ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ DOMAT ZEYTİNİ POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOMAT ZEYTİNİ POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu tez 30/06/2009 tarihinde aşağıdaki jüri üyeleri tarafından oybirliği/oyçokluğu ile kabul edilmiştir. İmza: İmza: İmza: Doç.Dr.M.Ümit ÜNAL Prof. Dr. Sadık DİNÇER Yrd. Doç. Dr. Sertaç Özer Danışman Üye Üye Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve mühür Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF 2008 YL 19 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS DOMAT ZEYTİNİ POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN BİYOKİMYASAL ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Danışman : Doç. Dr. M. Ümit ÜNAL Yıl : 2009, Sayfa : 47 Jüri : Doç. Dr. M. Ümit ÜNAL Prof. Dr. Sadık DİNÇER Yrd. Doç. Dr. M. Sertaç ÖZER Bu çalışmada, Çukurova bölgesinde yetiştirilen Domat çeşidi zeytinden izole edilen ve kısmen saflaştırılan polifenol oksidaz enziminin (PFO) optimum sıcaklık, optimum ph, kinetik parametreler, termal inaktivasyon, inhibitörlerin etkisi gibi biyokimyasal özellikleri araştırılmıştır. Substrat olarak 4-metil kateşol kullanılmış ve enzimin K m değerinin mm, V m değerinin ise 1.73 Abs/dk olduğu bulunmuştur. PFO aktivitesi için optimum ph değeri 4,5 olarak bulunmuş ve optimum ph dan sonra enzim aktivitesinde hızlı bir düşüş görülmüştür. Enzimin optimum sıcaklığı 30 C olarak bulunmuştur. Enzim C gibi sıcaklık aralığında %70 in üzerinde aktivite göstermiştir. Enzimin aktivasyon enerjisi (Ea) ve Z değerleri sırasıyla, 121 kj.mol -1 (r²=0.9496) ve C (r²= olarak hesaplanmıştır. Denenen inhibitörlerden en düşük inhibisyon etkisi askorbik asit te görülmüştür. Anahtar Kelimeler: Zeytin, enzimatik esmerleşme, polifenol oksidaz, kinetik, termal inaktivasyon. I

4 ABSTRACT MSc THESIS DETERMINATION OF BIOCHEMICAL PROPERTIES OF POLYPHENOL OXIDASE FROM DOMAT OLIVE DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Assoc. Prof. Dr.M. Ümit ÜNAL Year : 2009, Pages : 47 Jury : Assoc. Prof. Dr. M. Ümit ÜNAL Prof. Dr. Sadık DİNÇER Assist. Prof. Dr. M. Sertaç ÖZER This research was undertaken to determine some of the biochemical properties (substrate specificity, optimum ph, optimum temperature, heat inactivation, and effect of inhibitors) of polyphenol oxidase (PPO) which was isolated from Domat olives grown in Çukurova region and partially purified. 4-methylcatechol was used as substrate and K m dand Vm values of the enzyme were found to be mm and 1.73 Abs/dk, respectively. The optimum ph and temperature for PPO activity was found to be 4.5 and 30 C, respectively. After the optimum ph enzyme activity declined rapidly. The enzyme had more than 70% activity between C. Energy of activation (Ea) and Z values were found to be 121 kj.mol -1 (r²=0.9496) and C (r²=0.9532), respectively. Of the inhibitors tested, ascorbic asid was the least effective inhibitor. Key Words: Olive, enzymatic browning, polyphenol oxidase, kinetics, thermal inactivation. II

5 TEŞEKKÜR Yüksek lisans eğitimim boyunca, çalışmanın düzenlenmesi, gerçekleştirilmesi ve değerlendirilmesinde katkılarıyla beni yönlendiren, bana yol gösteren ve destekleyen, bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım danışman hocam Sayın Doç. Dr. M. Ümit Ünal a teşekkürlerimi sunarım. Çalışmamın her aşamasında yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen; Araştırma Görevlisi Aysun Şener e ve değerli arkadaşım Murat Yılmaz a, İlgi, sabır ve maddi manevi desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen babam Ahmet Taş, annem Hatun Taş ve ablam Derya Taş a, Destek ve katkılarından dolayı Çukurova Üniversitesine ve Gıda Mühendisliği Bölümü personeline teşekkürlerimi borç bilirim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... VI ŞEKİLLER DİZİNİ... VII 1.GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Dünya Zeytin Üretimi ve Türkiye nin Bu Üretimdeki Payı Türkiye Zeytin Ağacı Varlığı ve Üretim Durumu Zeytin Danesinin Yapısı Zeytinin Bileşimi Polifenol Oksidaz Enzimi MATERYAL ve METOT Materyal Analizlerde Kullanılan Araç-Gereç ve Kimyasal Maddeler Metot Polifenol Oksidaz Ekstraktının Hazırlanması Enzimin Kısmi Saflaştırılması İyon Değişim Kromatografisi ile Saflaştırma Protein Tayini Enzim Aktivitesinin Ölçümü Enzimin Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi Optimum ph Optimum Sıcaklık Kinetik Parametreler Termal İnaktivasyon İnhibitörlerin Etkileri IV

7 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Enzimin Saflaştırılması Optimum ph Optimum Sıcaklık Kinetik Parametreler Termal İnaktivasyon İnhibitörlerin Etkisi SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ. 47 V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 2.1 Dünya Zeytin Alanlarının Ülkelere Göre Dağılımı... 3 Çizelge 2.2. Dünya Zeytin Üretiminin Ülkelere Göre Dağılımı... 3 Çizelge 2.3. Ülkemizde Bölgeler İtibariyle Zeytin Üretimi... 5 Çizelge 2.4. Zeytin Tanesinin Ortalama Bileşimi... 7 Çizelge 4.1 Zeytin PFO sunun Saflaştırma Çizelgesi Çizelge 4.2. Çeşitli Ürünlerden İzole Edilen Polifenol Oksidaz Enziminin Optimum ph Değerleri Çizelge 4.3. Çeşitli Ürünlerden Elde Edilen Polifenol Oksidaz Enzimlerinin Optimum Sıcaklık Değerleri 32 Çizelge 4.5. Çeşitli Ürünlerin Polifenol Enzimlerinin Km Değerleri 34 Çizelge 4.6. Beyaz Kiraz Polifenol Oksidaz Enziminin Termal İnaktivasyon Parametreleri 34 Çizelge 4.7. Çeşitli Ürünlerden İzole Edilen Polifenol Oksidaz Enzimlerinin Aktivasyon Enerjileri.. 35 Çizelge 4.8. İnhibitörlerin Beyaz Kiraz Polifenol Oksidaz Enzimine Etkileri 36 VI

9 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 2.1. Türkiye nin Zeytin Üretim Alanlarını Gösteren Harita... 5 Şekil 2.2. Zeytin Danesinin Yapısı... 6 Şekil 2.3. Zeytinin Temel Fenolik Bileşenlerinin Kimyasal Yapısı... 8 Şekil 2.4. Enzimatik Esmerleşme Mekanizması Şekil 4.1. DEAE-selüloz İyon Değişim Kromotografisi ile Zeytin PFO sunun Saflaştırılması Şekil 4.4. Sıcaklığın Zeytin PFO suna Etkisi 31 VII

10 1. GİRİŞ 1. GİRİŞ Zeytin ağacı, tarihin her aşamasında Akdeniz de kurulan bütün uygarlıkların vazgeçilmez bir parçasını oluşturmuştur. Anadolu nun en eski kültür bitkilerinden olan zeytin, oleceae familyasının, Olea cinsinin Oleaeuropa türünün Oleaeuropa sativa alt türünü teşkil etmektedir. Akdeniz iklim kuşağında en iyi yetiştirme koşullarını bulmuş olan zeytinin gen merkezinin, Güneydoğu Anadolu da Hatay, Kahramanmaraş ve Mardin üçgeninde olduğu ve buradan da dünyaya yayıldığı birçok yazar tarafından doğrulanmaktadır. Güneydoğu Anadolu dan önceleri Batı Anadolu ya yayılan zeytin, Ege Adaları yoluyla Yunanistan, İtalya, Fransa ve İspanya ya kadar ulaşmıştır (Bozdoğan, 2002). Dünya üzerinde ekonomik olarak zeytin yetiştiriciliği kuzey ve güney enlemleri arasında yapılmaktadır (Ulaş, 2001). Geleneksel olarak zeytin hasadı elle yapılmaktadır. Bu işlemin fiyatı işlenmemiş zeytin fiyatının % ini oluşturmaktadır. Son zamanlarda ise zeytin hasadı büyük makinelerle zeytin ağaçlarının sallanması veya küçük makinelerle zeytin ağacı dallarının hareketi ile mekanik olarak yapılmaktadır. Ancak mekanik yöntem hasat sırasında zeytinlere zarar verip ezme ve berelenmelere neden olabilmektedir. Yeşil zeytinlerin mekanik olarak toplanması istenmez çünkü yeşil zeytinin mekanik olarak hasadı sırasında zedelenmeler nedeni ile zeytinlerde kahverengi lekeler oluşmaktadır. Bu durum zeytinlerin kalitesinin düşmesine ve istenmeyen görünüm nedeni ile tüketici açısından kabul görmemesine neden olmaktadır. Zeytinlerde görülen kahverengi lekeler esmerleşme reaksiyonlarından kaynaklanmaktadır (Segovia-Bravo ve ark., 2007). Hasat sonrası depolama veya meyve ve sebzelerin işlenmesi sırasında mekanik zedelenmelerden kaynaklanan esmerleşme reaksiyonları çok sık görülmektedir. Meyve ve sebzelerde görülen bu esmerleşme reaksiyonları polifenol oksidaz (PFO) enziminin fenolik bileşiklerle reaksiyonu sonucu meydana gelmektedir (Godfrey ve West, 1996). Fenol bileşiklerinin miktarı ve çeşidi zeytinin olgunlaşmasına çeşidine, yağış miktarına, sıcaklığa bağlı olarak değişmektedir. Bu nedenle bazı çeşitler fenol 1

11 1. GİRİŞ bileşenlerce zengin bazı çeşitler ise fakirdir. Zeytinde bulunan başlıca fenolik bileşenler; oleuropein, verbaskosid, ligrosit gibi fenolik glikozitler ile flavonoidler, flavonol glikozitleri, antosiyaninler ve glikozitleri, fenolik asitler ve diğer bileşenlerdir (Ryan ve Robards, 1998; Keçeli, 2000). Fenolik bileşiklerin oksidasyonla esmerleşmesi sonucu oluşan renk, sofralık siyah zeytin için istenilen bir değişimdir. Polifenollerin oksidatif kararması, zeytinde bulunan enzimlerin (difenoloksidaz) veya zeytinde bulunmayan ve dışarıdan katılan metal katyonlarının katalitik etkisiyle oluşmaktadır (Garcia ve ark., 1996; Robards ve ark., 1999). PFO, oksidoredüktaz grubuna giren enzimlerdir ve bakır içerirler. Substratları fenolik bileşiklerdir. Özellikle bitkiler âleminde yaygın olarak bulunan PFO lar hayvansal dokular ve küf mantarlarında da bulunmaktadırlar. Substratlarını oksijen eşliğinde esmer renkli bileşiklere oksitlemektedirler. Bu olay gıda teknolojisinde enzimatik esmerleşme olarak da bilinmektedir (Godfrey ve West, 1996). Bu çalışmada Domat zeytini kullanılmıştır. Domat zeytini Türkiye nin en önemli yeşil sofralık çeşididir. Meyvesi iri, silindirik yapıda olup, saptan meyve ucuna doğru bir sırt bulunur. Kilogramdaki ortalama dane adedi arasında değişir. Et- çekirdek oranı 5/1 ve yağ miktarı %20 22 dir. En uygun hasat zamanı Ekim ayıdır. Zeytinler hasattan sonra tatlandırılır ve fermantasyon kaplarında stoklanır. Fermantasyonunu tamamlamış zeytin karakteristik bir sarı renk alır. Ülkemizde zeytin PFO su üzerine çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmanın amacı zeytinden PFO enzimini ekstrakte ederek kısmen saflaştırmak ve enzimin optimum ph, sıcaklık, termal inaktivasyon, inhibitörlerin etkisi ve kinetik parametreler gibi özelliklerini belirlemektir. 2

12 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Dünya Zeytin Üretimi ve Türkiye nin Bu Üretimdeki Payı Dünya zeytin üretiminin yaklaşık % 97 sini karşılayan Akdeniz havzası ülkelerinin başında İtalya, İspanya, Yunanistan, Türkiye, Tunus, Portekiz ve Fas gelmektedir (Bozdoğan, 2002). İspanya dünyada en fazla zeytin alanına sahip ülke durumundadır (Çizelge 2.1). FAO kaynaklarına göre 2004 yılı Dünya zeytin üretimi ton olup, ülkemizde ise ton dur (Çizelge 2.2). Dünya zeytin üretimi bakımından Türkiye, % 10.7 lik bir payla 4. sırayı almaktadır (Bozdoğan, 2002). Ülkemizde zeytin üretiminin hala ilkel yöntemlerle yapılması nedeniyle üründe büyük zararlar oluşmakta ve kalitesi düşmektedir. Bu nedenle Avrupa ülkelerine olan zeytin dış satımımız yok denecek kadar azdır. Bu ülkeler zeytin gereksinimini daha çok diğer Akdeniz ülkelerinden sağlama yoluna gitmektedir. Türkiye ise ihracatının büyük çoğunluğunu Doğu Bloğu ülkelerine gerçekleştirmektedir (Öksüz, 1998). Çizelge 2.1 Dünya Zeytin Alanlarının Ülkelere Göre Dağılımı (Anonim, 2004) Alan (Ha) Yıllar Yunanistan İtalya İspanya Tunus Türkiye Çizelge 2.2. Dünya Zeytin Üretiminin Ülkelere Göre Dağılımı (Anonim, 2004) Üretim (ton) Yıllar Yunanistan İtalya İspanya Tunus Türkiye

13 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.2. Türkiye Zeytin Ağacı Varlığı ve Üretim Durumu Ilıman iklim zeytin ağacı için uygundur, çok kurak ve çok sulak yerler pek uygun değildir. -7 derecenin altındaki sıcaklıklarda ve 400 mm nin altında yağış alan bölgelerde yetiştirilmesi ekonomik olmamaktadır. Toprak istekleri bakımından fazla seçici olmadığından dolayı birçok bitkinin yetiştirilemediği alanların değerlendirilmesinde kullanılmaktadır (Ulaş, 2001). Zeytin meyvesinin besi dokusu bol miktarda yağ içermektedir. Zeytin ağacı en fazla m ye kadar boylanmakta ve çapı ise 5 6 m ye kadar ulaşmaktadır. Ağaç ömrü ortalama olarak 1000 yıl kadardır. Zeytin meyvesi ham ve olgun halde salamura yapılarak yenmekte; ayrıca ezilerek yağı çıkarılmaktadır. Yağ çıkarıldıktan sonra geriye kalan pirina olarak adlandırılan küspe; gübre ve hayvan yemi şeklinde değerlendirilmektedir (Öksüz, 1998). Türkiye de işlenen tarım alanlarının % 4.1 inde zeytin tarımı yapılmaktadır. DİE 2007 yılı istatistiklerine göre Ülkemizde yaklaşık ha alanda, adedi meyve veren, adedi meyve vermeyen olmak üzere toplam adet zeytin ağacı olmakla birlikte bu rakam dünyadaki zeytin ağacı varlığının (700 milyon) yaklaşık % 13 üne karşılık gelmektedir. İklim ve toprak özellikleri bakımından büyük bir zeytin üretimi potansiyeline sahip olan Türkiye de zeytin üretimi Marmara, Ege, Akdeniz ve Güneydoğu Anadolu Bölgelerinde yoğunlaşmıştır. Yetiştirilen zeytinlerin ortalama % 30 u sofralık, % 70 i ise yağ üretiminde kullanılmaktadır. Gerek zeytin ağacı varlığı gerekse zeytin üretimi bakımından sırasıyla Ege (% 75), Akdeniz (% 14), Marmara (% 10) Bölgeleri ilk sıralarda gelmektedir. Ancak Ege ve Akdeniz Bölgesi yağlık zeytin çeşitleri, Marmara Bölgesi ise sofralık zeytin çeşidi bakımından öndedir Ülkemizde yaygın bulunan zeytin çeşitleri Memecik, Tavşan yüreği, Ayvalık, Domat ve Gemliktir. Zeytin üretimi, sofralık ve yağlık olmak üzere iki farklı şekilde yapılmaktadır. Sofralık çeşitlerde meyve tam olgunlaşmadan (yağ içeriği % 18 22) hasadı yapılarak değişik yöntemlerle tüketiciye iletilmektedir. Yağlık çeşitler ise meyve olgunlaştıktan sonra (yağ içeriği % 30 40) hasadı yapılarak değerlendirilmektedir (Aydın, 2000). 4

14 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Çizelge 2.3. Ülkemizde Bölgeler İtibariyle Zeytin Üretimi (Anonim, 2001) Bölgeler Ege Akdeniz Marmara Ortagüney Güneydoğu Kuzeydoğu Karadeniz Orta Kuzey Toplam Ağaç Sayısı Meyve Veren Yaştaki Ağaç Sayısı MeyveVermeyen Yaştaki Ağaç Sayısı Üretim (Ton) Ortadoğu Türkiye Toplamı Şekil 2.1. Türkiye nin Üretim Alanlarını Gösteren Harita 1.Ege, 2. Marmara, 3. Akdeniz, 4. Güneydoğu Anadolu, 5. Karadeniz (Numaralar bölgelerin ağaç sayısı ve üretim miktarlarına göre çoktan aza doğru verilmiştir.) 5

15 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.3. Zeytin Danesinin Yapısı Meyve sapı %1 2 Epikarp (kabuk) %63-86 Mesokarp (meyve eti) %10 30 Endokarp (çekirdek) %2 6 Çekirdek içi Şekil 2.2. Zeytin Danesinin Yapısı (Boskou, 1996) Oval olan zeytin meyvesi perikarp (etli kısım) ve endokarptan (çekirdek) oluşmuştur. Perikarp ise epikarp (kabuk) ve mezokarptan (etli kısım) meydana gelmiştir. Meyve eti meyvenin yaklaşık % ünü, çekirdek ise % unu teşkil etmektedir. Meyvedeki su oranı % 70 lere kadar çıkabilse de genellikle % 50 civarındadır. Bunun yanında meyvede % 1.6 protein, % 20 yağ, % 20 karbonhidrat, % 5 6 selüloz, % 1.5 kül bulunmaktadır (Boskou, 1996) Zeytinin Bileşimi Zeytin, çeşidine göre şekli ve rengi değişen, besin değeri açısından oldukça zengin bir üründür. Zeytinin yapısında önemli miktarda su ve yağ bulunurken protein, selüloz, şeker, mineral maddeler, hidrokarbonlar, fenolik bileşikler ve tokoferoller de bulunmaktadır (Çizelge 2.7). Bunlar arasında zeytinde iz miktarda bulunduğu halde özellikle yağı oksidasyona karşı koruyarak antioksidan özellik gösteren fenolik bileşikler, yağın rengi, lezzeti, oksidatif stabilitesi ve besin değeri açısından önemli rol oynamaktadır (Kritsakis, 1998). 6

16 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Çizelge 2.4. Zeytin Tanesinin Ortalama Bileşimi (Kiritsakis, 1998) Bileşim Miktar (%) Su 50 Yağ 22 Protein 1.5 Şeker 19.1 Selüloz 5.8 Mineral Madde (Kül) 1.6 Zeytinde bulunan fenol bileşikleri, sofralık zeytin veya zeytinyağının oksidatif stabilitesini ve duyusal özelliklerini etkilediği için oldukça önemlidirler. Bunun dışında fenol bileşenlerinin beslenme ve farmokolojik etkileri doğal antioksidatif ve antimikrobiyel özellikleri bulunmaktadır. Ayrıca bu işlemler renk ve tadı etkilediğinden meyvenin işlenmesinde de önemlidirler (Esti ve ark., 1998). Meyvenin doğal savunma sisteminin oluşturulmasında da fenol bileşenleri önemli rol oynamaktadır (Siciancalepore ve Longone; 1984; Brenes-Balbuena ve ark., 1995; Robards ve ark., 1999). Fenolik bileşikler, meyvenin duyusal özellikleri açısından önemli parametrelerdir ve özellikle o-difenoller, meyve veya yağın oksidasyona karşı dayanıklılığında antioksidan olarak görev yapmaktadır (Keçeli ve Gordon, 2001). Zeytin; başlıca oleuropein, verbaskosit, ligrosit ve flavonollerin glikozit türevleri ile flavonlar, antosiyaninler ve glikozitleri ve fenolik asitleri içermektedir (Montedoro ve ark., 1993; Esti ve ark., 1998; Saija ve ark., 1998; Tsimidou, 1998; Keçeli ve Gordon, 2001). Zeytinin temel fenolik bileşenlerinin kimyasal yapısı Şekil 2.3 de verilmiştir. 7

17 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şekil 2.3. Zeytinin Temel Fenolik Bileşenlerinin Kimyasal Yapısı (Keçeli, 2000) 2.5. Polifenol Oksidaz Enzimi PFO, bitki ve hayvan dokularında yaygın olarak görülen bir enzimdir. Bitkilerde tüm kısımlarda bulunabilirken, gelişmiş hayvanlarda deri, saç, tüy ve gözlerde bulunur. Bitkisel dokularda öncelikle latent (inaktif) formlar halinde sentezlenmekte ve zamanla çeşitli etkenlerle, örneğin dokuda doğal olarak bulunan proteazlar veya etilen gibi birtakım solunum metabolitlerince aktif hale getirilmektedirler (Yemenicioğlu ve ark., 1997). Sağlıklı meyve ve sebze dokularında, PFO enzimlerinin substratları olan fenolik bileşiklerle teması, yok denecek kadar sınırlıdır. Bunun başlıca nedeni, enzim 8

18 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ve substratlarının bitkisel hücrenin farklı kısımlarında yer almalarıdır. Nitekim PFO enzimlerinin bir kısmı sitoplazmada serbest halde bulunurken, büyük bir kısmı hücrenin tilakoid ve kloroplast gibi unsurlarında, membrana bağlı olarak bulunmaktadır. Buna karşın, fenolik bileşiklerin neredeyse tamamı vakuollerde yoğunlaşmış halde bulunmaktadır. Ancak doku olgunlaşmasının ileri aşamalarında hücredeki pektinazların faaliyetiyle, doku kontrollü ve sınırlı bir şekilde doğal olarak değişimlerle uğrar. Ayrıca, hasat, taşıma ve işleme sırasındaki etkiler veya uygulanan çeşitli işlemlerle hücre ve buna bağlı olarak doku bütünlüğü bozulmaktadır. Böylece, PFO enzimleri kendi substratları olan fenolik bileşiklerle ve havadaki oksijen ile bir araya gelmektedirler (Muchuweti ve ark., 2006). Meyve ve sebzelerin olgunlaşmasına paralel olarak, gerek PFO aktivitesinde, gerekse bunların substratları olan fenolik bileşiklerin konsantrasyonunda önemli değişimler görülmektedir. Örneğin elmalarda PFO substratı niteliğindeki o-difenolik bileşiklerin konsantrasyonu ve kateşol oksidaz aktivitesi, olgunlaşmayla beraber sürekli düşüş gösterirken şeftalilerde olgunlaşmayla birlikte o-difenollerin miktarında önce büyük bir artış ve bunu takip eden sınırlı bir düşüş, kateşol oksidaz aktivitesinde sürekli bir düşüş fakat lakkaz aktivitesinde sürekli bir artış görülmektedir. Aynı şekilde zeytinlerde olgunlaşmayla birlikte PFO aktivitesinde sınırlı bir düşüş, ancak buna karşın o-difenollerin konsantrasyonunda sürekli olarak devam eden büyük bir artış görülmektedir. Buna göre, hasat zamanında zeytinlerin esmerleşmeye büyük bir eğilim göstermesinin nedeni kolaylıkla anlaşılmaktadır. Yine mantarlarda olgunlaşmayla birlikte PFO aktivitesinde büyük bir düşüş görülmekte ancak bu durum onların esmerleşmeye eğilimini azaltmamaktadır (Ben- Shalom ve ark., 1977; Ingebrigtsen ve ark., 1989). Birçok meyve ve sebzelerde gerek hasat veya tasıma sırasında mekaniki bir zedelenme sonucu, gerekse bunların herhangi bir ürüne islenmesi aşamasında uygulanan doğrama, parçalama ve ezme gibi işlemler sırasında renkte esmerleşme ve bozulmalar meydana gelmektedir. Bu olay polifenol oksidaz enziminden kaynaklanmaktadır. Enzimatik esmerleşme denilen bu reaksiyon; hem polifenol oksidaz aktivitesi hem de fenolik madde konsantrasyonuyla ilgilidir. Polifenol oksidazlar, gıda endüstrisinde genellikle istenmeyen enzimlerdir. Enzimatik 9

19 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR esmerleşme ürünün duyusal özelliklerini bozar, satın alınabilirliğini azaltır ve aynı zamanda besin değerinde azalmaya neden olur (Coseteng ve Lee, 1987). PFO lar meyve ve sebzelerin hasat, depolama ve işlenme kalitesi ve ekonomisini belirleyen çok önemli enzimlerdir. Oksijen geçişine neden olan hasat, depolama ve işleme sırasındaki zedelenme, kesilme ve diğer mekanik zararlar çoğu meyve ve sebzelerde melanin oluşumuna, bu da hızla esmerleşmeye neden olur. Esmerleşme yüzünden meyvelerde önemli kayıplar olmaktadır. Ürün renginin değişmesi, kötü tat ve besin değeri kaybı tüketici açısından kabul edilemez hususlardır. Muz, şeftali, kayısı, elma, üzüm, çilek ve bazı tropik meyveler ve suları ayrıca patates, marul ve diğer yapraklı sebzelerde esmerleşme görülmektedir. Buna karşılık çay, kahve, kakao, siyah üzüm ve siyah incirlerde PFO aktivitesi istenen bir durumdur (Casado-Vela ve ark., 2005). PFO tirosinaz, fenolaz, kateşoloksidaz, kateşolaz, o-difenoloksidaz, mono fenoloksidaz ve kresolaz olarak da bilinir ve ilk olarak Schoenbein tarafından 1856 da keşfedilmiştir. PFO Uluslar arası Biyokimya Birliği nin sınıflandırmasına iki kez girmiştir: EC (monofenol, L-dopa: oksijen oksidoredüktaz) monohidroksifenolü (ör.p-kresol) o-pozisyonuna hidroksile eder. EC (1,2- benzendiol: oksijen oksidoredüktaz) o-dihidroksifenolleri (ör: kateşol) okside edip hidroksil grubundan hidrojenleri uzaklaştırarak benzokinonlar oluştururlar. Bu enzim iki çeşit oksidatif reaksiyonu katalizler: Monofelik bileşiklerin o-difenollere hidroksilasyonu (kresolaz aktivitesi), diğeri ise o-difenollerin o-kinonlara oksidasyonudur (kateşolaz aktivitesi) (Cash ve ark., 1976). Uluslar arası enzim sistematiğine göre; kresolaz aktivitesi; monofenol monooksigenaz, kateşolaz aktivitesi ise difenol oksidaz ismi ile anılan enzimlerce gerçekleştirilmektedir (Rocha ve ark., 1998). Enzimatik esmerleşme olayı, iki farklı mekanizmaya göre gelişmektedir. Bunlardan birisi, monofenolik bileşiklerin o-difenollere hidroksilasyonu (kreşolaz aktivitesi), diğeri ise o-difenollerin o-kinonlara oksidayonudur (kateşolaz aktivitesi) (Şekil 1). 10

20 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR monofenol 0-difenol o-kinon OH OH O 1/2 O 1/2O 2 OH 2 O R (1) R H 2 O (2) R (çoğunlukla renksiz) (çoğunlukla renksiz) (çoğunlukla kırmızı) Şekil 2.4. Enzimatik Esmerleşme Mekanizması (Cemeroğlu ve Ark., 2001) (1) Kreşolaz aktivitesi (hidroksilasyon) (2) Kateşolaz aktivitesi (oksidasyon) PFO gıdalarda yol açtığı enzimatik esmerleşmeyle önemli kalite kayıplarına neden olmaktadır. PFO nun meyve ve sebzelerden izole edilip biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi depolama ve işleme sırasında kalite kayıplarının en aza indirilmesi ve böylece daha kaliteli ürünlerin üretilmesine olanak sağlayabilir. Bu nedenle PFO enzimi üzerinde çok sayıda araştırma yapılmış, çok değişik meyve ve sebzelerdeki PFO enziminin özellikleri belirlenmiştir. Zeytin PFO su üzerinde yapılmış çok az sayıda çalışma bulunmaktadır. Domat çeşidi zeytindeki PFO enzimi üzerine ise herhangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. Zeytin PFO su ve enzimatik esmerleşme üzerinde yapılmış araştırmalar aşağıda özetlenmiştir. Segevia-Bravo ve ark. (2007), Manzanilla çeşidi zeytinden PFO enzimini saflaştırmışlar ve bazı özelliklerini belirlemişlerdir. Enzimin optimum ph sı 6.0 olarak bulunmuştur. Termodinamik parametrelerin ph ya bağlı olduğu bildirilmiştir. Sciancalepore ve Longone (1984), yeşil zeytinlerde PFO ve esmerleşmeyi inceledikleri çalışmalarında enzim aktivitesi ile esmerleşme derecesi arasında pozitif bir korelasyon bulmuşlardır. Goupy ve ark. (1991), 10 farklı zeytin çeşidinde enzimatik esmerleşme, oleuropein içeriği ve PFO arasındaki ilişkiyi araştırmışlardır. Esmerleşme kapasitesinin PFO aktivitesi ve oleuropein arasındaki karmaşık ilişkiye bağlı olduğu bildirilmiştir. 11

21 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Zeytin dışındaki ürünlerden izole edilen PFO üzerine çok sayıda araştırma yapılmış ve bunlardan bazıları aşağıda verilmiştir. Yemenicioğlu ve Cemeroğlu yaptıkları çalışmada (1996), Hale Haven şeftalilerinde polifenol oksidaz (PFO) enziminin niteliklerini araştırmışlardır. Ham, yarı olgun ve tam olgun şeftalilerden öncelikle aseton tozu hazırlanmıştır. Aseton tozundan hazırlanan enzim çözeltisinde optimum ph, Michaelis sabiti (K m ), maksimum hız (Vm) ve enzim aktivitesinin termal inaktivasyonu incelenmiştir. Olgunluk durumuna göre enzimin optimum ph derecesi arasında bulunmuştur. Tam olgun şeftalilerde elde edilmiş enzimin ph 6.2 de K m değerinin 14.3 mm ve Vm değerinin 1.25 Abs.dk -1. ml -1 olduğu saptanmıştır. Enzimin termal inaktivasyon kinetiği 70 C de araştırılmıştır. Her enzim ekstraktının termal inaktivasyon kurvesinin, başlangıçta dik bir doğru, sonra daha yatık bir doğru olmak üzere iki bölümden oluştuğu belirlenmiştir. Bu nedenle şeftali PFO enziminin ısıya dirençli farklı iki izoenzimden oluştuğu sonucuna varılmıştır. Aydemir ve arkadaşları yaptıkları çalışmada (2003), polifenol oksidaz (PFO) enzimini yer elmasından izole etmişlerdir. PFO, kateşol, L-dopa, DL-dopa ya karşı aktivite göstermiş fakat bir monofenol olan L-tirozine karşı aktivite göstermemiştir. Yer elmasından izole edilen PFO nun optimum ph ve sıcaklık değeri sırasıyla 7.0 ve 25 C dir. Enzim nötr ph civarında oldukça kararlıdır. 60 ve 80 C deki aktivitenin % 50 inaktivasyonu için gerekli olan zaman sırasıyla, 40 ve 20 dakika olarak bulunmuştur. Kateşol için K m ve Vm değerleri sırasıyla, 5.88 mm ve IU/mg.dk dır. Ayrıca, yapılan çalışmada en etkili inhibitörlerin potasyum siyanid, β- merkaptoetanol ve tiyoüre olduğu belirlenmiştir. Yemenicioğlu ve ark. (1997), altı elma çeşidinin (Golden Delicious, Starking Delicious, Granny Smith; Gloster, Starcrimson ve Amasya) PFO larının ısıl inaktivasyon kinetiklerini üç sıcaklıkta (68, 73 ve 78 C) çalışmışlardır. PFO aktivitesi başlangıçta artmış ve daha sonra ısıcaklıktaki artışla beraber birinci dereceden kinetik modele uyarak azalmıştır. Aktivitedeki artış bağlı PFO nun varlığını göstermektedir. İnaktivasyon eğrisinin lineer bölümü için regresyon katsayısı inaktivasyon parametrelerini belirlemek için hesaplanmıştır. 78 C de 12

22 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Amasya elması PFO sunun en az, Starking Delicious cinsi PFO nun ise en yüksek ısıl-dirence sahip olduğunu göstermiştir. Saygılı ve arkadaşları (1998), Türkiye Şeker Fabrikaları A.Ş. Şeker Enstitüsü (Ankara) deneme tarlalarında yetiştirilen Evita, TŞ. Poly, Gisela, Adonis ve Agra adlı şeker pancarı çeşitlerindeki polifenoloksidaz (PFO) aktivitesini incelenmişlerdir. PFO enzim aktivitesi substrat olarak kateşolün kullanıldığı dolaylı bir yöntemle ölçülmüştür. Absorbans-zaman grafiğinin eğimi toplam enzim aktivitesi olarak değerlendirilmiştir. Bazı şeker pancarı çeşitlerinde (Evita, T.Ş. Poly) ortalama PFO aktivitesinin yüksek olduğu ve aynı çeşit örneklerdeki enzim aktivitesi değerlerinin çok geniş sınırlar arasında değiştiği belirlenmiştir. Fakat Adonis çeşidi için ortalama PFO aktivitesi ve standart sapma değerleri oldukça düşük bulunmuştur. Tam doğal şeker (Whole Sugar) üretiminde pancardaki polifenol oksidazlar ürün rengini olumsuz etkilemekte ve bu nedenle üretimin ilk aşamasında PFO buharla inaktive edilmektedir. Bu tür düşük PFO aktivitesine sahip çeşitlerin kullanımı ile proseste ve ürün kalitesinde iyileştirme sağlanabilecektir. Wissemann ve Lee (1981), üzümden elde ettikleri PFO nun niteliklerinin belirlenmesi ile ilgili yaptıkları çalışmada, iki farklı üzüm çeşidi kullanmışlar (Ravat 51 ve Niagara) ve her iki üzüm çeşidinde optimum ph ve sıcaklık değerlerinin 5.5 ve 25 C olduğunu bildirmişlerdir. Niagara üzümünden elde edilen PFO nun, Ravat 51 den elde edilen üzüm PFO suna göre ısıya karşı daha dirençli olduğu bildirilmiştir. Enzim üzerine çeşitli inhibitörlerin etkisi denenmiş ve en etkili inhibitörler L-sistein ve sodyum dietilditiyokarbomat olarak bulunmuştur. Nakamura ve ark. (1983), Japon çeşitlerinden Koshu üzümlerinden aseton tozu yöntemi ile ekstrakte ettikleri PFO enzimini amonyum sülfat çöktürmesi ve kolon kromatografisi ile saflaştırmışlar ve enzimin bazı özelliklerini belirlemişlerdir. Enzimin molekül ağırlığının , optimum ph sının 6.0 ve optimum sıcaklığının ise 25 C olduğunu belirlemişlerdir. Ayrıca, enzim o-difenolik bileşiklere yüksek aktivite gösterirken, monofenollere hiç aktivite göstermemiştir. Ünal (2007), Anamur muzundan polifenol oksidaz enzimini saflaştırıp, enzimin karakteristik özelliklerini belirlemiştir. PFO nun muz için optimum sıcaklığı 30 C bulunmuştur. Enzimin optimum ph derecesi 7.0 olarak bulunmuştur C deki 13

23 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR termal inaktivasyon çalışmalarından, enzimin yarı ömür değeri 7.3 ve 85.6 dakika arasında değişmektedir. E a ve Z değerleri, sırasıyla, 155 kj.mol -1 ve 14.2 C olarak hesaplanmıştır. K m ve Vm değerleri sırasıyla 8.5 mm ve 0.754OD 410 dak -1 dır. İnhibitör testlerinde ise askorbik asit ve sodyum metabisülfit en etkili inhibitör olarak tespit edilmiştir. Rapeanu ve arkadaşları (2006), Güney Afrika da yetişen Viktorya üzümlerinden ekstrakte edilen PFO enziminin biyokimyasal tanımlanmasını ve kimyasal stabilitesini araştırmışlardır. McIlvaine tamponu ile hazırlanmış 10 mm kateşol substratı ile üzüm PFO aktivitesi için optimum ph ve sıcaklık sırasıyla 5.0 ve 25 C olarak bulunmuştur. 10 mm kateşol substrat olarak kullanıldığında K max ve Vm değerleri sırasıyla 52.6± mm ve 653±24.0 OD 400 nm/dk dır. Çalışmada sekiz inhibitör test edilmiş ve en etkili inhibitörlerin askorbik asit, L-sistein ve sodyum metabisülfit olduğu bulunmuştur. Kinetik çalışmalar, Viktorya üzümleri PFO sunun termal inaktivasyonunun, E a =225±13.5 kj/mol lük bir aktivasyon enerjisi ile birinci dereceden kinetiğe uyduğunu göstermiştir. Yemenicioğlu ve arkadaşları Taro yumrularından ekstrakte edilmiş peroksidaz (POD) ve polifenol oksidaz (PFO) enzimlerinin C arasındaki ısıl inaktivasyonunun birinci dereceden reaksiyon kinetiğine uygun olarak geliştiğini saptamışlardır. Her iki enzimin, ısıl dirençleri birbirinden farklı iki izoenzimden oluştuğu belirlenmiştir C aralığında, ısıl direnci yüksek olan fraksiyonun oranı POD için; %33 34 ve PFO için; %67 72 olarak bulunmuştur. Diğer taraftan, bu enzimlerin E a ve Z değerlerinin sırasıyla POD için 19.4 kcal.mol -1 ve 25.9 C ve PFO için ise 21 kcal.mol -1 ve 25.5 C olarak saptanmıştır. Aynı şekilde, ph optimumu POD için 5.9 ve PFO için 6.5 olarak belirlenmiştir. Bu enzimlerin yumrudaki dağılımı da incelenmiş ve POD enziminin yumruların yüzey kısımlarında, buna karsın PFO enziminin ise daha çok merkez kısımlarında yoğunlaştığı saptanmıştır. PFO enziminin kateşol oksidaz ve floroglusinol oksidaz aktivitesi içermesine karşı, lakkaz aktivitesine sahip olmadığı görülmüştür. EDTA, SO 2, NaCl ve askorbik asidin PFO enzimi üzerindeki inhibe edici özellikleri de belirlenmiştir. Gόmez (2002), gıda işleme operasyonları sırasında yol gösterici olarak yararlı bilgi sağlamak amacıyla iki avokado çeşidinden (Booth 1 (B1PFO) ve Julio Millian 14

24 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR (JMPFO)) elde edilen kaba PFO enzimi üzerinde çalışmıştır. İki ekstrakt için de optimum aktivitenin görüldüğü ph bulunmuştur ºC arasındaki ısıl aktivasyon enerjisinin, kcal/mol arasında değiştiği bildirilmiştir. Yağar (2004), çalışmasında, ph 7 de, 0.1M fosfat tamponu kullanarak kereviz köklerinden PFO ekstrakte etmiştir. Substrat spesifikliği denemeleri, kateşol, pirogallol, L-DOPA, p-kresol, resorsinol ve tirozin kullanılarak yapılmıştır. Pirogallol, kateşol ve L-DOPA için K m değerleri 25 C de sırasıyla; 4.5, 8.3 ve 6.2 mm bulunmuştur. Optimum ph ve sıcaklık kateşol, pirogallol ve L-DOPA ile belirlenmiştir. Optimum ph kateşol ve L-DOPA için 7, pirogallol için 7.5 dir. Maksimum PFO aktivitesi için optimum sıcaklıklar; pirogallol için 25 C, kateşol için 40 C ve L-DOPA için 45 C bulunmuştur. Isıl inaktivasyon çalışmaları, 60 C nin üzerinde enzimatik aktivitede düşüş olduğunu göstermiştir. İnhibitörlerin etki sırası şu şekilde bulunmuştur: L-sistein>askorbik asit>glisin>resorsinol>nacl. Sabancılar ve ark. (2007), yaptıkları çalışmada Denizli Narından PFO enzimi Afinite Kromatografisi yardımı ile saflaştırmış ve karakterizasyonunu yapmışlardır. Denizli narından saflaştırılan polifenol oksidaz enzimi afinite kromatografisi kullanılarak 67 kat saflaştırılmıştır. Enzimin optimum ph sı 7.5 optimum sıcaklığı 40 C olarak bulunmuştur. Enzimin kinetik parametreleri olan Vm ve K m değerleri ise Linewearver-Burk grafiğinden saptanmıştır. Gülçin ve ark., (2005) ısırgan PFO nun saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı inhibitörlerin enzim aktivitesine etkisini inceledikleri çalışmada, amonyum sülfat çökeltmesi ve iyon değişim kromatografisi ile saflaştırma yapmışlardır. Saflaştırdıkları enzime 8 farklı substratın etkisini denemişler ve en uygun substratın L-tirozin olduğunu bulmuşlardır. Optimum ph ve sıcaklık değerleri sırası ile 4.5 ve 30 C olarak bulunmuştur. K m ve Vm değerleri ise 7.90x10 4 mm ve EU/mL olarak bildirilmiştir. Ayrıca, birkaç inhibitörün etkisi denenmiş ve en etkili inhibitörün sodyum dietil ditiyokarbomat olduğu saptanmıştır. Orenes-Pinero ve ark. (2006), ayva PFO sunu kısmi olarak saflaştırmışlar ve bazı biyokimyasal özelliklerinin belirlemişlerdir. Araştırmacılar amonyum sülfat çökeltmesi uygulayarak kısmi saflaştırma yapmışlar ve 0.5 g/dm 3 sodyum dodesil sülfat (SDS) varlığında ve asidik ph da enzimin maksimum aktivite gösterdiğini 15

25 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR bulmuşlardır. SDS varlığında enzimin maksimum hız değerinin 15 kat daha fazla ve optimum ph değerinin 5.0 olduğu, her iki durumda da K m değerinin 1.2 mm olduğu bildirilmiştir. Araştırmacılar birkaç inhibitörün etkisini denemişler ve en etkili inhibitörün tropolon olduğunu bulmuşlardır. Yağar ve Sağıroğlu (2000), ayvadan ekstrakte ettikleri PFO enzimini (NH 4 ) 2 SO 4 çökeltmesi ile kısmen saflaştırılmıştır. Substrat spesifikliği denemeleri, kateşol, pirogallol, L-DOPA, p-kresol, resorsinol ve tirozin kullanılarak yapılmıştır. Kateşol en iyi substrat olarak belirlenmiştir. Michealis sabiti kateşol, pirogallol, L- DOPA için, sırasıyla 4.54 mm, 7.35 mm, 1.78 mm olarak bulunmuştur. Optimum ph ve sıcaklık, spesifik substrat olan kateşol için sırasıyla 8.0 ve 40ºC olarak belirlenmiştir. Sekiz çeşit inhibitör test edilmiş ve ayva PFO su üzerinde en etkili olanlarının L-sistein, askorbik asit, potasyum siyanid olduğu tespit edilmiştir. Ziyan ve Pekyardımcı (2003), polifenol oksidaz enzimini amonyum sülfat çökelmesi, jel filtrasyon ve diyaliz yöntemi ile yerli armut çeşidi olan Ankara armudundan izole etmişlerdir. Amonyum sülfat çökeltmesinden sonra diyalizde elde edilen enzimin biyokimyasal özelliklerini belirlemiştlerdir. Optimum ph değerleri, pirogallol için 8.2, 4-metil kateşol için 7.2, kateşol için 7.0, D-tirosin için 5.6, p- kresol için 5.0, L-dopa için 4.8 olarak belirlenmiştir. Optimum sıcaklık 4-metil kateşol için 35ºC olarak bulunmuştur. 4-metil kateşol, klorogenik asit, kafeik asit iyi substratlar olmasına karşın, kateşol en etkili substrat olarak saptanmıştır. Ayrıca, 6 farklı inhibitörün PFO üzerindeki etkisi araştırılmıştır. L-askorbik asit, L-sistein ve Dietilditiyokarbomat en etkili inhibitör olarak tespit edilmiştir. K m ve Vm değerleri sırasıyla kateşol için 5.55 mm ve IU/mL olarak hesaplanmıştır. Termal inaktivasyon çalışmalarında aktivasyon enerjisi 0.19 kal/mol olarak belirlenmiştir. Ankara armudu PFO sunun üç izoenzimi polikirilamid jel elektroforezindeki aktivitesiyle tespit edilmiştir. Molekül ağırlıkları ise sodyum dodesil sülfat PAGE için 60, 20, 28 kda olarak bulunmuştur. Mazzafera ve Robinson (2000), kahve yaprakları ve kahve endosperminin kısmen saflaştırılmış ekstraktından PFO enzimini karakterize etmişlerdir. PFO aktivitesi meyve endospermi ve yaprakların ikisinde de, erken gelişme safhasında daha yüksek oranda bulunmuştur. PFO proteaz uygulamalarıyla aktive edilememiştir 16

26 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ve bağlı değildir. PFO aktivitesi mm sodyum dodesil sülfat (SDS) ile %10-15 civarında arttırılmıştır. Ancak, daha yüksek konsantrasyonlarda çalışmalar deterjansız kontrol yöntemleriyle benzerdir. Tripsin veya proteinaz K ile ekstraktın uzun inkübasyonu PFO aktivitesini inhibe etmiştir ancak pepsinin hiçbir etkisi olmamıştır. Proteinaz K ile PFO inhibisyonu SDS varlığında artmıştır. İki dokudaki PFO aktivitesi ph 6-7 de ve 30 C de en yüksektir. Substrat olarak klorojenik asit mm (PFO-L) ve 2.27 mm (PFO-E) K m ile en yüksek aktiviteye sahiptir. Hekzadekil trimetil-amonyum bromid polivinilprolidon 40, sinnamik asit ve salisihidroksamik asid her iki dokudan PFO su her iki dokudan inhibe etmiştir. Espin ve arkadaşları (1997) enginardan elde edilen PFO enziminin monofenolaz aktivitesini incelemişlerdir. Enginar PFO su aseton tozu gibi basit bir yöntem kullanılarak izole edilmiştir. Enzim ekstraktı hem monofenolaz hem de difenolaz aktivitesi göstermiştir. Enzim monofenolaz aktivitesi, substrat olarak çiftli bir nükleofil olarak 3-metil-2-benzothiazolinon ile birlikte 4-hidroksianisol, kullanılarak tanımlanmıştır. Bu metot yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik göstermiş ve PFO nun mikro miktarlarını tespit etmede faydalı olabilecek olan, bir kalibrasyon eğrisi elde etmeye izin vermiştir. Doğan ve arkadaşları (2002), kurutma işlemleri için en uygun patlıcan çeşidini tanımlamak için, farklı patlıcan çeşitlerinden elde edilen PFO enziminin biyokimyasal özelliklerini araştırmışlardır. PFO kateşol, 4-metilkateşole karşı aktivite göstermiş, fakat L-tirozin ile aktivite göstermemiştir. Çeşit I (Vm= EUdk -1 ml -1, K max =8.7 mm ve Vm/K max = dk -1 ) ve çeşit III (Vm 1000 EU dk -1 ml -1, K max =9.3 mm ve Vm/K max = dk -1 ) için en iyi substrat kateşol bulunurken, çeşit II için (Vm=5000 EU dk -1 ml -1, K max =35.5 mm ve Vm/K max = dk -1 ) en iyi substrat 4-metilkateşoldür. Kateşol için optimum ph 7, 4-metilkateşol için optimum ph 6 dır. Isıl inaktivasyon çalışmalarına göre 40 C nin üzeri sıcaklıklarda enzim aktivitesi düşmüştür. Kateşol ve 4-metil kateşol substratları için maksimum aktivite elde etmek için optimum sıcaklık, kateşol kullanılan ve optimum sıcaklığı 20 C bulunan çeşit I dışında, tüm patlıcan çeşitleri için 30 C olarak bulunmuştur. Katalizlenen PFO reaksiyonları üzerine Tropolon, D, L-ditiotreitrol ve glutation gibi 17

27 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR bileşenlerin inhibitör olarak etkileri test edilmiş ve genelde en etkili inhibitör olarak tropolon bulunmuştur. Serradell ve ark. (2000), çilek PFO sunu amonyum sülfat çökeltmesi ve iyon değişim kromatografisi kullanarak saflaştırmışlar ve karakterizasyonunu çalışmışlardır. Substrat olarak prokateşol kullanılmış ve bu substratta K m değeri 11.2 mm, optimum ph değeri 50 C de SDS varlığında 7.2 ise olarak bulunmuştur. Sanchez-Ferrer ve ark. (1988), Monastrell üzümlerinden izole edip kısmen saflaştırdıkları PFO enziminin kateşolaz ve kresolaz aktivitelerini incelemişlerdir. Kateşolazın sıcaklık ve ph optimum aralıkları sırasıyla C ve arasında bulunmuştur. Kresolaz aktivitesinde lag periyodu gözlenmiştir. Enzim konsantrasyonu, sıcaklık veya ph daki artış lag periyodununda düşmeye neden olurken substrat konsantrasyonunun artırılması artışa neden olmuştur. Sanchez-Ferrer ve ark. (1989), Monastrell ve Airen üzüm tanelerinde gelişme ve olgunlaşma sırasında kateşolaz ve kresolaz aktivitelerini araştırmışlardır. Monastrell üzümü PFO nun kateşolaz aktivitesi ölçümde kullanılan ph ya bağlı olarak artmış veya azalmıştır. Airen üzümlerinde ise ph dan bağımsız olarak sürekli artmıştır. Monastrell üzümlerinde ağır yağmurlu gün ve ben düşme döneminde daha yüksek kateşolaz aktivitesi gözlenmiştir. Gauillard ve Richard-Forget (1997), yaptıkları çalışmada armuttan elde ettikleri PFO yu saflaştırmış ve bazı özelliklerini belirlemişlerdir. Saflaştırma için amonyum sülfat çökeltmesi ve iyon değişim kromatografisi kullanılmıştır. Saflaştırma sonunda F1 ve F2 olmak üzere iki farklı fraksiyon elde edilmiştir. F1, 124 kat ve F2 ise 36 kat saflaştırılmıştır. Her iki fraksiyon da benzer K m değeri göstermiştir. K m değeri 5-11 mm arasında değişmiştir. Ayrıca, değişik substratlar denenmiş ve en iyi substrat klorojenik asit olarak bulunmuştur. Ding ve ark. (1998), yenidünyadan elde ettikleri PFO enziminin bazı biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi ile ilgili yaptıkları çalışmada enzimi amonyum sülfat çökeltmesi, jel değişim ve iyon değişim kromatografisi kullanarak 157 kat saflaştırmışlardır. Saflaştırma sonunda enzimin optimum ph sı 4.5, optimum sıcaklığı 30ºC ve enzimin stabil olduğu ph aralığı 4-8 olarak bulunmuştur. Ayrıca, araştırmacılar substrat olarak klorojenik asit ve neoklorojenik asit kullandıkları 18

28 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR çalışmada enzimin K m değerinin ve mm olduğunu ve inhibitörlerin etkisini çalışmada ise sodyum L-askorbik asit, sodyum dietil ditiokarbomat ve sodyum metabisülfitin enzimi tamamen inhibe ettiğini bildirmişlerdir. Rocha ve ark. (1998), elmadan elde ettikleri PFO ın bazı biyokimyasal özelliklerini belirlemişlerdir. Araştırmacılar farklı substratların etkisini denemişler ve en etkili substratın klorojenik asit olduğunu bulmuşlardır. Weemaes ve ark. (1998), yaptıkları çalışmada elma, avokado, armut ve erikten PFO enzimi izole etmişler ve bazı biyokimyasal özelliklerini belirlemişlerdir. En yüksek PFO aktivitesi avokadodan elde edilen PFO da bulunmuştur. Arslan ve ark. (2004), duttan elde ettikleri PFO yu amonyum sülfat ve affinite kromatografisi kullanarak saflaştırmışlardır. Araştırmacılar substrat olarak kateşol, 4- metil kateşol ve pirogallol kullanmışlardır. Optimum ph ve sıcaklık değerlerinin bu 3 substrat için ve C arasında değiştiğini bildirmişlerdir. 19

29 3.MATERYAL VE METOT 3. MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Denemelerde Ç.Ü. Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Araştırma ve Uygulama Bahçesinden temin edilen Domat zeytini kullanılmıştır Analizlerde Kullanılan Araç Gereç ve Kimyasal Maddeler Aseton tozunun elde edilmesinde Torrington HGBTWTS3 (Amerika) marka Waring blendor kullanılmıştır. Tamponların ayarlanmasında ve ph ölçümlerinde cam elektrodlu Inolab (Almanya) marka ph metre kullanılmıştır. Spektrofotometrik ölçümler, sıcaklık kontrol ünitesi olan Shimadzu UV-1700 marka (Japonya) spektrofotometrede gerçekleştirilmiştir. Enzim ekstraktının elde edilmesinde Nüve NM 110 marka karıştırıcı ve Kubota 7780 (Japonya) marka santrifüj kullanılmıştır. Enzimlerin saflaştırılmasında Atto AC-5750 (Japonya) marka fraksiyon kollektörü kullanılmıştır. Enzimlerin biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi sırasında Memmert WB14 ve Nüve BM402 marka su banyosu kullanılmıştır. Enzimin saflaştırılması ve biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesinde kullanılan triton X-100, sodyum metabisülfit, PVPP (polivinilpolipirolidon), askorbik asit, commasie brillant blue (CBB) Merck (Darmstadt, Almanya) firmasından temin edilmiştir. DEAE-Toyopearl 650-M Supelco (Montgomeryville, Amerika) firmasından sağlanmıştır. PEG (polietilen glikol), PMSF (fenilmetilsülfonil florid), 4-metil kateşol, sodyum disülfit, askorbik asit, L-sistein, aseton, amonyum sülfat ve selüloz membran (76mm 49mm) Sigma-Aldrich (St. Louis, Amerika) firmasından temin edilmiştir Metot Polifenol Oksidaz Ekstraktının Hazırlanması Dondurulmuş (-25ºC), zeytinlerden çekirdekleri çıkartıldıktan sonra 150 gr alınmış, g polietilen glikol (PEG) içeren 225 ml önceden soğutulmuş (-18ºC) 20

30 3.MATERYAL VE METOT aseton içerisinde 2 dk Warring blendorda homojenize edilmiştir. Homojenat vakumlu filtreden geçirilmiştir. Elde edilen filtre keki 150 ml soğutulmuş aseton ile karıştırılarak aynı işlemler uygulanmıştır. Filtre üzerinde kalan kısım, beyaz aseton tozu elde edilene kadar 150 ml soğuk aseton kullanımlarıyla ekstrakte edilmiştir. Elde edilen aseton tozu bir gece oda sıcaklığında kurutulduktan sonra cam kavanoz içerisinde 25ºC de saklanmıştır (Coseteng ve Lee, 1987) Enzimin Kısmi Saflaştırılması Elde edilen aseton tozundan 10g alınarak 10 mm askorbik asit, %0.1 polivinilpoliprolidon, %0.5 Triton X-100 ve 1mM PMSF (fenil metil sülfoni florid) içeren 300 ml, 0.1 M, ph 6.8 fosfat tamponunda 40 saniye homojenize edilmiştir. Homojenat 3 saat, +4ºC de magnetik karıştırıcı ile karıştırılmış ve daha sonra x g de 45 dakika +4ºC de santrifüjlenmiştir. Santrifüj sonrası, berrak kısma %90 amonyum sülfat çökeltmesi uygulanmıştır. Çökeltilen fraksiyonlar x g de 45 dakika, + 4ºC de santrifüj edilerek ayrılmıştır. Çökelti, az miktarda 0.01 M ph 6.8 fosfat tamponunda çözülmüş ve +4ºC de aynı tampona karşı bir gece boyunca diyaliz edilmiştir (Serradell ve ark., 2000) İyon Değişim Kromatografisi ile Saflaştırma Diyaliz edilen enzim çözeltisi, 0.01 M ph 6.8 fosfat tamponu ile dengelenmiş DEAE-Toyopearl 650-M iyon değişim kolonuna (2.5 x 30 cm) 0.5 ml.dk -1 hızla verilmiştir. Enzim çözeltisi verildikten sonra 0.5 ml.dk -1 hızla yaklaşık 200 ml başlangıç tamponu geçirildikten sonra M, ph 6.8 fosfat tamponu kullanılarak gradient elüsyon yapılmıştır. Toplam 40 ml enzim çözeltisi kolona verilmiştir. Fraksiyonlar 4 er ml olacak şekilde toplanmış ve elde edilen fraksiyonlarda enzim aktivitesi ve protein tayini yapılmıştır Protein Tayini Enzimlerin protein içeriği standart olarak sığır serum albumini kullanılan Bradford yöntemine göre belirlenmiştir (Bradford, 1976). 21

31 3.MATERYAL VE METOT Enzim Aktivitesinin Ölçümü Enzim aktivitesi 30 C de 410 nm de 40 sn boyunca absorbanstaki artıştan belirlenmiştir. Absorbans-zaman grafiğinin lineer kısmının eğiminden enzim aktivitesi hesaplanmıştır. Ölçümler iki paralelli olarak yapılmış ve sonuçlar ortalama değerler şeklinde ifade edilmiştir. Optimum ph daki tampon ile hazırlanmış ve 30 C ye ısıtılmış 0.9 ml substrat çözeltisi 0.1 ml enzim çözeltisi ile karıştırıldıktan sonra absorbanstaki artış otomatik olarak kaydedilmiştir. Sadece inhibitörün etkisini belirlemek için yapılan enzim aktivitesi ölçümlerinde 0.8 ml substrat, 0.1 ml inhibitor ve 0.1 ml enzim çözeltisi kullanılmıştır. Kontrol olarak fosfat tamponunda hazırlanmış substrat kullanılmıştır. 1 ünite PFO aktivitesi 30 C de dakikada birimlik absorbans artışına neden olan enzim miktarı olarak tanımlanmıştır (Ünal ve Şener, 2006) Enzimin Biyokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi Enzimin optimum ph ve sıcaklığı, kinetik parametreler, termal inaktivasyon, inhibitörlerin etkisi gibi biyokimyasal özellikleri Ünal (2007) a göre belirlenmiştir Optimum ph Enzimin en yüksek aktivite gösterdiği optimum ph yı bulabilmek için ph aralıklarında aktiviteler ölçülmüştür. ph için 0.2 M sitrat tamponu, ph için 0.2 M fosfat tamponu kullanılmıştır. PFO aktivitesi farklı tamponlarda, standart reaksiyon karışımı kullanılarak ölçülmüştür. Enzimin en yüksek aktivite gösterdiği ph değeri optimum ph olarak belirlenmiş ve diğer deneyler bu ph da gerçekleştirilmiştir Optimum Sıcaklık Optimum sıcaklığı belirleyebilmek için C ler arasında enzim aktivitesi ölçülmüştür. Bunun için optimum ph daki tamponla hazırlanmış 0.9 ml 4-metil kateşol çözeltisi ilgili sıcaklıkta su banyosunda 5 dakika bekletildikten sonra üzerine 22

32 3.MATERYAL VE METOT 0.1 ml enzim çözeltisi ilave edilerek enzim aktivitesi ölçülmüştür. Maksimum enzim aktivitesinin görüldüğü sıcaklık değeri optimum sıcaklık olarak belirlenmiştir Kinetik Parametreler Enzimin Michaelis-Menten sabiti (K m ) ve maksimum hız V m değerlerini bulabilmek için optimum ph ve sıcaklıkta değişik konsantrasyonlarda 4-metil kateşol kullanılarak enzim aktiviteleri ölçülmüştür. Kinetik parametreler Lineweaver-Burk metoduyla grafiksel olarak hesaplanmıştır. Bu amaçla 1/Substrat-1/Reaksiyon hızı grafiği çizilmiş ve eğim ve y eksenini kestiği noktalardan K m ve V m değerleri hesaplanmıştır Termal İnaktivasyon Sıcaklığın enzim stabilitesine etkisini belirlemek için enzim 65, 70 ve 75ºC de (5, 10, 15 dk ) ısıtıldıktan sonra kalıntı enzim aktiviteleri belirlenmiştir. Vidalı deney tüpü ilgili sıcaklıktaki su banyosunda 5 dk bekletildikten sonra içerisine 0.3 ml enzim konulup değişik sürelerde sıcaklığa maruz bırakılmıştır. Süre sonunda enzim hızlı bir şekilde su banyosundan çıkarılıp buz banyosunda soğutulmuş, ardından oda sıcaklığına getirildikten sonra enzim aktivitesi standart reaksiyon karışımı kullanılarak ölçülmüştür. Kontrol olarak sıcaklığa maruz bırakılmayan enzim kullanılmıştır. Sıcaklığa maruz kalan enzimlerdeki kalıntı aktivite (E t ), sıcaklığa maruz kalmamış enzimin aktivitesi (E o ) ile kıyaslanarak birinci dereceli inaktivasyon sabiti (k d ), yarı ömür (t1/2), aktivasyon enerjisi E t, sabit bir sıcaklıktaki enzim aktivitesinin %90 ını inaktive etmek için gereken süre (D değeri) ve D değerinde bir log10 azalma için (% 90 azalma için) gereken sıcaklık artışı (Z değeri) hesaplanmıştır. Bu değerlerin hesaplanması aşağıda özetlenmiştir. Belli bir zaman süreci içerisinde doğal enzimin aktivitesindeki kayıplar ya da konsantrasyonundaki azalmalar birinci dereceden kinetiğe uyar ve aşağıdaki gibi ifade edilebilir. 23