PERMEABİLİZE DÜZ KASLARDA MİYOGRAF KULLANILARAK KASILMA YANITLARININ HÜCRE İÇİ MEKANİZMALARININ İNCELENMESİ

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "PERMEABİLİZE DÜZ KASLARDA MİYOGRAF KULLANILARAK KASILMA YANITLARININ HÜCRE İÇİ MEKANİZMALARININ İNCELENMESİ"

Ebru Taner
7 yıl önce
İzleme sayısı:

1 PERMEABİLİZE DÜZ KASLARDA MİYOGRAF KULLANILARAK KASILMA YANITLARININ HÜCRE İÇİ MEKANİZMALARININ İNCELENMESİ Dr. N. Tuğba DURLU-KANDİLCİ Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı MİYOGRAF Kasılma-gevşeme / basınç değişikliği Damar (halka) / kas (şerit) Mikro düzeyde preparatlar Banyo ve transdusırlar yatay konumda Banyo hacmi küçük Hassas transdusırlar 1

2 MİYOGRAF MİYOGRAF 2

3 MİYOGRAF Diseksiyon mikroskobu Banyo hacimleri ml / ml Damar (halka) μm Kas (şerit)( μm MİYOGRAF 3

4 MİYOGRAF MİYOGRAF 4

5 DÜZ KAS PERMEABİLİZASYONU Membranları hasarlayarak kasılmada rol oynayan proteinlerin ve diğer hücre içi organellerin fonksiyonlarının araştırılması Hücre içi Ca ++ konsantrasyonu kontrolü Kasılma sisteminin in Ca ++ a olan duyarlılığının ölçülmesi Kalmodulin konsantrasyonu, nükleotidlerin konsantrasyonu, G proteini aktivasyonunun araştırılması DÜZ KAS PERMEABİLİZASYONU Farklı maddeler - farklı selektiviteler Agonist/antagonistler ve antikorların hücre içine girişinin sağlanması IP 3, ryanodin reseptörleri ve Ca ++ pompalarının davranışlarının incelenmesi İnce preparatlar difüzyon (Ca ++ / EGTA / MgATP) 5

6 PERMEABİLİZASYONDA KULLANILAN AJANLAR Triton X-100X Saponin α-toksin β-eskin TRİTON X-100X Plazma membranının fonksiyonel olarak uzaklaştırılması Son derece geçirgen bir düz kas Tüm membran fonksiyonları ve reseptör-efektör efektör kenetlenmesi bozulur Sarkoplazmik retikulum hasarı Miyozin hafif zincir fosfataz etkilenmez İntraselüler sinyal transdüksiyonu çalışılmasında problem Ca antagonistlerinin direkt etkileri 6

7 SAPONİN Hücre membranında porlar Sarkoplazmik retikulum ve mitokondri gibi Ca depoları ve pompaları etkilenmemekte Reseptör-efektör efektör kenetlenmesini bozar Hücre membranı ATP / ADP ye geçirgen duruma gelmekte Ca ++ α-toksin Plazma membranında nda saponine ve β-eskin e oranla daha az permeabilizasyon Sadece 3kDa dan küçük üçük k protein kaybı Düşük k molekül l ağıa ğırlıklı maddeler geçebilmekte ebilmekte (ATP / inorganik iyonlar ) Reseptör-efektör efektör kenetlenmesi ve endojen kalmodulin gibi hücre içi solübl proteinleri etkilenmemekte 7

8 β-eskin Saponin türevidir Plazma membranında nda saponine oranla daha küçük k ancak α-toksine göre g daha büyük b porlar Yüksek molekül ağırlıklı maddeler (kalmodulin( kalmodulin- 17 kda) ) hücre dışına kaçar Heparin / IP 3 rahatça hücre içine girer İntraselüler sinyal transdükleme mekanizmaları etkilenmemekte Reseptör-efektör efektör kenetlenmesi etkilenmemekte DÜZ KAS PERMEABİLİZASYONU YÖNTEMİ Albino kobayların mesane detrusor kası ve tenia çekumu Perspex bir blok üzerinde bulunan 500 µl hacimdeki bir seri küçük banyodan oluşan deney düzeneği Hassas İzometrik Kuvvet Transdusırı Transdusır Organ banyosu Kas preparatı Miyograf Amplifikatör Bilgisayara kayıt 8

9 DÜZ KAS PERMEABİLİZASYONU YÖNTEMİ 100 mg gerim 80 mm K + / 50 µm Karbakol β-eskin (40 µm M / 80 µm) - 30 dakika Ca ++ ( M) içeren hücre içi solüsyonlar ile konsantrasyona bağımlı kasılma yanıt eğrileri Kasılma ajanlarının incelenmesi; 10-6 M kalsiyum+1 µm kalmodulin ile inkübasyon Agonistler ile kasılma yanıtı olup olmadığı incelenir (kontrol / antagonist varlığında) Kümülatif kalsiyum ile konsantrasyona bağımlı kasılma yanıt eğrileri (A)15 min (B) 30 min (C) 45 min β-eskin ile permeabilizasyon Sıçan mesanesi Durlu-Kandilci & Brading., EJP, basımda (2007) 9

10 YÖNTEM Kalsiyum yüklemesi deneylerinde; 10-6 M kalsiyum ile inkübasyon / doku yıkanır Agonist (50 µm karbakol-100 µm GTP varlığında) ile kasılma yanıtı alınır Karbakol yanıtı antagonistler / inhibitörler (30 mm kafein, 5 µm ryanodin,, vb.) ile inkübasyon sonrasında tekrar edilir (B) Kalsiyum yüklemesi sonrasında GTP varlığında karbakol kasılma yanıtı (C) Kalsiyum yüklemesi sonrasında IP 3 ve takiben GTP + karbakol kasılma yanıtı Kobay mesanesi Durlu-Kandilci & Brading., EJP, basımda (2007) 10

11 DÜZ KAS KASILMASI Sinyal transdükleme mekanizmalarında Ca ++ belirli hücresel cevapların oluşabilmesi için önemli bir role sahiptir. Ca ++ salıverilmesini sağlayan birçok ulak gösterilmiştir. Somlyo & Somlyo, Physiol Rev., 83, 1325 (2003) FARMAKOMEKANİK DÜZENLEME Fosfatidil inozitol yolağı (G-protein( proteinleri/tirozin kinazlar) 11

12 FARMAKOMEKANİK DÜZENLEME Kalsiyum pompaları (Plazma membranı/ ı/sarkoplazmik retikulum ulum) Marin et al.,life Sci.,64, 279 (1999) IP 3 /cadpr/naadp IP 3 (1983) permeabilize pankreatik asiner hücrelerde Ca salıverilmesi. Deniz kestanesi yumurtalarında IP 3 yanı sıra piridin nükleotidi metabolitleri cadpr (1989) ve NAADP (1995) aracılı Ca ++ salıverilmesi Ca ++ Pankreatik asiner hücrelerde de bu üç ulağın varlığı bilinmektedir. 12

13 cadpr IP 3 dan bağımsız bir mekanizma ile SR dan Ca ++ salıverir (heparin( ile bloke olmaz). cadpr-aracılı Ca ++ salıverilmesi SR dan ryanodin reseptörleri (RYRs)) ile olmaktadır (Lee et al., 1989; Galione et al., 1991). Evans et al., Pharmacol. Ther., 107(3), 286 (2005) cadpr Kalp kasında β-adrenoseptörlerrler ve anjiyotensin II reseptör aktivasyonu cadpr sentezini artırır r (Higashida( et al., 1999, 2000). İzole pulmoner arter düz d z kasında β-adrenoseptörlerinrlerin neden olduğu hiperpolarizasyonda cadpr nin kısmen rolü var (Boittin( et al., 2003). Boittin et al.,

14 cadpr Koroner arter düz kası ve kalp kasında reaktif oksijen türevleri (ROS) cadpr sentezini artırabilir (Kumasaka( et al., 1999; Zhang et al., 2004). Sığır koroner arter düz kası Zhang et al., Microvas. Res., 67, 159 (2004) NAADP SR (IP 3 ve cadpr) dan bağımsız bir mekanizma ile Ca ++ salıvermektedir. Tüm ulaklar içerisinde en potent Ca ++ salıveren moleküldür. Deniz kestanesi yumurtalarında, beyinde ve kalpte NAADP için yüksek afiniteli bağlanma bölgeleri olduğu bilinmektedir. L-tipi Ca ++ kanal blokörleri ile ve bazı K + kanal blokörleri ile inhibe olur. 14

15 NAADP NAADP aracılığı ile Ca salıverilmesi tapsigargine duyarlı olmayan asidik bir Ca deposundan, lizozom- ilişkili bir organelden olmaktadır. Deniz kestanesi spermlerinde fertilizasyon öncesi Pankreas beta hücrelerinde glukoza yanıt olarak Pankreas asiner hücrelerinde kolesistokinine yanıt olarak (Cancela et al., 1999) NAADP salıverilir. NAADP Arteriel düz kas İki havuz modeli- vakuoler H + pompası inhibitörü bafilomisin A1 Evans et al., Pharmacol. Ther., 107(3), 286 (2005) 15

16 NAADP Pulmoner arteriel düz kasda ET-1 1 ile NAADP-bağımlı sinyalleme olduğu gösterilmiştir (Kinnear( et al., 2004). Kinnear et al., J. Biol. Chem., 279, (2004) Durlu-Kandilci & Galione, FASEB J, 21(6), A1161 (2007) 16

17 Ca + + SENSİTİZASYONU Permeabilize düz kaslarda Düz kasın [Ca + + ] i artışı ile görülen kasılmasından bağımsız bir kasılmadır [Ca + + ] i ve miyozin hafif zincir kinazın aktivitesinin sabit olduğu koşullar altında G proteinlerini aktive eden agonistlerin oluşturduğu kasılmalardır Sarkoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz pompasının inhibitörü siklopiazonik asit varlığında (i.e. muskarinik reseptörün karbakol ile aktivasyonuna bağlı olarak sarkoplazmik retikulumdan inozitol trifosfat aracılı kalsiyum salıverilmesini engellenir) yanıt alınır Miyozin fosfataz aktivitesi inhibisyonu RLC fosforilasyonu ve kuvvet Durlu-Kandilci N.T., Doktora Tezi, H.Ü.E.F. Sağlık Bilimleri Enstitüsü (2004) 17

18 rat ileum β-escin Loirand et al., J.Physiol., 516.3, 825 (1999) Ca ++ SENSİTİZASYONU YOLAKLARI Miyozin fosfataz inhibisyonu (MLCP) Küçük GTPaz RhoA.MYPT.MYPT-1 Araşidonik asit salıverilmesi..rho-kinaz Protein kinaz C.CPI-17 18

19 Sıçan mesanesi Kobay mesanesi Karbakol ile indüklenen Ca ++ sensitizasyonu Durlu-Kandilci & Brading., BJP, 148, 376 (2006) TEŞEKKÜR Oxford Üniversitesi Farmakoloji Departmanı İngiltere Profesör Alison F. Brading Profesör Antony Galione Mrs Tracyann Doore Mr Clive Garnham Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı Prof. Dr. İnci Şahin- COMMAT Ltd. Mehmet Ali Yıldız Erdemli 19

Benzer belgeler

2 tip düz kas vardır: 1. Viseral düz kaslar. (mide, barsak, üreter, damarlar) 2. Çok üniteli düz kaslar (iris kasları, piloerektör kaslar)

Düz kaslar 2 tip düz kas vardır: 1. Viseral düz kaslar. (mide, barsak, üreter, damarlar) 2. Çok üniteli düz kaslar (iris kasları, piloerektör kaslar) UYARILMALARI: Düz kaslar tiplerine göre farklı uyarılır