ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE Proje Türü : Altyapı Proje No :12A Proje Yöneticisi Proje Konusu :Prof. Dr. Şule Pekyardımcı : DNA-İlaç Etkileşimlerine Dayanan Elektrokimyasal DNA Biyosensörlerinin Geliştirilmesi Yukarıda bilgileri yazılı olan projemin sonuç raporunun e-kütüphanede yayınlanmasını; İSTİYORUM İSTEMİYORUM 29/09/2014 Proje Yöneticisi İmza

2 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ SONUÇ RAPORU Proje Başlığı DNA-İLAÇ ETKİLEŞİMLERİNE DAYANAN ELEKTROKİMYASAL DNA BİYOSENSÖRLERİNİN GELİŞTİRİLMESİ Proje Yürütücüsünün İsmi Prof. Dr. Şule Pekyardımcı Yardımcı Araştırmacıların İsmi Yrd. Doç. Dr. Derya Koyuncu Zeybek Araş. Gör. Gözde Aydoğdu Ceren Erdem Filiz Doğan Proje Numarası 12A Başlama Tarihi 07/03/2012 Bitiş Tarihi 07/09/2014 Rapor Tarihi 29/09/2014 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - " 2014 "

3 I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri DNA-İlaç Etkileşimlerine Dayanan Elektrokimyasal DNA Biyosensörlerinin Geliştirilmesi/ Development of Electrochemical DNA Biosensors Based on DNA-Drug Interactions Yeni ilaçların keşfedilmesi ile ilgili olarak yapılan biyolojik çalışmalarda DNA-ilaç etkileşimlerinin oldukça önemli bir yeri vardır. Gen ekspresyonu ve ilaç-protein etkileşimlerini inceleyen araştırma laboratuarlarında DNA-foodprinting, filter bağlanma, gel mobility shift ve floresans temelli birçok tayin yöntemi kullanılmaktadır. Ancak bu yöntemlerin hepsi indirekt ve kesikli sistemlerdir ve bunlarla çalışılırken çeşitli etiketleme stratejilerine gerek duyulmaktadır. Yeni ilaçlar bulunması ve bunların onaylanması amacıyla ilaç-protein ve DNA etkileşimlerinin analizleri için hızlı, sürekli, fazla veri sağlayabilen ve düşük maliyeti tekniklere çok fazla gereksinim vardır [Buerk, 1993, Bonnemann ve Richards, 2001]. Son yıllarda biyosensör tasarımında nükleik asitlerden oluşan tanıma yüzeylerinin kullanılması yaygınlaşmış ve çip teknolojisine yönelik genosensör (DNA biyosensörü) tasarım çalışmaları oldukça hızlanmıştır [Baker ve Qin, 2006]. Kalıtsal veya bulaşıcı hastalıkların tedavisinde kullanılan bazı ilaç etken maddelerinin DNA ile etkileşmesi ve bu etkileşmenin yeni yöntemlerle tayin edilmesi; bu hastalıkların teşhis ve tedavisine yönelik yeni ilaç tasarımlarında merkezi rol oynamaktadır. Bu çalışmalar daha etkili ilaçların dizayn edilmesinde ve daha az yan etki oluşturacak hedefe özel ilaçların geliştirilmesinde hayati öneme sahiptir. Ayrıca bazı maddelerin (çevresel kirlilik ajanları, toksik molekül, vb.) çift sarmal DNA ile interkalasyon, baza seçimli bağlanma vb. yollarla etkileşimi sonucu bir ürünün oluşması, bu ürüne duyarlı elektrokimyasal DNA biyosensör tasarımını getirmiştir. Bir kimyasal maddenin veya metabolitin DNA ile etkileşimi sonrasında DNA da oluşabilecek yan ürünlerin kısa zamanda tayini kanser gibi hastalıkların araştırmaları için çok önemlidir. Bununla birlikte çeşitli kronik ve metabolik hastalıkların da tedavisinde kullanılan ilaçlarların DNA ile etkileşiminin incelenmesi kişiye özgü ilaç tasarımının önünü açmaktadır [Wang, 1987, Bertino, 1992, Wang vd. 1998, Thevenot, vd. 2001, Niemeyer, 2001]. İlaç etken maddesi-dna etkileşiminin sonucunda, çalışmanın türüne göre elde edilen madde sinyali ya da DNA daki bir bazın sinyalindeki artma veya azalmaya bağlı olarak elektrokimyasal tayin gerçekleşmektedir. Bu amaçla kullanılan DNA modifiye edilmiş karbon pasta elektrotlar (CPE), camsı karbon elektrotlar (GCE), perde baskılı karbon

4 elektrotlar (SCPE), altın elektrotlar (AuE), platin elektrotlar (Pt) ve kalem grafit elektrotlar (PGE) incelenen maddelerin çok düşük derişimlerinde bile doğru ve güvenilir ölçümlerini sağlamaktadırlar. Bu çalışmanın amacı, elektrokimyasal sensör teknolojisini kullanarak, bazı ilaçların özellikle de kanser tedavisine yönelik ilaçların DNA ile etkileşimini açıklamak ve mevcut yöntemlere göre daha kolay, hızlı, seçimli ve güvenilir bir şekilde ilaç etken maddesinin tayinini yapmaktır. Bunun için çeşitli nano yapılar ve medyatörler ile modifiye edilmiş katı elektrotların (altın, platin, camsı karbon, perde baskılı karbon), karbon pasta elektrotlarının ve kalem grafit elektrotlarının hazırlanması, hazırlanan elektrotların analitik uygulamalarının yapılması düşünülmektedir. II. Amaç ve Kapsam a. İlaç etken madde - DNA etkileşimi için polimer ile modifiye edilmiş katı camsı karbon elektrotların hazırlanması ve analitik uygulamaları: Çalışmanın ilk aşamasında elektrokimyasal deneyler için kullanılan camsı karbon elektrotlar monomerlerin elektrot yüzeyinde polimerleştirilmesi ile modifiye edilerek yeni çalışma elektrotları hazırlanacaktır. Bu aşamada, modifiye edici olarak tiyadizol türevlerinin kullanılması amaçlanmaktadır. Nano yapılı polimerlerin elektrot performansını geliştirdiği ve elde edilen cevabı arttırdığı pek çok çalışmada vurgulanmıştır [Revin ve John, 2012]. Nanoyapıların hızlı kütle transferi, etkin bir şekilde büyük yüzey alanı, yüksek yüzey enerjisi, protein-metal partikülleri yaklaştırma özelliği bulunmaktadır. Ayrıca elektroanalitik işlemler için hassas, kolay modifiye edilebilir, kararlı bir elektrot yüzeyi oluştururlar. Bu sebepten biyosensörlerde kullanılan nano yapılar ile yapılan çalışmalar hızla artmaktadır (Bonnemann ve Richards 2001, Niemeyer 2001). Farklı türlerdeki nano yapılarla modifiye edilmiş çalışma elektrotları ilaç DNA etkileşiminin elektrokimyasal tayinine yönelik çalışmalarda kullanılacaktır. Ayrıca bu proje çalışmasında biyolojik ortamda toksik etki gösterebilecek bazı maddelerin DNA ile etkileşiminin de araştırılması düşünülmektedir. b. Analitik Uygulamalar: Farklı polimerler ile modifiye edilmiş camsı karbon elektrotların ilaç etken maddelerinin ticari tabletlerinde elektrokimyasal tayinine yönelik sensör tasarımında kullanılması da amaçlanmaktadır. Alt Yapının Geliştirilmesi: Bu projenin diğer bir amacı da üniversitemiz bünyesinde araştırma olanaklarının arttırılması, alt yapının kuvvetlendirilmesi ve yeni çalışma alanlarının oluşturulmasıdır. Ayrıca bu konu ile ilgili çalışan araştırmacıların bilimsel

5 yönlerinin geliştirilmesidir. III. Materyal ve Yöntem Projeden çıkarılan yayın ekte verilmiştir. IV. Analiz ve Bulgular Projeden çıkarılan yayın ekte verilmiştir. V. Sonuç ve Öneriler Litaratürde poli(amt) modifiye elektrotların yalın elektroda göre karşılaştırıldığında elektrot performansını geliştirdiği bildirilmektedir [Kalimuthu ve John 2009]. Bu nedenle ilk olarak hazırlanan modifiye elektrotların elektrokimyasal karakterizasyonları yapıldı. Yalın GCE (BGCE), poli(amt) modifiye GCE (GCE/PAMT) ve dsdna tutturulmuş GCE/PAMT nin (GCE/PAMT/dsDNA) elektrokimyasal davranışları 5.0 mm [Fe(CN) 6 ] 3 /4 içeren 1.0 M KCl çözeltisinde incelenmiştir. Hazırlanan GCE/PAMT elektrodunun yalın elektroda göre hem anodik (ipa) ve katodik (ipc) pik akımları daha yüksek hem de ΔEp (ipc-ipa) değeri daha küçüktür. Elektrotların elektrokimyasal davranışlarını daha iyi açıklamak amacıyla elektrokimyasal impedans spektroskopisi (EIS) yöntemi kullanıldı. PAMT modifiye elektrodun elektron tranfser direnci (R ct ) değeri yalın elektrodun direncinden dört katı kadar küçük bulundu (Tablo 1). Buradan PAMT modifiye elektrodun iyi iletkenlik sağladığı ve yalın camsı karbon elektroda göre daha geniş bir yüzey alanı sağladığı sonucuna varılabilir. Tablo 1 BGCE, GCE/PAMT ve GCE/PAMT/dsDNA için 1 mol L 1 KCl içeren 5 mmol L 1 3 /4 Fe(CN) 6 çözeltisinde elde edilen EIS sonuçları Elektrot R s (Ω) CPE dl (S.s n ) n R ct (Ω) W (S.s 0.5 ) χ 2 BGCE GCE/PAMT GCE/PAMT/dsDNA

6 Çift sarmal DNA nın miktarının ve adsorpsiyon süresini belirlemek için V civarında gözlenen guanin bazı yükseltgenme sinyalleri incelendi. Diferensiyal puls voltametrisi yöntemiyle elde edilen sonuçlarda, dsdna miktarı arttıkça guanin pik akımlarında artış gözlendi. dsdna miktarları 0.5 ile 40 mg L 1 aralığında seçildi. En yüksek guanin pik akımı 20 mg L 1 de elde edildiğinden sonraki deneylere bu değer sabit tutularak devam edildi. Daha sonra, dsdna nın adsorpsiyon süresinin guanin yükseltgenme sinyaline etkisi araştırıldı. 3 ile 30 dakika boyunca modifiye elektrot 20 mg L 1 dsdna içeren çözeltide bekletildi. Adsorpsiyon süresi arttıkça guanin yükseltgenme sinyalleri arttı ve 15 dakikadan sonra sabit kalmaya başladığından en uygun adsorpsiyon süresi 15 dakika olarak seçildi. Yöntemin tablet dozaj formlarına da uygulanabilmesi için dsdna yla etkileşen nitrofurantoin derişimi ve etkileşim zamanı optimize edilmiştir. Nitrofurantoin µg/ml derişim aralığında 120 s etkileştirildi, guanin sinyalini en çok düşüren derişim µg/ml da olarak bulunmuştur. Bu derişimde sn aralığında etkileşim süresi optimize edildi ve biriktirme zamanı 120 sn olarak belirlenmiştir. Guanin yükseltgenme pik akımı nitrofurantoin ile etkileşmesinden sonra doğrusal olarak azaldı. 0.5 M ph 4,80 asetat tamponu içerisinde guanin sinyalindeki azalma nitrofurantoin artan derişiminin ( µg/ml aralığında) (R 2 =0.998) fonksiyonudur. Yakalama sınırı 0.65 µg/ml bulunmuştur (Çizelge 1). Çizelge 1 Nitrofurantoin in CKE/PAMT/dsDNA elektrotta voltametrik tayini için analitik parametreler Parametreler CKE/PAMT/dsDNA elektrot Ölçülen potansiyel (V) 0.82 Doğrusal aralık (mg L 1 ) 2-25 Eğim(µA mg 1 L) Korelasyon katsayısı (R 2 ) LOD (mg L 1 ) 0.65 LOQ ( mg L 1 ) 2.17 Tekrarüretilebilirlik (%) 3.32 Tekrarlanabilirlik (%) 1.15 Sonuçlar beş ölçümün ortalaması olarak verilmiştir.

7 Voltametrik incelemenin saf maddeler üzerinde yapılmasından sonra geliştirilen teknikler nitrofurantoin in piyasa preparatı olan Pylesepthyl film kaplı tabletlere uygulanmıştır. % geri kazanım çalışmaları için numuneler hazırlanmıştır. Bu numunelerden alınan voltamogramlardan ve elde edilen bağıl standart sapma (BSS), % geri kazanım değerlerinin yüksek olmasından ilaç katkı maddelerinin yöntemlerimizi etkilemediği sonucuna varılmıştır (Çizelge 2). Çizelge 2 Nitrofurantoinin serum örneklerinde elde edilen tayin sonuçları Eklenen (µg ml 1 ) Bulunan (µg ml 1 ) BSS (%) Geri kazanım (%) Sonuçlar beş ölçümün ortalaması olarak verilmiştir. VI. Geleceğe İlişkin Öngörülen Katkılar Projemizden elde edilen sonuçlar ile yeni, hızlı ve hassas bir şekilde antikanser özellik gösteren bir antibiyotik ilaç olan nitrofurantoinin başarılı bir şekilde tayin edildiği sonucuna varılmıştır. Geliştirilen bu yöntem yeni ilaç tasarımları ve tayinleri ile ilgili çalışmalara katkı sağlayacaktır. Ayrıca sentezlenen ilaçların DNA etkileşiminin açıklanması ve mevcut yöntemlere göre daha kolay, hızlı, seçimli ve güvenilir bir şekilde ilaç etken maddesinin tayini gerçekleştirilebilecektir. VII. Sağlanan Altyapı Olanakları ile Varsa Gerçekleştirilen Projeler Projemizden temin edilen elektrokimyasal analiz cihazı, saf su cihazı, yarı analitik terazi gibi temel laboratuar malzemeleri ile bir doktora ve bir yüksek lisans tezi araştırma projesi verilmiştir. VIII. Sağlanan Altyapı Olanaklarının Varsa Bilim/Hizmet ve Eğitim Alanlarındaki Katkıları Projemizden sağlanan altyapı olanakları ile iki yüksek lisans ve bir doktora öğrencisinin tez çalışmaları yapılmıştır. Ayrıca SCI kapsamında bir yayın çıkarılmış

8 ve ekte sunulmuştur. IX. Kaynaklar Buerk, D.G., Biosensors Theory and Applications, (1993), Technomic Publishing, 221s. Pennsylvania, USA. Baker, E. and Qin, Y., Electrochemical sensors. Analytical Chemistry, 78, (2006), pp Bonnemann, H. and Richards, F. J. M. European Journal of Inorganic Chemistry, (2001), 2455 p Kalimuthu, P. and John S.A. Bioelectrochemistry, 77 (2009), pp Niemeyer, C. M. Nanoparticles, Proteins, and Nucleic Acids: Biotechnology Meets Materials Science, (2001), Angewandte Chemie International Education, 40, 4129 p. S. Brillians Revin, S. Abraham John, Bioelectrochemistry 88 (2012) Thevenot, X. Ekler D. R., Toth, K., R., Durst, A., Wilson, S. G. Biosensors and Bioelectronics, 16, (2001) Wang, A. H. J., Interactions between antitumor drugs and DNA,Nucleic Acids and Molecular Biology, (1987), Vol.1: (Ed; Eckstein, F., Lilley,D.M.J., Springer- Verlag Berlin Heidelberg - Germany) Wang, J., Ozsoz, M., Cai, X., Rivas, G., Shiraishi, H., Grant, D.H., Chicarro,M., Fernandes, J. R. and Palecek, E.,Bioelectrochem.Bioenerg.,45,(1998), a. Mali Bilanço ve Açıklamaları Projemiz ,00 TL ile desteklemiş ve bu tutardan ,20 TL tüketime yönelik mal ve malzeme alımları, 3162,40 TL hizmet alımları, ,48 TL mamul mal alımları ve 8.091,38 TL ise menkul sermaye üretim giderleri kalemleri için harcanmıştır. Bu kalemlerde alınan sarf, hizmet ve cihazların detaylı listesi ekte verilmiştir. b. Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar Projemizden temin edilen elektrokimyasal analiz cihazı potansiyostat/galvanostat ile iki yüksek lisans ve bir doktora tezi çalışması yapılmış ve iki adet BAP projesi yazılması sağlanmıştır.

9 c. Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar (varsa Kesim III'de yer almayan analiz ayrıntıları) d. Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar) (Altyapı Projeleri için uygulanmaz) A novel electrochemical DNA biosensor based on poly-(5-amino-2-mercapto- 1,3,4-thiadiazole) for assaying of antibacterial drug nitrofurantoin (poster) G. Aydogdu 1, G. Gunendi 1, D. Koyuncu Zeybek 2, B. Zeybek 2, S. Pekyardimci *1, 1 Ankara University, Turkey, 2 Dumlupinar University, Turkey Biosensors th Anniversary World Congress on Biosensors May 2014 Melbourne, Australia e. Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler (Altyapı Projeleri için uygulanmaz) A novel electrochemical DNA biosensor based on poly-(5-amino-2-mercapto- 1,3,4-thiadiazole) modified glassy carbon electrode for the determination of nitrofurantoin Gözde Aydoğdu, Gülendem Günendi, Derya Koyuncu Zeybek, Bülent Zeybek, Şule Pekyardımcı Sensors and Actuators Volume 197, 5 July 2014, Pages NOT: Verilen sonuç raporu bir (1) nüsha olarak ciltsiz şekilde verilecek, sonuç raporu Komisyon onayından sonra ciltlenerek bir kopyasının yer aldığı CD ile birlikte sunulacaktır. Sonuç raporunda proje sonuçlarını içeren, ISI nın SCI veya SSCI veya AHCI dizinleri kapsamında ve diğer uluslar arası dizinlerce taranan hakemli dergilerde yayınlanmış makaleler, III. Materyal ve Yöntem ve IV. Analiz ve Bulgular bölümleri yerine kabul edilir.