ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Emine ÇINKILOĞLU CYPRİNUS CARPİO DA BEYİN DOKUSUNDA FENTHİONUN ANTİOKSİDANT SAVUNMA SİSTEMİ, LİPİD PEROKSİDASYONU ve ASETİLKOLİNESTERAZ ENZİM AKTİVİTESİNE N-ASETİLSİSTEİN MODÜLATÖRLÜĞÜNDE ETKİLERİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2007

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ CYPRİNUS CARPİO DA BEYİN DOKUSUNDA FENTHİONUN ANTİOKSİDANT SAVUNMA SİSTEMİ, LİPİD PEROKSİDASYONU ve ASETİLKOLİNESTERAZ ENZİM AKTİVİTESİNE N-ASETİLSİSTEİN MODÜLATÖRLÜĞÜNDE ETKİLERİ Emine ÇINKILOĞLU YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez / / 2007 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza:... Prof. Dr. Nevin ÜNER JÜRİ BAŞKANI İmza:... Doç. Dr. Bedii CİCİK ÜYE İmza:... Yard. Doç. Dr. Mehmet SULANÇ ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. Proje No: FEF2003YL4 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ CYPRİNUS CARPİO DA BEYİN DOKUSUNDA FENTHİONUN ANTİOKSİDANT SAVUNMA SİSTEMİ, LİPİD PEROKSİDASYONU ve ASETİLKOLİNESTERAZ ENZİM AKTİVİTESİNE N-ASETİLSİSTEİN MODÜLATÖRLÜĞÜNDE ETKİLERİ Emine ÇINKILOĞLU ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman: Prof. Dr. Nevin ÜNER Yıl: 2007, Sayfa: 83 Jüri: Prof. Dr. Nevin ÜNER Doç. Dr. Bedii CİCİK Yrd. Doç. Dr. Mehmet SULANÇ Bu araştırmada organofosforlu insektisid ve avisid fenthion içeren ortamda antioksidant ve GSH öncüsü NAC nin düşük (0,5mg/kg) ve yüksek (400mg/kg) intraperitonal dozlarının jüvenil Cyprinus carpio da beyin dokusunda GSH redoks durumuna, antioksidant enzim aktivitelerine, lipid peroksidasyonu ile protein düzeylerine ve AChE enzim aktivitesine etkileri incelenmiştir. Kontrol grubu dışında balıklar 96 saat süresince fenthionun LC 50 değerinin %80 inin etkisine bırakılmışlardır. Bileşiklerin GSH redoks durumuna etkilerini belirlemek amacıyla tgsh, GSH, GSSG düzeyleri ile GSH/GSSG oranı, antioksidant enzimlere etkilerini belirlemek amacıyla GR, GST, SOD ve CAT enzim aktiviteleri, lipid peroksidasyonuna etkilerini belirlemek amacıyla MDA düzeyi ve fenthionun nörotoksik potansiyelini belirlemek amacıyla AChE enzim aktivitesi spektrofotometrik yöntemler kullanılarak belirlenmiştir. Fenthion etkisinde kontrole göre tgsh, GSH düzeyleri ile GSH/GSSG oranında artışlar GSSG düzeyinde ise azalma belirlenmiştir. Fenthion CAT aktivitesi ile protein ve MDA düzeylerinde azalmaya neden olurken GST aktivitesinde artışa neden olmuştur. Düşük dozda NAC, tgsh, GSH düzeylerinde GSH/GSSG oranı ile GST ve SOD enzim aktivitelerinde artışa neden olurken GSSG düzeyinde azalmaya neden olmuştur. NAC yüksek dozda GSH/GSSG oranında artışa, GST aktivitesi ile protein düzeyinde ise azalmalara neden olmuştur. Fenthion tüm gruplarda AChE de inhibisyona neden olmamıştır. Bu sonuçlara göre fenthionun oksidatif strese bağlı toksisitesinde NAC nin düşük dozda GSH redoks kapasitesi ile GST ve SOD gibi antioksidant enzimlerin aktivitesini arttırarak oksidatif stresi azalttığı, yüksek dozda NAC nin ise beyinde GST aktivitesi ile protein düzeyini olumsuz etkileyerek oksidatif strese neden olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Fenthion, Glutatyon, N-asetilsistein, Lipid Peroksidasyonu, Balık. I

4 ABSTRACT MSc. THESIS EFFECTS OF FENTHION IN THE BRAIN OF CYPRINUS CARPIO ON ANTIOXIDANT DEFENCE SYSTEM, LIPID PEROXIDATION AND ACETYLCHOLINESTERASE ENZYME ACTIVITIES BY THE MODULATION OF N-ACETYLCYSTEINE Emine ÇINKILOĞLU UNIVERSITY of ÇUKUROVA INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF BIOLOGY Supervisor: Prof. Dr. Nevin ÜNER Year: 2007, Page: 83 Jury: Prof. Dr. Nevin ÜNER Doç. Dr. Bedii CİCİK Yrd. Doç. Dr. Mehmet Sulanç The effects of low and high dose of NAC in the brain of organophosphate insecticide and avicide fenthion exposed Cyprinus carpio on GSH redox status, antioxidant and acetylcholinesterase enzyme activities, lipid peroxidation and protein levels was evaluated. Animals were injected with 0.5 mg/kg or 400 mg/kg of NAC intraperitoneally and exposed to 80% of LC 50 value of fenthion for 96-h. tgsh, GSH, GSSG, MDA, and protein levels, and GR, GST, SOD, CAT, and AChE enzyme activities were determined spectrophotometrically in brain tissue at the end of the 96-h. Fenthion treatment caused an increase in tgsh and GSH levels, GSH/GSSG ratio, and a decrease in GSSG levels. CAT enzyme activity, protein and MDA levels were decrease while an increase in GST activity was observed in the brain of fenthion-exposed C. carpio. Low dose NAC injection increases the tgsh and GSH levels, GSH/GSSG ratio, and SOD and GST enzyme activities. A significant decrease in higher NAC dose was observed in GST activity and protein levels, while GSH/GSSG ratio was elevated. No inhibition in AChE enzyme activity was found by fenthion treatment. In conclusion, NAC in lower dose alleviated the oxidative stress-inducing potential of fenthion with the elevation in GSH redox capacity, GST and SOD enzyme activities. Higher NAC dose elevated the oxidative stress-inducing potential of fenthion. Keywords: Fenthion, Glutathione, N-acetylcysteine, Lipid peroxidation, Fish. II

5 TEŞEKKÜR Çalışmalarım boyunca her konuda yardım ve desteklerini gördüğüm tez danışmanım Sayın Prof. Dr. Nevin ÜNER e; Sayın Yrd. Doç. Dr. Yusuf SEVGİLER e; Sayın Doç. Dr. Bedii CİCİK e; Sayın, Yrd. Doç. Dr. Mehmet SULANÇ a, Uzman Biyolog Hülya DURMAZ ile Petek PİNER e ve değerli aileme teşekkürlerimi sunarım. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ.I ABSTRACT...II TEŞEKKÜR...III İÇİNDEKİLER...IV ÇİZELGELER DİZİNİ...VI ŞEKİLLER DİZİNİ....VIII 1. GİRİŞ Antioksidant Savunma Sistemi Süperoksid Dismutaz Katalaz Glutatyon Glutatyon Sentezi Glutatyon Redüktaz Glutatyon Redoks Döngüsü Ksenobiyotiklerin Detoksifikasyonu Glutatyon S-Transferazlar Pestisidler Organofosforlu Pestisidler Fenthion Asetilkolinestraz Lipid Peroksidasyonu Proteinlere Etkisi Beyin Dokusunun Önemi Kan Beyin Engeli Biyoindikatör Organizma ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOD Materyal Kimyasal Maddeler...34 IV

7 Cihazlar ve Diğer Gereçler Yöntem Analiz Yöntemleri Süperoksid Dismutaz Yöntemi Katalaz Yöntemi Total Glutatyon Yöntemi Okside Glutatyon Yöntemi Glutatyon Redüktaz Yöntemi Glutatyon S-Transferaz Yöntemi Asetilkolinesteraz Yöntemi Malondialdehid Yöntemi Protein Yöntemi İstatistiksel Analiz BULGULAR Glutatyon Redoks Durumuna Etkileri Antioksidant Enzim Aktivitelerine Etkileri Asetilkolinestraz Aktivitesine Etkileri Malondialdehid ve Protein Düzeylerine Etkileri TARTIŞMA Glutatyon Redoks Durumuna Etkileri Antioksidant Enzim Aktivitelerine ve Lipid Peroksidasyonuna Etkileri Asetilkolinesteraz Aktivitesine Etkileri.65 6.SONUÇ VE ÖNERİLER...67 KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Çizelge 3.2. Süperoksid Dismutaz Yöntemi.. Katalaz Yöntemi Çizelge 3.3. Çizelge 3.4. Total Glutatyon Yöntemi Okside Glutatyon Yöntemi Çizelge 3.5. Çizelge 3.6. Glutatyon Redüktaz Yöntemi Glutatyon S-Transferaz Yöntemi Çizelge 3.7. Asetilkolinesteraz Yöntemi 46 Çizelge 3.8. Malondialdehid Standart Grafiğinin Hazırlanması 48 Çizelge 3.9. Malondialdehid Yöntemi 49 Çizelge 4.1. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin GSH redoks durumuna (nm/mg protein) etkileri.. 53 Çizelge 4.2. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin antioksidant enzim aktivitelerine (U/mg protein) etkileri.. 55 Çizelge 4.3. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin AChE spesifik aktivitesine (U/mg protein) etkisi 56 Çizelge 4.4. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC nin MDA ve protein düzeyine etkileri.. 57 VI

9 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1 Glutatyonun (GSH) yapısı; L-γ-glutamil-L-sisteinilglisin... 6 Şekil 1.2. Sistein ve N-asetilsisteinin (NAC) kimyasal yapısı.. 8 Şekil 1.3. Hayvanlarda glutatyonun sentezi ve dağılımı Şekil 1.4. Organofosfat (A), karbamat (B) ve piretroid (C) insektisidlerin kimyasal yapıları Şekil 1.5. Nörotransmitter asetilkolinin etki mekanizması ve asetilkolin (ACh) metabolizmasını bloke eden ilaçlar.. 19 Şekil 1.6. AChE aktivitesinin farklı mekanizmalar tarfından inhibisyonu Şekil 1.7. Bir omega-6 çoklu doymamış yağ asidi çeşidi olan linoleik asidin yapısı. 21 Şekil 1.8. Lipid peroksidasyonunun fazlarına genel bir bakış.. 22 Şekil 3.1. MDA standart grafiği 49 Şekil 4.1. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC'nin GSH redoks durumuna (nm/mg protein) etkileri. 53 Şekil 4.2 C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC'nin antioksidant enzim aktivitelerine etkileri. 55 Şekil 4.3. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC'nin AChE enzim aktivitesine etkisi Şekil 4.4. C. carpio da beyin dokusunda fenthion etkisinde NAC'nin protein ve MDA düzeylerine etkileri 58 VII

10 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU 1. GİRİŞ Biyolojik sistemler, serbest radikaller ve reaktif oksijen türleri (ROS) gibi çeşitli radikallerin oluşumuna neden olan karmaşık zincir mekanizmalar içermektedir (Zhang ve ark., 2005). Serbest radikaller, paylaşılmamış bir ya da daha fazla elektron içeren moleküllerdir (Zwart ve ark., 1999). Radikal olmayan bir türün yalnızca bir elektron kaybetmesi ya da kazanmasıyla oluşmaktadırlar. Zayıf bir elektriksel alana sahip olmaları paylaşılmamış elektronlarından kaynaklanır. Bu özellikleri ile yüksek derecede reaktiftirler. ROS ya da oksidant terimi; sadece süperoksid (O -. 2 ) ve hidroksil (HO. ) gibi oksijen radikallerini değil, hidrojen peroksid (H 2 O 2 ) ve hipokloröz asit (HOCl) gibi bazı radikal olmayan oksijen türevlerini tanımlamak amacıyla kullanılmaktadır (Halliwell ve Gutteridge, 1999). Süperoksid anyonu, mitokondride normal solunum sürecindeki otooksidasyon reaksiyonlarında moleküler oksijenin (O 2 ) bir elektronla indirgenmesi sonucunda oluşan bir radikaldir. Elektron transport zinciri tam olarak korunamadığı için zincirden kaçan elektronların sitokrom oksidaza transferlerinden önce O 2 ye -. katılmaları, O 2 anyonunun oluşumu ile sonuçlanmaktadır (Evans ve Halliwell, 2001). O -. 2, direk hücre hasarına neden olmakla birlikte sitotoksisitesini daha reaktif türlerin oluşumuna neden olarak da gösterebilmekte ve dismutasyonu sonucunda H 2 O 2 oluşmaktadır (Halliwell ve Gutteridge, 1999). Hidrojen peroksid yapısında paylaşılmamış elektron içermediğinden radikal özelliği taşımayan bir moleküldür ve oksitleyici bir tür olarak kabul edilmesinin nedeni, demir (Fe) ya da bakır (Cu) varlığında HO. radikalinin öncüsü olmasıdır. Özellikle proteinlerin hem grubundaki Fe ile reaksiyona girerek reaktif Fe formlarını oluşturur. Oluşan reaktif Fe formları çok güçlü oksitleyicilerdir ve hücre membranında lipid peroksidasyonu gibi radikal tepkimelerine neden olabilmektedir (Livingstone, 2001). Yüksüz olması sebebiyle hücre kompartmanları arasında kolaylıkla difüze olabilmektedir (Lledias ve ark., 1998). Endojen olarak oluşan H 2 O 2 ; suya (H 2 O) detoksifiye edilemezse; Fe tarafından katalizlenen Haber-Weiss ya da Fenton reaksiyonları sonucunda lipid peroksidasyonlarını başlatan ve çok kısa 1

11 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU ömürlü bir radikal olan HO. radikali ve türevlerine dönüşür (Reed, 2001) ve HO. radikali balıklar için çok tehlikeli bir türdür (Hidalgo ve ark., 2002). Haber-Weiss Reaksiyonu O H 2 O 2 + Fe 2+ O 2 + HO. + Fe 3+ + OH - (1) Fenton Reaksiyonu H 2 O 2 + Fe 2+ HO. + Fe 3+ + OH - (2) Hücrelerde ROS un oluşumunu başlatan birçok temel mekanizma bulunmaktadır. Hücre solunumu sırasında O 2, elektron taşıma sistemi içerisinde H 2 O ya indirgenmektedir. Bu indirgenme sırasında oluşan redükte ara bileşikler, prooksidant olarak görev yapmakla birlikte, hücrelerdeki ROS un birinci kaynağını oluşturmaktadır. ROS un oluşumununa neden olan ikinci hücresel kaynak ise bazı oksidasyon enzimleridir. Canlılarda, hücre içi oksiradikallerin üretimini arttıran ksenobiyotikler ise ROS un üçüncü kaynağıdır (Kelly ve ark., 1998). Kontaminantlar tarafından indüklenen sitokrom P 450 sistemi, hücrelerdeki ROS un oluşumunu hızlandırmaktadır. Ayrıca bilinen birçok ksenobiyotiğin mikrozomal enzimler tarafından metabolizasyonu sırasında da doğrudan serbest radikaller oluşmaktadır. Mitokondri, sitosol, endoplazmik retikulum, peroksizomlar ve lizozomlar gibi çeşitli hücre kısımlarında O 2 kullanımına bağlı olarak gelişen oksidatif prosesler sonucunda ROS oluşmaktadır (Cajarville ve ark., 2003) Çok reaktif özellikteki HO. radikali gibi ROS lar; DNA, protein ve lipidler gibi biyomolekülleri hızlıca oksitleyebilmektedir (Adams, 2002). Tüm aerobik hücrelerde ve dokularda ROS u detoksifiye ederek hücre yıkımlarını sınırlayan veya tamamen ortadan kaldırabilen antioksidant savunma sistemleri bulunmaktadır (Reed, 2001). Sağlıklı aerobik organizmalarda üretilen ROS ve reaktif nitrojen türleri (RNS) gibi oksidantlar, antioksidant savunma sistemi tarafından dengede tutulur. Bu kontrol mekanizmalarındaki prooksidant/antioksidant steady state durumunda oluşan her türlü dengesizlik oksidatif stres olarak tanımlanmaktadır (Halliwell ve Gutteridge, 1999; Reed, 2001). 2

12 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU 1.1. Antioksidant savunma sistemi Oksijen, elektron afinitesi nedeniyle oldukça reaktif bir moleküldür. Ayrıca O 2 nin H 2 O ya redüksiyonu sırasında çok daha reaktif ara bileşikler oluşmaktadır (Lledias ve ark., 1998). Fotosentetik organizmaların 2-3 milyar yıl önce gerçekleşen evrimleri, atmosfere O 2 girmesine ve O 2 ye bağımlı türlerin evrimlerine neden olmuştur. Oksidatif metabolizma glukozun aerobik organizmalar tarafından tam olarak parçalanmasını sağlamaktadır. Dolayısıyla; O 2 yönünden zengin bir atmosferin varlığı ROS ve RNS ye karşı çıkan endojen bir antioksidant sistemin gelişmesini sağlamıştır (Sen ve Packer, 2000). Antioksidant savunma sistemin en önemli özelliği, sistemin tüm bileşenlerinin ROS a karşı bir sinerji oluşturacak şekilde görev almasıdır (Chaudiere ve Ferrari- Illiou, 1999). Antioksidant enzimler oksidatif stres tarafından indüklenen anahtar bileşenlerdir (Oruc ve ark., 2004). Bu nedenle, antioksidant enzimler hücre homeostazisinin düzenlenmesinde yaşamsal bir öneme sahiptirler ve indüksiyonları kirleticilere karşı verilen tepkinin bir sonucudur (Doyotte ve ark., 1997). Antioksidant sistemin bileşenleri; enzimatik ve enzimatik olmayanlar şeklinde iki grupta incelenmektedir. Enzimatik olmayan antioksidantlardan glutatyon (GSH), ürik asit ve melaninler omurgalılar tarafından sentezlenebilirken; alfa-tokoferol (E vitamini), askorbik asit (C vitamini) ve β-karoten (Provitamin A) gibi bileşikler besinler yoluyla alınabilen enzimatik olmayan antioksidantlardır (Adams, 2002). Süperoksid dismutaz (SOD; EC ), glutatyon peroksidaz (GPx; EC ) ya da katalaz (CAT; EC ) enzimatik antioksidantlardır (Zwart ve ark., 1999). SOD ve CAT oksijen toksistesine karşı savunmanın ilk ve en önemli basamağındadır (Pandey ve ark., 2003) Süperoksid Dismutaz Süperoksid dismutaz, O 2. - anyonunu, daha az reaktif türler olan O 2 ve H 2 O 2 ye dönüştürür (Doyotte ve ark., 1997). 3

13 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU O O H + SOD O 2 + H 2 O 2 (3) Memelilerde üç farklı SOD bulunur. Bunlar; sitosol, nükleus ve lizozomlarda bulunan homodimerik yapıdaki bakır (Cu) ve çinko (Zn) taşıyan Cu, Zn-SOD; mitokondriyal matrikste bulunan homotetramerik mangan (Mn) içeren Mn-SOD; ekstraselüler boşluklarda heparine bağlı olarak bulunan homotetramerik Cu, Zn- SOD dir (Fridovic, 2001). Bakır, çinko içeren süperoksid dismutaz sitosol ve çekirdeğe, Mn-SOD ise mitokondriyal matriks içerisine yerleşmiştir (Olsvik ve ark., 2005). Cu, Zn-SOD; yaklaşık 32 kilodalton (kda) büyüklüğünde iki alt üniteden oluşmaktadır ve Cu ile Zn köprülerinden oluşan kısım enzimin aktif bölgesi olarak kabul edilmektedir (Banci ve ark., 1998). Cu eksikliği, Zn eksikliğine oranla enzimin aktivitesini daha çok engellemektedir (Evans ve Halliwel, 2001). Mn-SOD ortalama 86 kda molekül ağırlığında tetramerik bir proteindir. Prokaryotlarda Cu, Zn-SOD ve Mn-SOD ye ek olarak 41 kda moleküler ağırlığındaki dimerik bir protein olan Fe içeren SOD (Fe- SOD) bulunmaktadır. Metal katalizörleri ne olursa olun bütün SOD ler benzer bir mekanizmayı paylaşırlar. Ancak, prooksidantlar tarafından oluşturulan aşırı oksidatif stres şartlarında Cu, Zn-SOD daha hızlı indüklenir ve omurgalılarda SOD lerin %80 i sitosolik Cu, Zn-SOD dir (Ahmad, 1995). Süperoksid dismutaz tarafından gerçekleşen redüktif detoksifikasyonda, her. O - 2 radikali için bir adet H 2 O 2 molekülü oluşmakta ve NADPH gibi çeşitli hücresel indirgeyiciler tüketilmektedir. SOD tarafından gerçekleşen direk detoksifikasyonda. ise hücresel indirgeyicilere gereksinim duyulmaksızın, tüketilen her O - 2 radikali için 0,5 H 2 O 2 molekülü oluşmaktadır (Benov ve Fridovic, 1998).. Süperoksid dismutaz, O - 2 nin dismutasyonu için spesifik olduğu halde, HO., singlet oksijen ( 1 O 2 ) ile peroksil radikalleri gibi reaktif türlerle de reaksiyona girebilecek histidin ve diğer çeşit yan zincirler içermektedir (Halliwell ve Gutteridge, 1999). 4

14 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Katalaz Katalaz, her biri yaklaşık 60 kda ağırlığındaki dört alt ünitenin tetrahedral düzenlenmesiyle oluşan, tetramerik bir enzimdir. Dolayısıyla, dört protoporfirin grubu içeren enzimin moleküler ağırlığı, 240 kda civarındadır. CAT, H 2 O 2 nin hiç bir konsantrasyonu ile doygunluğa ulaştırılamayan tek enzimdir (Lledias ve ark., 1998). SOD aktivitesi sonucunda oluşan H 2 O 2 nin büyük bir kısmı, CAT tarafından H 2 O ve O 2 ye dönüştürülür (Halliwell ve Gutteridge, 1999). H 2 O 2 + H 2 O 2 CAT 2H 2 O + O 2 (4) İnsan ve sığır CAT ı enzime sıkıca bağlı olan dört NADPH molekülü taşır. Bu redükte nükleotid, CAT aktivitesi için gerekli olmayıp, sadece; enzimin H 2 O 2 nin düşük derişimlerinde gösterdiği inaktivasyona karşı duyarlılığını azaltır (Kirkman ve Gaetani,1984). Hücrelerde, H 2 O 2 üretiminden sorumlu oksidazların birçoğu peroksizomlara yerleştiği için; CAT ın büyük bir kısmı sitosol ve mitokondriye oranla peroksizomlarda bulunur. (Kelly ve ark., 1998). Mitokonriyal CAT peroksidazlar gibi görev yaparken, peroksizomal CAT daha çok dismutazlar gibi çalışmaktadır (Chaudiere ve Ferrari-Iliou, 1999). GPx in, CAT a oranla daha başarılı kabul edilmesinin nedeni; hidrojen peroksit dışındaki peroksitleri de detoksifiye edebilmesi ve enzimin hücrelerde, oksidatif stresin yoğun olarak gerçekleştiği bölgelere lokalize olmasıdır (Kelner ve ark., 1995) Glutatyon Glutatyon; hücrelerde suda çözünebilir formlarda bulunan düşük molekül ağırlıklı antioksidant bir moleküldür (Travacio ve ark, 2000). L-sistein, L-glutamat ve L-glisin amino asitlerinden oluşan ve glutamat ile sistein amino asitleri arasında 5

15 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU γ-peptid bağı içeren bir tripeptiddir. Bu bağ, GSH ı peptidazların hidrolitik etkilerinden korumaktadır. Şekil 1.1. Glutatyonun (GSH) yapısı; L-γ-glutamil-L-sisteinilglisin (Anderson, 1998) Glutatyon genellikle tüm hücrelerde milimolar (mm) düzeylerde bulunur (Sen, 1997). Hücre içi GSH derişimi hücre tipine bağlı olarak mm arasında değişmektedir. Bu değer karaciğer hücrelerinde 4-8 mm aralığındadır. GSH ın hücre içi lokalizasyonu incelendiğinde, sitoplazma ve mitokondriye ait havuzların, GSH içeriklerinin birbirinden farklı olduğu ve sitosolik havuzun hücresel savunma fonksiyonu ile karakterize edilirken, mitokondriyal havuzun mitokondrinin fonksiyonlarının korunabilmesi açısından gerekli olduğu düşünülmektedir (Reed, 2001). GSH; kan hücreleri, plazma, beyin, böbrekler ve sindirim sistemi gibi birçok organ ve dokuda bulunmakla birlikte temel kaynağı karaciğerdir. Eksikliği mitokondri ile hücre fonksiyonlarındaki bozukluklardan kaynaklanmaktadır (Faintuch ve ark., 1999). Hücrelerde, total glutatyonun %95 i GSH, kalan %5 lik kısmı ise okside glutatyon (GSSG) şeklinde bulunur. Hayvansal hücrelerin birçoğunda, GSSG nin protein sentezini inhibe ettiği bilinmektedir. Bu bilgi; GSSG nin hücrelerde neden daha düşük derişimlerde bulunduğunu ve GSSG nin neden kalp ve böbrek gibi organlar ile eritrositlerden dışarıya taşındığını açıklamaktadır (Halliwell ve Gutteridge, 1999). Glutatyon düzeyi ile GSH a bağlı enzimlerin aktivitelerindeki değişiklikler ksenobiyotiklerin bazı türler üzerindeki etkilerinin belirlenmesinde kullanılan 6

16 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU biyomarkırlardır (Almar ve ark., 1998). GSH ın, antioksidant savunma, elektrofilik ksenobiyotiklerin detoksifikasyonları, sisteinin taşınması ve depolanması, immün tepkinin düzenlenmesi, prostaglandin metabolizmasının düzenlenmesi ve DNA sentezi gibi çok önemli fizyolojik görevleri bulunmaktadır (Sen, 1997). Bu görevlerinin yanı sıra hücre içersindeki tiyollerin %50 sini oluşturan GSH; E ve C vitaminleri gibi eksojen kaynaklı antioksidantların kullanılabilirliğini de arttırmaktadır. Reaktif oksijen türlerinin GSH a bağımlı detoksifikasyonu genel anlamda iki temel mekanizma yoluyla gerçekleşmektedir; 1. ROS ile direk ya da kendiliğinden gerçekleşen reaksiyonlar, 2. GPx tarafından katalizlenen reaksiyonlar, Her iki reaksiyonun sonucunda da GSSG oluşmaktadır (Sen ve Packer, 2000). Hücre içerisinde ve dokularda GSH içeriğini azaltan üç önemli faktör bulunmaktadır. Bu faktörler; a. Glutatyon sentezinin sınırlandırılması, b. Glutatyon kullanımının artması, c. Okside glutatyonun hücre içi redüksiyonunun azaltılmasıdır. Hücre içi GSH sentezini sınırlayan en önemli faktör, kullanılabilir formdaki substrat sistein amino asitidir (Sen, 1997). Hücre içerisinde, amino asitlerin çeşitliliği besin durumuna, türe ve dokuya bağlı olarak değişebilir. Ancak; L-sisteinin hücre içi düzeyi her zaman L-glutamat ile L-glisinden düşüktür (Griffith, 1999). Çünkü; sistein yüksek dozlarda sinirsel toksisiteye neden olmaktadır (Faintuch ve ark., 1999). Sistein; karaciğerde transsülfürasyon reaksiyonları aracılığıyla, metiyonin ve serin amino asitlerinden oluşturulduğu için, temel bir amino asit olarak kabul edilmemektedir. Protein sentezinin gerçekleştirilebilmesi için sülfür içeren amino asitlerin miktarı yeterli olduğunda, serin ve metiyoninden oluşan sisteinler ortadan kaldırılmak yerine GSH olarak depolanmaktadırlar. Sisteinin tiyol grupları, sadece hücrelerin redoks durumlarını düzenlemekle kalmayıp, aynı zamanda, proteinlerin kuaterner yapılarındaki moleküller arası bağların oluşumunda ve metal iyonları ligandı olarak da iş görmektedir (Vina, 1990). 7

17 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Hücrelere dışarıdan sistein sağlayıcı ajan olarak genellikle, N-asetil L-sistein (NAC) ve α-lipoik asit (α-la) kullanılmaktadır (Sen, 1997). Kimyasal formülü C 5 H 9 NO 3 S olan NAC, hücrelere alındığında L-sisteine deasetile olmaktadır. N-asetil D-sistein ise deasetilasyona uğrayamadığı için inaktiftir. GSH biyosentezi sırasında, sistin yerine sisteinin tercih edilmesinin nedeni; sisteinin hücre içerisine sistinden 10 kat daha hızlı girebilmesidir (Ercal ve Gürer, 2002). N-asetil L-sistein; tiyol içeren bir antioksidant olarak doğrudan serbest radikalleri temizleyebileceği gibi GSH sentezinde de iş görmektedir (Neal ve ark., 1998). Sistein N-Asetilsistein (NAC) Şekil 1.2. Sistein ve N-asetilsisteinin (NAC) kimyasal yapısı ( N-asetilsisteinin, toksisitesinin ve maliyetinin düşük olması ve suda çözünebilirliğinin yüksekliği nedenleri ile organofosforlu (OP) pestisidlerin etkisinde detoksifikasyon mekanizmalarını indüklemek amacıyla, oksidatif strese karşı güçlü bir GSH öncüsü ajan olarak kullanıldığı bildirilmektedir (Pena-Llopis ve ark., 2003a). N-asetilsisteinin merkezi sinir sistemi üzerindeki faydalı etkilerini kan beyin engelini (BBB) aşarak gerçekleştirdiği düşünülmektedir (Martinez ve ark., 1999). Glutatyon oksidatif strese karşı savunmanın en önemli basamağını oluşturmaktadır (Ahmed ve ark., 2000). Oksidatif stresin zayıf olduğu durumlarda devreye giren adaptasyon mekanizmaları sonucunda GSH düzeyi artmaktadır. Ancak; oksidatif stresin güçlü olduğu durumlarda zayıflayan adaptasyon mekanizmalarına ve artan GSSG oluşumuna bağlı olarak GSH düzeyi azalmaktadır (Zhang ve ark., 2005). Hücre içerisinde GSSG nin GSH a redüksiyonunu 8

18 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU katalizlemekle görevli olan enzim, glutatyon disülfid redüktaz (GR; EC ) olarak bilinmektedir. Sitosole yerleşen enzim, aktivitesi sırasında bir kofaktör olan nikotinamid adenin dinükleotid fosfat a (NADPH) gereksinim duymaktadır. Bu durumda; NADPH üretim yollarındaki herhangi bir bozukluk, enzimin inaktivasyonu ve dolayısıyla hücre içi GSH miktarının azalması anlamına gelmektedir (Sen,1997) Glutatyon sentezi Glutatyon biyosentezi; γ-glutamilsisteinil sentetaz (γ-gcs, EC ) ve glutatyon sentetaz (GS, EC ) adı verilen iki enzimin katalizlediği reaksiyon sonucunda iki adımda gerçekleşir; γ-gcs L-Glu + L-Cys + ATP GS L-γ-Glu-Cys + Gly + ATP L-γ-Glu + L-Cys + ADP + Pi (5) GSH + ADP + Pi (6) (Anderson, 1998). Sentez sırasında iş gören her iki enzimde hücre sitosolüne lokalize olmuştur (Griffith, 1999) ve adenozin trifosfat (ATP) her iki enzim içinde ko-substrat görevindedir (Camera ve Picardo, 2002). γ-glutamilsisteinil sentetaz, L-sistein ile L-glutamat arasındaki bağı katalizleyen ve glutatyon sentezini sınırlandırabilen önemli bir enzimdir (Pena- Llopis ve ark., 2003). Memeli γ-gcs enzimi, tüm substratların enzime bağlanmalarını sağlayan, katalitik olarak aktif ağır bir alt ünite ile ağır ünitenin substratlara ve inhibitörlere olan ilgisini kontrol eden hafif bir alt üniteden oluşmaktadır. Enzimin sentezlenmesi ve aktivitesi, GSH homeostazisinin sağlanabilmesi açısından kritik bir öneme sahiptir (Griffith, 1999). Hücre içi GSH sentezinin gerçekleştirilebilmesi için, GSH ın hücre dışında degradasyona uğratılması ve oluşan ürünlerin hücre içerisine alınması gerekmektedir. İşte bu görevi, membrana bağlı bir enzim olan γ-glutamil transpeptidaz (γ-gt, EC ) enzimi gerçekleştirmektedir (Anderson, 1998). 9

19 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Glutatyon Redüktaz Glutatyon disülfid redüktaz; sitoplazmaya lokalize olmuştur ve moleküler ağırlığı kda civarındadır. Şimdiye kadar birçok prokaryotik ve ökaryotik kaynaktan izole edilen enzim, tüm koşullarda aktif merkezinde molekül başına bir adet flavinoid adenozin dinükleotid (FAD) içeren dimerik bir flavoenzimdir (Patel ve ark., 1998). Glutatyon redüktaz aktivitesi hücrenin redoks durumu tarafından düzenlenir ve hücrenin oksidatif stres sırasındaki fizyolojik gereksinimlerini yansıtır (Reed, 2001). GR, sitosol GSH/GSSG oranını, 100 ün üzerinde tutmakla görevlidir (Farber ve ark., 1998). Normal hücrelerde GSH/GSSG oranı son derece yüksektir ve GSSG nin yeniden GSH a indirgenmesi gerekir. Enzimin katalizlediği reaksiyon sırasında FAD, NADPH tarafından indirgenirken açığa çıkan elektronlar, aktif merkezdeki disülfid bağına taşınır ve bu şekilde GSSG, iki GSH molekülüne indirgenmiş olur (Halliwel ve Gutteridge, 1999). GSSG + NADPH + H + GR 2GSH + NADP + (7) Glutatyon Redoks Döngüsü Redoks döngüsü; ksenobiyotiklerin, ksantin oksidaz ve NADPH-sitokrom P 450 redüktaz gibi çeşitli enzimler tarafından radikal bir ara ürüne redüksiyonu sırasında oluşan oksiradikallerin eliminasyonundan sorumludur (Kelly ve ark., 1998). Hücreler aerobik metabolizma sırasında sürekli olarak ROS ları ürettiği için hücresel redoks durumu hücre yaşamının korunması için önemlidir (Jefferies ve ark., 2003). Yabancı bileşiklerin redoks döngüsünü katalizleyen bütün enzimler, substrat spesifitesi düşük flavoproteinlerdir (Kappus, 1986). Ksenobiyotikler, radikal oluşumundan kaynaklanan ağır hasarları indükledikleri için glutatyon redoks döngüsü tetikleyicileri olarak kabul edilirler (Zwart ve ark., 1999). 10

20 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Ksenobiyotiklerin redoks döngüsü içerisindeki biyoredüksiyonları sırasında oluşan ve oksidatif strese neden olan reaktif ara bileşikler, glutatyon redoks döngüsü tarafından elimine edilir. GSH redoks döngüsünde, hidrojen peroksitlerin maksimum kapasiteyle eliminasyonlarında düzenleyici etkilerin büyük bir kısmı NADPH a bağımlı yollar tarafından dengede tutulur ve NADPH nin tüketim düzeyi, GR nin ROS u yüksek bir verimle detoksifiye ettiğini göstermektedir. Mitokondride çeşitli oksidantların engellediği sınırlı O 2 alınımı sonucunda, her 10 dakikada bir GPx molekülü eşliğinde tam bir GSH redoks döngüsü gerçekleşmektedir. GSH redoks döngüsünde, indirgeyici molekül akışının sürekliliği mitokondriyel NADPH üretiminin sürekliliği ile dengeleniyor gibi gözükmektedir (Reed, 2001). Şekil 1.3. Hayvanlarda glutatyonun sentezi ve dağılımı. Reaksiyonları katalizleyen enzimler şunlardır: 1) γ-glutamil transpeptidaz, 2) γ-glutamil siklotransferaz, 3) 5-oksoprolinaz, 4) γ-glutamil-sistein sentetaz, 5) glutatyon sentetaz, 6) dipeptidaz, 7) glutatyon peroksidaz, 8) Glutatyon redüktaz, 9) süperoksid dismutaz, 10) BCCA transaminaz (sitosolik ve mitokondriyal), 11) glutaminaz, 12) glutatmat dehidrojenaz, 13) glutamin: fruktoz-6-fosfat transaminaz (sitosolik), 14) nitrik oksid sentaz, 15) glutatyon S-transferaz, 16) NAD(P)H 11

21 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU oksidaz ve mitokondriyal solunum kompleksleri, 17) glikolizis, 18) glutatyona bağımlı tiyosülfid, tiyoltransferaz ya da enzimatik olmayan reaksiyon, 19) transsülfürasyon yolu, 20) deaçilaz, 21) serin hidroksimetiltransferaz. Kısaltmalar: AA, amino asit; BCKA, dallanmış zincir içeren α-keto asitler; GlcN-6-P, glukozamin-6-fosfat; GS-NO, Glutatyon-nitrik oksid bileşiği; KG, α-ketoglutarat; LOO, lipid peroksil radikali; LOOH, lipid hidroperoksid; NAC, N-asetilsistein; OTC, L-2-oksotiazoldin-4-karboksilat; R., radikaller; R, radikal olmayanlar; R-5-P, ribulaz-5-fosfat; X, elektrofilik ksenobiyotikler (Wu ve ark., 2004). İntraselüler GSSG içeriği, oksidatif stres durumuna bağlı olmakla birlikte GSH/GSSG oranı, hücrenin redoks durumu hakkında bilgi vermektedir (Cnubben ve ark., 2001). Oksidatif stres, GSH kullanımına paralel olarak artan GSSG oluşumuyla sonuçlanmaktadır. Hücredeki bu değişiklikler, artan GSSG nin, hücre dışına taşınmasıyla dengelenmektedir. GSSG nin hücre dışına taşınması, hücrelerin oksidatif strese karşı duyarlılıklarını belirleyen önemli faktörlerden biridir (Schafer ve Buettner, 2001). Patolojik bozuklukların birçoğu, hücrelerdeki GSH eksikliği ya da GSH/GSSG oranındaki dengesizliklerle karakterize edilmektedir (Camera ve Picardo, 2002). Dolayısıyla; hücresel metabolizmanın gücü, tiyollerin redoks durumu ile dengelenmektedir (Sen ve Packer, 2000) Ksenobiyotiklerin Detoksifikasyonu Ksenobiyotiklerin detoksifikasyonu ya da transformasyon reaksiyonları Faz I ve Faz II adı altındaki iki basamakta gerçekleşir. Faz I reaksiyonlarında, hidroksil (-OH), karboksil (-COOH), tiyol (-SH) ve amino (-NH 2 ) grupları gibi polar gruplar oksidasyon, redüksiyon ve hidroliz reaksiyonları ile ksenobiyotiğin yapısına eklenir. Faz II reaksiyonlarında; oluşan polar metabolit glukuronidler, sülfatlar, asetatlar ve amino asitler gibi endojen substratlar ile konjuge edilir. Sonuçta, üre ile kolayca uzaklaştırılabilen hidrofilik ürünler meydana gelir (Jokanovic, 2001). Faz II reaksiyonlarında görev alan enzimler transferazlar olarak tanımlanmaktadır (Sole ve ark., 2003). 12

22 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Glutatyon S-Transferazlar (GST, EC ) Glutatyon S-transferaz lar, GSH ile elektrofilik gruplar taşıyan bileşikler arasındaki konjugasyonu katalizleyen, çok fonksiyonlu faz II biyotransformasyon multigen enzim ailesinin üyeleridir (Hamed ve ark., 2003). Bu reaksiyonun sonucunda, bileşiğin hidrofilitesi artar ve molekülün lipid tabakası içerisindeki dağılımı ile hücre içi birikimi engellenmiş olur (Hudson ve ark., 1998). Enzimin suda çözünebilir formları moleküler ağırlığı 25 kda olan alt ünitelerden oluşan dimerik yapılı proteinlerdir. Dimerik enzimin her alt ünitesi farklı iki fonksiyonel bölge içeren bir aktif merkeze sahiptir. Hidrofilik G bölgesi fizyolojik substrat GSH ı bağlarken komşu H bölgesi faklı yapıdaki elektrofilik substratların bağlanabilmesi için hidrofobik bir ortam sağlar. G bölgesi yüksek GSH spesifitesi nedeniyle bütün GST lerde oldukça benzerdir. GST ler arasında tamamen farklı yapıda olan H bölgesinin substrat bağlama kapasitesi ve çeşitliliği son derece değişkendir. GST ler; GSH + R-X GSR + HX (8) şeklindeki genel bir reaksiyonu katalizlemektedirler. Enzimin fonksiyonu: 1. Aktif merkezine hem GSH hem de elektrofilik substratı bağlayarak GSH ile substratın etkileşimi sağlamak, 2. Glutatyonun sülfidril grubunu aktive ederek GSH ın elektrofilik substrat üzerindeki nükleofilik atağını sağlamaktır (Armstrong, 1997). Substratların elektrofilik fonksiyonel merkezleri karbon, nitrojen veya sülfür olabilmektedir. GSH ın sistein rezidüsü ile elektrofilik substrat arasında kurulan tiyoeter bağı genellikle daha az reaktif ve daha çok suda daha çok çözünebilir ürünlerin oluşumuyla sonuçlandığı için; GST reaksiyonları genellikle detoksifikasyon mekanizmalarıdır (Eaton ve Bammler, 1999). Glutatyon S-transferazlar; bitkiler ve hayvanlar alemi ile omurgalılar ve omurgasızlar ve de bakterilerde bulunur. Detoksifikasyonun yoğun olarak gerçekleştiği bölgelerde yüksek aktivite gösterirler ve endoplazmik retikulum 13

23 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU membranı ile nükleustaki interkromatin bölgeye yerleşirler. Ancak; enzimin en bol bulunan formları, homo ya da heterodimerik yapıdaki sitoplazmik GST lerdir. GST ler merkaptürik asit biyosentezinin başlangıç reaksiyonlarına aracılık etmektedirler. Merkaptürik asit biyosentezi başlangıçta GSH konjugatı ile başlayan ve sonra γ-gt tarafından glutamik asitin uzaklaştırılması ile sonuçlanan, sisteinilglisin konjugatının oluşumu ile devam eden birkaç basamaktan oluşmaktadır. Bu reaksiyonu glisinin uzaklaştırılması ile sisteinil S- konjugatının yani pre-merkaptürik asidin oluşumu izler. N-asetiltransferazlar tarafından sisteinil S-konjugatının asetilasyonu N-asetil türevi olan merkaptürik asit oluşumu ile sonuçlanır (Leblanc ve Dauterman, 2001). Glutatyon S-transferazlar; çevre kirleticilerinden ilaçlara, karsinojenlerden pestisidlere kadar birçok bileşiği metabolize edebilirler. GST ile reaksiyona girecek ksenobiyotiklerin genel özellikleri; hidrofobik olmaları, elektrofilik bir atom çekirdeği içermeleri ve GSH ile enzimatik olmayan koşullarda reaksiyona girebilmeleridir. Glutatyon S-transferazların diğer bir fonksiyonu, lipid peroksitlerinin bozunma ürünleri ile GSH arasındaki konjugasyondaki antioksidant görevidir. Balıklarda, organik hidroperoksitlerin detoksifikasyonlarında GST ler GPx ten çok daha gereklidir (Stephensen ve ark., 2002). GPx ten farklı olarak H 2 O 2 için inaktif olan GST ler; sadece organik hidroperoksitleri indirger ve selenyumdan bağımsız olarak iş görürler (Cnubben ve ark., 2001; Sen ve Packer, 2000). Selenyum eksikliği durumunda; GST devreye girer ve kayıp selenyuma bağımlı GPx aktivitesinin boşluğunu doldurur. Selenyum varlığında ise enzimin bu görevi baskılanmaktadır (Leblanc ve Dauterman, 2001) Pestisidler Pestisidler genellikle daha fazla ürün elde etmek amacıyla tarım ürünlerine zarar veren böceklerin ve hastalık etkeni olan çeşitli vektörlerin kontrolünde kullanılan bileşiklerdir (Abdollahi ve ark., 2004). Pestisidlerin tarım alanlarındaki gelişigüzel kullanımları sonucunda bozulan ekolojik denge sebebiyle, ticari önemleri 14

24 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU büyük olan balıklarıda içine alan birçok hedef dışı organizma zarara uğramaktadır (Oruç ve Üner, 1999). Şekil 1.4. Organofosfat (A), karbamat (B) ve piretroid (C) insektisidlerin kimyasal yapıları (Sogorb ve Vilanova, 2002). Günümüzde çevreye uygulanan pestisidlerin büyük çoğunluğu OP pestisidlerdir (Aydın ve Köprücü, 2005). Pestisidler, çevrede kalıcılıklarına göre iki grupta incelenirler. Organoklorlu (OC) pestisidlerin çevredeki kalıcılıkları uzun olmasına karşılık, OP ve karbamatlı pestisid grupları ile piretroidler, su ve güneş ışığının etkisiyle kolayca degradasyona uğradıkları için çevredeki kalıcılıkları oldukça kısadır. Biyoakümülasyonları düşüktür ve vücutta kısa süre içerisinde metabolize edilerek ekskresyona uğratılırlar (Barr ve Needham, 2002) Organofosforlu Pestisidler Organofosforlu pestisidler; fosfonik, fosforik, fosfotiyoik ya da fosfonotiyoik asitlerin ester, amid veya tiyol türevleridir. R 1 ve R 2, aril ya da alkil gruplarını ifade ederler ve fosfor (P) atomuna bir O atomu (fosfinatlar) veya bir kükürt (S) atomu (fosfatlar veya fosfotiyoatlar) ile bağlanırlar. X grubu halojen, alifatik, aromatik veya heterosiklik bir grup olabilir ve fosfor atomuna bir S ya da O atomu ile bağlanır. Fosfodiesterazlar etkisinde ya da protein hedefler ile etkileşim sonucunda kolayca parçalanabilen X grubu ayrılan grup olarak tanımlanır. P atomuna çifte bağ ile bağlanan kısım O ya da S atomudur. (Sogorb ve Vilanova, 2002). Bu bileşiklerin toksisite mekanizmalarının en önemli parçası oksidatif strese neden olmalarıdır (Abdollahi ve ark., 2004). OP pestisidler genellikle tiyo formunda 15

25 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU (P=S) kullanılırlar ve metabolik oksidatif desülfürasyonlar sırasında anti-kolinesteraz ajanı olan okson (P=O) formuna dönüşürler (Cocker ve ark., 2002). Organofosforlu bileşiklerin biyotransformasyonları, aktivasyon ve detoksifikasyon mekanizmalarını içine alır. Aktivasyon mekanizmaları, aktif olmayan bir OP bileşiğin, aktif hale dönüştürülmesi olarak tanımlanabileceği gibi; aktif bir OP bileşiğinin diğer bir aktif OP bileşiğine dönüşümü olarak da tanımlanabilir. Detoksifikasyon mekanizmalarında ise OP bileşiği toksik olmayan metabolitlerine dönüşür. Detoksifikasyon sonucu oluşan metabolitlerin antikolinerjik etkileri daha düşüktür ve bu metabolitler aynı zamanda idrar yoluyla uzaklaştırılabilen suda çözünür bileşiklerdir. Detoksifikasyon reaksiyonları A- esteraz, karboksil esteraz (CarbE; E.C ) ve GST enzimlerinin varlığında gerçekleşir. OP pestisidler; B-esterazlar adı verilen CarbE, AChE, kimotripsin ve tripsin enzimlerini, sıcaklığa ve zamana bağlı olarak inhibe ederler. A-esterazlar ise OP insektisidlerin, asetilkolinesteraz (AChE; E.C ) inhibitörleri olan aktif metabolitleri ile reaksiyona girerek, OP etkilenmelerine karşı koruyucu bir görev üstlenirler (Jokanovic, 2001) Fenthion Bu çalışmada etkileri incelenecek olan fenthion bir OP insektisid ve avisiddir. Fenthion (O,O-dimetil O-4-metiltiyo-m tolilfosforotiyoat) molekül ağırlığı, kda olan lipofilik karakterde bir bileşik olup Environmental Protection Agency (EPA) zehirlilik sınıfının ikinci grubunda yer alan, orta derecede toksik bir insektisiddir (EPA, 2001). Kapalı formülü C 10 H 15 O 3 PS 2, oktanol/su partisyon katsayısı (log K ow ) 4.09 dur (Pehkonen ve Zhang, 2002). Bir bileşiğin oktanol su partisyon katsayısı, o bileşiğin belirli bir sıcaklıktaki lipofilitesinin bir ölçüsüdür. Log K ow değeri 4 den küçük olan bileşikler hidrofilik, log K ow değeri 4 ün üzerinde olan bileşikler ise lipofilik karakterlidirler (Noble, 1993). 16

26 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Kapalı Formülü: Fenthion; Bayer Kimya tarafından 1960 yılında evcil hayvanlardaki dış parazitlere karşı şampuan ve sprey şeklinde üretilerek piyasaya sürülmüştür ( Baycid, Baytex, Dalf, DMTP, Lebaycid, Queletox, Talodex, Prentox Fenthion 4E, Mercaptophos, S 1752, Entex, Spotton ve Tiguvon ticari adları altında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bayer firmasının Amerika da fenthion üretimini durdurması ile birlikte EPA fenthion kullanımının 30 Haziran 2004 tarihinden itibaren yasaklanacağını duyurmuştur (EPA, 2003). Ancak ülkemizde Bayer firmasının ruhsat aldığı 1966 yılından (Aydınoğlu ve ark., 2002) başlayarak Gebze deki tesislerinde fenthion üretimine ve ülke genelinde çeşitli ürünlerde kullanımına devam edilmektedir. Türkiye genelinde yılları arasında L fenthion satılmıştır (Bayer firmasının yılları arası fenthion satış raporlarından derlenmiştir.). Çukurova Bölgesi nde 2003 yılının ilk altı ayında zeytin ve ekin zararlılarına karşı toplam 4515L, 2003 kış-2004 bahar aylarında 4685 L fenthion kullanılmıştır (Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, Adana Bitki Koruma Şube Müdürlüğü, Çukurova Bölgesi pestisid satış raporlarından derlenmiştir.). Fenthion kolaylıkla okson formuna dönüşmeyecek nispeten güvenli bir pestisid olarak geliştirilmiş (Roberts ve Hutson, 1999), ancak balıklarda ve sıçanlarda yapılan çalışmalar fenthionun fenoksona dönüşerek bu canlılara yüksek derecede toksik etkili olduğunu göstermiştir (Kitamura ve ark., 2000; Kitamura ve ark., 2003a). Fenthionun 25 C deki transformasyon ürünleri fenthion sülfon, fenthion sülfoksid, fenokson, fenokson sülfon ve fenokson sülfoksiddir. Fenthionun subletal derişimlerde akut ve kronik etkileri yanında çevrede fenthion oksona dönüştüğü bildirilmiştir (Lacorte ve ark., 1997). 17

27 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Bu bileşik öncelikle; dönüşümlü olarak fenthion sülfokside okside olmakta, ardından sitokrom P 450 sistemi tarafından insanda olduğu gibi okson formuna dönüştürülmek üzere desülfürasyona uğratılır. Balıklarda insandan farklı olarak fenthion sülfon oluşumu gerçekleşmez. Bileşiğin okson formu çok güçlü bir kolinesteraz (ChE) inhibitörüdür (Kitamura ve ark, 2000; Kitamura ve ark., 2003a). Çevredeki bazı kimyasallar organizmaların hormonlarını taklit ederek veya diğer etkiler ile endokrin sistemlerde kesintilere neden olabilmektedir. Bunlar doğal hormonların sentez, salınım, taşınma, bağlanma veya eliminasyonlarını etkileyerek üreme, gelişme ve davranışlarda olumsuz değişikliklere yol açmaktadırlar (EPA, 1997). Birçok endüstriyel ve tarımsal kirleticinin akuatik ortamlardaki canlıların endokrin sistemlerine zarar verdikleri bilinmektedir (Sumpter,1998). Endokrin etkili fenthionun dihidrotestosteronun androjenik aktivitesinin antagonisti olarak etki yaptığı bilinmektedir (Kitamura ve ark., 2003b) Asetilkolinesteraz (AChE) Asetilkolin (ACh), balıkların sinir ve nöromuskular sistemlerindeki başlıca nörotransmitterdir (Kirby ve ark., 2000). ACh nin sentezi, yıkımı ve depolanması bütün kolinerjik nöronlarda benzerdir. Asetil koenzim A ile kolinden, kolin asetiltransferaz (ChAT) enzimin katalizlediği reaksiyon sonucunda tek bir adımda sentezlenir. Asetil Koenzim A + Kolin ChAT ACh + Koenzim A + H 2 O (9) Reaksiyonda kullanılan asetil koenzim A nın büyük çoğunluğu, mitokondri iç membranında, glikolizis sırasında, pürivat dehidrojenaz enzimi tarafından oluşturularak ChAT nin bulunduğu sitoplazmaya taşınır. Bazı nöronlarda, kolinin de novo sentezi yapılmakla birlikte, merkezi sinir sisteminde, ACh sentezinde kullanılan kolinin üçte biri diğer kaynaklardan sağlanır. Kolinin yaklaşık %35 ile %50 si, sinaps aralığında AChE tarafından yeniden oluşturulup, ACh sentezinde kullanılan kolinin yarısını içeren akson ucuna taşınır. 18

28 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Kolinesterazlar; ACh, bütirilkolin ve asetiltiyokoliniyodid gibi çeşitli kolin türlerinin ayrıştırılma reaksiyonlarını katalizleyen enzimlerdir. AChE ve bütirikolinesteraz (BchE; E.C ) en bilinen kolinesteraz enzimleridir. Bir adet AChE enzim molekülü dakikada 4 x 10 5 adet ACh molekülünü hidrolize eder ve 150 µs lik turnover süresi, onu en etkin hidrolitik enzim yapar (Chang ve Strichartz, 2005). Şekil Nörotransmitter astilkolinin etki mekanizması ve asetilkolin (ACh) metabolizmasını bloke eden ilaçlar. 1. Bazı maddeler ACh ın reseptörle birleşmesini engeller: a) atropin kalp kası, düz kas ve bez hücrelerinde b) tubocurarine, iskelet kasında c) hexamethonium, ganglion hücrelerinde ACh ın reseptörle birleşmesini engeller; 2. Antikolinesterazlar: a) edrophonium, enzimin anyonik tarafı ile dönüşümlü olarak birleşir, b) karbamat ve organofosfor bileşikler, enzimle bileşik kurarlar; 3. Hemicholinium: membran yoluyla kolin transportunu inhibe eder ve sentezini engeller (Noyan, 1996). Kemikli balıklarda, beyinde AChE nin birden beşe kadar faklı moleküler formları bulunur ve tüm formlar, diğer kolin analogları içerisinde sadece ACh molekülüne özeldir. AChE, ACh nin hidrolizinde görev alan aktif bölgesinde serin hidroksil grubu içerir ve bu bölge türler arasında farklı konfigürasyonlara sahiptir. 19

29 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Enzimin çeşitli inhibitörlere olan afinitesini de sağlayan aktif bölgedeki farklar, aynı bileşiğin teleost türleri arasındaki toksisite farklılığına neden olmaktadır (Carr ve Chambers, 2001). Organofosfat bileşikler, canlılarda toksisite mekanizmalarını, ilk olarak, AChE yi inhibisyona uğratarak indüklemektedir. İnhibisyon enzimin aktif bölgesindeki serin rezidüsü ile OP insektisid arasında kurulan kovalent bağ sonucunda nörotansmitterin doğal katabolizmasının engellenmesiyle gerçekleşir (Klaassen, 2001; Barr ve Needham, 2002). İnhibisyona bağlı olarak sinapslarda aşırı ACh birikimi sonucunda, nikotinik ve muskarinik reseptörlerin aktivasyonları artar ve kolinerjik sistem sürekli uyarılır (Hazarika ve ark., 2003). AChE aktivitesindeki inhibitör etki, pestisitlerin aynı zamanda, sinir hücrelerindeki enerji metabolizması gibi önemli yaşamsal süreçleri de etkilediğini göstermektedir (Nath ve Kumar, 1999). Karbamatlı pestisidlerle gerçekleşen AChE inhibisyonu dönüşümlü olduğu halde; OP pestisidlerle gerçekleşen inhibisyon dönüşümsüzdür. AChE enziminin inhibisyonunun ölçülmesi, OP bileşikleriyle etkilenmenin belirlenmesinde kullanılan yararlı bir biyomarkırdır (Adams, 2002). OP bileşikler AChE nin serin OH grubuna bağlanır AChE aktivitesindeki değişiklikler ROS tarafından indüklenir AChE aktivitesi membranın akıcılığı ve yüzey yükü tarafından düzenlenir Membran tabakasının elektrik yükündeki değişiklikler AChE aktivitesini düzenler Şekil AChE aktivitesinin farklı mekanizmalar tarafından inhibisyonu (Bukowska ve Hutnik, 2006). Genellikle; serum, barsak, cilt ve sinir uçlarında bol bulunan BChE; ACh ve bütirilkolin için aktivite gösterebilmekle beraber bütirilkolin için daha spesifiktir (Lang ve ark., 1997). BChE nin rolü henüz tam olarak belirlenememiştir, bununla birlikte görevinin dokularda AChE tarafından temizlenemeyen ACh i uzaklaştırmak 20

30 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU olduğu düşünülmektedir ve C. carpio da beyin dokusunda BChE aktivitesi bulunmamaktadır (Chuiko ve ark., 2003) Lipid Peroksidasyonu Organofosfat insektisidlerin birçoğu hücrede lipid peroksidasyonuna neden olmaktadır (Altuntas ve ark., 2003). Nitro-aromatik yapılı OP bileşikler,.- organizmalardaki biyotransformasyonları sırasında O 2 grupları açığa çıkarmaktadırlar. Açığa çıkan bu gruplar, hücre zarı fosfolipidlerinde lipid peroksidasyonuna ve sonuçta hücre hasarına neden olmaktadır (Mercan, 2004). Lipid peroksidasyonu serbest radikaller tarafından indüklenmektedir ve bu reaksiyonlar sonucu açığa çıkan ürünler, radikal hasarlarının incelenmesinde kullanılan etkin parametrelerdir. Membran fosfolipidlerinin yoğun olarak bulunduğu bölgelerde, endojen hedefleri etkileyebilecek kapasitede ROS bulunmaktadır. Özellikle; çoklu doymamış yağ asitlerini (PUFA) içeren lipidler, serbest radikallere karşı oldukça duyarlıdır (Zwart ve ark., 1999). PUFA iki veya daha fazla sayıda karbon-karbon çifti taşıyan yağ asitleridir (Halliwell ve Gutteridge, 1999). Şekil 1.7. Bir omega-6 çoklu doymamamış yağ asidi çeşidi olan linoleik asidin yapısı ( Ökaryotlarda membranın akıcılığı, membran lipidlerinin içeriğinde bulunan, PUFA zincirleriyle sağlanır. Genellikle PUFA zincirleri, fosfolipidlerden özellikle fosfatidil kolin ve fosfatidil etanolaminin gliserol molekülüne 2-C pozisyonuna bağlı olarak bulunur. Bazıları nötral lipitler üzerinde de bulunabilmektedir. Lipidlerin PUFA zincirlerinin bozulmasıyla başlayan reaksiyonlar zinciri sonucunda oluşan 21

31 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU radikaller, moleküler oksijenle reaksiyona girerek, lipid radikallerini oluşturmaktadır. Bu reaksiyonlar zincirinin tamamı lipid peroksidasyonu olarak kabul edilmektedir (Horton ve Fairhust., 1987). Lipid peroksidasyonu, balıklarda oksidatif stresin belirlenmesinde kullanılan önemli bir indikatördür. Biyolojik sistemlerde lipidlerin otooksidasyonuna neden olan zincir reaksiyon; inisiyasyon, propagasyon ve terminasyon olarak tanımlanan üç fazdan oluşur. İnisiyasyon fazında; 1.- O 2, O 2 ve HO. gibi ROS ile lipid molekülü arasında gerçekleşen reaksiyonun sonucunda meydana gelen lipid substratının (LH. ) metilen karbon çekirdeğinden H atomunun ayrılması ile çok daha reaktif bir karbon çekirdeği taşıyan lipid radikali (L. ) oluşur. Propagasyon fazında; L. ile O 2 reaksiyona girerek hızla lipid peroksil radikaline (LOO. ) dönüşür. LOO., DNA ve proteinler gibi birçok in vivo kaynaktan H atomu alarak temel oksidasyon ürünü lipid hidroperoksitini (LOOH. ) oluşturur. Antioksidantların yokluğunda ya da yetersiz kaldığı durumlarda ise LOO. diğer bir LH den H alarak yeni L. lerin oluşmasına neden olur. Bu da, zincir reaksiyonlar şeklinde devam eden yeni propagasyon reaksiyonları ile sonuçlanmaktadır. Şekil 1.8. Lipid peroksidasyonun fazlarına genel bir bakış. Kısaltmalar: NRP, nonradikal ürün; LOOH, lipid hidroperoksid; α-toh, tokoferol; α- TO, α-toh radikali; LH, lipid substratı; LOO, lipid peroksil radikal 22

32 1. GİRİŞ Emine ÇINKILOĞLU Lipid peroksidasyonun son fazı olarak kabul edilen terminasyon reaksiyonunda ise iki radikalin eşleşmesiyle radikal olmayan bir son ürün oluşur ve bu stabil ürün, lipid peroksidasyon zincirinin devamını sağlayamaz. Lipid peroksidasyonu ürünlerinin artışını ve lipid peroksidasyonunun yayılmasını, redoks yapan Fe 2+ ve Fe 3+ ile Cu tetiklemektedir. Lipid peroksidasyonu ürünleri olan lipid peroksitleri, hidroperositleri ve aldehidleri membran yapısını doğrudan, diğer hücresel bileşenleri ise aldehid üreterek dolaylı yoldan zarara uğratır ve membran yapısının bozulması sonucunda malondialdehid (MDA) oluşur (Kelly ve ark., 1998). Lipid peroksidasyonun düzeyi genellikle, MDA ile tiyobarbitürik asit (TBA) arasındaki in vitro reaksiyon sonucunda ölçülür ve MDA ph ya bağlı olarak çeşitli şekillerde bulunabilir. Fizyolojik ph şartlarında, MDA nın amino gruplarına karşı afinitesi düşüktür ancak; proteinlerin lizin gibi amino asitlerinde modifikasyonlar ile molekül içi ve moleküller arası çapraz bağlanmalara neden olur (Halliwell ve Gutteridge, 1999) Proteinlere etkisi Proteinlerin oksidatif strese karşı en duyarlı bölgeleri sülfidril gruplarıdır (Sen ve Packer, 2000). Proteinler ROS a karşı lipidlere oranla daha az duyarılıdır ve amino asit dizilerine bağlı olarak etkilenirler. Özellikle doymamış bağ ve sülfür içeren moleküllerin ROS ile etkileşimleri son derece yüksektir. Bu nedenle yapısında triptofan, tirozin, fenil alanin, histidin, metionin ve sistein gibi amino asitleri bulunduran proteinler ROS a karşı daha duyarlıdır. İmmünoglobin G ve albümin gibi disülfid bağı fazla olan proteinlerin ise üç boyutlu yapıları bozulmaktadır (Kelly ve ark., 1998) Beyin dokusunun önemi Beyin, çevresel kirleticilerden kaynaklanan oksidatif hasarda hedeftir (Hai ve ark., 1997). Teleostlarda beyin büyük oranda yüksek omurgalılarınkine benzer bir 23