Bir Kimyasal Savaş Ajanının Böbrekler Üzerindeki Akut Toksititesinin Araştırılması

Transkript

1 Araştırma/Research Article Bir Kimyasal Savaş Ajanının Böbrekler Üzerindeki Akut Toksititesinin Araştırılması Turgut Topal 1, Muharrem Uçar 2, Ercan Göçgeldi 3, Hakan Yaren 4, Bülent Kurt 5, Recai Oğur 3, Ahmet Korkmaz 1 * 1 Gülhane Askeri Tıp Fakültesi Fizyoloji AD, 2 Tıp Tarihi ve Deontoloji AD, 3 Halk Sağlığı AD, 4 Tıbbi NBC BD, 5 Patoloji AD, Ankara * Ahmet Korkmaz, GATA Fizyoloji AD, 06018, Etlik, Ankara. E-posta: fizyocan@gmail.com Kor Hek 2007; 6 (4): Özet: Kimyasal Savaş Ajanlarının en önemlilerinden bir tanesi olan sülfür mustard (SM) yaşamsal akut ve kronik toksik etkiler gösterir. Etkilenen en önemli organlar arasında akciğerler, deri, göz ve böbrekler gelmektedir. Bu çalışmada nitrojen mustard (NM) ile oluşturulan böbrek hasarına artmış nitrik oksit (NO) ve peroksinitritlerin aracılık edip etmediği araştırılmıştır. Çalışmada indüklenebilir nitrik oksit sentaz inhibitörü (inos) olarak aminoguanidin (AG), peroksinitrit süpürücüsü olaran ebselen kullanılmıştır. NM uygulaması böbreklerdeki oksidan ve antioksidan parametrelerde önemli değişimle birlikte, doku hasarına neden olmuştur. Tedavi ajanları önemli oranda koruma sağlamış ve oksidan parametrelerde gerilemeye eşlik eden doku iyileşmeleri gözlenmiştir. Çalışmanın sonuçları, NM nin böbreklerde oluşturduğu hasarın önlenmesinde benzer özelliklere sahip ilaçların kullanılabileceğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: kimyasal savaş, sülfür mustard, nitrojen mustard, ebselen, aminoguanidin Investigation of Acute Toxicity of a Chemical Warfare Agent in Kidneys Abstract: One of the most important chemical warfare agents, sulfur mustard (SM) causes crucial acute and chronic toxic effects. Lung, skin, eye and kidneys are the most affected organs. In this work, it was investigated if increased nitric oxide (NO) and peroxynitrite are involved in nitrogen mustard (NM) induced kidney damage. In this experimen, aminoguanidine (AG) as inducible nitric oxide synthase (inos) inhibitor and ebselen as peroxynitrite scavenger were used. NM administration resulted in important oxidant and antioxidant changes as well as tissue damage in kidneys. Therapeutic agents showed significant protection and reduced oxidant parameteres leading to tissue healing was observed. Results of this study suggest that drugs with similar properties can be used to protect kidney damage caused by NM. Key words: chemical warfare, sulfur mustard, nitrogen mustard, ebselen, aminoguanidine GİRİŞ Mustard grubu ajanlar sülfür, azot ve oksijen bazlı bileşikler olup birbirine benzer kimyasal ve biyolojik etkiler gösterirler. Mustard grubu ajanlar ikiye ayrılır; birincisi sülfür mustard [SM; bis (2- chloroethyl)sulfide)] olup en önemli kimyasal savaş ajanlarından bir tanesidir. İkincisi nitrojen mustard [NM; bis (2-chloroethyl)methylamine] ve NM türevi ajanlardır. Bu ajanlardan başlıcaları mekloretamin, klorambusil (KB), siklofosfamid (SF) ve ifosfamid (İF) olarak sıralanabilir (1). NM İkinci Dünya Savaşı sırasında geliştirilmiş bir ajandır; ancak kısa zamanda bir kimyasal savaş ajanı olarak kullanılmaya uygun olmadığı anlaşılmıştır. NM türevleri olan KB, SF ve İF son otuz yıldır yaygın kullanılan kemoterapötik ajanlardandır. Mustard grubu ajanların temel etki mekanizması DNA alkilasyonudur. Bu sayede etkiledikleri hücrenin mitoz ile çoğalmasına engel olurlar (2). Tüm mustard grubu ajanlara ait alkile edici özellik kendilerine değil metabolitlerine bağlıdır. Bu metabolitler SM için etilen episülfonyum, SF ve IF için ise akrolein ve diğer metabolitleridir. Mustard grubu ajanların herbiri kendine özgü ciddi toksik etkilere sahiptir. Bu etkiler DNA alkilasyonunun sonucu olarak ortaya çıkan mitotik inhibisyonun yanında spesifik olarak örneğin SM için özellikle akciğer, göz ve deride, SF ve İF için ise ağırlıklı olarak mesanede ortaya çıkar (3). SM yi önemli bir savaş ajanı yapan da özellikle akciğer, göz ve deri üzerindeki kronik toksik etkileridir. Bunun yanında böbrek, karaciğer, dalak, ince barsak gibi viseral organlar da mustard grubu ajanlardan ciddi olarak etkilenirler. Mustard grubu ajanların tamamının etki mekanizması olan DNA alkilasyonu kronik bir etki kabul edilir. Ancak mustard grubu ajanlara yüksek dozda maruziyetin deneysel olarak başka mekanizmaları da çalıştırarak 227

2 daha erken hücre ölümüne neden olduğu gösterilmiştir (3, 4). Kimyasal savaş ajanına maruziyetten saatler sonra başlayan akut toksik etkilerin alkile edici özelliğinden çok, hücrelerde reaktif oksijen türevlerinin üretiminin artması ve oksidan stres ile karakterize bir süreç ile ortaya çıktığına dair veriler mevcuttur. N-asetil sistein, amifostine gibi pekçok antioksidan madde SM nin özellikle akciğerdeki akut toksik etkilerini azaltmıştır (5-7). Son dönemde çeşitlenen çalışmalar, mustard grubu ajanların toksik etkilerine SOR yanında özellikle indüklenebilir nitrik oksit sentaz (inos) kaynaklı NO nun da eşlik ettiğini göstermiştir. Non-selektif NOS inhibitörü olan L-NAME (8-10), ve selektif inos inhibitörü aminoguanidin mustard grubu ajanların yan etkilerini azaltmıştır (11). Bu çalışmada aynı zamanda NM nin akciğer toksisitesine SOR ve NO nun oluşturduğu peroksinitritlerin neden olduğu gösterilmiştir (11). SOR ve NO nun reaksiyonu sonucu oluşan peroksinitritler, radikal olmamasına rağmen, güçlü okside edici maddelerdir. Yarılanma ömürlerinin öncül moleküllerine (süperoksit ve nitrik oksit) göre uzunluğu ve okside edici özellikleri sayesinde membran lipidleri, tioller, her tür protein (yapısal, enzimatik) ve DNA gibi hücresel makromoleküllerin tamamını hasarlayabilir. Mustardların hücre içinde oluşturdukları akut hasarın mekanizması daha önceki çalışmalarımızda ayrıntılı olarak açıklanmıştır (12). Her ne kadar mustard grubu savaş ajanlarının kronik etkileri akciğer, deri ve göz üzerinde yoğunlaşsa da, özellikle Vijayaraghavan ve arkadaşlarıın yaptığı çalışmalar viseral organlarda da önemli hasar olabileceğini bildirmiştir (13). NM grubu ajanlar daha az toksik olmakla birlikte kimyasal ve toksikolojik olarak SM ile benzer etkilere sahiptir. Deneysel olarak SM kullanımı son derece tehlikeli olduğu için mekloretamin vb. türevleri araştırma amaçlı kullanılmaktadır. Bu çalışmada da mustard türevi olarak mekloretamin kullanılmış ve böbrek üzerinde oluşturduğu akut toksik etkilerin SOR, NO ve bunların öncülük ettiği peroksinitritler üzerinden olup olmadığının gösterilmesi amaçlanmıştır. GEREÇ VE YÖNTEM Çalışmamızda kullanılan 30 adet Wistar Albino türü erkek sıçan kontrol, mekloretamin, ebselen ve aminoguanidin (AG) olmak üzere dört gruba ayrıldı. Çalışmaya başlamadan önce 7 gün süreyle aklimatize edilen sıçanlar, o C sıcaklıktaki ortamda tutularak, normal sıçan yemi ve musluk suyu ile beslendi. Çalışma prosedürü yerel etik kurulu tarafından kabul edilmiştir. Mekloretamin dozu Vijayaraghavan ın çalışmasında Wistar Albino sıçanlar için tespit ettikleri oral LD 50 dozu (6.8 mg/kg) referans alınarak uygulandı. Mekloretamin SM ye göre daha az toksik olduğu ve hayvanlarda 72. saatteki akut etkileri araştırıldığı için oral doz aynıyla tek doz olarak uygulandı. Ebselen 20 mg/kg (oral) ve AG 100 mg/kg (intraperitoneal) dozunda mekloretamin uygulamasına eş zamanlı olarak verilmeye başlandı ve 72. saate kadar 12 saat arayla toplam 6 doz uygulandı. Çalışma sonundaki cerrahi işlemden önce nitrik oksit üretimindeki (özellikle inos aktivasyonunu yansıtması nedeni ile) değişimi tespit etmek için hayvanlar metabolik kafeslere alınarak son 12 saatteki idrarları toplandı. Toplanan idrarlar NO metabolizmasının dolaylı göstergesi kabul edilen nitrit ve nitrat (NO x ) düzeyi tespitinden önce - 80 o C buzdolabında saklandı. Hayvanlar mekloretamin uygulamasından 72 saat sonra ketamin (100 mg/kg) ve ksilazin (5 mg/kg) ile anestezi edildi. Sağ böbrekler cerrahi yöntemle çıkarılarak histopatolojik değerlendirme için %10 luk formalin solüsyonu içine alındı. Sol böbrekler ise doku süperoksit dismutaz (SOD), Glutatyon peroksidaz (GPx) ve Malondialdehit (MDA) düzeylerinin tespiti için sıvı nitrojende dondurularak, - 80 o C buzdolabında saklandı. Biyokimyasal ve Histopatolojik Analizler Homojenizasyon yapmak üzere -80 o C buzdolabından çıkarılan böbrek dokuları çözüldü. Daha sonra dokular ph sı 7.4 olan fosfat tampon içersinde homojenizatör (Heidolph Diax 900) ile homojenize edildi. Homojenize edilen dokularda ilk olarak dokuda yapılacak biyokimyasal ölçümlerde kullanılmak üzere protein miktarları Lowry nin tarif ettiği yöntem ile (14) ölçüldü. MDA ölçümü Okhawa nın tarif ettiği (15) tiyobarbitürik asit reaksiyonu esasına dayanan spektrofotometrik (UNICAM, Helios Epsilon, USA) yöntemle yapıldı. SOD aktivitesine Sun ın tarif ettiği (16) Nitroblue tetrazolium reaksiyonu esasına dayanan spektrofotometrik yöntemle bakıldı. GPx aktivitesi Paglia ve Valentine nin tarif ettiği (17) glutatyon redüktaz yoluyla oluşan NADPH oksidasyon reaksiyonu esasına dayanan spektrofotometrik yöntemle ölçüldü. İdrarda NO x tayini Miranda ve arkadaşlarının tarif ettiği (18) Griess reaksiyonu esasına dayanan spektrofotometrik yöntemle yapıldı

3 Histopatolojik inceleme için alınan böbrek örnekleri %10 luk tamponlu formalinde 24 saat bekletildi. Rutin patolojik takip ardından elde edilen parafin bloklardan 5 mikron kalınlığında kesitler alındı. Kesitler Hematoksilen Eozin (HE) ile boyandı ve ışık mikroskopu (Nikon, Tokyo, Japonya) ile değerlendirildi. Patolojik incelemede glomerüller, interstisyel alan ve tübüller değerlendirildi. Tüm gruplar arasındaki karşılaştırma Kruskal Wallis testi, gruplar arasındaki ikişerli karşılaştırmalar ise Mann Whitney U testi ile yapıldı. p<0.05 anlamlı olarak kabul edildi. mekloretamin grubuna ait biyokimyasal parametlerden SOD kontrol grubuna göre anlamlı olarak artmıştı. Bu artış AG ve Ebselenin uygulandığı gruplarda da yüksek olarak devam etti. Mekloretamin grubu GPx düzeylerinin kontrol grubuna göre anlamlı şekilde düştüğü gözlendi. Mekloretamin grubundaki bu düşüşün tedavi ajanları ile engellenemediği ve doku GPx düzeylerinin tedaviye rağmen düşük devam ettiği gözlendi. Tüm biyokimyasal veriler Tablo 1 de özetlenmiştir. BULGULAR Histopatolojik incelemelerde, kontrol grubunda incelenen yapılar normal olarak değerlendirildi (Resim 1). Mekloretamin verilen gruptaki böbrek kesitlerinde interstisyel inflamasyon görüldü. Mekloretamin grubun en dikkat çekici özelliği renal papillalarda bölgesel nekrotik alanların görülmesiydi (Resim 2). Ebselen uygulanan grupta damarlarda konjesyon haricinde patolojik bulgu izlenmedi (Resim 3). AG uygulanan grupta bölgesel interstisyel inflamasyon görüldü (Resim 4). Doku MDA düzeyleri mekloretamin uygulanan grupta anlamlı şekilde yükseldi. Özellikle ebselen uygulaması MDA düzeylerini anlamlı şekilde düşürdü. AG uygulanan grupta bir azalma olsa da istatistiksel olarak anlamlı değildi. SOD düzeyleri, Resim 1. Kontrol grubu; normal glomerüler yapı. Ödem, kanama ve inflamasyon gözlenmemiştir (HE, x100). Resim 2. Mekloretamin grubu; interstisyel inflamasyon, yer yer hemorajik alanlar ve yoğun nötrofil infiltrasyonu gözlenmektedir (HE, x50) (solda). Mekloretamin uygulamasına bağlı papiller nekroz (HE, x100) (sağda)

4 Resim 3. Ebselen grubu; uygulama mekloretaminin neden olduğu inflamasyonu geriletmiştir. Ödem ve kanama odakları azalmıştır (HE, x100). Resim 4. AG grubu; devam eden bölgesel interstisyel inflamasyon. AG ile sağlanan doku iyileşmesi ebselen kadar olmamıştır (HE, x100). Tablo 1. Böbrek dokusu MDA, SOD, GPx sonuçları ve idrarda NOx sonuçları (Ortalama±Standart sapma) Gruplar Hayvan sayısı (n) MDA (mmol/gpro) SOD (U/gpro) GPx (U/gpro) NO x (µm) Kontrol ± ± ± ±7.690 Mekloretamin ±0.055* ±2.770* ±3.168* ±6.506* Mekloretamin+Ebselen ±0.037 # ±2.500* ±8.289* ±4.941* Mekloretamin+AG ± ±1.768* ±2.520* ±5.999 # *p<0.01, kontrol grubuna göre anlamlı azalma veya artma # p<0.01, mekloretamin grubuna göre anlamlı azalma İdrar NO x düzeyleri, mekloretamin grubuna ait idrar NO x değerleri kontrol grubuna göre anlamlı şekilde yüksekti. Ebselen grubunda NO x değerleri AG grubuna göre anlamlı şekilde yüksek ve mekloretamin grubuna yakındı. AG idrar NO x değerlerini başarılı şekilde düşürmüştür. TARTIŞMA SM bilinen en güçlü ve en çok kullanılan kimyasal savaş ajanlarından biridir. Bu nedenle savaş gazlarının kralı olarak tanımlanmıştır. Özellikle yakın geçmişte (İran-Irak savaşı) kullanılmış olması (19) ve pek çok ülkenin stoklarında bulunması durumu daha ciddi hale getirmektedir. Halen bir antidotunun olmaması, SM nin toksik etki mekanizmalarının (akut ve kronik) araştırılmasını cazip hale getirmektedir. SM a ait bir antidotun geliştirilebilmesi için hasar mekanizmasının tamamen ortaya konması önemlidir. Öyle ki, bir kez maruziyete rağmen toksik bulguların yıllarca devam etmesi ve ilerleyici karakter göstermesi mekanizmayı daha da önemli hale getirmektedir (4). Toksik etkileri SM nin araştırma amaçlı kullanımını kısıtlamaktadır. Bu nedenle çalışmamızda SM ile benzer farmakolojik ve toksik etkiler gösteren NM grubu ajanlardan mekloretamin kullanılmıştır. Çalışmamızdan elde edilen histopatolojik bulgular mekloretaminin böbrekte oluşturduğu hasarın gerek AG gerekse ebselen ile azaltılabildiğini göstermiştir. Selektif inos inhibitörü olan AG nin, bu modelde hasarı azaltması akut renal toksik etkinin patogenezinde inos indüksiyonunun ve artmış NO üretiminin payı olduğunu düşündürmektedir (9). Bu veriler mekloretamin grubundan elde edilen idrar NOx değerleri ile de örtüşmektedir. Mekloretamin grubunda idrar NOx değerleri kontrol grubuna göre anlamlı şekilde artmıştır. Bu artış AG uygulaması ile kontrol grubuna yakın değerlere kadar inmiştir (grafik 4). Güçlü bir peroksinitrit süpürücüsü olan ebselen grubunun sonuçları da AG grubuna benzerlik göstermektedir. Ancak ebselen inos enzimini inhibe etmediği için idrar NOx değerleri mekloretamin 230

5 grubuna yakın değerlerde çıkmıştır (grafik 4). inos inhibisyonu olmaksızın böbrek hasarının azaltılması fizyopatalojik süreçte SOR ve/veya NO dan ziyade peroksinitritin önemli olduğunu göstermektedir. İntratrakeal mekloretamin uygulaması ile akciğerdeki hasar mekanizmasının araştırıldığı önceki çalışmamızda da, akut akciğer toksisitesinde peroksinitritin rolü gösterilmiştir (11). Ancak mustard grubu ajanlar başka pek çok organda da toksik bulgular gösterdiği için (karaciğer, dalak, akciğer, gastrointestinal sistem vb.) idrar NO x artışı ve dolayısıyla inos indüksiyonunun pek çok dokuda ortaya çıkabileceği unutulmamalıdır. Ancak inos inhibitörü AG ve peroksinitrit süpürücüsü ebselenin böbrek hasarını azaltması, mekloretamine ait hasar mekanizmasında -akciğerde olduğu gibiböbreklerde de SOR, NO ve peroksinitritlerin rolü olabileceği değerlendirilmiştir. Böbreğin oksidan ve antioksidan sistemine ait ölçümler de mekloretamin uygulanan deney hayvanlarının önemli bir oksidan strese maruz kaldıklarını göstermektedir. Mekloretamin grubundan elde edilen MDA değerleri böbrek dokusunda istatistiksel olarak anlamlı oksidan stres artışını gösterdi. Lipid peroksidasyonunun bir göstergesi olan MDA düzeyleri böbrekte antioksidan enzimlerin üstesinden gelemeyeceği kadar fazla radikal oluştuğunu düşündürdü. Yine aynı grupta SOD düzeylerinin anlamlı şekilde artması bunu destekleyen bir bulgudur. Ancak ilginç bir şekilde glutatyon üzerinden işleyen antioksidan savunmanın bir göstergesi olan GPx mekloretamin grubunda anlamlı şekilde düşük bulundu. GPx reaktif oksijen türevlerinin detoksifikasyonunda önemli bir enzimdir. Süperoksitin ortamdan uzaklaştırılmasında birinci basamakta en önemli enzim olan SOD düzeylerinin mekloretamin grubunda artmış olması dokuda SOR üretiminin arttığının önemli bir göstergesidir. Ancak düşmüş GPx düzeyleri ortaya çıkan hidrojen peroksiti suya indirgeyemediği için, hidroksil radikalinin üretimini artırmış olabilir. Hidroksil radikali bilinen en güçlü oksidanlardan biridir ve hücresel tüm makro-molekülleri hasarlayabilir. Doku MDA düzeylerinin özellikle ebselen grubundaki anlamlı düşüşü bir başka gerçeği göz önüne sermektedir. Ebselen dokuda SOR ve artmış NO üretimine engel olmamaktadır. Ebselen temel olarak güçlü bir peroksinitrit süpürücüsüdür ancak bu grupta hem histolojik hasarın azalması hem de MDA düzeylerinin anlamlı düşüşü önemli bir noktayı ortaya çıkarmaktadır. Ebselen grubunda gözlenen MDA düşüşüne GPx ve SOD düşüşü eşlik etmemiştir. Bu durum böbrekte oksidan hasarın halen devam ettiği şeklinde yorumlanabilir. inos kaynaklı artmış NO üretiminin kendisinin zararlı olup olmadığı uzun süre tartışılmıştır (20). Bilindiği kadarı ile tek başına artmış NO düzeyleri hücresel düzeyde büyük hasara neden olmamaktadır. Tüm inflamatuar süreçlerde hemen tüm hücreler inos indüksiyonu ile yüksek düzeyde NO üretirler. Bunun yanında bir başka gerçek, tüm inflamatuar süreçlerde SOR üretiminin de artmış olduğudur. Beckman artmış NO ve süperoksit üretiminin olduğu süreçlerde NO nun süperoksite olan ilgisinin çok yüksek olduğunu, SOD enzimi ile süperoksite karşı yarıştığını ve SOD enzimini devre dışı bıraktığını göstermişlerdir. Özetle NO ve süperoksit üretiminin yüksek olduğu süreçlerde peroksinitrit oluşumu kaçınılmazdır. Mustard toksisitesinde önemli yer tutan peroksinitritlerin oluşumu ile sonuçlanan süreç daha önceki bir çalışmada ayrıntılı olarak açıklanmış ve şeytan üçgeni olarak tanımlanmıştır (12). Bu nedenle SOR, NO ve peroksinitritlerin oluşturduğu bu üçgende en önemli hasara peroksinitritlerin neden olduğu ifade edilebilir. Ebselen grubundaki doku iyileşmesi ve MDA düşüşü bu iddiayı desteklemektedir. AG ise artmış NO üretimini baskılayarak peroksinitrit oluşumuna engel olur ve iyileşmeye katkıda bulunur. Gerçekte SM gibi son derece lipofilik bir molekülün maruziyetten sonra hücrelere girişinin engellenmesi zor gözükmektedir ve ayrı bir araştırma sahasıdır. Bununla birlikte akut SM hasarına karşı geliştirilecek bir antidotun da tıpkı SM gibi tüm hücrelere kolaylıkla girebilmesi (lipofilik olması ve/veya reseptörünün olması), güçlü antioksidan, inos inhibitörü ve peroksinitrit süpürücüsü gibi özellikleri olması beklenmelidir (4). İleri çalışmalarda ince barsak, karaciğer vb. organlardaki hasarın araştırılmasının yanında, SM nin kronik ve/veya gecikmiş toksik etkilerinin de göz önünde bulundurulması yararlı olacaktır. Son yıllarda kimyasal savaş ajanlarının, savaş durumu dışında terör eylemlerinde de kullanılması ve toplumun hemen her kesimini tehdit edebilmesi nedeniyle SM hasarına ve diğer kimyasal savaş ajanlarına karşı geliştirilecek antidotların toplum sağlığı açısından önemi gün geçtikçe artmaktadır. KAYNAKLAR 1. Saladi RN, Smith E, Persaud AN. Mustard: a potential agent of chemical warfare and terrorism. Clin Exp Dermatol 2006; 31 (1): Balali-Mood M, Hefazi M, Mahmoudi M, Jalali E, Attaran D, Maleki M, Razavi ME, Zare G, Tabatabaee A, Jaafari MR. Long-term complications of sulphur mustard poisoning in severely intoxicated Iranian veterans. Fundam Clin Pharmacol 2005; 19 (6):

6 3. Kehe K, Szinicz. Medical aspects of sulphur mustard poisoning. Toxicology 2005; 214 (2): Balali-Mood M, Hefazi M. The pharmacology, toxicology, and medical treatment of sulphur mustard poisoning. Fundam Clin Pharmacol 2005; 19 (3): Bobb AJ, Arfsten DP, Jederberg WW. N-acetyl-L-Cysteine as prophylaxis against sulfur mustard. Mil Med 2005; 170 (1): Chatterjee D, Mukherjee S, Smith MG, Das SK. Evidence of hair loss after subacute exposure to 2-chloroethyl ethyl sulfide, a mustard analog, and beneficial effects of N- acetyl cysteine. J Biochem Mol Toxicol 2004; 18 (3): Santini V, Giles FJ. The potential of amifostine: from cytoprotectant to therapeutic agent. Haematologica 1999; 84 (11): Sawyer TW, Lundy PM, Weiss MT. Protective effect of an inhibitor of nitric oxide synthase on sulphur mustard toxicity in vitro. Toxicol Appl Pharmacol 1996; 141 (1): Sawyer TW. Modulation of sulfur mustard toxicity by arginine analogues and related nitric oxide synthase inhibitors in vitro. Toxicol Sci 1998; 46 (1): Sawyer TW, Hancock JR, D'Agostino PA. l-thiocitrulline: A potent protective agent against the toxicity of sulphur mustard in vitro. Toxicol Appl Pharmacol 1998; 151 (2): Yaren H, Mollaoglu H, Kurt B, Korkmaz A, Oter S, Topal T, Karayilanoglu T. Lung toxicity of nitrogen mustard may be mediated by nitric oxide and peroxynitrite in rats. Res Vet Sci 2007; 83 (1): Korkmaz A, Yaren H, Topal T, Oter S. Molecular targets against mustard toxicity: implication of cell surface receptors, peroxynitrite production, and PARP activation. Arch Toxicol 2006; 80 (10): Vijayaraghavan R, Kulkarni A, Pant SC, Kumar P, Rao PV, Gupta N, Gautam A, Ganesan K. Differential toxicity of sulfur mustard administered through percutaneous, subcutaneous, and oral routes. Toxicol Appl Pharmacol 2005; 202 (2): Lowry OH RN, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the folin-phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193 (2): Okhawa H ON, Yagi K. Assay or lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 1979 (4); 95: Sun Y OL, Ying L. A simple method for clinical assay of superoxide dismutase. Clin Chem 1988 (5): 34: Paglia DE, Valentine WN. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 1967; 70 (1): Miranda KM, Wink DA. A rapid, simple spectrophotometric method for simultaneous detection of nitrate ande nitrite. Nitric Oxide 2001; 5 (1): Benschop HP, van der Schans GP, Noort D, Fidder A, Mars-Groenendijk RH, de Jong LP. Verification of exposure to sulfur mustard in two casualties of the Iran- Iraq conflict. J Anal Toxicol 1997; 21 (4): Beckman JS, Koppenol WH. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: the good, the bad, and ugly. Am J Physiol 1996; 271 (5 Pt 1):C