ARLAB VIII. HÜCRESEL, MOLEKÜLER ve ANALİTİK TEKNİKLER KURSU

Ebat: px
Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "ARLAB VIII. HÜCRESEL, MOLEKÜLER ve ANALİTİK TEKNİKLER KURSU"

Transkript

1 ARLAB VIII. HÜCRESEL, MOLEKÜLER ve ANALİTİK TEKNİKLER KURSU 4 Aralık 5 Aralık 2012 İzmir

2 VIII. ARLAB HÜCRESEL, MOLEKÜLER ve ANALİTİK TEKNİKLER KURSU DÜZENLEME Prof. Dr. Gül GÜNER AKDOĞAN, ARLAB Yöneticisi Yard. Doç. Dr. Zahide ÇAVDAR, ARLAB Koordinatörü Prof.Dr. Dr. Şermin GENÇ Yard.Doç. Dr. Mehtap YÜKSEL EĞRİLMEZ, PhD Memduh BÜLBÜL, PhD Uzm. Dr. Püreda YAZICI Oya SAYIN, PhD Kerim GÜNDÜZ, MSc Uğur TÜFEKCİ, MSc Duygu HARMANCI EĞİTİCİLER Prof. Dr. Cem Şeref BEDİZ Prof.Dr.Hüray İŞLEKEL Prof.Dr. Şermin GENÇ Yrd.Doç.Dr Zahide ÇAVDAR Yrd.Doç. Dr. Mehtap YÜKSEL EĞRİLMEZ, PhD Memduh BÜLBÜL, PhD Öğr. Gör. Dr. İlkay AKSU Uzm. Dr. Püreda YAZICI Oya Sayın, PhD Kerim GÜNDÜZ, MSc Uğur TÜFEKCİ, MSc Duygu HARMANCI 1

3 ARLAB VIII. HÜCRESEL, MOLEKÜLER ve ANALİTİK TEKNİKLER KURSU İÇİNDEKİLER Sayfa 1. Kurs Programı 3 2. Spektrofotometri 4 3. Spektroflorometri 7 4. PCR LORCA Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Protein Elektroforezi ve Western Blot Analizi Hücre Kültürü Çalışmaları Gaz Kromatografisi (GC-MS) Atomik Absorbsiyon Spektrofotometrisi 43 2

4 ARLAB VIII. HÜCRESEL, MOLEKÜLER ve ANALİTİK TEKNİKLER KURSU PROGRAM 1. Gün: 4 Aralık, Salı, Gün: 5 Aralık, Çarşamba, 2012 Saat Etkinlik Kursun Tanıtımı G. Güner Akdoğan Hücre Kültürü Çalışmaları M. Eğrilmez/U. Tüfekci Spektrofotometri M. Bülbül/D. Harmancı Saat Etkinlik HPLC M. Bülbül/D.Harmancı Gaz Kromatografisi (GC-MS) M. Bülbül PCR Ş. Genç/ U.Tüfekci LORCA C. Bediz/İ. Aksu Spektroflorometri H.İslekel /M.Bülbül Protein Elektroforezi ve Western Blot Analizi Z. Çavdar/O.Sayın Atomik Absorbsiyon Spektroskopisi M. Bülbül/D. Harmancı ARLAB ın İşleyişi Z.Çavdar Kurs Katılım Belgelerinin Dağıtılması, Geri Bildirim 3

5 Memduh Bülbül, PhD SPEKTROFOTOMETRİ I.GENEL BİLGİ: Spektroskopi, bir örnekteki atom, molekül veya iyonların, bir enerji düzeyinden diğerine geçişleri sırasında absorplanan veya yayılan elektromanyetik ışımanın ölçülmesi ve yorumlanmasıdır. Elektromanyetik ışınımın madde ile etkileşimi sonucu dalgalar kırılır ve yansır, saçılır, polarize olur, absorbsiyon ve emisyona uğrar. Absorplanan fotonların sayısı, ortamdaki absorpsiyon yapan türlerin sayısı ile orantılıdır. Monokromatik ve I0 şiddetinde ışık, ortamı daha küçük olan I şiddetinde terk eder. I çözelti tarafından absorplanamayan ışıktır. Lambert-Beer kanunu: Bir çözeltiden geçen ışık miktarı, ışığın çözelti içinde katettiği yol ve çözelti konsantrasyonu ile logaritmik olarak ters orantılı, emilen ışık miktarı ise doğru orantılıdır A= x Lx c A= Absorbans =Molar absorbtivite katsayısı c=konsantrasyon L= Işık yolu Spektrofotometre; görünür ( nm), ultraviole ( nm) dalga boylarında doğrudan veya başka bir madde ile reaksiyona sokulduktan sonra ışık absorbsiyonu yapabilen her tür maddenin ölçümünü yapabilen bir cihazdır. Bir spektrofotometre düzeneği, başlıca ışık kaynağı, dalga boyu seçicisi (monokromatör), dedektörden oluşur; dedektörde elektrik sinyaline çevrilen optik sinyal bir kaydedici veya bir galvanometre ile ölçülür. 4

6 Şekil 1: Spektrofotometrenin bileşenleri. Ana bileşenlere ek olarak spektrofotometrede ışığı toplamak, odaklamak, yansıtmak, iki demete bölmek, ve örnek üzerine belli bir şiddette göndermek amacıyla mercekler, aynalar, ışık bölücüleri, giriş ve çıkış aralıkları vardır. Örnek, kullanılan dalga boyu bölgesinde ışığı geçiren maddeden yapılmış örnek kaplarına (küvet) konularak ışık yoluna yerleştirilir. Spektrofotometre, değişik konsantrasyonlarda standartlar kullanılarak bilinmeyenin konsantrasyonunun analizinde, zamana bağlı absorbsiyon değişimini ölçerek reaksiyon hızlarının ölçümünde ve analizi yapılacak maddenin maksimum absorbans yaptığı dalga boyunu bulmak için absorbsiyon spektrumu alımında kullanılabilir. ARLAB ta bulunan VARIAN Carry 50 sabit sıcaklıkta çalışmayı sağlayan sirkülasyon banyosu kullanıldığında özellikle enzim ölçümleri için uygun özelliklere sahiptir. Ultraviyole (UV) ve görünür bölge spektrofotometresi, tüm spektrofotometrik teknikler içinde ucuz olması ve yaygın bulunması nedeniyle, biyolojik örneklerin analizinde, gıda analizlerinde, su analizlerinde, sanayi laboratuvarlarında çok sık kullanılır. Son yıllarda hızla gelişen teknoloji daha küçük hacimlerde ve bir çok örneğin bir arada ölçümünün yapılmasını sağlayan sistemler geliştirmiştir. ARLAB ta bulunan Synergy HT model Multiplak okuyucu Absorbans, Flouresans ve Limunesans ölçüm yapabilen son derece gelişmiş özelliklere sahiptir. Ayrıca spektorofotometreler, HPLC dedektörleri, Gaz kromatografi dedektörleri gibi diğer analiz cihazlarına uygulanarak başka tekniklerin gelişmesine öncü olmuştur. II. YÖNTEMİN UYGULAMA ALANLARI Biyolojik sıvılarda, hücre kültürü süpernatantı /nükleer ekstraktında protein tayininde, Antioksidan-oksidan sistemde görevli enzimlerin aktivitelerinin incelenmesinde, Moleküldeki karakteristik gruplar yardımıyla saf bir maddenin yapısı hakkında bilgi verebilir. 5

7 Uygulamamızda spektrofotometre yardımıyla protein ölçümü gerçekleştirilecektir. I. LOWRY PROTEİN ÖLÇÜM YÖNTEMİ Lowry yöntemi ile protein ölçümü iki reaksiyonu kapsamaktadır. Birincisi klasik Biüre reaksiyonudur, alkali ortamda bakır iyonlarının protein peptid bağları ile oluşturdukları kompleksleri kapsar. İkinci reaksiyon ise, proteinlerdeki aromatik amino asidlerin (tirozin ve triptofan) yine bakır iyonları ile oluşturdukları reaksiyonlardır. İki reaksiyon kombine olarak mikrogram düzeyinde protein ölçümüne olanak tanımaktadır. Oluşan renkli bileşik, spektrofotometrik olarak ölçülmektedir. II. Araç ve Gereçler Spektrofotometre, Çözeltiler: 1. A Reaktifi (%2 NaCO3, %0.4 NaOH, %0.16 Na-tartarat, %1 SDS): 20 g sodyum karbonat, 4 g sodyum hidroksit, 1.6 g sodyum tartarat ve 10 g sodyum dodesil sülfat ayrı ayrı küçük kaplarda çözülür. Azar azar birbirlerine katılarak karıştırılır ve hacim saf su ile 1 L ye tamamlanır. 2. B Reaktifi (%4 CuSO4.5H2O): 1 g bakır sülfat az miktar saf suda çözülür, hacim 25 ml ye tamamlanır. 3. C Reaktifi: Kullanılmadan önce A ve B reaktifleri 100:1 oranında karıştırılarak taze olarak hazırlanır. 4. Folin Reaktifi: 2 N ticari Folin-Ciocalteau reaktifi, saf su ile 1:1 oranında seyreltilerek kullanılır. 5. Protein Standart Çözeltisi: Sığır serum albumini (BSA) kullanılarak saf su ile g/ml konsantrasyonlarda standart çözeltiler hazırlanır. III. Uygulama Basamakları Örnek ve standart tüplerine 1 ml protein çözeltisi (konsantre örnekler için daha küçük hacimde protein çözeltileri alınıp hacim saf su ile 1 ml ye tamamlanabilir) ve standart çözeltiler, kör tüpüne de 1 ml saf su koyulur. Tüm tüplere 3 ml C reaktifi eklenir. Oda sıcaklığında 30 dakika bekletilir. Tüm tüplere 300 L Folin reaktifi vortekslenerek eklenir. Oda sıcaklığında 45 dakika bekletilir. Absorbanslar 660 nm de köre karşı okunur. Protein miktarları standart grafiğinden hesaplanır. IV. Kaynak Markwell MAK, Hass SM, Bieber LL, Tolbert NE. A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in the membrane and lipoprotein samples. Anal Biochem, 1978; 87:

8 Prof. Dr. Hüray İŞLEKEL Memduh Bülbül, PhD SPEKTROFLOROMETRİ I. GENEL BİLGİ: Floresan bir maddeye ışık çarpınca, ışık enerjisi atomun bazı elektronları tarafından soğurulur (absorblanır). Işığı absorblayan elektronlar daha yüksek bir enerji düzeyine geçerler (eksitasyon durumu). Bu enerji düzeyinde çok kısa süre kalan elektronlar yeniden daha düşük enerji düzeyine dönerken elektron enerjinin bir kısmını ışıma (emisyon) şeklinde geri verirler. Ancak elektron, orijinal enerjinin bir kısmını absorbladığı için elektron tarafından geri verilen enerji (emisyon) daha düşük düzeyde ve daha uzun dalga boyundadır; bu nedenle floresan maddelerin absorbladığı ilk renk ve yaydığı renk birbirinden farklıdır. Spektroflorometri bir atom ya da iyona ait elektronun yüksek (uyarılmış) enerji düzeyinden daha düşük bir enerji düzeyine geçerken ısı oluşturmadan oluşturduğu ışımanın (emisyonun) değerlendirilmesine dayalı bir analitik ölçüm yöntemidir. Spektroflorometri yöntemi kullanılarak doğal olarak floresan moleküller (intrensek floroforlar - Aromatik gruplu amino asitler (Phe, Tyr, Trp) Nukleik asitlerin purin pirimidin bazları, bazı koenzimler (NAD, FAD vb...) ölçülebilir; ya da çalışma sırasında sisteme ilave edilen floresan moleküller (ekstrensek floroforlar- 1-anilino-8-naftelen sulfonat (ANS), dansil klorid, etidium bromid, aminometil kumarin (AMC) vb..) ile floresan olmayan maddelerin ölçümü de gerçekleştirilebilir. Duyarlılık, özgüllük, seçicilik ve tek bir örnekteki birden fazla floresan yapan madde miktarının belirlenmesine olanak sağlaması açısından spektrofotometriden daha üstün bir analitik yöntemdir. Cihaz bileşenleri:(şekil 1) 1. Eksitasyon kaynağı: Xenon arc lambası. UV, Vis, yakın IR ( nm) bölgesinde ışıma yapar. 2. Eksitasyon monokromatörü: Kaynaktan gelen ışından belirli dalga boyundakini alır veya belirli dalga boyu aralığındakini alarak eksitasyon ışığını ayırır. Fazla ışık almak için geniş aralıklı yapılır. 3.Küvet: Cam ya da quarts dört yandan geçirgen 4.Emisyon monokromatörü:mutlaka ışık kaynağı ile dik açılı olmalıdır. Önceden belirlenmiş dalga boylarındaki emisyona uğramış ışınları ayırır. 5.Dedektör: (Photomultiplier) Floresansın şiddetini ölçer 6.Kaydedici 7.Referans Photomultiplier: (Her zaman olmayabilir) IV. YÖNTEMİN UYGULAMA ALANLARI 1.Intrensek floroforlar:doğal olarak floresan veren maddeler Aromatik gruplu amino asitler (Phe, Tyr, Trp) Nukleik asitlerin purin pirimidin bazları (A, G, C, T) Bazı koenzimler (NAD, FAD) 7

9 İntrensek floresanslar ile protein konformasyonel değişiklikleri, enzimlerin aktif bölge ve koenzimleri çalışılabilir. 2. Ekstrensek floroforlar (probe): Çalışma sırasında sisteme ilave edilen floresan moleküllerdir anilino-8-naftelen sulfonat (ANS), dansil klorid, floescein daha çok biyokimyasal sistemlerde Etidium bromid (Çift sarmallı DNA ile), proflavin, akridin nükleik asit çalışmalarında Aminometil kumarin (AMC) peptidaz aktivite ölçümlerinde kullanılır. Şekil 1: Spektroflorometre şeması V. KAYNAKLAR 1.. Burtis C.A., Ashwood E.R. Bruns. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostic,Saunders Comp. 2006, Philadelphia 2. Spectroflourometer (Schımadzu RF 5301) Cihaz manueli

10 Uzm.Dr. Püreda Yazıcı Kursumuzda örnek olarak florofor özelliği olan naftalin (C10 H8) ölçümü spektroflorometri yardımıyla gerçekleştirilecektir. Naftalin suda çözünmez. Etanol (1gr/13 ml etanol veya metanol), benzen (1gr/3,5 ml benzen veya toluen), karbontetraklorür (1gr/2ml karbontetraklorür) veya karbondisülfit ile (1gr/1,2 ml karbondisülfit) çözünür. II. ARAÇ VE GEREÇLER Spektroflorometri Çözeltiler Stok naftalin çözeltisi (20 µg naftalin/600µl Etanol ) Standart naftalin çözeltisi aşağıdaki gibi hazırlanır: 33.2 µg naftalin/1000 µl Etanol 16.6 µg naftalin/1000 µl Etanol 8.3 µg naftalin/1000 µl Etanol 4.15 µg naftalin/1000 µl Etanol III. UYGULAMA BASAMAKLARI Cihaz açılır (Schimadzu RF 5301). Xenon lambanın ısınması için 30 dk beklenir. Scan mode seçilir. Naftalin çözeltisinin optimum eksitasyon ve emisyon dalga boyları bulunur. Quantitive mode seçilir. Parametre menüsünden naftalin için uygun olan eksitasyon ve emisyon dalga boyları seçilir. Küvete etanol konarak cihaz sıfırlanır. Sırasıyla standartlar küvete konur ve I (intensite) okunur. Standart kalibrasyon eğrisi oluşturulur. Standart kalibrasyon eğrisinden yararlanılarak (x ekseni=naftalin konsantrasyonu, y ekseni=intensite )bilinmeyen örnekteki naftalin konsantrasyonu belirlenir. 9

11 Prof. Dr. Şermin GENÇ I. GENEL BİLGİ: POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU Laboratuvar ortamında spesifik DNA dizilerinin; primer denilen sentetik oligonükleotid diziler yardımıyla çoğaltılması işlemidir. PCR metodu ilk kez K.Mullis tarafından (1987) tanımlanmıştır. PCR Basamakları: Tipik bir PCR üç temel basamakta gerçekleşir: 1. Denatürasyon: İlk aşamada DNA molekülünün çift zincirli yapısı yüksek ısı yardımıyla birbirinden ayrılır(denatürasyon).çoğunlukla 94 C- 97 C arasında sn süresince uygulanır. İlk denatürasyon tek döngü olarak 5-15 dakika olarak uygulanır. 2. Annealing (Bağlanma): Denatürasyonu takiben daha düşük ısılarda oligonükleotid primerler, ayrılmış olan tek zincirli DNA üzerinde kendilerine özgül bölgelere bağlanırlar. Bu olay çoğunlukla 47 C- 60 C arasında sn de gerçekleşir 3. Elongasyon (uzama): Uzama aşamasında ısı 72 C ye kadar arttırılarak DNA polimeraz enziminin tamamlayıcı DNA zincirini uzatması sağlanır. Elongasyon basamağının süresi kullanılan polimerazın cinsine ve amplifiye edilecek DNA nın uzunluğuna göre değişir. PCR ın bu üç basamağının her tekrarında DNA miktarı teorik olarak iki katına çıkar. Oluşan ürün; ilk koyulan DNA miktarı ve döngü sayısına bağlıdır. PCR Çeşitleri: 1. MULTİPLEX PCR: Klasik veya Real-time PCR ın modifikasyonuyla iki veya daha fazla farklı PCR amplifikasyonunun aynı reaksiyonda gerçekleştirilmesine dayanır. Klasik PCR ile aynı basamaklarda gerçekleşir fakat her bir reaksiyonda çoklu primer setleri kullanılır. Multiplex PCR ile daha az zamanda daha çok hedef bölge amplifikasyonu gerçekleştirildiğinden kullanışlı bir inceleme yöntemidir. 2. Reverse Transcription (RT)-PCR: RNA hedef dizilerinin amplifikasyonu amacıyla kullanılır. Bu PCR çeşidinde bir reverse transkriptaz enzimi ve DNA primeri kullanılır. Bu sayede kalıp RNA dizisi cdna ya dönüştürülür. 3. NESTED PCR: Ekspresyon miktarı düşük mrna nın özgül çoğaltılmasında kullanılan bir PCR çeşididir. Bu PCR da iki çift primer 10

12 kullanılır ve iki PCR yapılır. İlk PCR ürünü ikinci PCR da kalıp olarak kullanılır. PCR Ürününün Analizi 1. Beklenen ürünün elde edilip edilmediğini anlayabilmek için her örnekten bir miktar alınıp agaroz jelde yürütülerek bantlar kontrol edilmelidir. 2. Elde edilen ürünün spesifikliğini doğrulamak amacıyla; kesim noktası bilinen bir endonukleaz ile kesilip, tekrar elektroforez yaparak oluşan bant uzunluklarını kontrol edilir. 3. Alternatif olarak PCR ürününü bir filtreye transfer edip amplifikasyonu yapılan diziden oluşturulmuş primerler ile hibridizasyonu kontrol edilebilir. 4. Real-time PCR: Başlangıç miktarına göre oluşan, son PCR ürününün kantitasyonunun özgün, hassas ve diğer metodlara göre daha kolay tespit edilebildiği bir yöntemdir. Real-time PCR de oluşan fragmentin uzunluğu araştırılamaz, böylelikle DNA ve cdna ayrımı yapılamaz. Real-time PCR bizi klasik PCR sonrası yapılması zorunlu jel elektroforez gibi diğer değerlendirme çalışmalarından da kurtarır. Real-time PCR sisteminin temelini floresan taşıyıcı moleküllerinin ışınımlarının tespiti ve miktarının belirlenmesi oluşturur. Sinyal artışı PCR ürün artışıyla direkt orantılıdır. DNA amplifikasyonunu belirlemek için değişik floresan sistemler kullanılır. II. ARAÇ VE GEREÇLER: Real-time PCR aleti Mikropipetler ve pipet uçları Kapiller PCR tüpleri SYBR Green kiti Primer cdna III. UYGULAMA BASAMAKLARI: 1. Master miks hazırlanması: Her bir örnek için 10.5 µl distile su, 100 pmol konsantrasyondaki primerlerin her birinden 0.25 µl ve 4 µl SYBR Green master miskinden konulur. Master miks pipetle karıştırılır. 2. Kapiller PCR tüplerine 15 µl master miks ten konur. Üzerine 5 µl cdna eklenir. 3. Kapiller PCR tüpleri santrifüj sonrası PCR aletine yerleştirilir. 4. Uygun PCR programı ya seçilir ya da yeniden girilir. 5. PCR bittikten sonra uygun analiz programı seçilerek analiz tamamlanır. 11

13 IV. YÖNTEMİN UYGULAMA ALANLARI 1. Mutasyonların belirlenmesi 2. Edinsel hastalıklarda tanı (AIDS, Hepatit) 3. Genetik yapının belirlenmesi: Biyolojik değişkenlik, adli olgular 4. Genlerin mutasyona uğratılması 5. Hücre ya da dokuda mrna kantitasyonu V. KAYNAKLAR 1. Molecular Neuroscience. Patricia Revest & Alan Longstaff, BIOS Scientific Publishers, Oxford, PCR A Practical Approach. M.J. McPherson & P. Quirke & G.R. Taylor, Oxford University Pres, Oxford, Human Molecular Genetics 3. Tom Strachan & Andrew P. Read, Garland Publishing, Manchester,

14 Prof. Dr. Cem Şeref BEDİZ Öğr. Gör. Dr. İlkay AKSU ERİTROSİT DEFORMABİLİTESİ VE AGREGASYONUNUN ÖLÇÜLMESİ I.GENEL BİLGİ Hemoreoloji nedir? Canlı organizma içinde kanın, kan hücrelerinin ve damarların işlevlerini ve birbirleriyle olan etkileşimlerini inceler. Kan hücreleri bir fiziksel kuvvete maruz kaldıklarında (örneğin akış hızı) şekil ve davranış değişikliklerine uğrarlar. Kanın akışkanlığını etkileyen bu ve benzeri durumları incelemek hemoreolojinin konusudur. Dokulara ihtiyacı olan oksijen ve besinleri ulaştıran dolaşım sistemi dokularla olan alışverişini mikrodolaşım olarak tanımlanan kapillerler aracılığıyla yapar. Mikrodolaşım alanlarında kan akımının yeterliliğini etkileyen faktörler dokunun oksijen alışverişini de doğrudan etkilerler. Kapillerlerle taşınan oksijenin miktarı kandaki oksihemoglobin miktarı ile doğru orantılı iken kanın akışkanlığını belirleyen kan viskozitesi ile ters orantılıdır. Normal durumda kanın viskozitesini içerdiği hücre kütlesi (eritrositler) belirler. Eritrositlerin küçük çaplı damarlardan geçebilmek için deforme olurlar (şekil değiştirebilme). Ayrıca düşük akım bölgelerinde agregat oluştururlar. Deformabilite ve agregasyon davranışları viskoziteyi etkileyen çok önemli özelliklerdir. Hemoreolojik koşulların bozulması doku düzeyinde hipoksilere yol açabilir. Birçok hastalıklarda eritrosit deformabilite ve agregasyon özelliklerinden biri veya her ikisinin işleyişinde bozulma meydana gelmektedir. Bu da dokuların mikrodolaşımlarını olumsuz etkilemektedir. Hemoreolojik ölçümler nelerdir? Tam kanın viskozitesi, plazma viskozitesi, hematokrit, eritrositlerin deformabilite (şekil değiştirebilme) yeteneği ve agregasyon özellikleri ölçülür. II. ARAÇ VE GEREÇLER Deformabilite ve Agregasyon ölçüm tekniği nedir? Vücudun farklı bölgelerinde kanın akış kapasitesini değerlendirmek için bu eritrosit özelliklerinin doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlayabilen tekniklere ihtiyaç vardır. Bu tekniklerden biri Laser optical rotational cell analyser LORCA dır. LORCA araştırma merkezlerinin hemoreoloji laboratuarları, hematoloji bölümleri, yoğun bakım üniteleri için önemli bir araçtır. Bir cam kupa içine daldırılmış bir statik metal silindirden oluşur. Cam kupanın döndürülmesiyle, silindir ile kupa arasındaki çok dar aralıkta sıvılar için basit bir kayma stresi yaratılır. Kayma stresi = kayma hızı x ortam viskozitesi τ = η x γ τ = Kayma stresi (Pa) η = viskozite (mpa.sn) γ = Kayma hızı (1/sn) Kupanın dönüş hızı ve sıvının konduğu aralık verileri kullanılarak kayma hızı hesaplanır. İstenen kayma hızı bilgisayar yardımı ile uygulanabilir. 13

15 Kayma hızı (Shear rate): γ = [(4π x Rb x Rc) / (60 x (Rc2-Rb2))] x N γ = kayma hızı (1/sn) Rb = Silindirin çapı (mm) Rc = Kupanın çapı (mm) N= Kupanın dönme hızı (dönüş/dk) Aralıktaki kana değişik kayma stresleri uygulanarak bir lazer ışını yardımıyla eritrositlerin görüntüleri saptanarak bilgisayarda deformabiliteleri veya agregasyonları hesaplanır. III. UYGULAMA BASAMAKLARI DEFORMABİLİTE ÖLÇÜMÜ EDTA lı kandan alınan küçük bir örnek 30 mpa.sn viskozitedeki PVP solüsyonunda dilüe edilir. Bu süspansiyon kupa ile silindir arasına konur. Ortam sıcaklığı 37 o C ye getirilir. Bilgisayar kontrollü olarak Pa arasında kayma stresleri uygulanır. Kayma stresi altında eritrositler şekil değiştirir (elongasyon). Kan süspansiyonunun içinden geçen lazer ışınları eritrositler tarafından kısmen kırılır. Eritrositlerin kırdıkları ışınlara göre, projeksiyon ekranında eritrositlere ait bir yansıma oluşur. Bu yansımaları kaydeden bir kamera verileri bilgisayara aktarır. Bilgisayar bu yansıma verilerine uyan en iyi elipsi çizdirir. Bu elipsin uzun ve kısa çapları ölçülerek eritrositlerin elongasyon indeksleri (EI) hesaplanır. EI = (A-B)/(A+B) Seçilen her kayma stresi için ayrı ayrı EI hesaplanır. Her strese eritrositlerin verdiği şekil değiştirme cevabı ölçülmüş olur. AGREGASYON ÖLÇÜMÜ Agregasyon ölçümünde tam kanın yeterince oksijenlenmiş olması gerekir. 2-4 ml kan içinde 40 ml hava bulunan bir tüpe konarak en az 15 dakika yuvarlanma şeklinde hareket ettirilir (rollerbank). Tam kan örneği silindir ile kupa arasındaki aralığa konur. Kupa döndürülerek farklı kayma stresleri uygulanır. İn-vitro ölçümlerde eritrositlerin agregasyon ve disagregasyon durumları kayma hızına bağlıdır. Normal insan kanında yüksek kayma hızlarında bütün hücreler dağılır ve deforme olur. Düşük kayma hızlarında veya stazda ise agregatlar oluşur (Rouleaux formasyonu). Lazer ışını ile eritrositlerdeki bu kümelenmeler görüntülenir ve bilgisayarda farklı kayma hızlarında elde edilen cevaplar işlenir. Eritrositlerden yansıyan veriler Syllectometry = Silektometri ile değerlendirilir. Silektometri eritrosit eagregasyonunu çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntemde kana kayma stresi uygulanır. Bunun sonucunda hücreler kayma yönünde deforme olurlar. Bu sırada eritrositlerden arkaya yansıyan lazer ışınları gözlenmektedir. Dönüş aniden durdurulduğunda arkaya saçılan ışığın değişimi ölçülür. Arkaya saçılan ışık şiddetinin zamana göre değişiminin kaydı ve çizdirilmesine Silektogram denir. Bu grafikte görülen yüksek şiddet piki hücrelerin orijinal bikonkav şekillerine dönüş noktası olarak kabul edilir. Agregasyon oluştukça arkaya saçılan ışık miktarında azalma olur. Bu silektogramdan elde edilen matematiksel hesaplamalar eritrosit agregabilitesini gösteren agregasyon parametreleri olarak kullanılır. 14

16 IV. YÖNTEMİN UYGULAMA ALANLARI Arteryel Hipertansiyon Stoeff S, Vretenarska M, Stojanova N, Halacheva S, Jovtchev S, Tsaneva M, On the interrelationships between erythrocyte aggregation, plasma viscosity and the total peripheral resistance in arterial hypertension.clin Hemorheol Microcirc. 2004;30(3-4): Ateroskleroz, Miyokard Enfarktüsü Zeltser D, Rogowski O, Berliner S, Mardi T, Justo D, Serov J, Rozenblat M, Avitzour D Sex differences in the expression of haemorheological determinants in individuals with atherothrombotic risk factors and in apparently healthy people. Heart Mar;90(3): Venöz Hastalıklar Khodabandehlou T, Boisseau MR, Le Devehat C. Blood rheology as a marker of venous hypertension in patients with venous disease.clin Hemorheol Microcirc. 2004;30(3-4): Alt E, Banyai S, Banyai M, Koppensteiner R. Blood rheology in deep venous thrombosis--relation to persistent and transient risk factors. Thromb Res Aug 15;107(3-4): Diyabetes Mellitus ve Diyabetik Komplikasyonlar Pargalava N, Mantskava M, McHedlishvili G. Regional and systemic hemorheological disorders during feet diabetic gangrene. Clin Hemorheol Microcirc. 2004;30(3-4): Kanser von Tempelhoff GF, Heilmann L, Pollow K, Hommel G. Monitoring of rheologic variables during postoperative high-dose brachytherapy for uterine cancer. Clin Appl Thromb Hemost Jul;10(3): Spor/Egzersiz Varlet-Marie E, Brun JF. Reciprocal relationships between blood lactate and hemorheology in 15

17 athletes: another hemorheologic paradox?clin Hemorheol Microcirc. 2004;30(3-4): Kadın Doğum Robins JB, Woodward M, Lowe G, McCaul P, Cheyne H, Walker JJ. First trimester maternal blood rheology and pregnancy induced hypertension. J Obstet Gynaecol Nov;25(8): Travma, Yoğun Bakım, Anestezi Tatarishvili J, Momtselidze N, McHedlishvili G. Blood rheological abnormalities in the microcirculation during experimental traumatic shock.clin Hemorheol Microcirc. 2004;30(3-4): Kline JA, Wells PS. Methodology for a rapid protocol to rule out pulmonary embolism in the emergency department. Ann Emerg Med Aug;42(2): Review.. Obesite, Hiperlipidemi, Dislipidemi Sola E, Vaya A, Contreras T, Falco C, Corella D, Hernandez A, Aznar J. Effect of a hypocaloric diet on lipids and rheological profile in subjects with severe and morbid obesity. A follow-up study. Clin Hemorheol Microcirc. 2004;30(3-4): Hematoloji Kwaan HC, Wang J. Hyperviscosity in polycythemia vera and other red cell abnormalities. Semin Thromb Hemost Oct;29(5): Review. Adar T, Ben-Ami R, Elstein D, Zimran A, Berliner S, Yedgar S, Barshtein G. Aggregation of red blood cells in patients with Gaucher disease. Br J Haematol Aug;134(4): Epub 2006 Jul 10. Enfeksiyon Hastalıkları Pino P, Vouldoukis I, Kolb JP, Mahmoudi N, Desportes-Livage I, Bricaire F, Danis M, Plasmodium falciparum--infected erythrocyte adhesion induces caspase activation and apoptosis in human endothelial cells.j Infect Dis Apr 15;187(8): Epub 2003 Apr 02. Kim A, Dadgostar H, Holland GN, Wenby R, Yu F, Terry BG, Meiselman HJ. 16

18 Hemorheologic abnormalities associated with HIV infection: altered erythrocyte aggregation and deformability. Invest Ophthalmol Vis Sci Sep;47(9): Serebrovasküler ve Nörolojik Hastalıklar Beridze M, Momtselidze N, Shakarishvili R, McHedlishvili G. Effect of nitric oxide initial blood levels on erythrocyte aggregability during 12 hours from ischemic stroke onset. Clin Hemorheol Microcirc. 2004;30(3-4): Nefroloji Scott Brimble K, McFarlane A, Winegard N, Crowther M, Churchill DN. Effect of chronic kidney disease on red blood cell rheology.clin Hemorheol Microcirc. 2006;34(3): V. KAYNAKLAR 1- Stoltz J.F., Singh M., Riha P. Hemorheology in practice. IOS Pres, 1999, Amsterdam. 2- LORCA Laser assisted optical rotational cell analyser Version 2.1: User Manual. Academic Medical Center Pres, 2004, Amsterdam. 3- Chasis J.A., Mohandas N. Erythrocyte membrane deformability and stability: two distinct membrane properties that independently regulated by skeletal protein association. J Cell Biol :(2); Hardeman MR, Dobbe JG, Ince C. The Laser-assisted Optical Rotational Cell Analyzer (LORCA) as red blood cell aggregometer. Clin Hemorheol Microcirc. 2001;25(1):

19 Memduh BÜLBÜL, PhD Araş.Gör.Duygu HARMANCI YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ (HPLC) I. GENEL BİLGİ Son yirmi yıl içinde kromatografide kaydedilen gelişmeler, küçük miktarlardaki analitlerin hızlı, tekrarlanabilir ve doğru analiz edilebilmesi amacıyla kromatografik tekniklere klinik laboratuarlarda kullanım alanı açmıştır. Kromatografi, bir karışımda bulunan iki veya daha fazla sayıdaki bileşeni, bu bileşenlerin birbiri ile karışmayan iki faz arasındaki dağılım özelliklerindeki farklılıktan yararlanarak ayıran bir grup ayırma işlemini temsil eden kollektif bir terimdir. Fazlardan biri olan hareketli faz (mobil), çözücüyü içerir ve çözünmüş madde karışımını diğer faz olan sabit faz (stasyoner) arasında taşır. Kromatografik yöntemler, hareketli fazın sıvılardan gazlara, sabit fazın ise selüloz kağıt tabakalardan saç teli kadar ince kapiller cam tüplere dek değiştiği çok sayıda tekniği içerir. Bilimsel literatür incelendiğinde, hem yayınlanan kromatografik yöntemlerin sayısının hem de bunların uygulamalarının üssel olarak arttığı görülmektedir. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi ( HPLC), en yaygın olarak kullanılan analitik tekniklerden bir tanesidir. HPLC, bir karışımdaki bileşenlerin ayrılmasında sıvı hareketli fazı kullanır. Bu bileşenler, ilk olarak çözgende çözünürleştirilir ve daha sonra yüksek basınç altında kromatografi kolonundan geçmeye zorlanırlar. Modern sıvı kromatografisinin temel kriterinin basınç olduğu düşünülmekteydi ve bu nedenle yüksek basınçlı sıvı kromatografi olarak adlandırılmaktaydı. Yüksek performans sadece basıncın değil bir çok faktörün birleşmesiyle oluşturulduğundan günümüzde yüksek performanslı sıvı kromatografi adlandırılması kullanılmaktadır. HPLC nin diğer klasik tekniklere göre kıyaslaması yapıldığında; küçük boyutlu paslanmaz çelik kolonların kullanılması, partikül boyutları çok küçük matrikslerin kullanılması, yüksek iç basınç ve kontrollü akış hızı sağlanabilmesi, örnek gereksinimlerinin az olması, sürekli akış detektörleri ile küçük miktarların analizine imkan tanıması, otomasyona uygun olması, hızlı analiz imkanı ve yüksek ayırma gücüne sahip olmaları nedeniyle çok yönlü uygulamalara daha açık olduğu görülmektedir. Bu nedenlerden ötürü HPLC, popüler ve güçlü bir teknik olarak gelişimini sürdürmektedir. HPLC cihazının bileşenleri, hareketli faz rezervuarı, pompa, enjektör, kolon, detektör ve kaydedici sistemlerinden oluşur. Sistemin kalbi ayırmanın gerçekleştirildiği kolondur. Sabit faz mikrometre boyutlu poröz partiküllerden oluşur, bu nedenle hareketli fazın kolondan geçişi için yüksek basınç pompalarına ihtiyaç vardır. Kromatografik süreç, kolona örneğin 18

20 enjeksiyonu ile başlar. Bileşenlerin ayrılması analit ve hareketli fazın kolona pompalanmasıyla devam eder.ayrılarak elüe olan her bir bileşenin pikleri kaydedilir. Elüe olan bileşenlerin deteksiyonu çok önemlidir. Her bir bileşen için alınan detektör cevabı bir kaydedici veya bilgisayar ekranında kromatogram olarak görüntülenir. Kromatografik verilerin toplanması, saklanması ve analizi; bilgisayarlar, integratörler ve diğer veri işlemcileri kullanılarak yapılır. detektör pompa enjektör kolon mobil faz bilgi işlemci Şekil 1: HPLC cihazının bileşenleri II. ARAÇ VE GEREÇLER HPLC İLE MDA ANALİZİ Lipid peroksidasyonu, serbest radikaller tarafından doku hasarına yol açan moleküler süreçlerden biridir ve diğer oksidatif süreçlerle birlikte pek çok patolojik olaylardan sorumlu tutulmaktadır 19

21 Lipid peroksidasyonunun değerlendirilmesi, kimyasal ürünler olarak, konjuge dienler, etan, pentan, hidroperoksid ve malondialdehid gibi ürünlerin ölçülmesi ile, yöntem olarak ise spektroflorometri, spektrofotometri, gaz kromatografisi ve yüksek verimli sıvı kromatografisi (HPLC) ile gerçekleştirilebilir. Bu çeşitlilik içinde en çok kullanılan son ürün, tiyobarbiturik asid (TBA) reaksiyonu ile renkli kompleksler veren MDA dır. MDA nın TBA ile verdiği reaksiyon, görünür bölgede renk oluşturan, 2 mol TBA nın 1 mol MDA ile oluşturduğu bir kompleksle sonuçlanır. Oluşan renkli kompleks, 532 nm de görünür ışık absorbsiyonu veya ex 532/em 553 nm de spektroflorometrik olarak kantite edilebilmektedir. Kimyasal maddeler ve su Tiyobarbitürik asid (TBA), 1,1,3,3-teraetoksi propan (TEP), butillenmiş hidroksi toluen (BHT), K2HPO4,KH2PO4, NaOH ve sodyum dodesilsülfat (SDS) diğer maddeler ve solventler HPLC çalışmalarına uygun yüksek saflık derecesinde Sigma ve Fluka ürünlerinden oluşmaktadır. Tüm reaktif, çözelti ve mobil faz hazırlanmasında 18.2 Mohm HPLC kalite saf su (USF Elga, Maxima) kullanıldı. HPLC cihazının konfigürasyonu Kullanılan cihaz Shimadzu- VP serisi HPLC sistemidir. Cihaz, LC-10ADVP (pompa), SCL 10AVP (sistem kontrol ünitesi), RF-10AXL (Floresan detektör), SPD-10AVP (UV-VIS dedektör), SIL-10ADVP (oto enjektör), CTO-10ASVP (kolon fırını), bileşenlerinden oluşmaktadır. HPLC koşulları(kolon özellikleri ve cihaz ayarları) Kolon;150-4,6 mm, C (Macherey-Nagel) Mobil faz; 10 mm, %30 metanol içeren fosfat tampon (ph 7) kullanıldı. Mobil fazın akış hızı;0,8 ml/ dakika, Enjeksiyon hacmi 5 L Kolon fırnı sıcaklığı;30 C Foresan detektör dalga boyu:eksitasyon 515nm/Emisyon 553 nm 20

22 III. UYGULAMA BASAMAKLARI Örneklerin hazırlanması Doku veya sıvı örnek Saf su BHT SDS TBA 95 C de 60 dakika Ekstraksiyon Buz üzerinde soğutma Saf su + Butanol + Piridin Vorteks Üst faz Santrifügasyon Organik faz HPLC cihazına enjeksiyon Şekil 2: UV ve floresan detektörle elde edilen MDA kromatogramları 21

23 IV. YÖNTEMİN UYGULAMA ALANLARI Nörotransmitterler Amino asidler Nukleik asit Katekolaminler ve metabolitleri Adrenalin Noradrenalin Dopamin HVMA GABA Arginin Glutamat Aspartat Tirozin Fenilalanin Adenozin İnozin Hipoksantin Ksantin 6-Tiyoguanozin Purin 5-HT, 5-HIAA Taurin Pirimidin Tiramin Ornitin Floropirimidin Asetilkolin Metabolik ürünler Oksidatif stres Antioksidanlar ve Kreatin Ürik asid Askorbat Flavanoidler 4-hidroksinonenal Malondialdehid Vitamin E İmidazoller Kumarinler İlaçlar ve diyetsel bileşenler İzoprenalin Kafein KAYNAKLAR 1. Uchida K. 4-Hydroxy-2-nonenal: a product and mediator of oxidative stress. Prog Lipid Res 2003; 42: Siems W, Quast S, Carluccio F, Wiswedel I, Hirsch D, Augustin W, Hampi H, Riehle M, Sommerburg O. Oxidative stress in chronic renal failure as a cardiovascular risk factor. Clin Nephrol 2002; 58 Suppl 1: S Slatter DA, Bolton CH, Bailey AJ. The importance of lipid-derived malondialdehyde in diabetes mellitus. Diabetologia 2000; 43: Everett SM, Singh R, Leuratti C, White KLM, Neville P, Greenwood D, Marnett LJ, Schorah CJ, Forman D, Shuker D, Axon ATR. Levels of malondialdehyde-deoxyguanosine in gastric mucosa: Relationship with lipid peroxidation, ascorbic acid, and heliobacter pylori. Cancar Epidemiol Biomarkers Prev 2001; 10: Ercal N, Aykin-Burns N, Gurer-Orhan H, McDonald JM. Oxidative stress in phenylketonuria animal model. Free Radic Biol Med 2002; 32:

24 Yard.Doç Dr.Zahide ÇAVDAR Oya Sayın, PhD SDS POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ (SDS-PAGE) I. GENEL BİLGİ: Tüm proteinler kendilerine özgün ve genetik kodlama ile belirlenmiş bir amino asid dizilimine sahiptirler. Amino asid dizilimleri primer yapıyı oluştururken çözünür proteinlerin su molekülleri ile etkileşimleri sonucunda oluşan hidrojen bağları ve amino asidlerin hidrofilik bölümlerinin alfa-heliks düzenlenimi sekonder yapılarını oluşturmaktadır. Hidrojen bağları, hidrofobik amino asidler, Van der Waal s kuvvetleri ve disülfid bağları ile de proteinlerin tersiyer yapısı oluşmaktadır. Fonksiyonel proteinleri oluşturmak için polipeptid zincirleri birbirleri ile etkileşime girerek kuarterner yapı meydana gelmektedir. Tüm makromoleküllerin elektrik alanda ayırımı elektroforez olarak adlandırılmaktadır. Yüklü bir molekülün elektrik alanda göçünü ifade eden elektroforetik yöntemlerde molekülün göç hızı; elektrik alan şiddetine, molekülün üzerindeki net yüke, molekülün boyutuna, şekline, ortamın iyonik şiddetine, viskozitesine ve temperatürüne bağlıdır. SDS-PAGE proteinlerin sadece molekül büyüklüklerine bağlı olarak ayrımlanmasını sağlayan bir yöntemdir. Proteinlerin diğer fiziksel özelliklerinden etkilenmez. Bu nedenle proteinlerin öncelikle denature edilmesi; sekonder, tersiyer ve kuarterner yapılarına bağlı özelliklerinden arındırılması gerekmektedir. Denatüre edici ajan olarak kullanılan SDS (Sodyum Dodesil Sülfat) ve DTT veya 2-ME (ditiotreitol- 2-merkaptoetanol, disülfit köprülerini indirgeyici ajanlar) ile inkübe edilen proteinler; çözünürlük kazanmakta (özellikle membran proteinleri gibi hidrofobik proteinler), primer yapıları dışında tüm üç boyutlu yapılarını kaybetmektedirler. SDS in negatif yüklü sülfat iyonları ile sarılan proteinler molekül büyüklükleri ile orantılı olan bir negatif yüke sahip olmaktadırlar. Negatif yüklü moleküllerin tümü bir elektrik alana koyulduğunda pozitif yüke doğru negatif yük büyüklüklerine/molekül büyüklüklerine bağlı olarak göç edeceklerdir. Farklı büyüklüklükteki proteinlerin farklı hızlarda göç etmesini sağlayacak ortam ise akrilamid monomerlerinin polimerizasyonu ile oluşan poliakrilamid jelidir. Poliakrilamid jeli küçük kanallardan oluşan bir moleküler elek olarak görev görmektedir. Küçük molekül ağırlığına sahip olan moleküller uygulanan elektrik alanda poliakrilamidin oluşturduğu moleküler elek içinde daha hızlı hareket edebilirken, büyük moleküllerin hareketi daha yavaş olacaktır. Ancak molekül büyüklükleri birbirine yakın olan proteinlerin elektroforetik alanda göç hızları birbirine yakın olabilir bu durumda da bu proteinler tek bir band içinde bulunabilirler. Uygulanan elektrik akımının kesilmesi ile proteinlerin elektrik alanda göçü sonlandırılmaktadır. Kullanılan çeşitli boyalar (Coomasie Brillant Blue, Gümüş nitrat vb.) ile görüntülenmesi sağlanan proteinlerin molekül ağırlıklarına göre ayrımlanmaları ise kullanılan molekül ağırlığı standartları 23

25 ile belirlenmektedir. Sonuç olarak SDS-PAGE, moleküllerin sadece molekül ağırlıklarına bağımlı olarak ayrımlanmasını sağlayan bir yöntemdir. II. ARAÇ VE GEREÇLER Atto marka elektroforez sistemi (Sistem, AE-6220 Dual Slab Chamber elektroforez tankı, 2 adet Slab Gel Cast jel kalıbı, ikişer adet 1 mm lik cam, tarak ve conta, AE-8450 PowerStation 1000VC güç kaynağından oluşmaktadır). III. UYGULAMA BASAMAKLARI a. Eritrosit Membranı Elde Edilmesi b. Lowry Yöntemi İle Protein Ölçümü c. SDS-PAGE Jellerinin Hazırlanması Saf su Seçilen konsantrasyondaki ayırıcı jel için momomer karışımı, aşağıdaki tablo izlenerek hazırlanır. Ayırıcı (separating) Jel Hazırlanması: M Tris, ph 8.8 %5 %7 %10 %12 % ,7 ml ml 3.65 ml 3 M Tris-HCl, ph 8.8 1,25 ml 2,5 ml 2,5 ml 1.25 ml 1.25 ml %20 (w/v) SDS 0.05 ml 0,1 ml 0,1 ml 0.05 ml 0.05 ml Akrilamid/Bisakrilamid 1.15 ml 4,6 ml 6,6 ml 4.0 ml 5.0 ml (%29.2/%0.8 w/v) %10 (w/v) amonyum 0.05 ml 0,2 ml 0,2 ml 0.05 ml 0.05 ml persülfat TEMED ml 0.02 ml 0,02 ml ml ml Total monomer karışımı ml 20,12ml 20,12 ml ml ml Jel yüzeyi isopropanol ile kaplanır dakika polimerize olması için beklenir. Jel yüzeyindeki isopropanol dökülür. Paketleyici jel için monomer karışımı aşağıdaki tablo izlenerek hazırlanır. Paketleyici (stacking) Jel Hazırlanması: %4.0, M Tris, ph 6.8 Saf su 7.35 ml 1.5 M Tris-HCl, ph ml 20% (w/v) SDS 0.05 ml Akrilamid/Bis-akrilamid(%29.2/%0.8 w/v) 1.34 ml %10 (w/v) amonyum persülfat 0.1 ml TEMED 0.02 ml Toplam monomer karışımı ml Jel tarakları dikkatli bir biçimde polimerize olmamış karışım içine yerleştirilir. 24

26 Polimerizasyonun tamamlanması için dakika beklenir. d.örnek Hazırlanması Protein örnekleri L de yaklaşık g olacak biçimde, en az 1:4 oranında örnek tamponu ile karıştırılır. 95 C de 2-4 dakika (veya 100 C de 1 dakika ) tutulur. e. Elektroforetik Yürütme Örnek yüklendikten hemen sonra sistem kapatılır ve elektrodlar bağlanır. Örnekler ayırıcı jele girinceye kadar düşük akımda 100 V akım uygulanır. Örnek ayırıcı jele geçtikten sonra ise voltaj V çıkarılır. İlk denemelerde voltaj değişimleri izlenir ve not alınır. Brom fenol blue boyası jelin alt ucuna varınca akım kesilir ve jel tanktan uzaklaştırılır. f. Jellerin Coomassie Brilliant Blue (CBB) İle Boyanması Jel kaseti tanktan çıkarılır. Jel bir spatula yardımı ile kesetten çıkarılır. Çıkarılan jel önceden, içine yaklaşık 75 ml CBB boyası koyulmuş kapaklı bir kaba alınır. 4-5 saat (veya çalışmanın akışına göre gece boyunca da olabilir) boyada tutulur. Sürenin sonunda destainig çözeltisi içine alınır. Destaining çözeltisi zaman zaman değiştirilerek, işlem zemin tamamen şeffaflaşıncaya kadar devam ettirilir. g. Moleküler ağırlığın hesaplanması Molekül ağırlıkları bilinen standart proteinlerin Rf değerleri aşağıdaki şekilde hesaplanır: Rf=Protein göç uzaklığı /Ayırım jelinin uzaklığı Rf değerleri ve standart proteinlerin moleküler ağırlıkları log10 değerleri kullanılarak bir kalibrasyon eğrisi çizilir. Moleküler ağırlığının hesaplanılması istenen proteinin Rf değeri bu kalibrasyon eğrisine yerleştirilerek bulunur. 25

27 IV. YÖNTEMİN UYGULAMA ALANLARI SDS-PAGE yöntemi, proteinlerin saflaştırılmasının son aşaması olan saflık kontrolünde, molekül ağırlığının saptanmasında ve bir enzimin izomerlerinin saptanmasında kullanılmaktadır. V. KAYNAKLAR 1. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press New York, Principles and Techniques of Practical Biochemistry. K. Wilson and J. Walker, Cambridge University Press Cambridge, Current Protocols in Cell Biology. J.S. Bonifacino, M. Dasso, J. Lippincott-Schwartz, J.B. Harford, K.M. Yamada, John Wiley & Sons, Inc,

28 WESTERN BLOT ANALİZİ I. GENEL BİLGİ: SDS-PAGE heterojen bir protein karışımını ayrımlaştırmağı sağlamakla birlikte, bu karışımdaki proteinlerinden hedeflenen bir tanesini de çalışmak mümkündür. Bu amaçla proteinler istenilen amaca ve yönteme uygun şekilde jelde elektroforez edildikten sonra membrana transfer edilir. Bu yönteme Western blot analizi adı verilir. Membranlara transferde en çok kullanılan yöntem ise elektroblotlama dır. Elektroblotlama, elektroforetik olarak ayrılmış örneklerin elektrik alan altında mekanik olarak stabil bir membrana aktarılmasını sağlar. Elektroblotma nın diğer transfer yöntemlerine göre yüksek çözünürlük vermesi ve mikrogram seviyelerinde çalışmağa olanak vermesi gibi avantajları bulunmaktadır. Bu nedenle günümüzde en sık kullanılan transfer yöntemidir. Elektroblotlama, Wet (Islak) ve Semi-Dry (Yarı kuru) olmak üzere iki şekilde yapılabilir. Transferde nitrosellüloz veya polivinilidendiflorid (PVDF) membranları kullanılır. Yüksek bağlanma özelliği nedeni ile günümüzde PVDF daha çok tercih edilmektedir. Proteinlerin membrana transferi ortamın iyonik şiddetinden, SDS miktarından, metanol konsantrasyonundan ve membranın fiziksel parametrelerinden etkilenir. Proteinler membrana aktarıldıktan sonra membran üzerinde protein içermeyen bölgeler oluşur. Bu bölgeler spesifik olmayan bir protein (Bovin serum albumin, süt tozu) ile kaplanır. Membranda bulunan özel bir proteini belirlemek amacı ile genellikle prob antikorlar kullanılır. Membranda bulunan antijeni belirlemek için önce birincil antikor belirli bir dilüsyonda, membran ile inkübe edilir. Birincil antikorlar kendilerine özgü antijene bağlanır. Daha sonra bağlanmış antikorları belirlemek için membran reseptör bir grup (Ör: Horseradish peroksidaz, alkalin fosfotaz) içeren bir anti-immunoglobulin ile inkübe edilir. Bu anti-immunoglobulin enzim, ikincil antikor olarak adlandırılır. Son olarak uygun substrat eklenir ve ikincil antikorun ışıması sağlanarak röntgen filminde hedef proteinin tanımlanması sağlanır. Spesifik bağlanmanın gözlenmesinde kullanılan bu yönteme Enhanced Chemiluminescence (ECL) adı verilir. II. ARAÇ VE GEREÇLER Atto marka elektroforez sistemi (Sistem, AE-6220 Dual Slab Chamber elektroforez tankı, 2 adet Slab Gel Cast jel kalıbı, ikişer adet 1 mm lik cam, tarak ve conta, AE-8450 PowerStation 1000VC güç kaynağından oluşmaktadır). Atto marka elektroblotting sistemi (AE-6675 HorizBlot) 27

29 III. UYGULAMA BASAMAKLARI a. Doku veya Hücre Ekstraktı Hazırlanması b. Lowry Yöntemi İle Protein Ölçümü (Bkz. SDS-PAGE uygulama rehberi) c. SDS-PAGE Jellerinin Hazırlanması (Bkz. SDS-PAGE uygulama rehberi) d.örnek Hazırlanması (Bkz. SDS-PAGE uygulama rehberi) e. Elektroforetik Yürütme (Bkz. SDS-PAGE uygulama rehberi) f. Semi-Dry Transfer Transferde kullanılacak membran metanol ile doyurulur. 3MM filtre kağıtları transfer tamponu ile ıslatılır. 2 adet 3MM filtre kağıdı en alta yerleştirilir, üzerine membran konulur. Membran üzerine jel yerleştirildikten sonra diğer iki 3MM filtre kağıtları konulur. Bu aşamalar sırasında arada hava kabarcığı kalmamasına dikkat edilir. Kapaklar kapatıldıktan sonra 15 V ta 50 dk. transfer gerçekleştirilir. g. Bloklama Transfer sonrası proteinleri bağlanmış olan membran 1.5 saat %5 lik süt tozu ve %0.1 lik Tween 20 içeren PBS çözeltisi (bloklama çözeltisi) içinde çalkalamağa bırakılır. Bu süre sonunda membran 3 kez %0.1 lik Tween 20 içeren PBS çözeltisi ile 5 dk. süre ile yıkanır. h. Birincil antikor ile inkübasyon Membran bloklama çözeltisi içinde dilüe edilmiş birincil antikor ile inkübe edilir. İnkübasyon süresi her antikor için ayrı olarak belirlenmiştir. Bu süre sonunda membran 3 kez %0.1 lik Tween 20 içeren PBS çözeltisi ile 5 dk. süre ile yıkanır. i. İkincil antikor ile inkübasyon Membran bloklama çözeltisi içinde dilüe edilmiş horseradish peroksidaz bağlı ikincil antikor ile 1 saat oda sıcaklığında inkübe edilir. Bu süre sonunda membran 3 kez %0.1 lik Tween 20 içeren PBS çözeltisi ile 5 dk. süre ile yıkanır. j. ECL ile görüntüleme IV. YÖNTEMİN UYGULAMA ALANLARI Western blot analizi, bir protein karışımı içerisinde bulunan hedeflenen belirli bir proteinin varlığının saptanmasında kullanılmaktadır. Proteinler, membran (Ör: Reseptör), sitoplazmik (Ör: Sinyal ileti yollarında) ve nükleer (Ör: Transkripsiyon faktörleri) kaynaklı olabilir. Bu nedenle, bu analizde çok farklı kaynaklardan hazırlanan örnekler kullanılabilmektedir. 28

30 V. KAYNAKLAR 1. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press New York, Principles and Techniques of Practical Biochemistry. K. Wilson and J. Walker, Cambridge University Press Cambridge, Current Protocols in Cell Biology. J.S. Bonifacino, M. Dasso, J. Lippincott-Schwartz, J.B. Harford, K.M. Yamada, John Wiley & Sons, Inc,

31 Yard.Doç.Dr Mehtap YÜKSEL EĞRİLMEZ Araş.Gör.Uğur TÜFEKCİ I. GENEL BİLGİ HÜCRE KÜLTÜRÜ ÇALIŞMALARI PRİMER KÜLTÜRLER Primer kültürler eksize edilmiş normal hayvan ya da insan dokusundan eksplant bir kültür ya da enzim ile muamele sonrası elde edilen tek hücre süspansiyonundan kültüre edilir. Böyle kültürler başlangıçta heterojendir, fakat bir süre sonra fibroblastlar egemen duruma geçer. Primer kültürlerin hazırlanması yoğun emek gerektirir ve bu kültürler in vitro yalnızca sınırlı bir süre sürdürülebilir. Sınırlı yaşama süreleri sırasında primer hücreler hücrenin in vivo sahip olduğu çoğu farklılaşmış özelliklerini genellikle taşır. SÜREKLİ KÜLTÜRLER Sürekli kültürler kültürde sınırlı sayıda (yaklaşık 30) hücre bölünmesine uğrayan ya da süresiz yaşayan ve seri olarak pasajlanmış tek hücre tipinden oluşur. Sonlu yaşam süresi olan hücre hatları genellikle diploiddir ve bir miktar farklılaşmayı sürdürür. Böyle hücre hatları yaklaşık 30 bölünme döngüsünden sonra yaşlanır. Sürekli hücre hatları tümör hücrelerine transforme oldukları için sonsuz olarak sürdürülebilir. Tümör hücre hatları sık olarak gerçek klinik tümör materyallerinden türetilir. Fakat transformasyon viral onkogenler ya da kimyasal ajanlar kullanılarak da indüklenebilir. Transforme hücre hatlarının avantajı sınırsız sürdürülebilmeleridir. Fakat bu hücrelerin orijinal in vivo özelliklerinin çok azını taşımaları dezavantajdır. HÜCRE HATLARININ KAYNAKLARI Çok sayıda hücre hattı birbirine benzer görünür. Hücre hatlarının kaynağı çok farklıdır ve morfoloji ya da kültür özellikleri temelinde ayırtedilemeyen çok farklı biyolojik özellikleri vardır. Bir hücre hattının rastlantısal olarak virüs ya da mikoplazmayla enfeksiyonu ya da kontaminasyonu hücrelerin fonksiyonel özelliklerini değiştirebilir, fakat böyle bir kontaminasyon görünümle ayırtedilemez. Hücre hatlarının özellikleri kültür süresince de değişir. Bütün bunlara ek olarak çok yoğun bir hücre kültürü laboratuarında farklı hücre hatları arasında cross kontaminasyon ya da yanlış etiketleme de söz konusu olabilir. Bir hücre hattı ile çalışırken böyle bir istenemeyen hatanın yapılmasının sonuçları sınırsızdır. Kısa süreli çalışanların fazla olduğu, sürekli çalışan personeli sınırlı sayıda olan küçük bir hücre kültürü laboratuarı için hücre hatlarını yıllar boyunca değişmeden sürdürmek güç olacaktır. Bu nedenle yeni hücre hatlarının ECACC gibi büyük ve özelleşmiş kuruluşlardan sağlanması tavsiye edilir. KÜLTÜR MORFOLOJİSİ Morfolojik olarak hücre kültürleri tek tek hücreler ya da küçük yüzen kümeler biçiminde süspansiyon içinde olabilir ya da hücre kültür kabına yapışık olarak tek tabaka biçiminde gelişir. Bir hücre hattının kültürde 30

32 hangi biçimde gelişeceği köken aldığı dokuyu yansıtır. Kandan (lösemi, lenfoma) köken alan hücre hatları süspansiyonda gelişme eğilimindedir, oysa akciğer, böbrek gibi solid dokulardan köken alan hücre hatları tek tabaka biçiminde gelişme eğilimindedir. Hücre kültür kabına yapışarak üreyen hücre hatları endotelyal (HUVEC gibi), epitelyal (HeLa gibi), nöronal (SH- SY5Y gibi) ya da fibroblast (3T3 gibi) olabilir ve morfolojileri köken aldıkları doku alanını yansıtır. KÜLTÜR ORTAMI Kültürde hücreler steril çevre koşulları ve gelişim için besin desteğine gerek gösterir. Bunlara ek olarak çevre ph sı ve sıcaklığı da stabil olmalıdır. Son 30 yılda çeşitli tanımlanımış bazal kültür ortamları geliştirilmiştir ve ticari olarak bulunmaktadır. Başlangıçta tanımlanan dengeli tuz solüsyonları memeli kalp dokusunun kontraktilitesini sürdürmesi için kullanılmıştır ve Tyrode solüsyonu primer memeli hücreleriyle yapılan çalışmalarda kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Bu solüsyonlar o zamandan beri modifiye edilmiş ve amino asidler, vitaminler, yağ asidleri ve lipidlerle zenginleştirilmiştir. Sonuç olarak, bugün çok çeşitli hücre tiplerinin gelişimini destekleyen kültür ortamları ticari olarak bulunmaktadır. Kesin ortam formülasyonları sık olarak her bileşenin konsantrasyonunun optimizasyonuyla elde edilmiştir. KÜLTÜR ORTAMLARININ TEMEL BİLEŞENLERİ Her bileşenin özgül bir işlevi bulunmaktadır. - İnorganik tuzlar - Karbonhidratlar - Amino asidler - Vitaminler - Yağ asidleri ve lipidler - Proteinler ve peptidler - Serum TAMPONLAMA SİSTEMLERİ Hücrelerin çoğu arasında ph değerlerine gerek duyar ve ph nın sıkı kontrolü optimum kültür koşulları için gereklidir. Fibroblastlar daha yüksek ph değerlerini ( ) tercih eder, oysa sürekli transforme hücre hatları daha asidik koşullara ( ) gerek gösterir. ph nın regülasyonu özellikle yeni bir kültür kurulduğunda hücre ekiminin hemen ardından önemlidir ve iki tamponlama sistemiyle bu regülasyon sağlanabilir. 1. CO2/HCO3 - doğal tamponlama sistemini kullanan kültürlerin, %5-10 karbondioksid sağlanan karbondioksid sağlanan karbondioksid enkübatöründe sürdürülmesi gerekir. Bu tamponlama sistemi ucuzdur ve toksik değildir. 2. HEPES olarak adlandırılan bir zwitterion kullanılarak sağlanan kimyasal tamponlama arasında sıkı bir ph kontrolü sağlar. Fakat görece pahalıdır ve yüksek konsantrasyonlarda bazı tip hücreler için toksik olabilir. 31

33 HEPES ile tamponlanmış kültürler kontrollü gaz atmosferine gerek göstermez. Ticari kültür ortamlarının çoğu ph indikatörü olarak fenol red içerir. Böylece kültür ortamının ph sı renk değişimi gözlenerek izlenebilir. Renk sarıya (asid) ya da mora (alkali) dönmüşse kültür ortamı değiştirilmeli ya da tazelenmelidir. II. ARAÇ VE GEREÇLER LABORATUVAR TASARIMI Çoğu hücre kültürü çalışması özel olarak tasarlanmış ve bu çalışmalara ayrılmış hücre kültürü laboratuvarlarında yürütülmektedir. LAMİNER FLOW KABİNET Laminer flow kabinet hücre kültürü laboratuvarının belki de en öenmli donanımıdır. Çünkü uygun olarak kullanıldığında bu aygıt çalışılan ürün için temiz bir çalışma ortamı sağlar ve çalışanı zararlı aerosollerden korur. Bu kabinetlerde korunmayı High Efficiency Particulate Air (HEPA) filtreleri sağlamaktadır. Korunmanın derecesi kullanılan kabinetin sınıfına göre değişir. Çoğu hücre kültürü çalışması için sınıf II kabinetler yeterlidir. Kabinetin temizliği en az dört saat kabinetin içinde Tryptose Soya Broth agar plakları tutularak değerlendirilebilir. Bu süre içerisinde plaklarda bakteri ya da mantar üremesinin olmaması gerekir. SANTRİFÜJ Hücre kültürü laboratuvarlarında santrifüjler kültürlerin pasajlanması ve dondurma için hazırlanması işlemlerinde rutin olarak kullanılmaktadır. Santrifüj işlemi öncesinde tüplerin aşırı dolu olmamasına ve dengeli olmasına ve yerleştirilmesine dikkat edilmelidir. 32

34 ENKÜBATÖR Hücre kültürlerinin gelişmesi için sıkı bir biçimde kontrol edilen ortam koşullarına gerek vardır. Sıcaklık, nem derecesi ve karbondioksid düzeyi gibi uygun gelişme koşullarının kontrol edilebilir ve sabit bir biçimde sürdürülebilmesi için enkübatörler kullanılır. Enkübatörler, memeli hücre kültürleri için aksi belirtilmedikçe 37 C sıcaklığa ve %5 karbondioksid düzeyine ayarlanır. ÇALIŞMA ORTAMININ ÖZELLİKLERİ Temiz bir çalışma ortamı sağlayabilmek için laboratuvarda bankolar, duvarlar ve taban düz, kolay temizlenebilir ve asitler, alkaliler ve dezenfektanlar gibi çeşitli kimyasal maddelere karşı dirençli nitelikte olmalıdır. Ayrıca taban ve duvarlar temizliğin kolay olmasını ve toz birikmemesini sağlayan kaplama malzemeleriyle kaplanmış olmalıdır. Pencereler açılmamalıdır. Çalışma ortamı rahat çalışmaya uygun olmalıdır. PLASTİK KÜLTÜR VE SARF MALZEMELERİ Kültür kapları, tüpler ve pipetler steril, tek kullanımlık paketlenmiş biçimde ticari olarak bulunmaktadır ve bunların kullanımı tekrar kullanılan cam malzemelere göre daha cost effective dir, daha yüksek düzeyde kalite sunar ve temizlik ve sterilizasyon işlemlerini gerektirmez. Plastik hücre kültürü flaskları hücrelerin tutunmasını kolaylaştıran hidrofilik bir yüzey sağlamaktadır. LABORATUVAR ALANLARININ BAKIMI VE TEMİZLİĞİ Temiz ve güvenli bir çalışma ortamı sağlamak için düzen ve temizlik önemlidir. Bütün döküntüler (spills) hemen temizlenmelidir. Rutin temizlik de aksatılmamalıdır. Kabinetin bütün iç ve dış yüzeyi, enkübatör, hücre kültür odasının tabanı ve donanımın santrifüj gibi diğer elemanları periyodik olarak temizlenmelidir. Bütün donanımın bakımı eğitimli firma elemanlarına periyodik olarak yaptırılmalıdır. Örneğin; kabinetin hava akımı ve HEPA filtreleri periyodik olarak kontrol ettirilmelidir. Enkübatörün sıcaklığı düzenli olarak kalibre edilmiş bir termometreyle kontrol edilmeli ve gerekirse ayarlanmalıdır. Enkübatör karbondioksid ve oksijen düzeyleri de düzenli olarak ölçtürülmelidir. DEZENFEKSİYON Kültür atıklarının, çalışma alanlarının ve donanımın dezenfeksiyonu/ dekontaminasyonu güvenlik riskini en aza indirmek için gereklidir. Başlıca dezenfektan maddeler şu gruplara ayrılabilir:,hipokloritler (Chloros, Presept gibi): - Genel amaçlı dezenfektan olarak iyidir. - Virüslere karşı aktiftir. - Metallere karşı koroziftir. Bu nedenle santrifüj, enkübatör, kabinet gibi metal yüzeylerde kullanılmamalıdır. 33

35 - Organik maddelerle kolayca inaktive olduğu için günlük kullanılmalıdır. - Genel yüzey temizliği için 1000 ppm, pipetlerin yıkanması için 2500 ppm ve hücre kültürü artıklarının ve döküntülerin temizliği için ppm kullanılmalıdır. - Kabinet ya da odada formaldehid buharı kullanılacaksa önce hipokloritler ortamdan uzaklaştırılmalıdır. Çünkü bu iki kimyasal birlikte karsinojenik ürünler oluşturmak üzere etkileşirler. Fenolikler (Sudol, Hycolin gibi): - Virüslere karşı aktif değildir. - Organik maddelerin varlığında da aktif kalır. Alkol (Etanol, isopropranolol gibi): - Efektif konsantrasyonlar etanol için %70, isopropranolol için %60-70 dir. - Bakterilere karşı etkilidir. Etanol çoğu virüse karşı etkilidir, fakat zarflı olmayan virüslere karşı etkisizdir. - İsopropranolol virüslere karşı etkili değildir. Aldehidler (glutaraldehid, formaldehid gibi): - Aldehidler irritandır ve duyarlılık sorunu nedeniyle kullanımı sınırlı tutulmalıdır. - Glutaraldehid hipoklorit solüsyonların kullanılamadığı metal aksam için kullanılabilir. ATIKLARIN UZAKLAŞTIRILMASI Laboratuvar çalışanları, bütün biyolojik atıkların güvenli bir biçimde uzaklaştırılmasından sorumludur. En önemli noktalardan biri atıkların düzenli olarak dekontamine edilmesi ve uzaklaştırılmasıdır. En iyi yaklaşım az miktarda ve sık olarak bu işi yapmaktır. Farklı atık türlerine farklı işlemlerin uygulanması gerekir. Örneğin; Hücre kültürü atığı (kültür ortamı) boşaltılamadan önce bir gece hipoklorit solüsyonunda (10000 ppm) bekletilmeli ve ertesi gün bol suyla birlikte dökülmelidir. Kontamine pipetler otoklavlanmadan ve yakılmadan önce bütün gece hipoklorit solüsyonunda (2500 ppm) tutulmalıdır. Flasklar, santrifüj tüpleri, dokular, kontamine eldiven gibi materyaller yanmaz torbalara konulmalıdır (yakılmadan önce otoklavlanmalıdır). III. UYGULAMA BASAMAKLARI 1. Hücrelerin enkübatörden laminar flow kabinete taşınması 2. Hücre kazıyıcısı ile hücrelerin hücre kabından ayrılmasının sağlanması 34

36 3. Hücrelerin santrifüj tübüne aktarılması 4. Santrifüj basamağı (800 rpm de 5 dakika) 5. Santrifüj sonrası hücre ortamının alınması 6. Hücre peletinin 2 ml ortamda resüspande edilmesi 7. Hücre süspansiyonundan alınan (100 l) örneğin hücre sayımı için ependorf tübe aktarılması 8. 5 l % 0.4 lük Trypan Blue solüsyonu eklenmesi 9. Thoma lamının ve faz-kontrast mikroskobun sayım için hazırlanması 10. Thoma lamına örneklerin yerleştirilmesi 11. Sayımın yapılması KOMPLET KÜLTÜR ORTAMI HAZIRLANMASI Komplet ortam kullanım anında ve yalnızca gerekli hacimlerde hazırlanmalıdır. Materyaller: Bazal besleyici ortam (RPMI 1640, DMEM, Ham s, F-12 gibi) Serum (Fetal kalf serum, fetal bovin serum, at serumu gibi) Penisilin G ve streptomisin sülfat Glutamin 35

37 1. Bazal besleyici ortama final konsantrasyon %10 olacak şekilde serum eklenir IU/ml final konsantrasyonda olacak biçimde penisilin G ve 50 g/ml final konsantrasyonda olacak biçimde streptomisin eklenir mm final konsantrasyonda glutamin eklenir. TEK TABAKA HÜCRE KÜLTÜRÜNDEN HÜCRELERİN TRİPSİNİZASYONU VE ALT KÜLTÜRÜNÜN HAZIRLANMASI Materyaller: Kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS, 37 C Tripsin/EDTA solüsyonu, 37 C Serumlu komplet ortam. %10 (v/v) oranında serum ile desteklenmiş besleyici ortam, 37 C 1. Primer kültürden kültür ortamı steril bir Pasteur pipetiyle alınır. Aderan hücre tabakasını tripsinin etkisini inhibe edebilen herhangi FBS artığını uzaklaştırmak için az miktarda ve kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS (37 C) ile yıkanır. 2. Kültüre aderan hücre tabakasını kaplayacak volümde tripsin/edta (37 C) eklenir. 3. Kültür kabı 1-2 dk. enkübatöre konur. Hücrelerin yuvarlaklaştığından ve yüzeyden ayrıldığından emin olmak için kültür inverted mikroskopla kontrol edilir. 4. Komplet ortam (37 C) eklenir. Hücre süspansiyonu Pasteur pipetine çekilir ve yüzeyde kalmış olabilen aderan hücreleri ayırmak için hücre tabakası yıkanır. Hücreler ayrılır ayrılmaz hücreleri hasara uğratabilecek tripsinin aktivitesini inhibe etmek için serum içeren ortam eklenir. 5. Hücreler sayılır ve istenilen yoğunluğu elde etmek için sulandırılarak her bir kültür kabına belli sayıda hücre ekilir. Kültürlerin üzerine pasaj tarihi ve pasaj numarası yazılır. 6. Her yeni kültür kabına taze ortam eklenir ve enkübatöre konur. SÜSPANSİYON KÜLTÜRDEKİ HÜCRELERİN PASAJLANMASI Kültürler sıkışık duruma geldiğinde kültür aşağıdaki gibi pasajlanır: 1. Flask enkübatörden alınır ve hücrelerin ortamda eşit dağılması için flask sallanır. 2. Hücre süspansiyonu aseptik olarak alınır ve 1:2, 1:3 veya 1:4 oranında pasajlama yapılarak yeni bir flaska aktarılır. 3. Her flask önceden ısıtılmış taze ortamla beslenir ve enkübatöre geri koyulur. HÜCRELERİN ÇÖZÜLMESİ Dondurularak saklanmış hücreler çalışma için gerektiğinde hızla çözülmeli ve canlılığı optimize etmek için yüksek yoğunlukta ekilmelidir. Materyaller: %70 (v/v) etanol Komplet ortam/%20 FBS, 37 C 36

38 1. Vial sıvı nitrojen tankından çıkartılır ve hemen 37 C su banyosuna koyulur. Ortam çözünene kadar vial sürekli çalkalanır. 2. Açmadan önce vialin kapağı %70 etanolle silinir. 3. Çözünmüş hücre süspansiyonu önceden 2ml ısıtılmış komplet ortam/%20 serum bulunan steril bir santrifüj tüpüne aktarılır. Oda sıcaklığında g devirde 10 dk santrifüj edilir ve supernatant atılır. 4. Hücre pelleti küçük bir hacim (yaklaşık 1 ml) komplet ortam/%20 FBS ile resüspende edilir ve uygun miktarda ortam bulunan ve etiketlenmiş kültür kaplarına aktarılır. Hücrelerde dondurmaya bağlı bir miktar hücre ölümü olması nedeni ile, orijinal kültürler için kullanılandan daha yüksek bir yoğunlukta ekilir. 5. Kültürler 24 saat sonra kontrol edilir. 6. Ortam, ph indikatörünün rengi (fenol red gibi) değiştiğinde değiştirilir. Hücre hattı tekrar reestablish olana kadar kültürler % 20 FBS içeren ortamda tutulur. HÜCRELERİNİN DONDURULMASI Hücreleri korumak, yaşlanmadan kaçınmak, kontaminasyon riskini azaltmak ve genetik değişikliğin etkilerini en aza indirmek için hücre hatları uzun süreli saklama amacıyla dondurulabilir. Materyaller: Komplet ortam Dondurma ortamı: %20 (v/v) arasında oranda serum ile desteklenmiş komplet kültür ortamı ve %5-10 (v/v) oranında DMSO, 4 C 1. Hücre süspansiyonu steril bir santrifüj tüpüne koyulur ve 2 ml serumlu komplet medium eklenir. Oda sıcaklığında g devirde 5 dk santrifüj edilir. 2. Santrifüj sonrası supernatant uzaklaştırılır ve 1 ml dondurma ortamı (4 C) ekleyerek pellet resüspende edilir. 3. 4ml dondurma ortamı daha eklenir, hücreler iyice karıştırılır ve kuru buz üzerine koyulur. 4. Hücreler sayılır ve hücre süspansiyonuna dondurma ortamı ekleyerek 10 6 ya da 10 7 hücre/ml final hücre konsantrasyonuna getirilir. 5. Hücre süspansiyonundan 1 ml hacimde aliquot lar 2 ml hacimde ve önceden etiketlenmiş cryovial lere koyulur ve kapakları sıkıca kapatılır. 6. Vialler, 1 saat ile bütün gece arası bir süre -70 C dondurucuda tutulur ve daha sonra likid nitrojen tankına aktarılır. TRYPAN BLUE BOYAMASIYLA HÜCRE SAYISININ VE CANLILIĞININ BELİRLENMESİ Materyaller: HBSS içinde hazırlanan % 0.4 (w/v) trypan blue solüsyonu Thoma lamı ve lamel %70 (v/v) etanol 37

39 1. Canlı hücrelerin sayısını belirlemek için ependorf tüpüne 100 L hücre süspansiyonu koyulur ve 5 l %0.4 lük trypan blue solüsyonu eklenir. 2. Örnek, Thoma lamına yerleştirilir. Canlı hücreler ise boyaya geçirgen değil iken, canlı olmayan hücreler boyayı alacaktır. 3. Bütün hücreler ve canlı (boya almamış) hücreler sayılır. Canlı hücre yüzdesi aşağıdaki gibi hesaplanır: Canlı hücre oranı (%) = Boya almamış hücrelerin sayısı/toplam hücre sayısı x Thoma lamı %70 etanol ve sonra deiyonize su ile yıkanarak dekontamine edilir, havada kurutulur ve bir sonraki kullanım için saklanır. IV. YÖNTEMİN UYGULAMA ALANLARI Hücre içi enzim aktiviteleri Hücre içi sinyalleme Hücre ürünleri Genetik değişiklikler Çevresel etkenlerin yaptığı değişiklikler Hücre-Hücre ilişkileri V. KAYNAKLAR 1. Culture of Animal Cells. R. Ian Fresney, Wiley-Liss, Inc, New York, Mammalian Cell Culture Essential Techniques. A. Doyle and J. Bryan Griffiths, Bios Scientific Publisher, Oxford, Basic Cell Culture Protocols. Jeffrey W. Pollard and John M. Walker, Humana Press, New Jersey,

40 Prof. Dr. Halil RESMİ Memduh BÜLBÜL, PhD GAZ KROMATOGRAFİSİ-KÜTLE SPEKTROSKOPİSİ I.GENEL BİLGİ Gaz kromatografisi-kütle spektroskopisi (GC-MS) adından da anlaşılabileceği gibi iki temel tekniği birleştiren bir analiz yöntemidir. Gaz kromatografisi, gaz faza geçebilen bir karışımdaki bileşenleri bir birinden ayırırken, kütle spektroskopisi bu bileşenlerin tanımlanmasını sağlar. GC yaygın olarak kullanılan ayırım yöntemlerinden birisidir. Durgun (sabit/stasyoner) faz içeren kolondan uçucu (gaz) karışımların, hareketli (mobil) taşıyıcı gazlar ile taşınması temelinde ayırım yapar. Karışımı oluşturan bileşenler kolonda yer alan durgun faz ile etkileşimleri temelinde birbirlerinden ayrılırlar. Kromatografide temel kural etkileşimi çok olan bileşenin kolonu geç terk etmesidir. Kolondan çıkan bileşenler, yine kolondan çıkış sıralarına göre detektöre ulaşarak, burada miktarı ile orantılı bir sinyal oluştururlar. Dolayısı ile bileşenin kolondan çıkış zamanı (ya da kolon tarafından tutulması; retansiyon/alıkonma zamanı) ve maddenin oluşturduğu sinyalin büyüklüğü (pik yüksekliği/pik alanı) bileşenin tanımlanması ve kantite edilmesi için iki önemli parametredir. II.ARAÇ VE GEREÇ Gaz Kromatografi Cihazının Bileşenleri Tipik bir gaz kromatografi cihazının temel bileşenleri aşağıdaki şemada gösterilmiştir. Bu bileşenler şöyle sıralanabilir; Taşıyıcı gaz: Taşıyıcı gaz olarak He ve H2 gibi molekül ağırlığı küçük gazlar kullanılır.ancak H2 gazının kullanımının riskli olması nedeniyle çoğunlukla He gazı kullanılır. 39

41 İnjeksiyon Portu Uygun çözgende çözünmüş madde karışımının oto enjektör ya da manuel olarak sisteme gönderildiği bölümdür. Bu bölümün sıcaklığı 300 C a kadar çıkabilir. Sıvı olarak enjekte edilen örnek hızla gaz fazına geçer. Gaz faza geçen örnek taşıyıcı gaz yardımıyla kolona taşınır. Fırın Kolonun yerleştirildiği bölümdür. Tipik kolon sıcaklıkları C arasında değişir. Ayırım boyunca kolona farklı sıcaklık programları uygulanarak analiz edilmek istenen analit diğer bileşenlerden ayrılır. Sıcaklık programı sonunda kolon temizlenmesi amacıyla ayırım sıcaklığının üzerine çıkartılır. Kolon Sistemin değiştirilebilen kısmıdır. Örnek içeren gaz karışımı kolondan geçerek bileşenlerine ayrılır. Boyları m, çapları 0,20-0,32 mm olabilen kapiller borulardır. İçleri doldurulmuş veya iç yüzeyleri (0,33-1 µm kalınlığında) durgun faz ile kaplanmıştır. Kütle Spektrometresinin Bileşenleri İyon Kaynağı Detektöre ulaşan gaz fazdaki moleküller bir iyon kaynağınca üretilen elektronlarla bombardımana tutulurlar. Bu etki ile moleküller yüklü fragmanlarına ayrılır. Filtre Dört molibden elektromanyetik çubuktan oluşan ünite kuadrapol olarak adlandırılır. Kuadrapol filtre scan modunda iyonizasyon sonucu oluşan her bir fragmanı dedektöre gönderirken, sim (selective ion monitoring) modunda ise detektöre ulaşması istenilen molekül ağırlığındaki fragmanları filtre ederek detektöre gönderir. Diğer bileşenleri sistem dışına atar. Detektör Detektör özgül kütlelere sahip iyonların sayımını yapan bir cihazdır. Elde edilen bilgi bir yazılım ile kütle spektrumu na dönüştürülür. Sisteme bağlı olarak HED detektör bulunmaktadır. III. UYGULAMA BASAMAKLARI METİL PARATHİON EKSTRAKSİYON YÖNTEMİ 0,7 ml örnek (kan, serum, plazma, idrar, gastrik sıvı ) alınır Üzerine 7 µl fenitrothion (İS olarak kullanılıyor) (100 ng/ml) eklenir Buna 1 ml toluen eklenir ve karıştırılır Karışım 2 dakika vortekslenir 40

42 14000 rpm de ve +4 ºC de, 5 dakika santrifüj edilir Dondurularak üst faz alınır Azot altında uçurulur 50 µl toluen eklenip vortekslenir Hamilton şırınga ile (1 µl) cihaza enjekte edilir CİHAZ AYARLARI ve ISI PROGRAMI Fırın Ramp ºC/min NextºC Hold Run time 1 80(başlangıç) Clean Enjeksiyon Ünitesi FRONT INLET (SPLIT) Mode: Split (Major kompanentlerin analizinde kullanılır.) BACK INLET (SPLITLESS) Mode: Splitless (Trace kompanentlerin analizinde kullanılır) Taşıyıcı gaz: He Kolon Model No: HP S-433 Max sıcaklık: 325ºC Dolgu maddesi: HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane Boy: 30 m Çap: 0,25 mm İç yüzey film kalınlığı: 0,25 µm IV. KULLANIM ALANLARI Çevresel analizler (hidrokarbonlar, pestisidler, herbisidler) Gıda analizleri Endüstriyel kimyasal madde analizleri Sağlıkla ilişkili analizler (anestezikler, antiepileptik ilaçlar, homosistein ve metiyonin gibi amino asidler, organik asidler, izoprostanlar ve DNA bazları gibi oksidatif hasar göstergeleri vb) V.KAYNAKLAR Klinik Kimyada Temel İlkeler, Ed. Carl A. Burtis, Edward R. Ashwood (Çev. Ed. Diler Aslan), 5. baskı, Palme Yayıncılık,

43 Memduh Bülbül, PhD Araş.Gör. Duygu HARMANCI ATOMİK ABSORPSİYON SPEKTROFOTOMETRİSİ (AAS) I.GENEL BİLGİ Atomik Absorpsiyon Spektrofotometresi nde temel ilke, atomların belirli dalga boyundaki elektromanyetik ışımayı absorbe etmesine dayanmaktadır (Delves, 1981: Kaplan 1996). Atomlar iki durumda bulunabilirler: Temel düzey enerjili durum (ground state) Uyarılmış düzey enerjili durum (excited state) Düşük enerjili atomlar dış kaynaktan gelen enerjiyi absorbe ederek yüksek enerjili duruma geçerler. Atomlar temel düzeyde enerji absorblayarak uyarılmış düzeye geçerler. Şekil 1: Sodyum atomunun temel ve uyarılmış düzeyleri Atomik absorbsiyon spektrofotometresinde 30 a yakın element mg/l (ppm) ve /L (ppb) düzeyinde ölçülebilir. Moleküllerin parçalanarak serbest atomların açığa çıkarılmasına atomizasyon denir. Atomizasyon ısı ile yapılır.isı kaynağı alevli (flame) yöntemde alev alevsiz (flameless) yöntemde elektrikli grafit fırındır. Alevli (Flame) Atomizasyon Yöntemi (FAAS) 1-Alev 2-Püskürtme çemberi 3-Nebulizer(sisleştirici) 42

44 Bu sistemde ön karışımlı laminar alev kullanılır. Yanıcı ve oksitleyici gaz bir yerde birleştirilerek aleve gönderilir.farklı gazlar ile farklı sıcaklık değerlerine ulaşılabilir. Tablo 1: FAAS de gaz karışımları ve ulaşılan sıcaklıkları Bir FAAS nin sisteminde örnek aspire edildikten sonra nebulizer tarafından püskürtülür, büyük damlalar atık tarafından atılır, sadece sis haline gelmiş olan kısım yakıt ve oksidan gazlar ile karıştırılıp aleve gönderilir. Aleve ulaşan örnek önce suyunu kaybeder, buharlaşır ve atomlaşır. Şekil 2: FAAS başlığının yapısı 43

45 Alevsiz (Flameless) Atomizasyon Yöntemi Bu yöntem Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrophotometry (GFAAS) ve Electro-Thermal Atomic Absorption Spectrophotometry (ETAAS) olmak üzere iki şekilde adlandırılır. FAAS yöntemi ile örneğin sadece %10 u atomize edilebilmektedir. GFAAS yönteminde ise atomizasyon oranı %90 ın üzerindedir. Bu nedenle alevli yöntemden kat daha duyarlı bir yöntemdir GFAAS tekniğinde ısı kaynağı olarak elektrikli bir fırın, örneğin enjekte edildiği ve atomizasyonun sağlandığı bir grafit tüp, ve grafit tüpün oksidasyonunun önlenmesi için argon gibi bir inert gaz kullanılır. Ayrıca ısınan grafit tüpün soğumasını sağlayan su düzeneği vardır. Şekil 3: GFAAS başlık düzeneği GFAAS nde temel olarak dört basamaklı bir ısı programı uygulanır. Sırasıyla: 1. Kurutma basamağı (drying stage): Bu basamakta C de çözücü buharlaştırılarak uzaklaştırılır. 2. Küllendirme basamağı (ashing stage): Bu basamakta organik maddeler ve tuzlar buharlaştırılarak uzaklaştırılır. Uygulanan sıcaklık sıcaklık C arasında, süre saniye arasında değişebilmektedir. 3. Atomizasyon basamağı (atomization stage): Atomizasyon basamağında sıcaklık elemente göre değişmekte olup 3000 C ye kadar çıkabilir. Süre ortalama 5 saniyedir. 4. Temizlik (Cleaning) basamağı: Atomizasyon basamağından sonra yüksek bir sıcaklıkta temizlik basamağı uygulanır. 44

46 Şekil 4: GFAAS de atomizasyon basamakla Hidrür Jeneratörü Atomizasyon Yöntem Arsenik, civa ve selenyum gibi hidrojen ile hidrür adı verilen gaz halindeki kovalent hidrojen bileşikleri oluştururlar. Oluşan bu gaz aleve gönderilir ve atomize edilir. NaBH4 + 3H2O + HCl H3BO3 + NaCl + 8H + 8H + + A m+ A: Analiz elementi M, n: Katsayılar AHn + H2 Şekil 5: Hidrür jeneratörü 45

47 Atomik Absorpsiyon Fotometresi nin bileşenleri A. Işık kaynağı (oyuk katod lamba) B. Atomizasyon ünitesi (alev, grafit, hidrid sistemi) C. Atomizer optikleri D. Monokromatör E. Dedektör F. Sinyal işleme ünitesi Şekil 6: AAS cihazının yapısı Şekil 7: PERKIN-ELMER Analyst

SODYUM DODESİL SÜLFAT POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ İLE PROTEİNLERİN ANALİZİ

SODYUM DODESİL SÜLFAT POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ İLE PROTEİNLERİN ANALİZİ T.C. FIRAT ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ SODYUM DODESİL SÜLFAT POLİAKRİLAMİD JEL ELEKTROFOREZİ İLE PROTEİNLERİN ANALİZİ Yüksek Lisans Semineri Hazırlayan: Abdullah ASLAN Danışman:

Detaylı

Laboratuvar Tekniği. Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 9. Hafta (11.04.

Laboratuvar Tekniği. Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 9. Hafta (11.04. Laboratuvar Tekniği Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 9. Hafta (11.04.2014) 1 9. Haftanın Ders İçeriği Beer-Lambert Kanunu Spektrofotometre 2 Beer-Lambert

Detaylı

POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PZR-PCR) VE RESTRİKSİYON PARÇA UZUNLUĞU POLİMORFİZMİ (RFLP)

POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PZR-PCR) VE RESTRİKSİYON PARÇA UZUNLUĞU POLİMORFİZMİ (RFLP) Deney: M 1 POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PZR-PCR) VE RESTRİKSİYON PARÇA UZUNLUĞU POLİMORFİZMİ (RFLP) a) PCR yöntemi uygulaması b) RPLF sonuçları değerlendirilmesi I. Araç ve Gereç dntp (deoksi Nükleotid

Detaylı

SDS-PAGE Jel Elektroforezi İÇERİK

SDS-PAGE Jel Elektroforezi İÇERİK İÇERİK Tanım...2 SDS-PAGE jel elektroforez metodu...3 SDS-PAGE jel elektroforezi yürütme ortamının hazırlanması...4 Protein örneklerinin yüklenmesi...8 Jelin yürütülmesi...9 Jelin boyanması ve boyanın

Detaylı

NÜKLEİK ASİTLERİN ELEKTROFOREZİ

NÜKLEİK ASİTLERİN ELEKTROFOREZİ T.C. FIRAT ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ BÖLÜMÜ NÜKLEİK ASİTLERİN ELEKTROFOREZİ Yüksek Lisans Semineri Hazırlayan: Venhar ÇELİK Danışman: Yrd.Doç.Dr. Dilek Turgut-BALIK NÜKLEİK ASİTLERİN

Detaylı

Western Blot (veya immünblot), protein ekspresyonunu doğrulamak için standart laboratuvar

Western Blot (veya immünblot), protein ekspresyonunu doğrulamak için standart laboratuvar İçerik Giriş...2 Western Blot Yöntemi...2 Protein Örneklerinin Hazırlanması...2 Dikey Jel Sistemi Kullanımı...3 Kuru Transfer Sistem Kullanımı...4 Bloklama...6 Protein Tespiti...6 Kemilüminesans Tanımlama

Detaylı

Rahim ağzı kanseri hücreleri doku kültürü mikroskopik görüntüsü.

Rahim ağzı kanseri hücreleri doku kültürü mikroskopik görüntüsü. Doç.Dr.Engin DEVECİ HÜCRE KÜLTÜRÜ Hücre Kültürü Araştırma Laboratuvarı, çeşitli hücrelerin invitro kültürlerini yaparak araştırmacılara kanser, kök hücre, hücre mekaniği çalışmaları gibi konularda hücre

Detaylı

ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ

ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ UV-Görünür Bölge Moleküler Absorpsiyon Spektroskopisi Yrd. Doç.Dr. Gökçe MEREY GENEL BİLGİ Çözelti içindeki madde miktarını çözeltiden geçen veya çözeltinin tuttuğu ışık miktarından

Detaylı

ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ

ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) Yrd. Doç. Dr. Gökçe MEREY SIVI KROMATOGRAFİSİ Hareketli fazın sıvı olduğu bu kromatografi türünde sabit faz bir dolgu maddesi üzerine

Detaylı

SANTRİFÜJ TEKNİKLERİ VE SANTRİFÜJLER

SANTRİFÜJ TEKNİKLERİ VE SANTRİFÜJLER SANTRİFÜJ TEKNİKLERİ VE SANTRİFÜJLER Doç. Dr. Gülsen YILMAZ 2009 BAŞLIKLAR 1 Tanım ve Prensip 22 Santrifüj teknikleri 33 Santrifüj tipleri 44 Santrifüj kullanım alanları Laboratuvarı ilgilendiren Süreç

Detaylı

Total protein miktarının bilinmesi şarttır:

Total protein miktarının bilinmesi şarttır: Total protein miktarının bilinmesi şarttır: protein veriminin belirlenmesi saflık kontrolu deneylerin optimizasyonu spesifik aktivite tayini ve saflaştırma derecesinin belirlenmesi (enzimler için) KULLANILAN

Detaylı

KROMATOGRAFİ. Bir parça kağıt şeridin aşağı hizasından 1 cm kadar yukarısına bir damla siyah mürekkep damlatınız.

KROMATOGRAFİ. Bir parça kağıt şeridin aşağı hizasından 1 cm kadar yukarısına bir damla siyah mürekkep damlatınız. KROMATOGRAFİ Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin, biri sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması ve saflaştırılması yöntemidir. KROMATOGRAFİ

Detaylı

Protein Ekstraksiyonu

Protein Ekstraksiyonu Protein Ekstraksiyonu Dr.Gaye Güler Tezel Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı Proteinler tüm canlı organizmalar için en önemli makromoleküllerden biridir. Bazıları yapısal komponentleri

Detaylı

MAIA Pesticide MultiTest

MAIA Pesticide MultiTest MAIA Pesticide MultiTest GIDALARDA PESTİSiT KALINTILARI İÇİN AB MAKSİMUM KALINTI LİMİTLERİ İLE UYUMLU ÇOKLU KALINTI TARAMA TESTİ Microplate Acetylcholinesterase Inhibition Assay (MAIA) katı veya sıvı gıda

Detaylı

Hücre Üzerine Mikrocerrahi Uygulamaları Hücrenin altbirimlerine ayrılması Moleküllerin analizi. Prof. Dr. Müjgan Cengiz

Hücre Üzerine Mikrocerrahi Uygulamaları Hücrenin altbirimlerine ayrılması Moleküllerin analizi. Prof. Dr. Müjgan Cengiz Hücre Üzerine Mikrocerrahi Uygulamaları Hücrenin altbirimlerine ayrılması Moleküllerin analizi Prof. Dr. Müjgan Cengiz Canlı Hücrelerdeki Moleküllerin İzlenmesi Mikroskopla inceleme hücrede belli düzeyde

Detaylı

Kromozom, DNA ve Gen. Allel Segregasyonu. DNA çift sarmalı. Hastalık yapan mutasyonlar protein fonksiyonunu bozar. Hastalık yapan mutasyonlar

Kromozom, DNA ve Gen. Allel Segregasyonu. DNA çift sarmalı. Hastalık yapan mutasyonlar protein fonksiyonunu bozar. Hastalık yapan mutasyonlar Temel Genetik Kavramlar DNA izolasyon yöntemleri Kromozom, DNA ve Gen Hücre Nukleus Kromozomlar Gen Prof.Dr.Uğur ÖZBEK Protein DNA çift sarmalı Allel Segregasyonu Şeker Fosfat omurga Bazlar Baz çifti A

Detaylı

RTA JEL / PZR Saflaştırma Kiti

RTA JEL / PZR Saflaştırma Kiti RTA JEL / PZR Saflaştırma Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2011-12 DNA parçalarının agaroz jelden geri kazanımı ve PZR ürünlerinin saflaştırılması için Yalnızca profesyonel kullanım için REF 09009050

Detaylı

ÇÖZÜNMÜŞ OKSİJEN TAYİNİ

ÇÖZÜNMÜŞ OKSİJEN TAYİNİ ÇEVRE KİMYASI LABORATUVARI ÇÖZÜNMÜŞ OKSİJEN TAYİNİ 1. GENEL BİLGİLER Doğal sular ve atıksulardaki çözünmüş oksijen (ÇO) seviyeleri su ortamındaki fiziksel, kimyasal ve biyokimyasal aktivitelere bağımlıdır.

Detaylı

ATIKSULARDA FENOLLERİN ANALİZ YÖNTEMİ

ATIKSULARDA FENOLLERİN ANALİZ YÖNTEMİ ATIKSULARDA FENOLLERİN ANALİZ YÖNTEMİ YÖNTEM YÖNTEMİN ESASI VE PRENSİBİ Fenolik maddeler uçucu özellik göstermeyen safsızlıklardan distilasyon işlemiyle ayrılır ve ph 7.9 ± 0.1 de potasyum ferriksiyanür

Detaylı

REAKSİYON PRENSİPLERİ

REAKSİYON PRENSİPLERİ REAKSİYON PRENSİPLERİ Reaksiyon Bileşenleri: qpcr Master Mix (PMM) Hedef probe Mix (HPM) Zenginleştirilmiş gıda ürünleri kültüründen izole edilen DNA örneği Polimerase Chain Reaction (PCR): Son yıllarda

Detaylı

Protokolü PD S001 01. 50 Reaksiyon

Protokolü PD S001 01. 50 Reaksiyon Salmonella sp. Real time PCR Tespit Kiti Protokolü PD S001 01 50 Reaksiyon REAKSİYON PRENSİPLERİ Reaksiyon Bileşenleri: qpcr Master Mix (PMM) Hedef probe Mix (HPM) Zenginleştirilmiş gıda ürünleri kültüründen

Detaylı

NÜKLEİK ASİTLERİN SAKLAMA KOŞULLARI

NÜKLEİK ASİTLERİN SAKLAMA KOŞULLARI NÜKLEİK ASİTLERİN SAKLAMA KOŞULLARI Dr. Zafer KÜÇÜKODACI GATA HEH Patoloji Servisi 22. ULUSAL PATOLOJİ KONGRESİ 7 Kasım 2012 Manavgat DNA ve RNA NIN KANTİTASYONU Spektrofotometrik ölçüm Floresans teknik

Detaylı

PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI

PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI PROTEİNLERİN SAFLAŞTIRILMASI Bir hücre ve dokudan istenilen bir proteinin saf halde izole edilmesi oldukça güç bir olaydır. Bu proteinin konsantrasyonu düşük ise binlerce farklı protein arasından ayırmak

Detaylı

İÇİNDEKİLER ÖN SÖZ... III

İÇİNDEKİLER ÖN SÖZ... III İÇİNDEKİLER ÖN SÖZ... III İÇİNDEKİLER... V 1. LABORATUVARDA KULLANILAN MALZEME VE ALETLER... 1 1.1. Tüpler... 1 1.2. Beher... 1 1.3. Erlenmeyer... 2 1.4. Balonlar... 2 1.5. Mezur... 3 1.6. Pipetler...

Detaylı

Laboratuvar Tekniği. Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 5. Hafta (14.03.

Laboratuvar Tekniği. Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 5. Hafta (14.03. Laboratuvar Tekniği Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 5. Hafta (14.03.2014) 1 5. Haftanın Ders İçeriği DNA ekstraksiyonu DNA ekstraksiyonunun amacı

Detaylı

FLORESAN İN SİTU HİBRİDİZASYON

FLORESAN İN SİTU HİBRİDİZASYON FLORESAN İN SİTU HİBRİDİZASYON Sağlık Teknikeri Hande ÇOLAKOĞLU Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Patoloji AD SIVI ve DOKULARIN FISH UYGULAMASI ÖNCESİ HAZIRLIK İŞLEMLERİ FISH Çalışmalarında Ön Uygulama

Detaylı

HPLC. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi

HPLC. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi HPLC Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi HPLC Nedir? HPLC nin Kısımları: Hareketli Faz Rezervuarı Pompa Sistemi Numune enjeksiyon Sistemi Kolon Dedektör HPLC Çeşitleri HPLC Uygulamaları HPLC Yüksek

Detaylı

KAPİLLER ELEKTROFOREZ DNA SEKANSLAMA

KAPİLLER ELEKTROFOREZ DNA SEKANSLAMA İçerik Giriş...2 Deney İçin Gerekli Olan Malzemeler...3 Deneyin Yapılışı... 4-9 Genomik DNA Kalıbının Hazırlanması...4 PCR Amplifikasyonu... 4-5 DNA Miktarının Belirlenmesi...6 Sekans Reaksiyonunun Hazırlanması...7

Detaylı

DNA Đzolasyonu. Alkaline-SDS Plasmit Minipreleri. Miniprep ler bakteri kültüründen plasmit DNA sı izole etmenizi sağlar.

DNA Đzolasyonu. Alkaline-SDS Plasmit Minipreleri. Miniprep ler bakteri kültüründen plasmit DNA sı izole etmenizi sağlar. DNA Đzolasyonu Saflaştırılmak istenen DNA ya genomik DNA dır ya da genomik olmayan mtdna, chldna, plasmit DNAsıdır.DNA izolasyon kitleri, genomik ve genomik olmayan DNA izole etmemizi sağlayan standartlaştırılmış

Detaylı

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ UYGULAMA DERSİ NO:5 Enzim Analizleri

GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ UYGULAMA DERSİ NO:5 Enzim Analizleri 1. Enzimler GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ UYGULAMA DERSİ NO:5 Enzim Analizleri Enzimler, hücreler ve organizmalardaki reaksiyonları katalizleyen ve kontrol eden protein yapısındaki bileşiklerdir. Reaksiyon hızını

Detaylı

PCR Bir reaksiyonun kurulması ve optimize edilmesi

PCR Bir reaksiyonun kurulması ve optimize edilmesi Hafta V PCR Temelli Genetik Analiz Yaklaşımları PCR Bir reaksiyonun kurulması ve optimize edilmesi Doç. Dr. Hilâl Özdağ F Đ Z Đ K Đ A L T Y A P I Reaksiyonda kullanılanlar: P C R I. Kalıp DNA a) PCR degrade

Detaylı

KONU: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE TEMEL TEKNİKLER: Kromotografi ve Spektrofotometri

KONU: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE TEMEL TEKNİKLER: Kromotografi ve Spektrofotometri 17.12.2014/Çarşamba Laboratuvar 10 KONU: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE TEMEL TEKNİKLER: Kromotografi ve Spektrofotometri AMAÇ: Moleküler biyolojide kullanılan temel tekniklerler olan kromotografi ve spektrofotometrinin

Detaylı

RTA Kandan Genomik DNA İzolasyon Kiti

RTA Kandan Genomik DNA İzolasyon Kiti RTA Kandan Genomik DNA İzolasyon Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2011-05 IVD İnsan kan örneklerinden in vitro tanı amaçlı genomik nükleik asit izolasyon ve saflaştırması için In vitro tanı amaçlı

Detaylı

III-Hayatın Oluşturan Kimyasal Birimler

III-Hayatın Oluşturan Kimyasal Birimler III-Hayatın Oluşturan Kimyasal Birimler MBG 111 BİYOLOJİ I 3.1.Karbon:Biyolojik Moleküllerin İskeleti *Karbon bütün biyolojik moleküllerin omurgasıdır, çünkü dört kovalent bağ yapabilir ve uzun zincirler

Detaylı

RTA Bakteriden Genomik DNA İzolasyon Kiti

RTA Bakteriden Genomik DNA İzolasyon Kiti RTA Bakteriden Genomik DNA İzolasyon Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2011-12 IVD Bakteri örneklerinden genomik nükleik asit izolasyonu ve saflaştırılması için In vitro tanı amaçlı kullanım için Yalnızca

Detaylı

RT-PCR. (reverse transckripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) Dr Gülnur Güler

RT-PCR. (reverse transckripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) Dr Gülnur Güler RT-PCR (reverse transckripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) Dr Gülnur Güler RT-PCR (reverse transckripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu) mrna ekspresyon seviyelerini belirlemek için sensitiv bir metod

Detaylı

ayxmaz/biyoloji Adı: 1.Aşağıda verilen atomların bağ yapma sayılarını (H) ekleyerek gösterin. C N O H

ayxmaz/biyoloji Adı: 1.Aşağıda verilen atomların bağ yapma sayılarını (H) ekleyerek gösterin. C N O H Adı: 1.Aşağıda verilen atomların bağ yapma sayılarını (H) ekleyerek gösterin. C N O H 2.Radyoaktif izotoplar biyologları için önemlidir? Aşağıda radyoakif maddelerin kullanıldığı alanlar sıralanmıştır.bunlarla

Detaylı

SPEKTROSKOPİ. Spektroskopi ile İlgili Terimler

SPEKTROSKOPİ. Spektroskopi ile İlgili Terimler SPEKTROSKOPİ Spektroskopi ile İlgili Terimler Bir örnekteki atom, molekül veya iyonlardaki elektronların bir enerji düzeyinden diğerine geçişleri sırasında absorplanan veya yayılan elektromanyetik ışımanın,

Detaylı

Nilgün Çerikçioğlu Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

Nilgün Çerikçioğlu Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Nilgün Çerikçioğlu Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Kandolaşımı Enfeksiyonları %10 Kandidemi Ölüm hızı : % 50 (YBÜ) Erken tanı (?), tedavinin önemi Etken: Candida allbicans

Detaylı

Spektroskopi ve Spektrofotometri. Yrd. Doç. Dr. Bekir Engin Eser Zirve University EBN Medical School Department of Biochemistry

Spektroskopi ve Spektrofotometri. Yrd. Doç. Dr. Bekir Engin Eser Zirve University EBN Medical School Department of Biochemistry Spektroskopi ve Spektrofotometri Yrd. Doç. Dr. Bekir Engin Eser Zirve University EBN Medical School Department of Biochemistry Spektroskopi Nedir? Maddeyle ışığın (elektromagneek radyasyon) etkileşimini

Detaylı

BARTIN ÜNİVERSİTESİ METALURJİ VE MALZEME MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ MALZEME LABORATUVARI-I DERSİ OKSİTLİ BAKIR CEVHERİNİN LİÇİ DENEYİ DENEYİN AMACI: Uygun

BARTIN ÜNİVERSİTESİ METALURJİ VE MALZEME MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ MALZEME LABORATUVARI-I DERSİ OKSİTLİ BAKIR CEVHERİNİN LİÇİ DENEYİ DENEYİN AMACI: Uygun BARTIN ÜNİVERSİTESİ METALURJİ VE MALZEME MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ MALZEME LABORATUVARI-I DERSİ OKSİTLİ BAKIR CEVHERİNİN LİÇİ DENEYİ DENEYİN AMACI: Uygun bir reaktif kullanarak oksitli bakır cevherindeki bakırı

Detaylı

I. YARIYIL TEMEL BİYOKİMYA I (B 601 TEORİK 3, 3 KREDİ)

I. YARIYIL TEMEL BİYOKİMYA I (B 601 TEORİK 3, 3 KREDİ) T.C. İSTANBUL BİLİM ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS PROGRAMI 2014-2015 EĞİTİM-ÖĞRETİM YILI DERS İÇERİKLERİ I. YARIYIL TEMEL BİYOKİMYA I (B 601 TEORİK 3, 3

Detaylı

Hücrelerde gerçekleşen yapım, yıkım ve dönüşüm olaylarının bütününe metabolizma denir.

Hücrelerde gerçekleşen yapım, yıkım ve dönüşüm olaylarının bütününe metabolizma denir. METABOLİZMA ve ENZİMLER METABOLİZMA Hücrelerde gerçekleşen yapım, yıkım ve dönüşüm olaylarının bütününe metabolizma denir. A. ÖZÜMLEME (ANABOLİZMA) Metabolizmanın yapım reaksiyonlarıdır. Bu tür olaylara

Detaylı

ALKALİNİTE. 1 ) Hidroksitler 2 ) Karbonatlar 3 ) Bikarbonatlar

ALKALİNİTE. 1 ) Hidroksitler 2 ) Karbonatlar 3 ) Bikarbonatlar ALKALİNİTE Bir suyun alkalinitesi, o suyun asitleri nötralize edebilme kapasitesi olarak tanımlanır. Doğal suların alkalinitesi, zayıf asitlerin tuzlarından ileri gelir. Bunların başında yer alan bikarbonatlar,

Detaylı

Mikotoksin nedir? En sık karşılaşılan mikotoksinler; Aspergillus Penicillium Fusarium Alternaria

Mikotoksin nedir? En sık karşılaşılan mikotoksinler; Aspergillus Penicillium Fusarium Alternaria Mikotoksin nedir? Aspergillus Penicillium Fusarium Alternaria belirli nem ve ısı koşullarında oluşturdukları fungal metabolitler En sık karşılaşılan mikotoksinler; o aflatoksinler, o okratoksin, o trikotesen,

Detaylı

Mikrobiyolojide Moleküler Tanı Yöntemleri. Dr.Tuncer ÖZEKİNCİ Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji A.D

Mikrobiyolojide Moleküler Tanı Yöntemleri. Dr.Tuncer ÖZEKİNCİ Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji A.D Mikrobiyolojide Moleküler Tanı Yöntemleri Dr.Tuncer ÖZEKİNCİ Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji A.D 1 Enfeksiyonun Özgül Laboratuvar Tanısı Mikroorganizmanın üretilmesi Mikroorganizmaya

Detaylı

ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ

ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ ALETLİ ANALİZ YÖNTEMLERİ Infrared (IR) ve Raman Spektroskopisi Yrd. Doç. Dr. Gökçe MEREY TİTREŞİM Molekülleri oluşturan atomlar sürekli bir hareket içindedir. Molekülde: Öteleme hareketleri, Bir eksen

Detaylı

-1- Biüret Yöntemi. ANALĐZ ĐÇĐN GEREKLĐ EKĐPMANLAR Mikro pipet (1000 µl) Makro küvet (3 ml) 1 Vorteks Analitik terazi Spektrofotometre (540 nm)

-1- Biüret Yöntemi. ANALĐZ ĐÇĐN GEREKLĐ EKĐPMANLAR Mikro pipet (1000 µl) Makro küvet (3 ml) 1 Vorteks Analitik terazi Spektrofotometre (540 nm) 1 GĐRĐŞ Protein tayin kiti takip edilerek hazırlanmıştır. Protein tayin kiti kullanılarak örneklerde hızlı, güvenilir ve kolay bir şekilde protein miktarı saptanabilmektedir. Protein tayin kitinde gerçekleştirilen

Detaylı

KALİTELİ SÜT NASIL ELDE EDİLİR?

KALİTELİ SÜT NASIL ELDE EDİLİR? KALİTELİ SÜT NASIL ELDE EDİLİR? Prof. Dr. METİN ATAMER Dr. EBRU ŞENEL ANKARA ÜNİVERSİTESİ ZİRAAT FAKÜLTESİ SÜT TEKNOLOJİSİ BÖLÜMÜ Kaliteli süt üretimi için sağlanması gereken koşullar; Sağlıklı inek Özenli

Detaylı

KONU: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE TEMEL TEKNİKLER; Çözeltiler ve Tamponlar

KONU: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE TEMEL TEKNİKLER; Çözeltiler ve Tamponlar KONU: MOLEKÜLER BİYOLOJİDE TEMEL TEKNİKLER; Çözeltiler ve Tamponlar AMAÇ: - Moleküler Biyoloji laboratuvarında kullanılan çözeltileri ve hazırlanışlarını öğrenmek. - Biyolojik tamponların kullanım amaçlarını,

Detaylı

DEZENFEKTANLARA DİRENÇ TANIMLAR TANIMLAR STERİLİZASYON YAPMADAN TEMİZLİK YAPABİLİRSİNİZ TEMİZLİK YAPMADAN STERİLİZASYON YAPAMAZSINIZ DEZENFEKSİYON:

DEZENFEKTANLARA DİRENÇ TANIMLAR TANIMLAR STERİLİZASYON YAPMADAN TEMİZLİK YAPABİLİRSİNİZ TEMİZLİK YAPMADAN STERİLİZASYON YAPAMAZSINIZ DEZENFEKSİYON: Hidrojen peroksit sterilizasyon DEZENFEKSİYON EL ANTİSEPSİSİ iyod formaldehit gluteraldehit Perasetik asit fenol Çamaşır suyu Etilen oksit klor zefiran alkol ozon ppm Dr. Melda SINIRTAŞ TANIMLAR Hipokrat

Detaylı

Prof. Dr. Selmin TOPLAN

Prof. Dr. Selmin TOPLAN 384 ĐÇĐNDEKĐLER 1 Kanın Reolojik Özellikleri 1.1. Kanın Viskoz Özelliği 1.2. Kan Elemanlarının Reolojik Özellikleri 1.3. Eritrosit Süspansiyonun Dar Tüplerde Akışı ve Fahraeus-Lindqvist Etkisi 2. Kapiller

Detaylı

RNA DNA. Nükleosit Baz + Şeker Riboz (RNA) Deoksiriboz (DNA) Ribonükleozitler : Adenozin, Pürinler: Pirimidinler: AveGdışında

RNA DNA. Nükleosit Baz + Şeker Riboz (RNA) Deoksiriboz (DNA) Ribonükleozitler : Adenozin, Pürinler: Pirimidinler: AveGdışında Bazlar : Nükleik Asitlerin karakteristik Özellikleri DNA RNA Yasin EREN Recep LiMAN Muhsin KONUK Nükleik Asitlerin Yapısı Pürinler: Pirimidinler: AveGdışında TU T,U ve Sdışında d bazı theobromin, kafein,

Detaylı

Mikrobiyal Gelişim. Jenerasyon süresi. Bakterilerde üreme eğrisi. Örneğin; (optimum koşullar altında) 10/5/2015

Mikrobiyal Gelişim. Jenerasyon süresi. Bakterilerde üreme eğrisi. Örneğin; (optimum koşullar altında) 10/5/2015 Mikrobiyal Gelişim Tek hücreli organizmalarda sayı artışı Bakterilerde en çok görülen üreme şekli ikiye bölünmedir (mikroorganizma sayısı) Çok hücreli organizmalarda kütle artışı Genelde funguslarda görülen

Detaylı

5.111 Ders Özeti #12. Konular: I. Oktet kuralından sapmalar

5.111 Ders Özeti #12. Konular: I. Oktet kuralından sapmalar 5.111 Ders Özeti #12 Bugün için okuma: Bölüm 2.9 (3. Baskıda 2.10), Bölüm 2.10 (3. Baskıda 2.11), Bölüm 2.11 (3. Baskıda 2.12), Bölüm 2.3 (3. Baskıda 2.1), Bölüm 2.12 (3. Baskıda 2.13). Ders #13 için okuma:

Detaylı

METAL ANALİZ YÖNTEMİ (ALEVLİ ATOMİK ABSORPSİYON SPEKTROMETRE CİHAZI İLE )

METAL ANALİZ YÖNTEMİ (ALEVLİ ATOMİK ABSORPSİYON SPEKTROMETRE CİHAZI İLE ) METAL ANALİZ YÖNTEMİ (ALEVLİ ATOMİK ABSORPSİYON SPEKTROMETRE CİHAZI İLE ) YÖNTEM YÖNTEMĐN ESASI VE PRENSĐBĐ Atomik absorpsiyon spektrometresi cihazında numune alevin içerisine püskürtülür ve atomize edilir.

Detaylı

Nitrik Oksit Sentaz ve Nitrik Oksit Ölçüm Yöntemleri

Nitrik Oksit Sentaz ve Nitrik Oksit Ölçüm Yöntemleri Nitrik Oksit Sentaz ve Nitrik Oksit Ölçüm Yöntemleri Nitrik Oksit Sentaz ve Nitrik Oksit Ölçüm Yöntemlerine Giriş Doç. Dr. Bahar Tunçtan ME.Ü. Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Ab.D. ME.Ü. Tıp Fakültesi

Detaylı

DÖNEM 1- A, 3. DERS KURULU (2015-2016)

DÖNEM 1- A, 3. DERS KURULU (2015-2016) DÖNEM 1- A, 3. DERS KURULU (2015-2016) DERS SAATİ DERS ADI DERS KONUSU DERSİ VEREN ÖĞRETİM ÜYESİ 4. DK 1. Hafta 07 Aralık Pazartesi Mikrobiyoloji Mikrobiyolojinin tarihçesi ve mikroorganizmalara genel

Detaylı

MERKEZ LABORATUVAR. Moleküler Biyoloji Deneylerinde Sıklıkla Kullanılan Bazı Aletlerin Tanıtımı

MERKEZ LABORATUVAR. Moleküler Biyoloji Deneylerinde Sıklıkla Kullanılan Bazı Aletlerin Tanıtımı MERKEZ LABORATUVAR Moleküler Biyoloji Deneylerinde Sıklıkla Kullanılan Bazı Aletlerin Tanıtımı Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi (HPLC) Karbonhidratların, organik asitlerin, vitaminlerin, amino asitlerin

Detaylı

Proteinler. Fonksiyonlarına göre proteinler. Fonksiyonlarına göre proteinler

Proteinler. Fonksiyonlarına göre proteinler. Fonksiyonlarına göre proteinler Proteinler Canlılarda miktar olarak en çok bulunan biyomoleküllerdir. Amino asit birimlerinden oluşurlar Yapısal ve işlevsel olabilirler Genlerle aktarılan kalıtsal bilginin ortaya çıktığı moleküllerdir.

Detaylı

GÜNEŞİN ELEKTROMANYETİK SPEKTRUMU

GÜNEŞİN ELEKTROMANYETİK SPEKTRUMU GÜNEŞİN ELEKTROMANYETİK SPEKTRUMU Güneş ışınımı değişik dalga boylarında yayılır. Yayılan bu dalga boylarının sıralı görünümü de güneş spektrumu olarak isimlendirilir. Tam olarak ifade edilecek olursa;

Detaylı

A- LABORATUAR MALZEMELERİ

A- LABORATUAR MALZEMELERİ 1- Cam Aktarma ve Ölçüm Kapları: DENEY 1 A- LABORATUAR MALZEMELERİ 2- Porselen Malzemeler 3- Metal Malzemeler B- KARIŞIMLAR - BİLEŞİKLER Nitel Gözlemler, Faz Ayırımları, Isısal Bozunma AMAÇ: Karışım ve

Detaylı

RTA Plazmid DNA İzolasyon Kiti

RTA Plazmid DNA İzolasyon Kiti RTA Plazmid DNA İzolasyon Kiti Kullanma Kılavuzu Yayın Tarihi - 2011-12 Bakteri örneklerinden plazmid DNA izolasyonu ve saflaştırılması için Yalnızca profesyonel kullanım için REF 09007050 50 test 09007100

Detaylı

1. BÖLÜM : ANALİTİK KİMYANIN TEMEL KAVRAMLARI

1. BÖLÜM : ANALİTİK KİMYANIN TEMEL KAVRAMLARI ANALİTİK KİMYA DERS NOTLARI Yrd.Doç.Dr.. Hüseyin ÇELİKKAN 1. BÖLÜM : ANALİTİK KİMYANIN TEMEL KAVRAMLARI Analitik kimya, bilimin her alanında faydalanılan, maddenin özellikleri hakkında bilgi veren yöntemlerin

Detaylı

ALEV FOTOMETRESİ İLE SODYUM VE POTASYUM ANALİZİ. Alev fotometresinde kullanılan düzeneğin şematik gösterimi şekil 1 deki gibidir.

ALEV FOTOMETRESİ İLE SODYUM VE POTASYUM ANALİZİ. Alev fotometresinde kullanılan düzeneğin şematik gösterimi şekil 1 deki gibidir. ALEV FOTOMETRESİ İLE SODYUM VE POTASYUM ANALİZİ ALEV FOTOMETRESİ Alev fotometresinde kullanılan düzeneğin şematik gösterimi şekil 1 deki gibidir. Slit Slit Ayna Numune Filtre Dedektör Alev Galvanometre

Detaylı

İÇİNDEKİLER 1: ADLİ KİMYA...

İÇİNDEKİLER 1: ADLİ KİMYA... İÇİNDEKİLER Bölüm 1: ADLİ KİMYA... 1 1.1. Adli Kimya Tanımı... 1 1.2. Adli Kimyanın Kapsamı... 2 1.3. Adli Düşünce Yapısı... 2 1.4. İş Tanımı... 3 1.5. Kişisel Özellikler... 3 1.6. Adli Kimyanın Tarihi...

Detaylı

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri. Bölüm 9. MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması

Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri. Bölüm 9. MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri Bölüm 9 MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready Soya nın PCR ile Nitel Saptanması M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara WORLD HEALTH ORGANIZATION

Detaylı

Fotovoltaik Teknoloji

Fotovoltaik Teknoloji Fotovoltaik Teknoloji Bölüm 3: Güneş Enerjisi Güneşin Yapısı Güneş Işınımı Güneş Spektrumu Toplam Güneş Işınımı Güneş Işınımının Ölçülmesi Dr. Osman Turan Makine ve İmalat Mühendisliği Bilecik Şeyh Edebali

Detaylı

Gıda Analizlerinde Toksik Madde Tayini LC-GC Aplikasyonu Tanım:

Gıda Analizlerinde Toksik Madde Tayini LC-GC Aplikasyonu Tanım: Gıda Analizlerinde Toksik Madde Tayini LC-GC Aplikasyonu Tanım: İşlem görmüş gıda matrislerinde LC-MS/MS ve GC-MS ile Yüksek dozda toksik madde kalıntısı teşhis ve miktarlandırma analizleri için geliştirilmiş

Detaylı

ÇÖZÜNME KONTROLLERİ Çözünme Tayini (Miktar Tayini için kullanılan yöntem ücreti ilave edilir)

ÇÖZÜNME KONTROLLERİ Çözünme Tayini (Miktar Tayini için kullanılan yöntem ücreti ilave edilir) EK5a : ANALİZ PARAMETRELERİ VE ANALİZ SÜRELERİ TİTCK KOD 110,3 110,303 İLAÇ VE KOZMETİK LABORATUVARLARI Yöntem/Metod BİYOLOJİK KONTROLLER Numune Miktarı Analiz Süresi ÇÖZÜNME KONTROLLERİ Çözünme Tayini

Detaylı

Osmaniye Korkut Ata Üniversitesi, Biyoloji Bölümü Araştırma Laboratuarları ve Üniteleri

Osmaniye Korkut Ata Üniversitesi, Biyoloji Bölümü Araştırma Laboratuarları ve Üniteleri Osmaniye Korkut Ata Üniversitesi, Biyoloji Bölümü Araştırma Laboratuarları ve Üniteleri Biyoloji Bölümünde Merkezi Araştırma Laboratuarlarının Kurulumu Osmaniye Korkut Ata Üniversitesi, Biyoloji Bölümü

Detaylı

ANALĐZ ĐÇĐN GEREKLĐ EKĐPMANLAR. Mikro pipet (1000 µl) Ependorf tüpü (1.5 ml) Cam tüp (16X100 mm)

ANALĐZ ĐÇĐN GEREKLĐ EKĐPMANLAR. Mikro pipet (1000 µl) Ependorf tüpü (1.5 ml) Cam tüp (16X100 mm) 1 GĐRĐŞ Toplam lipid tayininde sülfo-fosfo-vanillin reaksiyonu takip edilmekte olup hızlı güvenilir ve kolay bir yöntem olduğu için tercih edilmiştir. Serum içerisindeki toplam lipid miktarının kantitatif

Detaylı

PEG-FOSFAT-SU SİTEMLERİNDE PROTEİN DAĞILIMI. Gazi Üniversitesi, Mühendislik-Mimarlık Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 06570, Maltepe, Ankara

PEG-FOSFAT-SU SİTEMLERİNDE PROTEİN DAĞILIMI. Gazi Üniversitesi, Mühendislik-Mimarlık Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 06570, Maltepe, Ankara PE-FOSFAT-SU SİTEMLERİNDE PROTEİN DAĞILIMI E.DİLAN ve U.ÜNDÜZ azi Üniversitesi, Mühendislik-Mimarlık Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 06570, Mepe, Ankara 1.ÖZET Model protein olarak seçilen Bovine

Detaylı

TEMEL ECZACILIK BİLİMLERİ ANABİLİM DALI Temel Eczacılık Bilimleri Programı

TEMEL ECZACILIK BİLİMLERİ ANABİLİM DALI Temel Eczacılık Bilimleri Programı Programa Kabul Koşulları: TEMEL ECZACILIK BİLİMLERİ ANABİLİM DALI Temel Eczacılık Bilimleri Programı Yüksek Lisans: Eczacılık Fakültesi, Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, Kimya Bölümü, Mühendislik Fakültesi

Detaylı

T.C. SELÇUK ÜNİVERSİTESİ MÜHENDİSLİK MİMARLIK FAKÜLTESİ KİMYA MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ

T.C. SELÇUK ÜNİVERSİTESİ MÜHENDİSLİK MİMARLIK FAKÜLTESİ KİMYA MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ T.C. SELÇUK ÜNİVERSİTESİ MÜHENDİSLİK MİMARLIK FAKÜLTESİ KİMYA MÜHENDİSLİĞİ BÖLÜMÜ KİMYA MÜHENDİSLİĞİ LABORATUARI SÜREKLİ KARIŞTIRMALI REAKTÖR DENEYİ 2012 KONYA İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER... ii SİMGELER VE

Detaylı

7. BÖLÜM MİKROBİYAL GELİŞİM

7. BÖLÜM MİKROBİYAL GELİŞİM 7. BÖLÜM MİKROBİYAL GELİŞİM 1 Gelişim Tek hücreli organizmalarda sayı artışı Bakterilerde en çok görülen üreme şekli ikiye bölünmedir (mikroorganizma sayısı) Çok hücreli organizmalarda kütle artışı Genelde

Detaylı

ÖZEL EGE LİSESİ BUĞDAY YETİŞTİRİCİLİĞİNDE KULLANILAN HERBİSİDLERİN YARATTIĞI BİYOKİMYASAL DEĞİŞİMLER VE TOPRAK MİKROORGANİZMALARININ ÜZERİNE ETKİSİ

ÖZEL EGE LİSESİ BUĞDAY YETİŞTİRİCİLİĞİNDE KULLANILAN HERBİSİDLERİN YARATTIĞI BİYOKİMYASAL DEĞİŞİMLER VE TOPRAK MİKROORGANİZMALARININ ÜZERİNE ETKİSİ ÖZEL EGE LİSESİ BUĞDAY YETİŞTİRİCİLİĞİNDE KULLANILAN HERBİSİDLERİN YARATTIĞI BİYOKİMYASAL DEĞİŞİMLER VE TOPRAK MİKROORGANİZMALARININ ÜZERİNE ETKİSİ HAZIRLAYAN ÖĞRENCİ: Umut Can YAĞAN İZMİR 2006 İÇİNDEKİLER

Detaylı

EVDE BİYOTEKNOLOJİ. Yrd. Doç. Dr. Hüseyin UYSAL ADNAN MENDERES ÜNİVERSİTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ 5. DERS

EVDE BİYOTEKNOLOJİ. Yrd. Doç. Dr. Hüseyin UYSAL ADNAN MENDERES ÜNİVERSİTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ 5. DERS EVDE BİYOTEKNOLOJİ Yrd. Doç. Dr. Hüseyin UYSAL ADNAN MENDERES ÜNİVERSİTESİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ BÖLÜMÜ 5. DERS STERİLİZASYON; BİTKİ DOKU KÜLTÜRLERİNDE KULLANILAN STERİLİZASYON YÖNTEMLERİ VE BU STERİLİZASYON

Detaylı

CYACUP SİYANÜRLÜ BAKIR KAPLAMA BANYOSU ARIZA TABLOSU

CYACUP SİYANÜRLÜ BAKIR KAPLAMA BANYOSU ARIZA TABLOSU Kadıköy Sicil Ticaret : 20707 CYACUP SİYANÜRLÜ BAKIR KAPLAMA BANYOSU ARIZA TABLOSU 1. Kaplama Pürüzlü ve Koyu Kırmızı - Kahve Renkli Kaplama a) Çözeltide Karbonat konsantrasyonunun aşırı miktarda oluşu.

Detaylı

TEKNO ELEKTROMEKANİK MÜHENDİSLİK SANAYİ ve TİCARET A.Ş.

TEKNO ELEKTROMEKANİK MÜHENDİSLİK SANAYİ ve TİCARET A.Ş. HTL TEMİZ ODA UYGULAMALARI BİYOGÜVENLİK KABİNLERİ Çeker ocaklar : Çeker ocaklar Biyogüvenlik kabini değildir. Kimyasal korunma amacıyla kullanılır. Radyoaktif malzeme ile çalışılabilen modeller vardır.

Detaylı

KROMOTOGRAFİK YÖNTEMLER

KROMOTOGRAFİK YÖNTEMLER KROMOTOGRAFİK YÖNTEMLER A. METODUN ÖZETİ Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin, biri sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması ve saflaştırılması

Detaylı

Kozmetik Ürün Bileşimlerinin Kontrolü İçin Gerekli Analiz Yöntemleri Hakkında Tebliğ. Tebliğ No:İEG-2005/5. 01.07.2005 R.G. Sayısı:25862.

Kozmetik Ürün Bileşimlerinin Kontrolü İçin Gerekli Analiz Yöntemleri Hakkında Tebliğ. Tebliğ No:İEG-2005/5. 01.07.2005 R.G. Sayısı:25862. Kozmetik Ürün Bileşimlerinin Kontrolü İçin Gerekli Analiz Yöntemleri Hakkında Tebliğ Tebliğ No:İEG-2005/5 01.07.2005 R.G. Sayısı:25862 Amaç Madde 1- Bu Tebliğin amacı, gümüş nitrat tanı ve tayini, kepek

Detaylı

İ Ç İ NDEKİ LER. Çevre Mühendisliği ve Bilimi İçin Kimyanın Temel Kavramları 1. Fiziksel Kimya ile İlgili Temel Kavramlar 52.

İ Ç İ NDEKİ LER. Çevre Mühendisliği ve Bilimi İçin Kimyanın Temel Kavramları 1. Fiziksel Kimya ile İlgili Temel Kavramlar 52. İ Ç İ NDEKİ LER Ön Söz xiii K I S I M 1 Çevre Mühendisliği ve Bilimi İçin Kimyanın Temel Kavramları 1 BÖLÜM 1 Giriş 3 1.1 Su 4 1.2 Atık Sular ve Su Kirliliği Kontrolü 5 1.3 Endüstriyel ve Tehlikeli Atıklar

Detaylı

ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ KİMYA MÜHENDİSLİĞİ

ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ KİMYA MÜHENDİSLİĞİ ONDOKUZ MAYIS ÜNİVERSİTESİ KİMYA MÜHENDİSLİĞİ 2013 S A M S U N ASİT-BAZ EKSTRAKSİYONLARI TEORİ Ekstraksiyon, organik bileşikleri ayırmak için oldukça yaygın kullanılan bir metotdur. Ekstraksiyon, sıvı-sıvı

Detaylı

DETERJAN VE DEZENFEKTANLAR. Fırat ÖZEL, Gıda Mühendisi 2006

DETERJAN VE DEZENFEKTANLAR. Fırat ÖZEL, Gıda Mühendisi 2006 DETERJAN VE DEZENFEKTANLAR Fırat ÖZEL, Gıda Mühendisi 2006 ÖNEMLİ! Gıdaları insanların sağlıklarını çok ciddi şekilde etkiler. Bu nedenle, gıda üreten kişilerin temizlik kurallarına uyması çok önemlidir.

Detaylı

Laboratuvar Kazaları, Sterilizasyon Dezenfeksiyon Uygulamaları Doç Dr Dilek ŞATANA İ.Ü. İstanbul Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

Laboratuvar Kazaları, Sterilizasyon Dezenfeksiyon Uygulamaları Doç Dr Dilek ŞATANA İ.Ü. İstanbul Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuvar Kazaları, Sterilizasyon Dezenfeksiyon Uygulamaları Doç Dr Dilek ŞATANA İ.Ü. İstanbul Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Laboratuvar Güvenliği Rehberi ve Eğitim Materyalinden yararlanılmıştır.

Detaylı

DİCLE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ DÖNEM I HÜCRE BİLİMLERİ 2 KOMİTESİ HÜCRE KÜLTÜRÜ ve TEKNOLOJİSİ Doç.Dr. Engin DEVECİ

DİCLE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ DÖNEM I HÜCRE BİLİMLERİ 2 KOMİTESİ HÜCRE KÜLTÜRÜ ve TEKNOLOJİSİ Doç.Dr. Engin DEVECİ DİCLE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ DÖNEM I HÜCRE BİLİMLERİ 2 KOMİTESİ HÜCRE KÜLTÜRÜ ve TEKNOLOJİSİ Doç.Dr. Engin DEVECİ Hücre Kültürü Araştırma Laboratuvarı, çeşitli hücrelerin invitro kültürlerini yaparak

Detaylı

Dekontaminasyon. Manuel Dekontaminasyon. Temizlik. Bir nesnenin mikroorganizmalardan arındırılarak güvenli hale getirilmesi için yapılan işlemler

Dekontaminasyon. Manuel Dekontaminasyon. Temizlik. Bir nesnenin mikroorganizmalardan arındırılarak güvenli hale getirilmesi için yapılan işlemler Dekontaminasyon Manuel Dekontaminasyon Dr. Aydan Özkütük Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AD Bir nesnenin mikroorganizmalardan arındırılarak güvenli hale getirilmesi

Detaylı

IDC Savunma Sanayii. Antikor tabanlı tanımlama sistemleri birçok üstün özellikler sahiptir. Yüksek hassasiyette ve kısa sürede hızlı sonuç üretme.

IDC Savunma Sanayii. Antikor tabanlı tanımlama sistemleri birçok üstün özellikler sahiptir. Yüksek hassasiyette ve kısa sürede hızlı sonuç üretme. IDC Savunma Sanayii Biyolojik Tabanlı Tanımlama Sistemleri Antikor tabanlı tanımlama sistemleri, biyolojik madde ve mikroorganizmaların tespitinde sayısal ve ayırt edici sonuçlar ile ortamda bulunan biyolojik

Detaylı

VİRUS HASTALIKLARINDA TANI YÖNTEMLERİ

VİRUS HASTALIKLARINDA TANI YÖNTEMLERİ VİRUS HASTALIKLARINDA TANI YÖNTEMLERİ Doç. Dr. Koray Ergünay MD PhD Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Viroloji Ünitesi Viral Enfeksiyonlar... Klinik

Detaylı

KOROZYON. Teorik Bilgi

KOROZYON. Teorik Bilgi KOROZYON Korozyon, metalik malzemelerin içinde bulundukları ortamla reaksiyona girmeleri sonucu, dışardan enerji vermeye gerek olmadan, doğal olarak meydan gelen olaydır. Metallerin büyük bir kısmı su

Detaylı

Infrared Spektroskopisi ve Kütle Spektrometrisi

Infrared Spektroskopisi ve Kütle Spektrometrisi Infrared Spektroskopisi ve Kütle Spektrometrisi 1 Giriş Spektroskopi, yapı tayininde kullanılan analitik bir tekniktir. Nümuneyi hiç bozmaz veya çok az bozar. Nümuneden geçirilen ışımanın dalga boyu değiştirilir

Detaylı

TAURİNİN İSKEMİ REPERFÜZYON HASARINDA MMP-2, MMP-9 VE İLİŞKİLİ SİNYAL İLETİ YOLAĞI ÜZERİNE ETKİLERİ

TAURİNİN İSKEMİ REPERFÜZYON HASARINDA MMP-2, MMP-9 VE İLİŞKİLİ SİNYAL İLETİ YOLAĞI ÜZERİNE ETKİLERİ TAURİNİN İSKEMİ REPERFÜZYON HASARINDA MMP-2, MMP-9 VE İLİŞKİLİ SİNYAL İLETİ YOLAĞI ÜZERİNE ETKİLERİ CEMRE URAL 1, ZAHİDE ÇAVDAR 1, ASLI ÇELİK 2, ŞEVKİ ARSLAN 3, GÜLSÜM TERZİOĞLU 3, SEDA ÖZBAL 5, BEKİR

Detaylı

SU ve ÇEVRENİN CANLILAR İÇİN UYGUNLUĞU

SU ve ÇEVRENİN CANLILAR İÇİN UYGUNLUĞU SU ve ÇEVRENİN CANLILAR İÇİN UYGUNLUĞU Suyun polaritesinin etkileri Su molekülünün polar olması hidrojen bağlarının oluşmasına neden olur. 2 Su molekülü Oldukça basit yapılıdır. Tekli bağla bağlı olup

Detaylı

HPLC (Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografisi)

HPLC (Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografisi) HPLC (Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografisi) HPLC yöntemi bir sıvıda çözünmüş bileşenlerin, bir kolon içerisinde bulunan genellikle katı bir destek üzerindeki sabit faz ile değişik etkileşimlere girmesi,

Detaylı

Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi ECZ 344 Prof.Dr. Dilek AK 28.03.2014 /4. DERS BİYOLOJİK SIVILAR

Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi ECZ 344 Prof.Dr. Dilek AK 28.03.2014 /4. DERS BİYOLOJİK SIVILAR 1 Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi ECZ 344 Prof.Dr. Dilek AK 28.03.2014 /4. DERS BİYOLOJİK SIVILAR PLAZMA ve SERUM 2 Kan, antikoagülan ilave edilmeden bir tüpe alınır ve pıhtılaşması için bekletilirse

Detaylı

OPTİK ÇEVİRME DAĞILIMI VE DAİRESEL DİKROİZM

OPTİK ÇEVİRME DAĞILIMI VE DAİRESEL DİKROİZM 1 OPTİK ÇEVİRME DAĞILIMI VE DAİRESEL DİKROİZM Ref. e_makaleleri, Enstrümantal Analiz Optik çevirme dağılımı ve dairesel dikroizm, her ikisi de, dairesel polarize ışının optikce aktif taneciklerle etkileşimine

Detaylı

Kasetin arka yüzeyi filmin yerleştirildiği kapaktır. Bu kapakların farklı farklı kapanma mekanizmaları vardır. Bu taraf ön yüzeyin tersine atom

Kasetin arka yüzeyi filmin yerleştirildiği kapaktır. Bu kapakların farklı farklı kapanma mekanizmaları vardır. Bu taraf ön yüzeyin tersine atom KASET Röntgen filmi kasetleri; radyografi işlemi sırasında filmin ışık almasını önleyen ve ranforsatör-film temasını sağlayan metal kutulardır. Özel kilitli kapakları vardır. Kasetin röntgen tüpüne bakan

Detaylı

Yıldız Teknik Üniversitesi Çağdaş, Öncü, Yenilikçi

Yıldız Teknik Üniversitesi Çağdaş, Öncü, Yenilikçi Hava Kirliliği Ölçüm Yöntemleri Emisyon Ölçümleri (Kaynakta) İmisyon Ölçümleri Sabit kaynaklar (Yakma tesisi, fabrika, termik santral bacaları) Hareketli kaynaklar (Motorlu araçlar) Ortam havasında yapılır

Detaylı