar CLSI sınır değerlerini dikkate alarak değerlendirmelidir Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae da ADT için SUP Disk Difüzyon Yöntemi Besiyeri: Mueller-Hinton Agar (MHA) İnokülum: McFarland 0.5 (Direkt koloni süspansiyonu) İnkübasyon: 35±2 C lik inkübatörde; ortam havasında; saat Kalite kontrol mikroorganizması: E. coli ATCC Disk difüzyon için 150 mm lik plakta maksimum 12; 100 mm lik plakta ise maksimum 5 disk test edilir. İnkübasyon sonrası disk etrafında üremenin tümüyle inhibe olduğu zonun çapı, disk çapını da içine alacak şekilde çıplak gözle ölçülür. Okuma, petri siyah bir zemin üzerinde tutularak ve yansıyan ışıkta yapılır. Ölçüm yapılırken zon kenarı olarak çıplak gözle herhangi bir üremenin görülmediği yer dikkate alınır. İnhibisyon zonu kenarında ancak lens ile bakıldığında görülebilen ince üremeler dikkate alınmaz. Trimetoprim ve sulfonamidlerle ilgili olarak besiyerindeki antagonistler hafif bir üremeye neden olabilir. Bu hafif üreme (esas üremenin %20 sini veya daha azını teşkil ediyorsa) değerlendirmeye alınmaz ve zon çapı üremenin belirgin olduğu bölgenin kenarı dikkate alınarak yapılır Genişlemiş Spektrumlu -laktamaz (GSBL) Saptama İzolat sefotaksim/seftriakson veya seftazidimden birine dirençli bulunuyorsa GSBL saptama testi yapılacaktır. Standart disk difüzyon yöntemi uygulanır. Antibiyotik diskleri: Seftazidim (30 g), seftazidim-klavulanik asit (30/10 g) ve sefotaksim (30 g), sefotaksim-klavulanik asit Değerlendirme: Klavulanik asitle kombine antimikrobiyal diskinin etrafındaki inhibisyon zonu, kombine olmayan diskin etrafındaki inhibisyon zonundan 5 mm daha büyükse izolat GSBL pozitiftir (Ör.: seftazidim zon çapı=16 mm, seftazidim-klavulonik asit zon çapı= 21 mm) *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 3

10 Escherichia coli ve K.pneumoniae için çalışma protokolü E.coli/ K.pneumoniae Aminopenisilin Aminoglikozid Florokinolon Sefalosporin Karbapenemler ampisilin ve amoksisilin/ klavulanik asit ve piperasilin/ tazobaktam gentamisin ve amikasin ve tobramisin a siprofloksasin ve ofloksasin a ve levofloksasin a sefoksitin ve sefotaksim b / seftriakson b ve seftazidim b İmipenem ve meropenem ve ertapenem a TMP-SXT b Duyarlı değil ise GSBL saptanması a tobramisin, ofloksasin, levofloksasin, ertapenem eğer çalışılıyorsa bildirilecektir. b sefotaksim ya da seftriakson kullanılabilir. İzolat sefotaksim/seftriakson veya seftazidimden birine dirençli bulunuyorsa GSBL saptama testi yapılacaktır. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 4

11 Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Tablosu Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae antimikrobiyal duyarlılık testinde kullanılacak antimikrobiyaller, disk difüzyon ve MİK değerlendirmeleri ve kategorileri Tablo 2. de verilmiştir. Tablo CLSI 2014 M100-S24 e göre düzenlenmekle birlikte EUCAST e geçiş süreci nedeniyle EUCAST deki disk içeriği ve duyarlılık sınır değerlerindeki farklılıklar tabloda parentez içinde belirtilmiştir. Bunu, duyarlılık test sonuçlarını okuma ve yorumlamada dikkat edilecek hususlar izlemektedir. Tablo 2. Antimikrobiyal Disk ug Zon çapı sınır değerleri (mm) MİK ug/ml S I R S I R Penisilinler Ampisilin veya amoksisilin Amoksisilin-klavulonik asit Piperasilin/tazobaktam (14) a ( 14) ( 8) /4 16/8 32/ (30-6) b (20) ( 17) 16/4 (1) 32/4-64/4 128/4 ( 4) Sefalosporinler Sefoksitin Sefotaksim c 30 (5) (20) ( 17) 1 (1) 2 4 ( 8) Seftriakson d (23) ( 20) 1 (1) 2 4 ( 2) Seftazidim e (22) ( 19) 4 (1) 8 16 ( 4) Karbapenemler İmipenem 10 Meropenem 10 Ertapenem (22) 23 (22) 22 (25) ( 16) 19 ( 16) 18 ( 22) 1 (2) 2 4 ( 8) 1 (2) 2 4 ( 8) 0.5(0.5) 1 2 ( 1) Aminoglikozitler Gentamisin (2) 8 16 ( 4) Tobramisin f (2) 8 16 ( 4) Amikasin (8) ( 16) Florokinolonlar Siprofloksasin 5 21 (22) ( 19) Ofloksasin g - (0.5) - (22) - - ( 19) Levofloksasin h - (0.5) - (22) - - ( 19) Folat inhibitor 1 (0.5) 2 4 ( 1) 0.12 (0.5) 0.12 (0.5) Trim./sulfametak (13) 2/38(2) ( 1) ( 1) a EUCAST da CLSI dan farklılık gösteren sınır değerleri parantez içinde belirtilmiştir. b EUCAST da CLSI dan farklılık gösteren disk içerikleri parantez içinde belirtilmiştir. c,d,e İzolat sefotaksim/seftriakson veya seftazidimden birine dirençli bulunuyorsa GSBL saptama testi yapılacak. f,g,h Katılımcı laboratuvar bu antibiyotikleri eğer çalışıyorsa bildirecek. 4/76 ( 4) *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 5

12 Sonuç Bildiriminde ve Yorumlu Sonuç Okumada Önemli Hususlar 1. Hastane ve toplum kaynaklı enfeksiyonların ayrımını kolaylaştırmak için (48 saat kuralı) laboratuvarlar hastanın yatış tarihini mutlaka belirtmelidir. 2. Katılımcı laboratuvarlar, test sonuçlarını verirken duyarlı (S)/ orta dirençli (I)/ dirençli (R) yorumunu her zaman yapmalı, sonucu zon çapı veya MİK değeri ile birlikte vermelidir. Hem disk difüzyon hem MİK çalışılıyorsa MİK değeri verilmelidir. 3. Tablo 2. esas olarak CLSI ye göre düzenlenmiş olup EUCAST da farklılık (disk içeriği, sınır değerleri açısından) gösterenler bilgilendirme amacıyla parentez içinde verilmiştir. 4. Sonuçlar değerlendirilirken Bölüm 3. de Enterobacteriaceae ile ilgili doğal direnç ve beklenmedik direnç fenotipi tabloları incelenmeli ve aykırı bir durum ile karşılaşıldığında test yenilenmeli aynı sonuç elde ediliyorsa konfirmasyon için izolat referans laboratuvarına gönderilmelidir. 5. Tablo 2. de belirtildiği üzere aminoglikozitler için amikasin ve gentamisin sonucu mutlaka verilmeli, çalışılıyorsa tobramisin sonucu da eklenmelidir. 6. Tablo 2. de belirtildiği üzere florokinolonlar için siprofloksasin sonucu mutlaka verilmeli çalışılıyorsa ofloksasin ve/veya levofloksasin sonucu da eklenmelidir. 7. İzolat sefotaksim, seftriakson veya seftazidimden birine dirençli bulunursa GSBL saptaması yapılmalıdır. GSBL saptamada kullanılacak yöntemler bu kitapçıkta yer almaktadır. GSBL üretimini laboratuvarda belirleme olanağı yoksa bu izolatlar referans laboratuvarına gönderilecektir. 8. Karbapenemlerden herhangi birine dirençli bulunan izolat hemen stoklanmalı ve mutlaka referans laboratuvara gönderilmelidir Pseudomonas aeruginosa ADT için SUP Disk Difüzyon Yöntemi Besiyeri: Mueller-Hinton Agar (MHA) İnokülum: McFarland 0.5 (Direkt koloni süspansiyonu) İnkübasyon: 35±2 C lik inkübatörde; ortam havasında; saat Kalite kontrol mikroorganizması: E. coli ATCC veya P. aeruginosa ATCC Disk difüzyon için 150 mm lik plakta maksimum 12; 100 mm lik plakta ise maksimum 5 disk test edilir. İnkübasyon sonrası disk etrafında üremenin tümüyle inhibe olduğu zonun çapı, disk çapını da içine alacak şekilde çıplak gözle ölçülür. Okuma, petri siyah bir zemin üzerinde tutularak ve yansıyan ışıkta yapılır. Ölçüm yapılırken zon kenarı olarak çıplak gözle herhangi bir üremenin görülmediği yer dikkate alınır. İnhibisyon zonu kenarında ancak lens ile bakıldığında görülebilen ince üremeler dikkate alınmaz. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 6

13 P. aeruginosa için çalışma protokolü P.aeruginosa Piperasilin ve Piperasilin/tazobaktam İmipenem ve Meropenem Amikasin ve Gentamisin ve Tobramisin a Kolistin (4 ve daha fazla grup antibiyotiğe dirençli ise çalışılacak) Seftazidim ve Sefepim Siprofloksasin ve Levofloksasin a a Tobramisin ve Levofloksasin eğer çalışılıyorsa bildirilecektir Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Tablosu Pseudomonas aeruginosa antimikrobiyal duyarlılık testinde kullanılacak antimikrobiyaller, disk difüzyon ve MİK değerlendirmeleri ve kategorileri Tablo 3. de verilmiştir. Tablo CLSI 2014 M100-S24 e göre düzenlenmekle birlikte EUCAST e geçiş süreci nedeniyle EUCAST deki disk içeriği ve duyarlılık sınır değerlerindeki farklılıklar tabloda parentez içinde belirtilmiştir. Bunu, duyarlılık test sonuçlarını okuma ve yorumlamada dikkat edilecek hususlar izlemektedir. Tablo 3 Antimikrobiyal Disk ug Zon çapı sınır değeri (mm) MİK ug/ml S I R S I R Penisilinler Piperasilin 100(30) a 21 (19) b ( 19) ( 16) Piperasilin/tazobaktam /4 32/4-128/4 21 (19) ( 19) (30-6) (16) 64/4 ( 16) Sefalosporinler Seftazidim 30 (10) 18 (16) ( 16) 8 (8) ( 8) Sefepim (18) ( 18) 8 (8) ( 8) Karbapenem İmipenem (20) ( 17) 2 (4) 4 8 ( 8) Meropenem (24) ( 18) 2 (2) 4 8 ( 8) Aminoglikozit Gentamisin ( 15) 4 (4) 8 16 ( 4) Tobramisin c (16) ( 16) 4 (4) 8 16 ( 4) Amikasin (18) ( 15) 16 (8) ( 16) Florokinolon Siprofloksasin 5 21 (25) ( 22) 1 (0.5) 2 4 ( 1) Levofloksasin d 5 (0.5) 17 (20) ( 17) 2 (1) 4 8 ( 2) Kolistin e 10 11(-) - 10 (-) 2(4) 4 8 (>4) a EUCAST da CLSI dan farklılık gösteren disk içerikleri parantez içinde belirtilmiştir. b EUCAST da CLSI dan farklılık gösteren sınır değerleri parantez içinde belirtilmiştir. c Katılımcı laboratuvar tobramisin çalışıyorsa sonucunu bildirecek. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 7

14 d Katılımcı laboratuvar levofloksasin çalışıyorsa sonucunu bildirecek. e İzolat dört veya daha fazla gruptan antibiyotiğe dirençli ise çalışılacak Sonuç Bildiriminde ve Yorumlu Sonuç Okumada Önemli Hususlar 1. Hastane ve toplum kaynaklı enfeksiyonların ayrımını kolaylaştırmak için (48 saat kuralı) laboratuvarlar hastanın yatış tarihini mutlaka belirtmelidir. 2. Katılımcı laboratuvarlar, test sonuçlarını verirken duyarlı (S)/ orta dirençli (I)/ dirençli (R) yorumunu her zaman yapmalı, sonucu zon çapı veya MİK değeri ile birlikte verilmelidir. Hem disk difüzyon hem MİK çalışılıyorsa MİK değeri verilmelidir. 3. Tablo 3. esas olarak CLSI a göre düzenlenmiş olup EUCAST da farklılık (disk içeriği, sınır değerleri açısından) gösterenler bilgilendirme amacıyla parentez içinde verilmiştir. 4. Sonuçlar değerlendirilirken Bölüm 3. de Pseudomonas aeruginosa ile ilgili doğal direnç ve beklenmedik direnç fenotipi tabloları incelenmeli ve aykırı bir durum ile karşılaşıldığında test yenilenmeli aynı sonuç elde ediliyorsa konfirmasyon için izolat referans laboratuvarına gönderilmelidir. 5. Tablo 3. de belirtildiği üzere aminoglikozitler için amikasin ve gentamisin sonucu mutlaka verilmeli çalışılıyorsa tobramisin sonucu da eklenmelidir. 6. Tablo 3. de belirtildiği üzere florokinolonlar için siprofloksasin sonucu mutlaka verilmeli çalışılıyorsa levofloksasin sonucu da eklenmelidir Acinetobacter baumannii ADT için SUP Disk Difüzyon Yöntemi Besiyeri: Mueller-Hinton Agar (MHA) İnokülum: McFarland 0.5 (Direkt koloni süspansiyonu) İnkübasyon: 35±2 C lik inkübatörde; ortam havasında; saat Kalite kontrol mikroorganizması: P. aeruginosa ATCC 27853, E. coli ATCC (tetrasiklin ve trimetoprim-sulfometoksazol), E.coli ATCC (βlaktam/β-laktamaz inhibitör kombinasyonları için) Disk difüzyon için 150 mm lik plakta maksimum 12; 100 mm lik plakta ise maksimum 5 disk test edilir. İnkübasyon sonrası disk etrafında üremenin tümüyle inhibe olduğu zonun çapı, disk çapını da içine alacak şekilde çıplak gözle ölçülür. Okuma, petri siyah bir zemin üzerinde tutularak ve yansıyan ışıkta yapılır. Ölçüm yapılırken zon kenarı olarak çıplak gözle herhangi bir üremenin görülmediği yer dikkate alınır. İnhibisyon zonu kenarında ancak lens ile bakıldığında görülebilen ince üremeler dikkate alınmaz. Trimetoprim ve sulfonamidlerle ilgili olarak besiyerindeki antagonistler hafif bir üremeye neden olabilir. Bu hafif üreme (esas üremenin %20 sini veya daha azını teşkil ediyorsa) değerlendirmeye alınmaz ve zon çapı üremenin belirgin olduğu bölgenin kenarı dikkate alınarak yapılır. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 8

15 A. baumannii için çalışma protokolü A. baumannii Piperasilin Ampisilin-sulbaktam Piperasilin-tazobaktam Doripenem a İmipenem Meropenem Siprofloksasilin Levofloksasilin c Tetrasiklin Trimetoprim/ Sulfometaksazol Kolistin Seftazidim Sefepim Sefotaksim Seftriakson Gentamisin Amikasin Tobramisin b a Doripenem, CLSI ve EUCAST ın 2014 versiyonlarına yeni olarak girmiştir. Katılımcı laboratuvar bu karbapenemi çalışıyorsa bildirecektir. b Katılımcı laboratuvar tobramisin çalışıyorsa sonucunu bildirecek. c Katılımcı laboratuvar levofloksasin çalışıyorsa sonucunu bildirecek Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Tablosu Acinetobacter baumannii antimikrobiyal duyarlılık testinde kullanılacak antimikrobiyaller, disk difüzyon ve MİK değerlendirmeleri ve kategorileri Tablo 4. de verilmiştir. Tablo CLSI 2014 M100-S24 e göre düzenlenmekle birlikte EUCAST e geçiş süreci nedeniyle EUCAST deki disk içeriği ve duyarlılık sınır değerlerindeki farklılıklar tabloda parentez içinde belirtilmiştir. Bunu, duyarlılık test sonuçlarını okuma ve yorumlamada dikkat edilecek hususlar izlemektedir. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 9

16 Tablo 4 Antimikrobiyal Disk ug Zon çapı sınır değeri (mm) MİK ug/ml S I R S I R Penisilinler Ampisilin-sulbaktam 10/10 (-) a 15 (IE) b 8/4 32/ (IE) 16/8 (IE) (IE) Piperasilin 100 (-) a 21 (IE) (IE) 16(IE) (IE) (-) a 16/4 32/4-128/4 Piperasilin/tazobaktam 21 (IE) (IE) (IE) 64/4 (IE) Sefalosporinler c Seftazidim Sefepim Sefotaksim Seftrikason Karbapenem Doripenem d (23) ( 20) 2 (1) 4 8 ( 2) İmipenem (23) ( 17) 2 (2) 4 8 ( 8) Meropenem (21) ( 15) 2 (2) 4 8 ( 8) Aminoglikozit Gentamisin (17) ( 17) 4 (4) 8 16 ( 4) Tobramisin e (17) ( 17) 4 (4) 8 16 ( 4) Amikasin (18) ( 15) 16 (8) ( 16) Florokinolon Siprofloksasin 5 21 (21) ( 21) 1 (1) 2 4 ( 1) Levofloksasin f 5 17 (21) ( 18) 2 (1) 4 8 ( 2) Tetrasiklin Tetrasiklin 30 (-) g Folat inhibitörleri Trim./sulfametak (16) (<13) 2/38(2) - 4/76 ( 4) Kolistin - e (2) 4 4 (>2) a,b EUCAST, CLSI dan farklı olarak ampisilin-sulbaktam, piperasilin ve piperasilin-tazobaktama karşı genellikle dirençli olması nedeniyle test edilmesini önermemektedir. IE; Insufficient evidence (bu ajanlarla tedaviye mikroorganizmanın iyi yanıt verdiğine dair yetersiz kanıt). c EUCAST, CLSI dan farklı olarak sefalosporinlerin test edilmesini önermemektedir. d Doripenem, CLSI ve EUCAST ın 2014 versiyonlarına yeni olarak girmiştir. Katılımcı laboratuvar bu karbapenemi çalışıyorsa bildirecektir. e Katılımcı laboratuvar tobramisin çalışıyorsa sonucunu bildirecek. f Katılımcı laboratuvar levofloksasin çalışıyorsa sonucunu bildirecek. g EUCAST, tetrasiklinle tedaviye mikroorganizmanın iyi yanıt verdiğine dair kanıtların yetersiz olması nedeniyle bu antimikrobiyalin test edilmesini önermemektedir. IE; Insufficient evidence Sonuç Bildiriminde ve Yorumlu Sonuç Okumada Önemli Hususlar 1. Hastane ve toplum kaynaklı enfeksiyonların ayrımını kolaylaştırmak için (48 saat kuralı) laboratuvarlar hastanın yatış tarihini mutlaka belirtmelidir. 2. Katılımcı laboratuvarlar, test sonuçlarını verirken duyarlı (S)/ orta dirençli (I)/ dirençli (R) yorumunu her zaman yapmalı, sonucu zon çapı veya MİK değeri ile birlikte verilmelidir. Hem disk difüzyon hem MİK çalışılıyorsa MİK değeri verilmelidir. 3. Tablo 4. esas olarak CLSI a göre düzenlenmiş olup EUCAST da farklılık (disk içeriği, sınır değerleri açısından) gösterenler bilgilendirme amacıyla *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 10

17 parentez içinde verilmiştir. 4. Sonuçlar değerlendirilirken Bölüm 4. de A. baumannii ile ilgili doğal direnç ve beklenmedik direnç fenotipi tabloları incelenmeli ve aykırı bir durum ile karşılaşıldığında test yenilenmeli aynı sonuç elde ediliyorsa konfirmasyon için izolat referans laboratuvarına gönderilmelidir. 5. Tablo 4. de belirtildiği üzere aminoglikozitler için amikasin ve gentamisin sonucu mutlaka verilmeli çalışılıyorsa tobramisin sonucu da eklenmelidir. 6. Tablo 4. de belirtildiği üzere florokinolonlar için siprofloksasin sonucu mutlaka verilmeli çalışılıyorsa levofloksasin sonucu da eklenmelidir Streptococcus pneumoniae ADT için SUP Disk Difüzyon Yöntemi Besiyeri: Mueller-Hinton Agar + %5 Koyun Kanı (KK-MHA) EUCAST: Mueller-Hinton Agar + %5 At Kanı + 20 mg/l -NAD (MH-F) İnokülum: McFarland 0.5 (Koyun kanlı agarda saat inkübasyon sonrası oluşan kolonilerden direkt koloni süspansiyonu). İnkübasyon: 35±2 C lik inkübatörde; %5 CO 2 li ortamda; saat. EUCAST da inkübasyon süresi 18 2 saat olarak belirtilmiştir. Kalite kontrol mikroorganizması: S. pneumoniae ATCC Disk difüzyon için 150 mm lik plakta maksimum 12; 100 mm lik plakta ise maksimum 5 disk test edilir. İnkübasyon sonrası disk etrafında üremenin tümüyle inhibe olduğu zonun çapı, disk çapını da içine alacak şekilde çıplak gözle ölçülür. Okuma, petri siyah bir zemin üzerinde tutularak ve yansıyan ışıkta yapılır. Ölçüm yapılırken zon kenarı olarak çıplak gözle herhangi bir üremenin görülmediği yer dikkate alınır. İnhibisyon zonu kenarında ancak lens ile bakıldığında görülebilen ince üremeler dikkate alınmaz. Trimetoprim ve sulfonamidlerle ilgili olarak besiyerindeki antagonistler hafif bir üremeye neden olabilir. Bu hafif üreme (esas üremenin %20 sini veya daha azını teşkil ediyorsa) değerlendirmeye alınmaz ve zon çapı üremenin belirgin olduğu bölgenin kenarı dikkate alınarak yapılır. İndüklenebilir Klindamisin Direnci Saptamada D-Zon Testi: Manuel disk difüzyon testi yapıyorsanız eritromisin ve klindamisin disklerini aşağıda belirtildiği şekilde agar üzerine yerleştirerek D-Zon testini de aynı zamanda yapmış olursunuz. Otomatize test kullanıyorsanız eritromisin dirençli klindamisine duyarlı bulunan izolatları agarda D-Zon testine alınız. Mueller-Hinton sıvı besiyerinde 0.5 McFarland bulanıklığında hazırlanan pnömokok süspansiyonları, % 5 koyun kanlı Mueller-Hinton agar veya EUCAST a göre Mueller-Hinton fastidious (MH-F) yüzeyine steril eküvyonla yayılır. Eritromisin (15 g) ve klindamisin (2 g) diskleri, birbirlerine uzaklıkları kenardan kenara 12 mm (EUCAST mm) olacak şekilde agar yüzeyine yerleştirilir ve plaklar %5 CO 2 li ortamda 35±2 C de saat inkübe edilir. Klindamisin diski etrafında oluşan inhibisyon zonu, eritromisin diskine bakan tarafta küntleşme gösteriyorsa bu fenotip indüklenebilir klindamisin direnci pozitif olarak değerlendirilir. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 11

18 Streptococcus pneumoniae için çalışma protokolü S.pneumoniae Oksasilin disk (1µg) Vankomisin Eritromisin Norfloksasin tarama b TMP-SXT Duyarlı değil D Zon testi Duyarlı değil Penisilin MİK Sefotaksim / Seftriakson ve Meropenem MİK a Klindamisin Siprofloksasin ve Ofloksasin ve Levofloksasin a Menenjit olgularında tedavide yeğlendiği için meropenem duyarlılığı çalışılması önerilir. Penisilin, ilave olarak sefotaksim, seftriakson, meropenem duyarlılığı için mutlaka MİK tayini yapılmalıdır. b Norfloksasin tarama testinde norfloksasine duyarlı bulunan izolatlar, levofloksasine duyarlı S ancak siprofloksasin (sokak tipi S. pneumoniae siprofloksasine orta-duyarlı olarak kategorize edilir) ve ofloksasine orta-duyarlı I olarak rapor edilir (EUCAST). Norfloksasin taramada R bulunan izolatlar levofloksasin duyarlılığı açısından ayrıca test edilmelidir Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Tablosu Streptococcus pneumoniae antimikrobiyal duyarlılık testinde kullanılacak antimikrobiyaller, disk difüzyon ve MİK değerlendirmeleri ve kategorileri Tablo 5. de verilmiştir. Tablo CLSI 2014 M100-S24 e göre düzenlenmekle birlikte EUCAST e geçiş süreci nedeniyle EUCAST deki disk içeriği ve duyarlılık sınır değerlerindeki farklılıklar tabloda parentez içinde belirtilmiştir. Bu bölümde ayrıca S. pneumoniae da beta-laktam direnç taramasıyla ilgili olarak EUCAST Version 3.1 den alınan bir tablo da eklenmiştir. Bunu, duyarlılık test sonuçlarını okuma ve yorumlamada dikkat edilecek hususlar izlemektedir. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 12

19 Tablo 5 Antimikrobiyal Disk ug Zon çapı sınır değeri (mm) MİK ug/ml S I R S I R Penisilinler: Menenjit dışı izolatlar için oksaslin zonu 20 mm veya MİK i 0.06 olan izolatlar, ampisilin, ampisilin-sulbaktam, amoksisilin, amoksisilin-klavulonik asit, sefaklor, sefdinir, sefditoren, sefepim, sefotaksim, sefpodoksim, sefprozil, seftarolin, seftizoksim, seftriakson, sefuroksim, imipenem, doripenem, ertapenem, meropenem ve oral ve parenteral penisilinlere DUYARLI dır. Oksasilin tarama 1 ug oksasilin 20 Oksasilin 20 mm olan izolatlarda mutlaka benzilpenisilin MİK tayini yap Penisilin parenteral (0.06) 4 8 ( 2) (menenjit dışı) a Penisilin parenteral (menenjit) b ( 0.06) Sefotaksim veya (0.5) 2 4 ( 2) seftriakson (menenjit dışı) c Sefotaksim veya seftriakson (menenjit) d ( 2) Karbapenem Meropenem ( 1) (menenjit) e Meropenem (menenjit dışı) f Makrolid Eritromisin (22) ( 19) ( 0.5) Linkozamid Klindamisin g ( 19) 0.25 (0.5) ( 0.5) Florokinolon Norfloksasin (10) ( 12) - (-) (-) (-) (-) tarama h Siprofloksasin i (5) ( 50) ( 16) ( 0.12) ( 2) Levofloksasin j (2) 4 8 ( 2) (17) Moksifloksasin k 5 18 (22) ( 17) ( 22) 1 (0.5) 2 4 ( 0.5) Folat inhibitör Trim./sulfamet (18) ( 15) 0.5/9.5 (1) 1/19-2/38 4/76 ( 2) Glikopeptid Vankomisin 30 (5) 17 (16) - - ( 16) 1 (2) - - ( 2) a,b,c,d,e,f Oksasilin taramada zon çapı 20 mm olan pnömokok izolatlarında mutlaka MİK tayini yapılmalıdır. BOS izolatları için penisilin + sefotaksim veya seftriakson veya meropenem MİK tayini mutlaka yapılmalıdır. g İndüklenebilir klindamisin direncini saptamak üzere D-zon testi yapılır. h,i,j Norfloksasin tarama testinde norfloksasine duyarlı bulunan izolatlar, levofloksasine duyarlı S ancak siprofloksasin (sokak tipi S. pneumoniae siprofloksasine orta-duyarlı olarak kategorize edilir) ve ofloksasine ortaduyarlı I olarak rapor edilir (EUCAST). Norfloksasin taramada R bulunan izolatlar levofloksasin duyarlılığı açısından ayrıca test edilmelidir. k Levofloksasine duyarlı ise moksifloksasine duyarlı olarak rapor edilebilir. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 13

20 Tablo 6. Pnömokoklarda -laktam direnci tarama (EUCAST) Oksasilin 1 g disk zon çapı Antimikrobiyal ajan İleri testler / Yorum 20 mm Tablo 4. de listelenen tüm beta-laktamlar Duyarlı S rapor et Benzil penisilin (menenjit) ve fenoksimetilpenisilinler (menenjit+menenjit MİK (E-test, sıvı dilüsyon) belirle ve sınır değerlerine göre rapor et 20 mm a dışı) Benzil penisilin (menenjit dışı) MİK (E-test, sıvı dilüsyon) belirle ve sınır değerlerine göre rapor et Diğer beta-laktam ajanlar MİK belirle a Oksasilin zon çapı 20 mm olan izolatlarda MİK belirlenmesi esastır. Ancak bu izolatlar sıklıkla bensilpenisiline dirençli çıkmaktadır. Dolayısıyla kliniğe erken penisilin duyarlılığı bildirimi yapmak üzere bu izolat hızla PENİSİLİN DİRENÇLİ olarak rapor edilmelidir. Diğer -laktamlar (ampisilin, amoksisilin, sefotaksim, seftriakson, sefepim) oksasilin zon çapı 8 mm ise izolat sıklıkla bu beta-laktamlara DUYARLI dır. Hızla bu şekilde rapor edilebilir. Ancak UAMDSS için MİK sonucu kategori bildiriniz Sonuç Bildiriminde ve Yorumlu Sonuç Okumada Önemli Hususlar Pnömokok için önemli notlar: 1. Oksasilin tarama: Oksasilin (1 g) disk zon çapı 20 mm. olan pnömokok izolatları penisiline duyarlı olup MİK leri 0.06 g/ml dir. Böyle izolatlar zon çapı belirtilmek koşuluyla penisiline, sefotaksim, seftriakson, meropeneme DUYARLI ( S ) olarak bildirilir. 2. Oksasilin zon çapı <20 mm. olan izolatlar için mutlaka penisilin + sefotaksim veya seftriakson veya meropenem MİK leri saptanarak duyarlılık sonucu verilmelidir. MİK belirlemede mikrodilüsyon, agar dilüsyon veya E-test kullanılabilir. Dilüsyon testleri kullanılıyorsa penisilin için sulandırım aralığı 0, g/ml; sefotaksim ve seftrikason için g/ml olmalıdır. 3. Menenjit olgularında BOS tan izole edilen pnömokoklar için penisilin + sefotaksim veya seftriakson veya meropenem duyarlılığını belirlemede mutlaka mikrodilüsyon, agar dilüsyon veya E-test kullanılmalıdır. 4. Florokinolon direncinde Norfloksasin Tarama testi: Florokinolon direncinin taraması için 10 g lık norfloksasin diskleri kullanılacaktır (EUCAST önerisi). Norfloksasin tarama testinde norfloksasine duyarlı S ( 12 mm) bulunan izolatlar, levofloksasine duyarlı S ancak siprofloksasin (sokak tipi S. pneumoniae siprofloksasine orta-duyarlı olarak kategorize edilir) ve ofloksasine orta-duyarlı I olarak rapor edilir (EUCAST). Norfloksasin taramada R ( 12 mm) bulunan izolatlar için levofloksasin/moksifloksasin duyarlılığı ayrıca test edilerek bildirilecektir. Norfloksasin ve siprofloksasine duyarlılık, düşük düzeyde direnci belirlemek amacı ile araştırılmaktadır. Sonuçlar klinisyenlere bildirilmez. Genel 5. Hastane ve toplum kaynaklı enfeksiyonların ayrımını kolaylaştırmak için (48 saat kuralı) laboratuvarlar hastanın yatış tarihini mutlaka belirtmelidir. 6. Katılımcı laboratuvarlar, test sonuçlarını veririken duyarlı (S)/ orta dirençli (I)/ dirençli (R) yorumunu her zaman yapmalı, sonucu zon çapı veya MİK değeri ile birlikte verilmelidir. Hem disk difüzyon hem MİK çalışılıyorsa MİK değeri verilmelidir. 7. Tablo 5. esas olarak CLSI ye göre düzenlenmiş olup EUCAST da farklılık (disk içeriği, sınır değerleri açısından) gösterenler bilgilendirme amacıyla parentez içinde verilmiştir. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 14

21 8. Sonuçlar değerlendirilirken Bölüm 3. de S. pneumoniae ile ilgili doğal direnç ve beklenmedik direnç fenotipi tabloları incelenmeli ve aykırı bir durum ile karşılaşıldığında test yenilenmeli aynı sonuç elde ediliyorsa konfirmasyon için izolat referans laboratuvarına gönderilmelidir Staphylococcus aureus ADT için SUP Disk Difüzyon Yöntemi ve Tarama Testleri Besiyeri: Mueller-Hinton Agar (MHA) İnokülum: McFarland 0.5 (Direkt koloni süspansiyonu) İnkübasyon: 35±2 C lik inkübatörde; ortam havasında; saat. Oksasilin ve vankomisin için 24 saat. Kalite kontrol mikroorganizması: S. aureus ATCC Disk difüzyon için 150 mm lik plakta maksimum 12; 100 mm lik plakta ise maksimum 5 disk test edilir. İnkübasyon sonrası disk etrafında üremenin tümüyle inhibe olduğu zonun çapı çıplak gözle ölçülür. Ölçüm yapılırken zon kenarı olarak çıplak gözle herhangi bir üremenin görülmediği yer dikkate alınır. İnhibisyon zonu kenarında ancak lens ile bakıldığında görülebilen ince üremeler dikkate alınmaz. Trimetoprim ve sulfonamidlerle ilgili olarak besiyerindeki antagonistler hafif bir üremeye neden olabilir. Bu hafif üreme (esas üremenin %20 sini veya daha azını teşkil ediyorsa) değerlendirmeye alınmaz ve zon çapı üremenin belirgin olduğu bölgenin kenarı dikkate alınarak yapılır. Duyarlılık değerlendirmesi, antibiyogram plağı geçirgen (transmitted) ışığa tutularak yapılmalıdır. Linezolid veya vankomisin için zon içi üreme direncin göstergesidir. Staphylococcus aureus da metisilin direncini saptamada sefoksitin tarama testini, vankomisin e azalmış duyarlılık (VISA) saptamada agar tarama yöntemini, indüklenebilir klindamisin direncini saptamada D-Zon yöntemini kullanınız. D-Zon testi için manuel disk difüzyon testi yapıyorsanız eritromisin ve klindamisin disklerini aşağıda belirtildiği şekilde agar üzerine yerleştirerek D-Zon testini de aynı zamanda yapmış olursunuz. Otomatize test kullanıyorsanız eritromisin dirençli klindamisine duyarlı bulunan izolatları agarda D-Zon testine alınız. Sefoksitin Tarama Testi (meca denetimindeki metisilin direncini saptamada) meca denetimindeki oksasilin (metisilin) direncini saptamak üzere yapılır. Yukarıda belirtilen disk difüzyon yöntemi koşullarında yapılır (oksasilin için disk difüzyon testi yapılmaz, MİK belirlenmelidir). İnkübasyon sıcaklığı 35ºC yi aşmamalıdır. Sefoksitinle birlikte veya sadece oksasilin MİK (sıvı dilüsyon veya E-test) çalışan laboratuvarlar oksasilin sonuçlarını bildirmelidirler. Vankomisin MİK belirleme: Vankomisin duyarlılığını saptamada mutlaka MİK tayini yapılmalıdır. E-test veya otomatize sistemler kullanılabilir. MİK i 2 g/ml olan izolatlar referans laboratuvarına gönderilmelidir. Vankomisine Azalmış Duyarlılık (VISA) Tarama Testi: S. aureus ta vankomisine azalmış duyarlılık (VISA), E-test ile veya agar tarama testi ile saptanır. Katılımcı laboratuvar izolatın VISA olup olmadığını *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 15

22 belirlemek zorundadır. VISA saptamak üzere ancak zorunlu durumlarda izolatlar referans laboratuvarına gönderilebilir. Agar Tarama Yöntemi: Besiyeri: Brain-Heart Infusion agar Vankomisin konsantrasyonu: 6 g/ml. İnokülum: 0.5 McFarland (direkt koloni süspansiyonu) İnkübasyon: 35±2 C lik inkübatörde; ortam havasında; 24 saat. Agar yüzeyine izolatın 0.5 Mc Farland süspansiyonundan 10 L spot ekim yapılır. 1 koloni veya ince film tarzında üreme vankomisine azalmış duyarlılık olduğunun göstergesidir. Bu izolat da vankomisin MİK değeri (E-test veya sıvı dilüsyon) belirlenir. Vankomisin MİK i 2 g/ml bulunan izolatlar doğrulama için mutlaka refarans laboratuvarına gönderilmelidir. İndüklenebilir Klindamisin Direnci Saptamada D-Zon Yöntemi: Mueller-Hinton sıvı besiyerinde 0.5 McFarland bulanıklığında hazırlanan S. aureus süspansiyonları, Mueller-Hinton agar yüzeyine steril eküvyonla yayılır. Eritromisin (15 g) ve klindamisin (2 g) diskleri, birbirlerine uzaklıkları kenardan kenara mm olacak şekilde agar yüzeyine yerleştirilir ve plaklar %5 CO 2 li ortamda 35±2 C de saat inkübe edilir. Klindamisin diski etrafında oluşan inhibisyon zonu, eritromisin diskine bakan tarafta küntleşme gösteriyorsa bu fenotip indüklenebilir klindamisin direnci pozitif olarak değerlendirilir. Florokinolon direncinde Norfloksasin Tarama testi: Florokinolon direncinin taraması için 10 g lık norfloksasin diskleri kullanılarak tarama testi yapılabilir (EUCAST önerisi). Katılımcı laboratuvar eğer norfloksasin tarama testi çalışıyorsa ve izolatı norfloksasine duyarlı S ( 17 mm) buluyorsa bu izolat, siprofloksasin, levofloksasin, moksifloksasin ve ofloksasin DUYARLI ( S ) olarak rapor edilir. Norfloksasin taramada R ( 17 mm) bulunan izolatlar siprofloksasin ve çalışılıyorsa levofloksasin için ayrıca test edilir ve sonuç bildirilir. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 16

23 Staphylococcus aureus için çalışma protokolü S.aureus Penisilin 10Ü Sefoksitin disk difüzyon veya Oksasilin MİK veya agar tarama testi Duyarlı-değil Doğrulama testleri: 1. PCR meca geni veya 2. PBP2a aglütinasyon veya 3. MİK oksasilin Vankomisin MİK Linezolid Eritromisin Norfloksasin tarama b D-Zon testi Trim./sulfamet. Klindamisin Dirençli ise Gentamisin ve Amikasin a Siprofloksasin ve Levofloksasin b a Amikasin zorunlu olmamakla birlikte çalışılıyorsa duyarlılık sonucu bildirilmelidir. b Norfloksasin tarama ve levofloksasin zorunlu olmamakla birlikte çalışılıyorsa duyarlılık sonucu bildirilmelidir. Siprofloksasin mutlaka çalışılmalıdır. Norfloksasilin tarama testinde norfloksasiline duyarlı bulunan izolatlar, siprofloksasine DUYARLI S olarak rapor edilebilir. Norfloksasine dirençli bulunduğu durumda siprofloksasilin ayrıca test edilmelidir. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 17

24 Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Tablosu Staphylococcus aureus antimikrobiyal duyarlılık testinde kullanılacak antimikrobiyaller, disk difüzyon ve MİK değerlendirmeleri ve kategorileri Tablo 7. de verilmiştir. Tablo CLSI 2014 M100-S24 e göre düzenlenmekle birlikte EUCAST e geçiş süreci nedeniyle EUCAST daki disk içeriği ve duyarlılık sınır değerlerindaki farklılıklar tabloda parentez içinde belirtilmiştir. Bunu, duyarlılık test sonuçlarını okuma ve yorumlamada dikkat edilecek hususlar izlemektedir. Tablo 7 Zon çapı sınır değeri (mm) MİK ug/ml Antimikrobiyal Disk ug S I R S I R Penisilinaz aktivitesine HASSAS PENİSİLİNLER: Penisiline duyarlı stafilokoklar aynı zamanda diğer stafilokokal aktiviteli -laktamlara da duyarlıdır. Penisiline dirençli stafilokoklar penisilinaz aktivitesine duyarlı penisilinlere (ampisilin, amoksisilin, azlosilin, karbenisilin, mezlosilin, piperasilin ve tikarsilin) dirençlidir. Benzilpenisilin diski etrafında oluşan inhibisyon zonunun kenarı keskin ise çapı 29 mm olsa bile izolat penisiline DİRENÇLİ R olarak rapor edilir. Benzilpenisilin diski etrafında oluşan inhibisyon zonunun kenarı net değil belirsiz ya da bulanık ise ve zon çapı 29 mm ise izolat penisiline DUYARLI S olarak rapor edilir Penisilin (benzilpenisilin) 10 ünite 29 (26) - 28 ( 26) 0.12 (0.12) ( 0.12) Penisilinaz aktivitesine DİRENÇLİ PENİSİLİNLER: Oksasilin veya sefoksitin sonuçları diğer penisilinaz dirençli penisilinlere (metsilin, nafsilin, kloksasilin, v.b.) uyarlanabilir. Sefoksitin veya oksasilin DUYARLI bulunan stafilokoklar -laktam/ -laktamaz inhibitör kombinasyonlarına oral sefemlere (sefaklor, sefdinir, sefpodoksim, sefprozil, sefuroksim, lorakarbef) Parenteral sefemlere (sefalosporin I, II, III, IV. kuşak) ve Karbapenemlere de DUYARLI dır. Sefoksitin veya oksasiline DİRENÇLİ bulunan stafilokoklar -laktam ajanların hepsine DİRENÇLİ dir (anti-mrsa aktiviteli yeni sefalosporinler hariç). Sefoksitin a (22) - 21 ( 22) 4-8 Oksasilin b ( 2) Glikopeptidler Vankomisin c ( 2) Makrolidler Eritromisin (21) ( 18) 0.5 (1) ( 2) Klindamisin d 2 21 (22) ( 19) 0.5 (0.25) ( 0.5) Oksazolidinon Linezolid e 30 (10) 21 (19) - 20 ( 19) 4 (4) - 8 ( 4) Aminoglikozit Gentamisin (18) ( 18) 4 (1) 8 16 ( 1) Amikasin e (18) ( 16) 16 (8) ( 16) Florokinolon Norfloksasin (10) 17 - ( 17) tarama f Siprofloksasin g 5 21 (20) ( 20) 1 (1) 2 4 ( 1) Levofloksasin h 5 19 (22) ( 19) 1 (1) 2 4 ( 2) Folat inhibitör Trim./sulfamet (17) ( 14) 2/38 (2) - 4/76 ( 4) a,b Sefoksitin sonucuna göre oksasilini duyarlı S ya da dirençli R olarak rapor et. c Stafilokoklarda vankomisin duyarlılığı mutlaka MİK yöntemi ile test edilmelidir. Vankomisin MİK i 2 g/ml bulunan tüm izolatlar doğrulanmak üzere referans laboratuvarına gönderilmelidir. d İndüklenebilir klindamisin direnci D-zon yöntemi ile test edilmelidir. e Amikasin zorunlu olmamakla birlikte çalışılıyorsa duyarlılık sonucu bildirilmelidir. f,g,h Norfloksasin tarama ve levofloksasin zorunlu olmamakla birlikte çalışılıyorsa duyarlılık sonucu bildirilmelidir. Siprofloksasin mutlaka çalışılmalıdır. Norfloksasin tarama testinde norfloksasin duyarlı bulunan izolatlar, siprofloksasin DUYARLI S olarak rapor edilebilir. Norfloksasin dirençli bulunduğu durumda siprofloksasin ayrıca test edilmelidir. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 18

25 Sonuç Bildiriminde ve Yorumlu Sonuç Okumada Önemli Hususlar Staphylococcus aureus için önemli notlar: 1. Benzilpenisilin direnci ( -laktamaz üretimine bağlı) belirleme ve değerlendirme: Penisiline duyarlı stafilokoklar aynı zamanda diğer antistafilokokal aktiviteli -laktamlara da (oksasilin, metisilin, v.b.) duyarlıdır. Penisiline dirençli stafilokoklar penisilinaz aktivitesine duyarlı penisilinlere (ampisilin, amoksisilin, azlosilin, karbenisilin, mezlosilin, piperasilin ve tikarsilin) DİRENÇLİ dir. Benzilpenisilin diski etrafında oluşan inhibisyon zonunun kenarı keskin ise çapı 29 mm olsa bile izolat penisiline DİRENÇLİ R olarak rapor edilir. Benzilpenisilin diski etrafında oluşan inhibisyon zonunun kenarı net değil belirsiz veya bulanık ise ve zon çapı 29 mm ise izolat penisiline DUYARLI S olarak rapor edilir 2. Metisilin direnci: Sefoksitin disk testinde dirençli bulunan izolatlar oksasilin dirençli olarak rapor edilir. Oksasilin MİK ine (sıvı dilüsyon, agar dilüsyon, E- test) bakan laboratuvarlar yöntemlerini belirtmek koşuluyla oksasilin sonuçlarını da bildirmelidir. 3. Oksasilin dirençli S. aureus (MRSA), diğer -laktam antibiyotiklere (penisilinler, -laktam/ -laktamaz inhibitör kombinasyonlarına, sefemlere (anti-mrsa aktiviteli sefalosporinler hariç) ve karbapenemlere DİRENÇLİ R olarak rapor edilir. 4. Vankomisine azalmış duyarlılık (VISA): Katılımcı laboratuarlar S. aureus ta vankomisine azalmış duyarlılık (VISA) olup olmadığını E-test ile veya agar tarama testi ile saptamakla yükümlüdür. Ancak zorunlu durumlarda VISA tayini için izolat referans laboratuvarına gönderilebilir. Agar tarama testi yapılıyorsa MİK i 2 g/ml olan izolatlar referans laboratuvarına gönderilmelidir. E-test kullanılıyorsa MİK değeri bildirilmelidir. 5. Linezolid veya vankomisin için zon içi üreme direncin/azalmış duyarlılığın göstergesidir. Genel 6. Hastane ve toplum kaynaklı enfeksiyonların ayrımını kolaylaştırmak için (48 saat kuralı) laboratuvarlar hastanın yatış tarihini mutlaka belirtmelidir. 7. Katılımcı laboratuvarlar, test sonuçlarını verirken duyarlı (S)/ orta dirençli (I)/ dirençli (R) yorumunu her zaman yapmalı, sonucu zon çapı veya MİK değeri ile birlikte verilmelidir. Hem disk difüzyon hem MİK çalışılıyorsa MİK değeri verilmelidir. 8. Tablo 7. esas olarak CLSI ye göre düzenlenmiş olup EUCAST da farklılık (disk içeriği, sınır değerleri açısından) gösterenler bilgilendirme amacıyla parentez içinde verilmiştir. 9. Sonuçlar değerlendirilirken Bölüm 3. de S. aureus ile ilgili doğal direnç ve beklenmedik direnç fenotipi tabloları incelenmeli ve aykırı bir durum ile karşılaşıldığında test yenilenmeli aynı sonuç elde ediliyorsa konfirmasyon için izolat referans laboratuvarına gönderilmelidir. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 19

26 2.7. Enterococcus faecium/faecalis Disk Difüzyon Yöntemi ve Tarama Testleri Besiyeri: Mueller-Hinton Agar (MHA) İnokülum: McFarland 0.5 (Direkt koloni süspansiyonu) İnkübasyon: 35±2 C lik inkübatörde; ortam havasında; saat. Vankomisin için tam 24 saat. Kalite kontrol mikroorganizması: S. aureus ATCC (EUCAST; Enterococcus faecalis ATCC 29212) Disk difüzyon için 150 mm lik plakta maksimum 12; 100 mm lik plakta ise maksimum 5 disk test edilir. İnkübasyon sonrası disk etrafında üremenin tümüyle inhibe olduğu zonun çapı çıplak gözle ölçülür. Ölçüm yapılırken zon kenarı olarak çıplak gözle herhangi bir üremenin görülmediği yer dikkate alınır. İnhibisyon zonu kenarında ancak lens ile bakıldığında görülebilen ince üremeler dikkate alınmaz. Duyarlılık değerlendirmesi, antibiyogram plağı geçirgen (transmitted) ışığa tutularak yapılmalıdır. Ancak vankomisin için inhibisyon zonu içindeki herhangi bir üreme DİRENCİN göstergesidir. Sefalosporinler, aminoglikozitler (yüksek düzey direnç tarama testi hariç) klindamisin ve trimetoprim-sulfametoksazol in vitro olarak enterokok türlerine karşı etkili görülebilirler ancak klinik olarak etkili değillerdir. Enterokok izolatları bu antibiyotiklere karşı DUYARLI olarak rapor edilmemelidirler. Enterokoklarda yüksek düzey aminoglikozit direnci araştırılması gerekmektedir. Enterokoklar aminoglikozitlere doğal olarak dirençli olmakla birlikte penisilin ve vankomisin ile sinerji gösterdiklerinden dolayı yüksek konsantrasyonlarda enterokoklara karşı etkili olabilirler. Bu yüzden enterokokların Yüksek Düzey (YD) aminoglikozit direnç durumlarının belirlenmesi gereklidir. Yüksek düzey aminoglikozit direnci varsa tedavide penisilinler veya vankomisinle sinerji sağlanamaz. Enterococcus faecium ve E. faecalis türlerinin bazı antibiyotikler için doğal direnç paternleri farklı olduğundan bakteri tanımlamada manuel yöntem kullanan laboratuvarlar tür ayırımlarını (Bkz. Bölüm 4 Bakteri Tanımlama SUP ları) yapmalıdır. Örneğin E. faecium ampisiline doğal olarak dirençli; E. faecalis değildir. E. faecalis eğer ampisiline duyarlı bulunursa imipeneme de duyarlıdır. Vankomisin Direnci ve MİK Belirleme: Enterokoklarda vankomisin disk difüzyonla test edilebilmektedir. Disk difüzyonla vankomisine R ya da I bulunan izolatlarda MİK tayini yapılmalı, bunlar yapılamıyorsa referans laboratuvara gönderilmelidir. *UAMDS Standart Uygulama Prosedürü Sayfa: 20