S r Oositlerinin n Vitro Maturasyonunda Kullan lan Vasat Katk lar

Transkript

1 Bülent POLAT 1 M. R fat SALMANO LU 2 S r Oositlerinin n Vitro Maturasyonunda Kullan lan Vasat Katk lar Özet Bu makalede s r oositlerinin in vitro maturasyonunda kullan lan vasat katk lar hakk nda bilgi verilmesi amaçlanm flt r. n vitro ortamda tek bafl na vasat kullan m, oositlerin maturasyonu ve daha sonraki geliflimleri aç s ndan yetersiz kalmaktad r. Bu nedenle vasata çeflitli serumlar, hormonlar, büyüme faktörleri, hücreler, folliküler s v ve di er katk maddeleri kat lmaktad r. Ancak elde edilen veriler de iflkenlik göstermektedir. Sonuç olarak, bu amaçla kullan lan vasat katk maddeleri üzerine yap lan çal flmalar n güncelli ini korudu u ve bu konuda daha fazla çal fl lmas gerekti i kan s na var lm flt r. Anahtar sözcükler: Katk maddeleri, maturasyon, s r oositi Media Supplements used for In Vitro Maturation of Cattle Oocytes Summary A review of current state of knowledge of media supplements used for in vitro maturation of cattle oocytes is presented. Results obtained by solely use of in vitro maturation media are usually unsatisfactory. For that reason, different sera, hormones, growth factors, cells, follicular fluids and some other supplements are added to in vitro maturation media. However, results have been inconsistent. In conclusion, success of different in vitro maturation media supplements is a current area of investigation and more studies are needed. Key words: Cattle oocyte, maturation, supplement G R fi Antral folliküllerden toplanan memeli oositleri, in vitro vasatlarda mayotik maturasyonu tamamlayabilmektedirler. n vivo ortamda mature olan oositlere göre in vitro mature edilen s r oositlerinin sonraki geliflimleri oldukça düflüktür. Bunun nedeni ise vasatlar n oositler için optimal koflullar tam olarak sa layamamas d r. n vivo flartlar, in vitro ortamda taklit etmek olanaks z olmas na karfl n, maturasyon medyumuna çeflitli serumlar, hormonlar, büyüme faktörleri, hücreler, folliküler s v ve di er katk maddeleri eklenerek oositlerin geliflme yetenekleri art r labilmektedir (2, 18). S r Oositlerinin Maturasyonu Maturasyon, fertilizasyondan önce diploid (2n) kromozom say s na sahip oositlerin mayoz bölünme sonucu kromozom say lar n n haploide (n) indirgenmesi ve bu bölünmeyle birlikte seyreden bir organel yap lanmas sonucu fertilizasyon yetene inin kazan lmas olarak aç klanmaktad r 1 Arafl.Gör., Atatürk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Do um ve Jinekoloji Anabilim Dal 2 Prof. Dr., Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Do um ve Jinekoloji Anabilim Dal 36 Cilt: 76 Say : 3-4 Y l: 2005

2 (20). Oositlerin maturasyonu iki aflamada gerçekleflmektedir. Nükleer maturasyonda germinal vezikül y rt lmas (GVBD), kromozomlar n yo unlaflmas, i ipli i oluflumu, ilk kutup hücresinin at l - m yla homolog kromozomlar n ayr m olaylar n içerir ve metafaz II (M II) aflamas nda durur (17). Nükleer maturasyon hormona ba l bir dönemdir, çünkü bu dönemin bafllamas için LH'n n uyar c, devam içinse steroidlerin mayozisi destekleyici etkisine gereksinim vard r. S r oositlerinin nükleer maturasyonu ortalama 24 saatte tamamlanmaktad r (3). Oosit maturasyonunda fertilizasyonu ve erken embriyonik bölünmeyi desteklemek amac yla sitoplazmada da bir tak m de ifliklikler gerçekleflir. kinci aflama olan sitoplazmik maturasyonda, sitoplazma içerisinde yer alan çekirdek, çekirdekçik, mitokondri, ribozom, golgi kompleksi gibi organellerde yer de ifltirme, farkl fonksiyon kazanma, aktivasyon, say ca art fl ve farkl laflma gibi olaylar gözlenmektedir (17). S r Oositlerinin n Vitro Maturasyonunda Kullan lan Vasatlar Memeli oositlerinin in vitro maturasyonu (IVM) s ras nda kültür flartlar, IVM'yi ve sonraki embriyonik geliflimi etkilemektedir. S r oositlerinin IVM ve fertilizasyonunda kullan lan vasatlardan, Ham's F-10, Ham's F-12, Brister BMOC-3, Waymouth's MB 752/1, Dulbecco'nun B2, KRB (Krebs Medium) ve MEM (Minimum Essential Medium) vasatlar bir çok çal flmada baflar yla kullan lmas na ra men genellikle TCM-199 (Tissue Culture Medium) ve TALP (Tyrode's Albumine Lactate Pyruvate Medium) vasatlar kullan lmaktad r (7). S r Oositlerinin n Vitro Maturasyon Vasat nda Kullan lan Katk Maddeleri Serumlar Uzun bir süredir s r oositlerinin IVM çal flmalar nda bafll ca protein kayna olarak fötal buza- serumu (FCS), östrustaki s r serumu, k s rlaflt - r lm fl bo a serumu veya proöstrustaki s r serumu kullan lmaktad r. Serumlar n muhtemelen embriyo için gerekli olan çeflitli hormon, beslenme ve büyüme faktörlerini içerdikleri ve embriyoyu a r metal ve oksijenin olumsuz etkisinden korudu u düflünülmektedir (6). Östrustaki S r Serumu Östrustaki s r serumunda (ECS) (östradiol: 15 pg/ml) siklusunun di er aflamalar na (östradiol: 5 pg/ml) göre steroid/gonadotropin düzeyi daha yüksek oldu undan, IVM vasat na genellikle ECS kat lmaktad r. Ayn zamanda östradiolün en yüksek seviyede oldu u dönemde LH düzeyinde de art fl gözlenmifltir (6). Vasata kat lan ko-kültürler gözard edildi inde blastosist aflamas na ulaflan oosit say s, vasata östrustaki s r serumu kat ld - nda art fl göstermektedir (5). K s rlaflt r lm fl Bo a Serumu Oositlerin maturasyonunda etkili olmas ndan dolay IVM vasat na k s rlaflt r lm fl bo a serumu da ilave edilmektedir. K s rlaflt r lm fl bo a serumu eklenen vasatlarda erken embriyonik bölünme oran n n % 87,8 ve embriyo eldesinin % 17,6 oldu u bildirilmifltir (6). Proöstrustaki S r Serumu Proöstrustaki s r serumunun (PCS) yüksek düzeyde LH ve prolaktin içermesinden dolay östrustaki s r serumundan daha etkili olabilece i belirtilmektedir (24). S r oositlerinin IVM vasat - na % 20 oran nda proöstrustaki s r serumu (100 ºg/ml LH) ilave edilmesiyle fertilizasyon sonras elde edilen embriyo say s n n, serum eklenmeyen gruba göre önemli miktarda artt belirtilmifltir (25). Fötal Buza Serumu Fötal buza serumunun (FCS) kumulus hücresinin viabilitesini düzenlemek ve ilk mayotik bölünmenin tamamlanmas aç s ndan etkili oldu u belirtilmifltir (6). Ayr ca bu serum, embriyotrofik etki göstererek fertilize olan oositlerin morula ve blastocyst aflamas na ulaflan embriyo say s n da art rmaktad r (21). Fötal buza serumu (% 57-71), ECS'ye (% 34-52) göre daha yüksek fertilizasyon oran sa lamaktad r. Ancak polispermik fertilizasyon oranlar FCS'de (% 8-19), ECS'ye (% 2-3) göre oldukça yüksek görülmüfltür (15). Fetuin Serum bulunmayan vasatlarda oosit maturasyonu kendili inden olufltu u s rada flemotripsin erimesine karfl zona pellusida da (ZP) direnç olufl- Cilt: 76 Say : 3-4 Y l:

3 maktad r. Bu durum ZP sertleflmesi olarak adland r lmaktad r. Zona pellusida sertleflmesinin derecesine ba l olarak in vitro ortamda oositin fertilizasyonunda baflar s zl k flekillenmektedir. Bu nedenle fertilizasyon sonras normal embriyonun geliflimi için gerekli olan zona sertleflmesi erken dönemlerde gerçekleflti inde fertilizasyonu bask layabilmektedir. Fötal buza serumunun önemli glikoproteinlerden biri olan fetuin, oositlerin maturasyonu boyunca serumun bulunmad - vasatlarda zona sertleflmesinin engellenmesi amac yla kullan lmaktad r. Fetuin bu etkisini, oosit maturasyonu boyunca ZP2 proteininin ZP2f proteinine, proteolitik dönüflümünü engelleyerek gerçeklefltirmektedir. Fetuin, vasata 1 mg/ml kat ld nda zona erimesi için gereken süre 9,2 dk olup, M II aflamas na ulaflan oosit say s % 76'd r (14). S r Serum Albumini n vitro maturasyon vasat na eklenen s r serum albumini (BSA), kimyasal olarak saf elde edilememesinden dolay de iflken sonuçlar vermektedir. Kan serumuyla karfl laflt r ld nda BSA'n n IVM'de daha etkili oldu u görülmüfltür. Ancak BSA'n n düflük dozlar n n (% 1) kumulus oosit kompleksinin (COC) maturasyonu ve viabilitesi aç s ndan, FCS'nin yüksek dozlar (% 10-20) kadar etkili olmad bildirilmektedir (15). Hormonlar Follikül Uyar c Hormon Follikül uyar c hormon (FSH) reseptörleri kumulus ve granuloza hücrelerinde bulunmaktad r (6). Oosit maturasyonu üzerine FSH'n n düzenleyici etkisi kumulus hücrelerinin varl na ba l d r. Follikül uyar c hormonun GVBD'yi uyarmas da kumulus hücreleri arac l yla gerçeklefltirmektedir. Follikül uyar c hormon ve di er gonadotropinlerin oositi saran kumulus hücrelerinin genifllemesi üzerine etkili oldu u belirtilmektedir (11). S r oositlerinin IVM'sinde kullan lan FSH, büyüme hormonu (GH) taraf ndan harekete geçirilmektedir. n vitro maturasyon medyumuna FSH eklendi inde siklik AMP (camp) art fl n uyarmakta ve kumulus genifllemesi meydana gelmektedir. Düflük dozda FSH (0,15 ng/ml) kumulus genifllemesini uyarmakta iken, kumulus genifllemesi üzerindeki en büyük etkiyi 1,5 ya da 15 ng/ml dozlar nda göstermektedir. n vitro maturasyon vasat - na FSH (609/941) ve LH (642/987) ilave edildi inde elde edilen polar cisimcik formasyonunun ortalama % 65 oldu u belirtilmektedir. S r oositlerinin IVM vasat na FSH eklendi inde morula ve blastosist aflamas na ulaflan embriyo say s % 63 olarak bulunmufltur (2). Luteinlefltirici Hormon Luteinlefltirici hormon (LH) ooplazma içerisindeki Ca da l m n de ifltirirken, oosit kumulus kompleksinde mitokondriyal glikoz oksidasyonu ve glikolizisi art rmaktad r (13). S r oositlerinin IVM'sinde serum bulunmayan vasatlara s r kaynakl saflaflt r lm fl LH ilavesinin (ml'de 100 Cºg), maturasyonun tamamlanmas n etkilememesine ra men, fertilizasyon ve embriyonik geliflim üzerine etkili oldu u belirtilmifltir (4). S r oositlerinin IVM vasat nda LH, en yüksek etkiyi 1 Cºg/ml eklendi inde göstermektedir. Bu durum kumulus hücrelerinde FSH reseptörlerinin afl r miktarda bulunmas ndan veya LH reseptörlerinin az ya da hiç olmamas ndan kaynaklanmaktad r (2). n vitro maturasyonda LH eklenmesiyle elde edilen fertilizasyon oran (% 73,5) yüksek iken, TCM 199 vasat tek bafl na kullan ld nda elde edilen fertilizasyon oran (% 39,7) düflük bulunmufltur (25). Prolaktin Prolaktin, epitel hücrelerin yüzeyinin bozulmas ve follikül duvar n n uç k sm ndaki ba lay c dokular n ayr flmas n engellemektedir. Bu hormon ayr ca hcg ile uyar lan olgun folliküldeki plazminojen aktivitesini de inhibe etmektedir (23). Kültür vasat na 50 ng/ml s r prolaktini eklendi inde metafaz II ve telofaz I aflamas na ulaflan oosit say s artmaktad r ve/veya dejenere kromozomlu oositlerin say s nda düflüfl görülmektedir. S r oositlerinin IVM vasat na s r prolaktini ilave edildi inde çekirdek olgunlaflmas uyar lm flt r. Maturasyondan 24 saat sonra prolaktin eklenen gruptaki oositlerin % 87,3'ü metafaz II ve telofaz I aflamas na ulafl rken prolaktin eklenmeyen (kontrol) gruptaki oositlerin ancak % 65,1'i bu aflamalara ulaflabilmifltir (13). 38 Cilt: 76 Say : 3-4 Y l: 2005

4 Steroidler S r ve tavflan oositlerinin IVM vasat na progesteron ilave edilmesi nükleer maturasyonu uyarmaktad r. Progesteronu ba lay c antiserumlar nükleer maturasyon üzerine olumsuz etki göstermektedir (24). Bunun aksine Gliedt ve ark. (5) ilave edilen östradiolün s r oositlerinin kumulus genifllemesi üzerine olumsuz etkisi oldu unu ve IVF'yi izleyen dönemde blastosist formasyonunu azaltt n belirtmektedir. Vasata östradiol ilave edilerek mature edilen oositlerin kültürü sonucunda elde edilen blastosist say s n n az olmas - n n nedeni M II aflamas na geçen oositlerin az olmas ndan kaynaklanmaktad r. Domuz COC ve ç plak oositlerinde kromozom bozukluklar yla karfl laflma ihtimalinin daha yüksek oldu u belirtilmifltir. Ayn etkiler somatik hücrelerde de gözlenmifl ve maturasyon vasat na östradiol kat ld - nda Suriye hamster embriyolar nda, akci er fibroblastlar nda kromozom bozukluklar n n uyar ld belirlenmifltir. S r oositlerinin maturasyonunda yüksek miktarda östradiolün bulunmas eksen formasyonu, polar cisimci in at lmas ve çekirdek maturasyonu üzerinde de olumsuz etki göstermektedir (1). Beker ve ark. (1) taraf ndan yap lan çal flmada COC kültürüne 1ºg/ml östradiol ilave edildi inde (22 saat) çekirdek maturasyonunun belirtisi olarak kabul edilen metafaz II aflamas na ulaflan oositlerinin oran % 56,3 iken östradiol eklenmeyen (kontrol) grupta bu oran % 74 seviyelerindedir. Ayr ca çekirdek bozuklu u yüzdesi IVM vasat na östradiol kat lan grupta % 13,3 iken bu oran kontrol grubunda ise % 2,1'dir. Yirmi iki saat süren bir maturasyon evresinden sonra polar cisimci in at lma oran maturasyon medyumuna östradiol eklenen grupta % 68,6 iken bu oran kontrol grubunda % 74,7 olarak bulunmufltur. Büyüme Hormonu Serum bulunmayan vasatlara s r büyüme hormonu eklendi inde s r oositlerinin maturasyon oranlar, kumulus genifllemesi, erken embriyonik bölünme ve blastosist aflamas na ulaflan embriyo say s nda art fl gözlenmifltir. Nükleer maturasyonun h zlanmas n n sonucu olarak, büyüme hormonunun 16 saatlik kültürü sonucunda M II aflamas na ulaflan oosit say s nda art fl meydana gelmektedir. Ancak maturasyonun 24. saatinde ise kontrol grubu ile maturasyon vasat na büyüme hormonu eklenen grup aras nda M II'ye ulaflan oosit say s aç s ndan bir de ifliklik flekillenmemifltir. Ç plak oositlerin IVM vasat na büyüme hormonu ilave edildi inde ise GVBD'de art fl flekilenmemektedir. Bu nedenle büyüme hormonunun, maturasyon üzerindeki etkisini kumulus hücreleri arac l ile gerçeklefltirdi i düflünülmektedir (10). Büyüme faktörleri Serumdaki epidermal büyüme faktörü (EGF) miktar ortalama 2 ile 15 ng/ml aras ndad r. mmunofloresan çal flmalarda s r oositlerindeki EGF reseptörlerinin, kumulus ve küçük antral granuloza hücrelerinde bulundu u belirtilmektedir. Büyüme faktörleri kendilerine yüksek derecede duyarl olan reseptörlere ba lan rlar ve sitoplazmada bulunan ikincil reseptörlerin sinyallerini düzenlerler. Epidermal büyüme faktörü reseptörleri tirosin kinaz n aktivasyonu ile uyar l rlar (16). Epidermal büyüme faktörü, GVBD için gereken süreyi k salt r ve germinal vezikül y rt lmas gerçekleflen oosit say s nda art fla neden olur. Bu faktör, mayozu uyar c etkisini kumulus hücreleri sayesinde gerçeklefltirmektedir (12). Im ve Park (9) taraf ndan yap lan çal flmada s - r oositlerinin IVM'sinde kullan lan TCM 199 vasat nda elde edilen en yüksek maturasyon oran 30 ng/ml EGF eklendi inde (% 97) elde edilmifltir. Epidermal büyüme faktörü ilave edilmedi i durumda ise bu oran % 77 seviyesinde bulunmufltur. Vasata 30 ng/ml ya da 50 ng/ml EGF eklendi- inde ise in vitro ortamda oositlerin monospermik penetrasyon oran önemli derecede artm flt r. Katthleen ve Brackett' n (12) yapt çal flmada ise s r oositlerinin IVM vasat na 0, 1, 10, 100 ng/ml EGF uyguland nda IVM'den sonraki kumulus genifllemesi s ras yla %16,7; % 43,6; % 52 ve % 63 olarak bulunmufltur. S r Follikül S v s Folliküler s v da (bff), folliküler duvar n hücreleri taraf ndan sentezlenen steroid ve glikoprotein gibi birçok bileflimle, follikülün d fl ortamda karfl laflaca olumsuz koflullara karfl etkili olan Cilt: 76 Say : 3-4 Y l:

5 fizyolojik öneme sahip tampon maddeler bulunmaktad r. Follikül s v s kumulus genifllemesi, çekirdek olgunlaflmas, fertilizasyon ve embriyonik geliflme üzerinde etkilidir. Folliküler s v, bir yandan mayozu durdururken di er taraftan oosit maturasyonun tamamlanmas n sa lamaktad r. S r folliküler s v s, oosit maturasyon inhibitörü (OMI) olarak adland r lan bir içeri e sahiptir. Bu s v daki unsurlar n, s r oositlerinin mayoz aflamas nda bekletilmesinden sorumlu oldu una inan lmaktad r. Bunun yan nda folliküler faktörlerin, sitoplazmik maturasyonun tamamlanmas nda etkili oldu u da bildirilmektedir (6, 19). Kumulus genifllemesi en fazla, LH dalgas ndan 20 saat sonra al nan folliküler s v n n vasata % 40 oran nda eklenmesiyle elde edilmifltir. S f r nc saatte al nan folliküler s v da mayotik inhibitörler, 20. saatte al nan folliküler s v da ise mayotik uyar c - lar bulunmaktad r. Ayr ca 20. saatte al nan folliküler s v n n, 0. saatte al nan folliküler s v ya göre östradiol seviyesinin düflük bulunmas da önemli bir etkendir (18). Hücrelerin Etkisi Kumulus/Granuloza Hücreleri Preovulatör follikül milyonlarca somatik hücrenin birleflmesi sonucu meydana gelen bir yap - d r. Kumulus hücreleri, oositlerin membran yla bitifliktir ve oosit sitoplazmalar yla yak ndan iliflkilidir (6). Kumulus hücrelerinin glikozdan piruvat sentezledi i ve bu sayede beslenme üzerine etkili oldu u, piruvat bulunmamas durumunda vasata glikoz ilavesinin etkili olmad belirtilmektedir (26). Oositlerin IVM vasatlar nda katk maddesi olarak ml'de 3-5 milyon granuloza/kumulus hücreleri kullan lmaktad r (6). Serum bulunan vasatlara tek bafl na granuloza hücreleri eklendi inde fertilize olan oositlerin yüksek miktarda blastosist aflamas na ulaflt (FCS'de % 17; ECS'de % 16) bildirilmektedir. Bu sonuçlar in vitro mature edilen oositlerin; in vitro fertilizasyonu ve blastosist aflamas na kadar geliflimi için en önemli faktörün granuloza hücrelerinin oldu unu göstermifltir (4). Teka Hücreleri Teka hücreleri en büyük androjen kayna olarak bilinmektedir. Bu hücreler granuloza hücreleri taraf ndan östrojen biyosentezi için gerekli bir substratd r. Teka hücreleri ayn zamanda TGF- ± ve TGF- gibi büyüme faktörlerinin sal n m ve olgun s r ovaryumundaki geliflen folliküllerinin düzenlenmesinde de önemli bir rol oynamaktad r. n vitro maturasyon vasat na teka hücresi eklendi inde (% 44,1), granuloza hücresi eklenen (% 35,9) vasatlara göre blastosist geliflimi daha yüksek bulunmufltur (6). Di er katk maddeleri Midkine (MK), s r folliküler s v s nda bol miktarda bulunan büyüme faktörlerinin en yenilerinden biridir. S r folliküler s v s nda MK (125 ng/ml) ve pleotropin (PTN) (400 ng/ml) yüksek düzeyde bulunmaktad r. Midkine ve PTN'nin % 50'sini aminoasitler ve sistein kal nt lar içermektedir. Bu nedenle bu faktörler memeli oositlerinde büyüme ve farkl laflmada önemli rol oynamaktad r. Midkine; gonadotropinlerin kontrolünde, granuloza hücreleri taraf ndan üretilir ve folliküler geliflme üzerinde etkin bir rol oynamaktad r (8). Midkine özellikle oositlerin sitoplazmik maturasyonunu art rmaktad r (18). Pokeweed (PWM), phytohemaglutinin (PHA) s r oositlerinin IVM'si ve implantasyon öncesi embriyo geliflimini art rmak amac yla kültür mitojenleri olarak kullan lmaktad r. S r oositlerinin IVM vasat na kat lan PWM erken embriyonik bölünme oran ve morula-blastosist aflamas na ulaflan embriyo say s üzerinde olumsuz etki göstermektedir. Pokeweed ayn zamanda embriyo geliflim yetene inde de olumsuz etkilere yol açmaktad r. Maturasyon vasatlar na PHA ilave edildi inde oosit maturasyonu ve embriyonik geliflim aç s ndan PWM'den daha iyi sonuçlar al nm flt r (22). Sitokinler, peptid ya da glikoprotein yap s ndaki küçük yap lard r. Annenin immunolojik olarak haz rlanmas na veya fertilizasyon ve erken gebelik dönemindeki endokrinolojik olaylar n flekillenmesinde rol oynayan sitokinler, muhtemelen oositlerden köken al rlar. mmun sistem makrofajlar, monositleri, T lenfositleri ve B lenfosit hücrelerini içermektedir. Interleukin-I (IL-I) 17 kilodalton a rl nda bir polipeptid olup granuloza ve teka hücrelerinin etkisiyle follikül geliflimin- 40 Cilt: 76 Say : 3-4 Y l: 2005

6 de önemli bir rol oynamaktad r. Sitokinlerin follikül geliflimi üzerindeki etkisi hakk nda bilgi s n rl d r. Ancak insan rekombinant IL-I 'n n geliflen follikülün maturasyon ve farkl laflmas üzerinde etkili oldu u belirtilmektedir. Oosit at l m n takiben ovaryumdaki follikül y rt lmas, tipik yang mekanizmas olarak de erlendirilmektedir. Bu reaksiyon monosit ve makrofajlar taraf ndan üretilen IL-I taraf ndan gerçeklefltirilmektedir. Interleukin-I granuloza-luteal geçiflte potansiyel düzenleyici bir rol oynar. Bu durum korpus luteumun oluflumunu sa lamaktad r (6). Kaynaklar 1. BEKER, A.R.C.L., COLENBRANDER, B., BEVERS, M.M. (2002). Effect of 17 -estradiol on the in vitro maturation of bovine oocytes. Theriogenology, 58: CHOI, Y.H., CARNEVALE, E.M., SEIDEL, G.E., SQUIRES, E.L. (2001). Effects of gonadotropins on bovine oocytes matured in TCM-199. Theriogenology, 56: CUPPS, P.T. (1991). Reproduction in Domestical Animal. Ed.: Cupps P.T., Fourth edition, Academic Press Inc., Oxford, UK. 4. FUKUI, Y., ONO, H. (1989). Effects of sera, hormones and granulosa cells added to culture medium for in-vitro maturation, fertilization, cleavage and development of bovine oocyte. J. Reprod. Fert., 86: GLIELDT, D.W., ROSENKRANS, C.F., RO RE, J.R., MUN- YON, A.L., PIERSON, J.N., MILLER, G.F., RAKES, J.M. (1996). Effect of media, serum, oviductal cells and hormones during maturation on bovine embryo development in vitro. J. Dairy. Sci., 79: GORDON, I., (1994). Oocyte Recovery and Maturation. In: Laborotory Production of Cattle embryos. Ed.: GORDON, I., ,4 th Ed. Cab International, Dublin. 7. GREVE, T., MAD SON, V. (1991). In vitro fertilization in cattle. A review. Reprod. Nutr. Dev., 31: IKEDA, S., ICHIERA-TANAKA, K., AZUMA, T., MURAMAT- SU, T., YAMADA, M. (2000). Effects of midkine during in vitro maturation of bovine oocytes on subsequent developmental competence. Biol. Reprod., 63: IM, K.S., PARK, K.W. (1995). Effect of epidermal growth factor on maturation fertilization and development of bovine follicular oocytes. Theriogenology, 44: IZADYAR, F., COLENBRANDER, B., BEVERS, M.M. (1996). In vitro maturation of bovine oocytes in the presence of growth hormone accelerates nuclear maturation and promotes subsequent embryonic development. Mol. Reprod. Dev., 45: IZADYAR, F., ZE NSTRA, E., BEVERS, M.M. (1998). Follicle stumilating hormone and growth hormone act differently on nuclear maturation while both enhance developmental competence of in vitro matured bovine oocytes. Mol. Reprod. Dev., 51: KATTHLEEN, M.H., BRACKETT, B.G. (1993). Bovine blastocyst development after in vitro maturation in a defined medium with epidermal growth factor and low concentrations of gonadotropins. Biol.Reprod., 48: KUZM NA, T.I., LEBEDEVA, I.Y., TORNER, H., ALM, H., DE- N SENKO, V.Y. (1999). Effect of prolactin on intracellular stored calcium in the course of bovine oocyte maturation in vitro. Theriogenology, 51: LAND M, F.C., BOYAZOGLU, S.E.A., CARVALHO, L.R., CHO, Y.H., SQU RES, E.L., SE DEL., G.E. (2002). Effect of fetuin on zona pellucida hardening fertilization and embryo development in cattle. Anim. Reprod. Sci., 71: LE BFR ED-RUTRELGE, M.L., CR TSER, E.S., F RST, N.L. (1986). Effects of fetal calf serum and bovine serum albumin on in vitro maturation and fertilization of bovine and hamster cumulus-oocytes complexes. Biol. Reprod., 35: LONERGAN, P., CAROLAN, C., VAN LANGENDONCKT, A., DONNAY, I., KHATT R, H., MERM LLOD, P. (1996). Role of epidermal growth factor in bovine oocyte maturation and preimplantation embryo development in vitro. Biol. Reprod., 54: MAYES, M. (2002) / eriflim tarihi: 20,02, ROMERO, A., SE DEL, G.E. (1996). Effect of follicular fluid during in vitro maturation of bovine oocytes on in vitro fertilization and embryonic development. Biol. Reprod., 55: S RARD, M.A., F RST N.L. (1988). In vitro inhibition of oocyte nuclear maturation in the bovine. Biol. Reprod., 39: XU, K.P., GREVE, T., SM TH, S., HYTTEL, P. (1986). Chronological changes of bovine follicular oocyte maturation in vitro. Acta Vet. Scand., 27: VAN LANGENDONCKT, A., DONNAY, I., SCHUURB ERS, N., AUQU ER, P., CAROLAN, C., MAS P, A., DESSY, F. (1997). Effect of supplementation with fetal calf serum on development of bovine embryos in synthetic oviduct fluid medium. J. Reprod. Fertil., 109: WANG, S., PANTER, K.E., EVANS, R.C., BUNCH, T.D. (2001). The effect of pokeweed mitogen (PWM) and phytohemaglutinin (PHA) on bovine oocyte maturation and embryo development in vitro. Anim. Reprod. Sci., 67: YOSH MURA, Y., NAKAMURA, Y., YAMADA, H., ANDO, M., UBUKATA, Y., ODA, T., SUZUK, M. (1991). Possible contribution of prolactin in the process of ovulation and oocyte maturation. Horm. Res., 35 (suppl 1): YOUN S, A., BRACKETT, B.G., FAYRER-HOSKEN, R.A. (1989). Influence of serum and hormones on bovine oocyte maturation and fertilization in vitro. Gamete Res., 31: ZUELKE, K.A., BRACKETT, B.G. (1990). Luteinizing hormone-enhanced in vitro maturation of bovine oocytes with and without protein supplementation. Biol. Reprod., 43: ZUELKE, K.A., BRACKETT, B.G. (1992). Effects of luteinizing hormone on glucose metabolism in cumulusenclosed bovine oocytes matured in vitro. Endocrinol., 131 (6): Cilt: 76 Say : 3-4 Y l: