Beşinci Baskıya Önsöz, xv Dördüncü Baskıya Önsöz, xvi Üçüncü Baskıya Önsöz, xvii İkinci Baskıya Önsöz, xviii Birinci Baskıya Önsöz, xx

Transkript

1 Beşinci Baskıya Önsöz, xv Dördüncü Baskıya Önsöz, xvi Üçüncü Baskıya Önsöz, xvii İkinci Baskıya Önsöz, xviii Birinci Baskıya Önsöz, xx Kısım 1: Gen Klonlama ve DNA Analizinin Temel İlkeleri, 1 1 Gen Klonlama ve DNA Analizi Neden Önemlidir, Genetiğin ilk gelişimi, Gen klonlama ve polimeraz zincir reaksiyonunun keşfi, Gen klonlama nedir? PCR nedir? Gen klonlama ve PCR neden çok önemlidir, Klonlamayla gen izolasyonu, PCR la gen izolasyonu, Bu kitap boyunca yolunuzu nasıl bulursunuz, 12 2 Gen Klonlama İçin Vektörler: Plazmitler ve Bakteriyofajlar, Plazmitler, Plazmitlerin temel özellikleri, Büyüklük ve kopya sayısı, Konjugasyon ve uyumluluk, Plazmitlerin sınıflandırılması, Bakteriler dışındaki organizmalarda plazmitler, Bakteriyofajlar, Bakteriyofajların temel özellikleri, Lizojenik fajlar, 20 v

2 λ DNA molekülünün gen düzenlenmesi, 22 λ DNA sının doğrusal ve halkasal formları, 23 M13 İpliksi bir faj, 25 Klonlama vektörü olarak M13 ün cazibesi, Diğer organizmalar için klonlama vektörleri olarak virüsler, 27 3 Canlı Hücrelerden DNA nın Saflaştırılması, Total hücre DNA sının hazırlanması, Bir bakteri kültürünü büyütme ve harmanlama, Bir hücre özütünün hazırlanması, Bir hücre özütünden DNA nın saflaştırılması, 33 Organik özütleme ve enzim sindirimiyle bulaşkanların uzaklaştırılması, 34 Bir hücre özütünden DNA'yı saflaştırmak için iyon-değiştirme kromatografisinin kullanımı, DNA numunelerinin derişimi, DNA derişiminin ölçülmesi, Total hücre DNA sının hazırlanması için diğer metotlar, Plazmit DNA sının hazırlanması, Büyüklük esasına dayalı ayırma, Konformasyona dayalı ayırma, 42 Alkalin denatürasyon, 43 Etidyum bromür- sezyum klorür yoğunluk kademeli santrifüjleme, Plazmit çoğaltılması, Bakteriyofaj DNA sı hazırlama, Yüksek λ titresi elde etmek için kültürlerin büyütülmesi, Lizojenik olmayan λ fajını hazırlama, Enfekte bir kültürden fajın toplanması, λ faj partiküllerinden DNA nın izolasyonu, M13 DNA sının saflaştırılması birkaç probleme yol açar, 52 4 Saflaştırılmış DNA nın Manipülasyonu, DNA manipülatif enzimler serisi, Nükleazlar, Ligazlar, Polimerazlar, DNA yı modifiye eden enzimler, Topoizomerler, DNA yı kesmek için enzimler restriksiyon endonükleazlar, Restriksiyon enzimlerinin keşfi ve işlevi, 63 vi

3 4.2.2 Tip II restriksiyon endonükleazları DNA nın spesifik nükleotit dizilerini keser, Küt uçlar ve yapışkan uçlar, Bir DNA molekülündeki tanıma dizilerinin sıklığı, Laboratuvarda bir restriksiyon sindiriminin gerçekleştirilmesi, Restriksiyon endonükleaz kesim sonuçlarını değerlendirme, 70 Jel elektroforezi ile moleküllerin ayırımı, 70 Jel boyamayla DNA moleküllerinin görüntülenmesi, 70 Otoradyografi ile DNA moleküllerini görüntüleme, DNA moleküllerinin büyüklüklerinin hesaplanması, Bir DNA molekülündeki farklı kesim pozisyonlarını haritalama, Ligasyon - DNA moleküllerini birbirine bağlama, DNA ligazın etki şekli, Bağlamanın etkisini artıran yapışkan uçlar, Küt uçlu bir moleküle yapışkan uçlar koymak, 80 Linkerler, 80 Adaptörler, 80 Homopolimer kuyruk takmayla (Homopolymer Tailing) yapışkan uçlar üretmek, 84 5 Canlı Hücrelere DNA nın Girişi, Transformasyon - bakteri hücreleri tarafından DNA nın alınması, Tüm bakteri türleri DNA alımında eşit şekilde etkili değildir, Kompetan E. coli hücrelerinin hazırlanması, Transforme olan hücrelerin seçilmesi, Rekombinantların Saptanması, pbr322 ile rekombinant seçimi bir antibiyotik direnç geninin insersiyonel inaktivasyonu, İnsersiyonel inaktivasyon, daima antibiyotiğe dirençliliği gerektirmez, Bakteri hücrelerine faj DNA sının sokulması, Transfeksiyon, λ klonlama vektörlerinin in vitro paketlenmesi, Faj enfeksiyonu bir agar ortam üzerinde plakalar şeklinde belirir, Rekombinant fajların saptanması, Faj vektörü tarafından taşınan lacz geninin insersiyonal inaktivasyonu, λ cl geninin insersiyonel inaktivasyonu, 101 vii

4 5.4.3 Spi fenotipini kullanarak seçilim, λ genomu büyüklüğüne dayalı seçilim, Bakteri olmayan hücrelerin transformasyonu, Bireysel hücrelerin transformasyonu, Tüm organizmanın transformasyonu, E. coli İçin Klonlama Vektörleri, E. coli plazmitlerine dayalı klonlama vektörleri, Plazmit klonlama vektörlerinin isimlendirilmesi, pbr322 nin kullanışlı özellikleri, pbr322 nin pedigrisi, Diğer tipik E. coli plazmit klonlama vektörleri, 109 puc8- Lac seçilim plazmiti, 111 pgem3z- klonlanan DNA nın in vitro transkripsiyonu, M13 bakteriyofajına dayalı klonlama vektörleri, M13mp2 klonlama vektörlerinin geliştirilmesi, 115 M13mp7- simetrik klonlama yerleri, 115 Daha kompleks M13 vektörleri, Hibrit plazmit- M13 vektörleri, λ bakteriyofajına dayalı klonlama vektörleri, λ genomunun parçaları, canlılığını yok etmeksizin çıkarılabilir, Doğal seçilim, belli restriksiyon yerlerinden yoksun modifiye λ yı izole etmek için kullanılabilir, İnsersiyon ve replasman (replacement) vektörler, 123 İnsersiyon vektörleri, 123 Replasman vektörleri, λ insersiyon ya da replasman vektörleriyle klonlama deneyleri, Uzun DNA fragmanları bir kozmit kullanarak klonlanabilir, λ ve diğer yüksek kapasiteli vektörler gen kütüphanelerinin yapılmasına izin verirler, Diğer bakteriler için vektörler, 130 viii 7 Ökaryotlar İçin Klonlama Vektörleri, Maya ve diğer mantarlar için klonlama vektörleri, μm plazmit için seçici belirteçler, μm plazmit e dayalı vektörler-maya epizomal plazmitleri, YEp maya kromozomal DNA sına sokulabilir, Maya klonlama vektörlerinin diğer tipleri, Yapay kromozomlar mayada uzun DNA parçalarını klonlamak için kullanılabilirler, 138

5 YAC vektörünün yapısı ve kullanımı, 138 YAC vektörleri için uygulamalar, Diğer mayalar ve mantarlar için vektörler, Yüksek bitkiler için klonlama vektörleri, Agrobacterium tumefaciens-doğanın en ufak genetik mühendisi, 141 Bitki hücrelerine yeni genlerin sokulması için Ti plazmitinin kullanılması, 142 Ti plazmitle transforme olan bitkilerin üretimi, 145 Ri plazmit, 145 Agrobacterium plazmitleriyle klonlamanın sınırlamaları, Bitkilerde doğrudan gen transferi ile klonlama, 147 Çekirdeğe doğrudan gen transferi, 147 Genlerin kloroplast genomuna transferi, Bitki virüslerini klonlama vektörleri olarak kullanmak için girişimler, 150 Kaulimovirüs vektörleri, 150 Geminivirüs vektörler, Hayvanlar için klonlama vektörleri, Böcekler için klonlama vektörleri, 151 Drosophila için klonlama vektörleri olarak P elementleri, 151 Böcek virüslerine dayalı klonlama vektörleri, Memelilerde klonlama, 153 Memeliler için klonlama vektörleri, 153 Vektörsüz gen klonlama, Belli Bir Geni İçeren Klon Nasıl Elde Edilir, Seçilim problemi, İstenilen klonu elde etmek için iki temel strateji vardır, Doğrudan Seçilim, Belirteç kurtarma (marker rescue) doğrudan seçilimin kapsamını genişletir, Belirteç kurtarmanın (marker rescue) kapsamı ve sınırlamaları, Bir gen kütüphanesinden bir klonun saptanması, Gen Kütüphaneleri, Tüm genler aynı anda ifade olunmaz, mrna komplementer DNA olarak klonlanabilir, Klon saptamak için metotlar, Komplementer nükleik asit iplikleri birbirleriyle hibritlenir, Koloni ya da plaka ile probu hibritleme, Hibritleme probunun pratik kullanımına örnekler, 172 ix

6 Bir cdna kütüphanesini analiz etmek için bolluk problama, 172 Translasyon ürünü tanımlanan genler için oligonükleotit problar, 172 Heterolog problama ilişkili genlerin saptanmasına izin verir, Klonlanan genin translasyon ürününün saptanmasına dayalı teşhis metotları, 177 İmmünolojik saptama metotları için antikorlar gereklidir, 177 Rekombinant kolonilerde protein saptamak için saflaştırılmış bir antikorun kullanılması, 178 Gen ifadesinin problemi, Polimeraz Zincir Reaksiyonu, Ana hatlarla polimeraz zincir reaksiyonu, Daha detaylarla PCR, Bir PCR için oligonükleotit primerleri tasarlama, Kullanılacak doğru sıcaklığı belirleme, PCR sonrası: PCR ürünlerini çalışma, 189 PCR ürünlerinin jel elektroforezi, 189 PCR ürünlerini klonlama, Taq polimerazın hata oranına ilişkin problemler, 193 Kısım 2: Araştırmalarda Gen Klonlama ve DNA Analizi Uygulamaları, 197 x 10 Genin Yerini ve Yapısını İncelemek, Klonlanan bir genin yeri nasıl çalışılır, Küçük bir DNA molekülündeki bir genin pozisyonunun belirlenmesi, Büyük bir DNA molekülündeki bir genin pozisyonunu belirlemek, 202 Jel elektroforezi ile kromozomların ayrılması, 203 Ökaryotik kromozoma klonlanan bir genin pozisyonunu in situ hibritleme ile görüntüleme, DNA baz dizisi çıkarma- bir genin yapısını çözme, Sanger-coulson metodu; zincir sonlandıran nükleotidler, 207 Primer, 207 Komplementer ipliğin sentezi, 207 Dört ayrı reaksiyon sonlanan ipliklerin dört ailesiyle sonuçlanır, 209 Otoradyografiden DNA dizisinin okunması, 209

7 Baz dizisi çıkarmak için tüm DNA polimerazlar kullanılamaz, Otomatik DNA dizileme, PCR ürünlerini dizileme, Maxam- Gilbert metodu-dna nın kimyasal sindirimi, Uzun bir DNA dizisi oluşturmak, DNA dizilemenin başarılması, Gen İfadesi (ekspresyonunun) ve İşlevini İnceleme, Klonlanan bir genin transkripsiyonunu inceleme, Nükleik asit moleküllerinin elektron mikroskobisi, Nükleaz muamelesi ile DNA-RNA hibritlerinin analizi, Primer uzatmayla transkript analizleri, RNA transkriptlerini incelemek için diğer teknikler, 225 Northern hibritleme, 225 Revers transkripsiyon-pcr (Rt-PCR), 226 cdna uçlarının hızlı çoğaltımı (RACE), 227 RNA dizileme, Gen ifadesinin düzenlenmesini inceleme, Bir DNA molekülü üzerinde protein bağlanma yerlerinin saptanması, 231 DNA-protein komplekslerinin jel gecikmesi (retardasyonu), 231 DNaz I ile ayakizleme (footprinting), 232 Modifikasyon interferans analizleri, Delesyon analiziyle kontrol dizilerininin saptanması, 236 Raportör genler, 236 Delesyon analizini gerçekleştirmek, Klonlanan bir genin translasyon ürününü saptama ve inceleme, HRT ve HART klonlanan genin translasyon ürününü saptayabilir, İn vitro mutagenez ile proteinlerin analizi, 240 In vitro mutagenez tekniklerinin farklı tipleri, 241 Klonlanan bir gende nokta mutasyonu oluşturmak için bir oligonükleotit kullanımı, 243 Klonlanan bir gende bir nokta mutasyonu oluşturmak için diğer metotlar, 245 İn vitro mutagenezin potansiyeli, Protein-protein etkileşimlerinin çalışılması, 247 Faj görüntüleme, 247 Maya iki hibrit sistemi, 250 xi

8 12 Genomları Çalışma, Genomiks bir genom nasıl dizilenir, Genom dizilemede rastgele yaklaşım, 254 H.influenza genomunu dizileme projesi, 255 Rastgele klonlama ile ilgili problemler, Klon kontig yaklaşımı, 257 Kromozom yürüme ile klon kontig birleştirme, 258 Klon kontig birleştirme için hızlı yöntemler, 259 Başlandırılmış dizi bölgesi içeriği analizi ile klon kontig birleştirme, Dizi birleştirmeye yardımcı olacak bir harita yapma, 261 Genetik haritalar, 261 Fiziksel haritalar, 262 Bir haritanın dizi birleştirmede önemi, Post-genomiks bir genom dizisini anlamaya çalışma, Bir genom dizisindeki genleri saptama, 265 Açık okuma çerçevelerini araştırma, 265 Olası ORF lerde gerçek genleri ayırt etme, Bilinmeyen bir genin işlevini belirleme, Transkriptom ve proteom çalışmaları, Transkriptomu çalışma, Proteomu çalışma, 271 Kısım 3: Gen Klonlama ve DNA Analizinin Biyoteknolojide Uygulamaları, Klonlanan Genlerden Protein Üretimi, Yabancı genlerin E. coli de ifade edilmesi için özel vektörler, Promotor bir ifade vektörünün kritik bileşenidir, 282 Promotor dikkatli seçilmelidir, 282 İfade vektöründe kullanılan promotor örnekleri, Kasetler ve gen birleşmeleri, E. coli de rekombinant protein üretimi ile ilgili genel problemler, Yabancı gen dizisinden kaynaklanan problemler, E. coli nin neden olduğu sorunlar, Ökaryotik hücreler tarafından rekombinant protein üretimi, Maya ve ipliksi mantarlardan rekombinant proteinler, 292 Rekombinant protein sentezinde konak olarak Saccharomyces cerevisiae, 292 xii

9 Diğer maya ve mantarlar, Rekombinant protein üretimi için hayvan hücrelerini kullanma, 295 Memeli hücrelerinde protein üretimi, 295 Böcek hücrelerinde protein üretimi, Canlı hayvanlar ve bitkilerden rekombinant protein üretimi (pharming-farmasötiktarım) Hayvanlarda farmasötiktarım, 297 Bitkilerden rekombinant proteinler, 298 Farmasötik tarım ile artan etik sorunlar, Tıpta Gen Klonlama ve DNA Analizi, Rekombinant farmasötiklerin üretimi, Rekombinant insülin, 302 Yapay insülin genlerinin sentezi ve ifadesi, İnsan büyüme hormonlarının E. coli de sentezi, Rekombinant faktör VIII, Diğer rekombinant insan proteinlerinin sentezi, Rekombinant aşılar, 309 Rekombinant proteinler olarak aşı üretimi, 310 Transgenik bitkilerde rekombinant aşılar, 312 Canlı rekombinant aşılar, İnsan hastalıklarından sorumlu genlerin saptanması, Genetik bir hastalık için bir gen nasıl saptanır, 315 İnsan genomunda genin yaklaşık pozisyonunu belirleme, 315 Hastalık genleri için adayların saptanması, Gen tedavisi, Kalıtsal hastalıklar için gen tedavisi, Gen tedavisi ve kanser, Gen tedavisi ile ortaya çıkan etik konular, Tarımda Gen Klonlama ve DNA Analizi, Bitki genetik mühendisliğinde gen ekleme yaklaşımı, Kendi böcek öldürücülerini yapan bitkiler, 324 Bacillus thuringiensis δ-endotoksinleri, 324 Mısıra bir δ -endotoksin genini klonlama, 325 Kloroplastlarda δ-endotoksin genlerinin klonlanması, 328 δ-endotoksin kültür bitkileri için böcek direncini sürdürme, Herbisite dirençli kültür bitkileri, 331 Roundup ready kültür bitkileri, 331 Glifosat dirençli kültür bitkilerinin yeni bir nesli, Diğer gen ekleme projeleri, 334 xiii

10 15.2 Gen çıkarma, Antisens teknolojinin arkasındaki prensip, Antisens RNA ve domateste meyve olgunlaşmasının mühendisliği, 336 Poligalakturonaz genini inaktif hale getirmek için antisens RNA nın kullanımı, 337 Etilen sentezini inaktive etmek için antisens RNA nın kullanımı, Bitki genetik mühendisliğinde antisens RNA kullanımının diğer örnekleri, Genetik olarak değiştirilmiş bitkilerle problemler, Seçilebilir belirteçlerle güvenlik endişeleri, Terminatör teknolojisi, Çevre üzerinde zararlı etkilerin olasılığı, Adli Tıp Biliminde ve Arkeolojide Gen Klonlama ve DNA Analizi, Suç şüphelilerinin teşhisinde DNA analizi, Hibritleme problama ile genetik parmakizleme, Kısa ardışık tekrarların PCR ı ile DNA profilleme, DNA profilleme ile akrabalık çalışma, Akraba bireyler benzer DNA profillerine sahiptir, DNA profilleme ve Romanovların kalıntıları, 350 Romanov kemiklerinin STR analizi, 351 Kayıp çocuklar, DNA analizi ile cinsiyet saptama, Y kromozomuna-özgül dizilere yönlendirilen PCR lar, Amelojenin geninin PCR ı, Arkeogenetik-İnsan evrimi çalışmak için DNA yı kullanma, Modern insanların kökeni, 356 DNA analizleri çoklubölgesel hipotezine ters düştü, 357 DNA analizleri Neanderthal lerin modern Avrupa lıların atası olmadığını gösterir, DNA tarih öncesi insan göçlerini araştırmak için de kullanılabilir, 359 Tarımın Avrupa ya yayılması, 359 Geçmişte Avrupa ya insan göçlerini incelemek için mitokondri DNA sının kullanılması, 360 Sözlük, 363 Dizin, 379 xiv