1. Giriş - Mesane kanseri - Tanı ve evrelendirme - Mesane kanseri ve iyon kanalları 3. Gereç ve yöntem 4. Bulgular 5. Tartışma

Transkript

1 Dr. GÜLAY GÜLEÇ CEYLAN, MD, PhD Yıldırım Beyazıt Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik ABD, Ankara

2 1. Giriş - Mesane kanseri - Tanı ve evrelendirme - Mesane kanseri ve iyon kanalları 3. Gereç ve yöntem 4. Bulgular 5. Tartışma

3 Genitoüriner sistem tümörleri içinde sıklık açısından ikinci sırada Ortalama görülme yaşı 73 Erkek/kadın oranı 3:1 %70 i başlangıçta noninvaziv formda Bunların %25 i zamanla invaziv forma dönüşebilir %5 inde uzak organ metastazı

4 Etyoloji Sigara (en sık) Boya fabrikalarında kullanılan anilin boyaları Siklofosfamid Aromatik aminler (Benzidin, beta naftilamin) Yüksek arsenik seviyeleri (özellikle içme sularındaki) Pelvik radyoterapi Kronik idrar yolu enfeksiyonu ve/veya kronik irritasyon Mesane enfeksiyonu (Schistosoma haematobium paraziti)

5 En sık klinik bulgu ağrısız, pıhtılı hematüri Bunun yanında sık idrara çıkma, ağrılı idrar yapma (dizüri) gibi şikayetleri olabilir. Radyolojik değerlendirme Sistoskopi Histopatolojik değerlendirme

6 Plazma membranında yer alan iyon kanalları hücresel elektrik iletiminden sorumludur. Apopitozis, proliferasyon ve farklılaşma gibi doku homeostazında gerekli olan temel hücre işlevlerinde rol oynarlar. İyon kanallarının bu kritik süreçlere katkısı 3 ana mekanizma ile olmaktadır: 1- Membran potansiyelinin korunması, 2- Hücre volümünün düzenlenmesi 3- Temel sinyal iletimini sağlayan iyonların girişidir.

7 Transient reseptör potansiyel (TRP) kanal genleri ilk kez Drosophila da tanımlanmış, 1989 da klonlanmış. TRP gen mutasyonuna sahip olan fotoreseptörler sürekli ışığa maruz bırakıldıklarında fazik olarak (transient) voltaj değişikliğine yol açmaları nedeniyle bu isim verilmiştir. Farklı türlerde, 50 den fazla TRP kanalı tanımlanmıştır

8 Sekans homolojisine bağlı olarak TRP ler 6 alt gruba ayrılır: 1) Vanilloid reseptör ailesi (TRPV), 2) Kanonikal (TRPC), 3) Melastatin (veya uzun) TRPM, 4) Polisitin (TRPP), 5) Mukolipin (TRPML), 6) Ankirin (TRPA)

9 Katyon selektif kanallar Hücresel seviyede, multifonksiyonel algılayıcılar olarak fonksiyon görürler. Fiziksel veya kimyasal uyarılar ve spesifik ligandların bağlanmasıyla aktive olurlar.

10 TRP genlerindeki mutasyonlar, çeşitli hastalıklarla ilişkilidir. TRP kanalları kanser gelişiminde etkili olan bazı patolojik süreçlerde yer almaktadır. Pek çok çalışmada, farklı kanser tiplerinde kanser başlangıcı ve progresyonu sürecinde, bir veya daha fazla TRP proteininin ekspresyonları farklı olabilir.

11 Tümör hücreleri membranında lokalize olan TRP kanalları ilaç terapisi, immunoterapi ve hatta gen terapisinde yeni hedefler olarak görülmektedir. Bu kanalların farklılaşma ve karsinogenez esnasındaki ekspresyon değişiklikleri hakkında çok az bilgi bulunmaktadır.

12 Bu grupta 8 (TRPM1-8) protein tanımlanmıştır. TRPM alt grubunun birçok üyesi kalsiyuma geçirgendir veya kalsiyumla aktive olan iyon kanallarıdır.

13 TRPM2 kanalı geni kromozom 21q22.3 üzerinde lokalize Ca2+ a geçirgen En fazla hipokampüs, serebral korteks, talamus ve orta beyin bölgeleri olmak üzere merkezi sinir sisteminde eksprese olur Bunun yanında kemik iliği, dalak, kalp, lökosit, karaciğer, akciğer ve pankreas gibi çok sayıda dokuda eksprese edildiği belirlenmiştir.

14 İntraselüler Ca2+ ile aktive edilen nonselektif katyon kanalları TRPM4, arteriyel endotelyal hücreler, venöz endotelyal hücreler, immun sistem hücreleri, nöronlar, düz kas hücreleri, pankreatik islet-β hücreleri gibi dokularda eksprese olur TRPM5 iyon kanalı, tat reseptör hücrelerinde fonksiyon görür ve fosfolipaz C ye bağlı G-protein ilişkili reseptörlerle aktive olduğu bildirilmiştir.

15 TRPM4 ve TRPM5 kanalları Ca2+ a geçirgen değildir. Fakat Ca2+ aktivitelerinde önemli yer tutar, çünkü her iki kanal internal Ca2+ un artışıyla aktive olur. Aktivasyonları, hücre membranı depolarizasyonunu indükler ve hücre fizyolojisini kuvvetli olarak etkiler.

16 TRPM7 kanalı geni 15q21.2 üzerinde lokalize TRPM7, endotelyal hücreler, monosit, nöron, osteoblastlar, mezenkimal kök hücreleri ve vasküler düz kas hücreleri gibi, hemen hemen tüm dokularda eksprese olmaktadır.

17 Seçici olmayan bir katyon kanalıdır. Özellikle kalsiyum ve magnezyum gibi divalan katyonlara geçirgendir. TRPM7 kanallarının aktivasyonunun artması patofizyolojik süreçlerde önemli

18 Plazma membranı depolarizasyonuna neden olan Ca2+ ve Na+ un plazma membranından geçişini sağlar. Karsinogenezde önemli bir rol oynamaktadır TRPM8-mRNA bazı fare genitoüriner dokularda tanımlanmıştır.

19 Bu çalışmada amacımız; Ülkemizde ve dünyada yaygın olarak görülen ve belirli ölüm nedenleri arasında bulunan mesane kanserinin TRPM kanalları ile ilişkili olup olmadığını belirlemek, Aralarında bir bağlantı varsa, terapötik hedef olarak kullanılabilirliği

20 Çalışma yapılan merkezler Yıldırım Beyazıt Üniversitesi, Ankara Atatürk EAH, Tıbbi Genetik ABD Fırat Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji ABD Türkiye Yüksek İhtisas Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Üroloji Kliniği

21 1. İmmünohistokimya 2. Moleküler genetik analizler Total RNA İzolasyonu Spektrofotometrik RNA Ölçümü (Qubit RNA Assay Kit) Komplementer DNA Sentezi Real Time-Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile cdna Amplifikasyonu 3. İstatistik analizler

22 Çalışmaya 47 birey dahil edildi (40 hasta, 7 kontrol). Hastaların yaş ortalaması 66.94±5.87 (56-78y) 34 (%72.3) ü erkek, 13 (%27.7)ü kadın hasta Histolojik tipleri; 30 hastada yüzeyel mesane tümörü, 10 hastada invaziv mesane tümörü

23 Yüzeyel ve invaziv kanser tipleri yaş ortalamaları açısından karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı farklılık izlenmedi (p=0.48). Yaş ortalaması yüzeyel grupta 67.57±5.82 İnvaziv grupta 66.7±7.05

24 TRPM2 İmmünreaktivitesi kanserli mesane dokusunda; epitel hücrelerinde, mesane kas hücrelerinde, kas tabakasını invaze eden malign hücrelerde ve vasküler media tabakasında (kahverengi ok) belirgin olarak izlendi.

25 TRPM4 İmmünreaktivitesi kanserli ve normal mesane dokusunda sadece epitel hücrelerinde (siyah ok) izlendi

26 Kanserli mesane dokusunda TRPM5 İmmünreaktivitesine rastlanmadı.

27 Kanserli ve normal mesane dokusunda TRPM7 İmmünreaktivitesi epitel hücrelerinin sitoplazmasında görüldü

28 TRPM8 İmmünreaktivitesi kanserli mesane dokusunda sadece epitel hücrelerinde (siyah ok) izlendi

29 Değerler ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir.

30 Real Time-Polimeraz Zincir Reaksiyon Analizi sonuçlarına göre kontrol grubu ile karşılaştırıldığında TRPM2 (p=0,17) ve TRPM4 (p=0,55) gen ekspresyonlarındaki değişimin istatistiki olarak anlamlı düzeyde olmadığı belirlendi. Kanser grubunda TRPM5 ve TRPM8 genlerinin mrna düzeylerinde istatistiki olarak anlamlı bir azalma ve TRPM7 geninde ise istatistiki olarak anlamlı bir artış olduğu saptandı (p<0,05).

31 Kontrol ve kanser dokularındaki TRPM2,TRPM4, TRPM5, TRPM7 ve TRPM8 iyon kanallarının mrna kat artışı grafiği. Real time PZR sonuçları gruplar arasında TRPM2 ve TRPM4 açısından anlamlı farklılık olmadığını, TRPM5 ve TRPM8 genlerinde anlamlı azalma ve TRPM7 geninde ise anlamlı artış olduğunu gösterdi. Her bir RT-PZR 3 tekrarlı olarak çalışıldı. Genlerin ekspresyon düzeyleri GAPDH e göre normalize edildi.

32 Mesane kanserinde iyon kanallarının varlığı ve malign fenotipe etkileri çok fazla araştırılmamıştır Bu çalışmada mesane kanseri ve bazı TRPM kanalları arasındaki ilişki ortaya koymaya çalışılmıştır.

33 Çalışmamızda sadece TRPM7 geni mrna ekspresyonu artarken, TRPM5 ve TRPM8 genleri ekspresyonlarında anlamlı düzeyde azalma olduğu belirlendi. Bu bulgu, literatürde yapılan bir çalışma (Mizuno et al, 2014) ile benzerlik göstermektedir. Yapılan bu çalışmaya göre, normal ürotelyal hücrelere kıyasla, insan mesane kanseri hücrelerinde TRPM7 mrna ekspresyonunun arttığı gözlenmiştir.

34 TRPM7 kanalları pek çok dokuda düşük oranda eksprese olurken, özellikle meme ve pankreas kanseri başta olmak üzere diğer kanserlerde aşırı ekspresyonu bulunduğu gösterilmiştir. TRPM7 ve kanser arasındaki ilişkiyi ilk tanımlayan çalışmalardan birisi (Trapani V et al, 2013) epidemiyolojik bir çalışma olup bu çalışmada TRPM7 genindeki bir polimorfizmin kolorektal neoplazi için artmış risk ile ilişkili olduğu ortaya konmuştur

35 Daha sonraları yapılan bir çalışmada (Baldoli E et al, 2012) ise serum kalsiyum/magnezyum oranındaki artışın, TRPM7 kanallarını aktive ederek, prostat kanseri proliferasyonunu desteklediğini, TRPM7 nin prostat kanserinde önemli bir rolü olduğunu, kalsiyum/magnezyum oranının tümör başlangıç ve progresyonunda esas teşkil ettiğini vurgulamıştır.

36 TRPM7 inhibitörleri kanser tedavisinde kullanılabilir. Bu kanalların aşırı ekspresyonu, karsinojenik hücreler ve tümörler için yeni markırlar olarak değerlendirilebilir.

37 TRPM8 kanalları, kalsiyuma geçirgen kanallardır ve oldukça yaygın oranda eksprese olurlar. Özellikle prostat kanserinde potansiyel bir prognostik ve tanısal bir göstergedir. Mesane kanserinde hastalarından elde ettiğimiz TRPM8 mrna ekspresyonlarında anlamlı düzeyde azalma olduğu saptanmıştır.

38 TRPM5 in değişmiş ekspresyon seviyelerinin de tümör oluşumu ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Ancak çalışmamızda TRPM5 immünreaktivitesinin hem kanser hem de normal dokularda oldukça düşük düzeyde olduğu bulunmuştur.

39 TRPM2 mrna seviyesi, özellikle CpG adacık metilasyonu ile artmış aktiviteye sahip olan melanomlarda yükselmektedir. TRPM2 sessizleştirilmesi, sağlıklı hücreleri etkilemeden prostat kanser hücreleri proliferasyonunu ortadan kaldırır. Çalışmamızda mesane kanseri olgularında TRPM2 kanalı mrna ekspresyonunda herhangi bir değişim saptanmamıştır.

40 Normal mesane ve kanserli mesane dokularında TRPM kanal ailesinin immün boyanması yada ekpresyonlarıyla ilgili çok sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır.

41 Çalışmamızda özellikle TRPM2 nin mesane dokusunda kas, epitel, ve mukozal hücrelerde ekpresyonunun yoğun bir şekilde olduğu gözlenmiştir. TRPM4, TRPM7 ve TRPM8 in ekspresyonunun epitel hücreleri ile sınırlı olduğu, TRPM5 ekpresyonu açısından immünreaktivite gözlenmemesine karşın RT-PCR çalışmasında normal hastalara göre çok düşük düzeyde mrna ekspresyonu olduğu gözlenmiştir.

42 Sonuç olarak, son zamanlardaki bulgular, TRP kanallarının kanser tedavisinde önemli hedefler olduğunu göstermektedir. Zira, bu kanalların ekspresyonu ve aktivitesi kanser gelişimi ve progresyonunda spesifik evrelerde önemlidir

43 Özellikle TRPM7 kanalının mesane kanseri gelişimindeki rolünün tam olarak belirlenmesi için hücre hatlarında TRPM7 nin overekspresyonunun ve inhibisyonunun invazyon, angiogenezis ve metastaz gibi süreçlere katkılarının belirlenmesi gerekmektedir. Yaptığımız çalışmada TRPM5 ve TRPM8 in ekspresyonunda azalma belirlenmesine rağmen daha fazla vaka kontrol örneklerinde yapılacak çalışmalara gereksinim vardır.

44 Karsinogeneze katkıları ve kanser tedavisindeki etkisi ile ilgili farklı araştırmalar, TRP agonistlerinin uygulamaya konmasında faydalı olacaktır.