KOÇ TESTİS ARJİNAZI: İZOLASYON VE ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ

Transkript

1 KOÇ TESTİS ARJİNAZI: İZOLASYON VE ÖZELLİKLERİNİN BELİRLENMESİ M. Barış Günaydın, M. Hande Gölgeli, Birce Kantar Danışman: E. Suna Türkoğlu ÖZET Arjinaz (EC ) arjininin ornitin ve üreye dönüşümünü katalizleyen bir metalloenzimdir. Hepatik ve ekstrahepatik olmak üzere iki izoziminin varlığı çeşitli dokularda tanımlanmıştır. Bu çalışmada, bir yaşında kıvırcık cinsi koç testisinde arjinaz aktivitesinin olası varlığının saptanması sonrası enzimin çeşitli özelliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Verilerimiz, testis dokusunda enzimin varlığı ve Michaelis-Menten kinetiğine uyduğu doğrultusundadır. GİRİŞ Arjinaz (EC ), arjinini ornitin ve üreye katalizleyen bir metalloenzimdir. Farklı genler tarafından kodlanan arjinaz I (hepatik arjinaz, Tip I) ve arjinaz II (ekstrahepatik arjinaz, Tip II) olmak üzere iki izoziminin varlığı tanımlanmıştır. İzozimlerin katalitik aktivite için mutlak Mn 2+ gereksinimlerinin benzer olduğu gösterilmiştir. Buna karşın alt birim çeşitliliği, dördüncül yapılanmaları, kinetik özellikleri, hücre içi yerleşimleri, doku dağılımları, sentezlerinin düzenlenmesi ve immünolojik reaktivitelerinde farklılıklar göstermektedirler. Arjinaz I sitozolik olup, ağırlıklı olarak karaciğerde sentezlenirken, arjinaz II mitokondriyaldir ve böbrek, beyin, ince bağırsak, meme bezi, makrofaj gibi ekstrahepatik dokularda yaygın olarak sentezlenmektedir (1,4-6,8,10,13). Hepatik dokuda arjinaz I, üre döngüsünün son basamağını katalizleyerek amonyak detoksifikasyonunda rol oynamaktadır. Ekstrahepatik dokularda da derişimi düşük olmak üzere sentezlenebilmektedir. Üre döngüsünün aktif olmadığı dokularda arjinazın (Tip I / Tip II) işlevi poliaminler, prolin ve glutamat biyosentezi için öncü molekül olan ornitini sağlamaktır. Bunun yanı sıra arjinaz, nitrik oksit sentezinden sorumlu olan nitrik oksit sentaz ile aynı substratı kullanmaktadır. Bu bağlamda arjinin homeostazında rol oynamaktadır (Şekil 1) (1,3,4,6,8,9,11,13). Enzimin moleküler formlarının farklı yapılanmalarının varlığı da bildirilmektedir (1,8,10). Arjinazın moleküler formları, dokuya bağımlı olarak değişiklik gösterebilmektedir. Patolojik durumlarda dokuya özgü enzim ekspresyonunun yanı sıra diğer izozimin ekspresyonu da gerçekleşebilmektedir (5,16). Bu neden ile fizyolojik ve patolojik süreçte arjinazın etkisinin olabileceği ileri sürülmektedir (4,5,8,16). Arjinazın fizyolojik ve patolojik durumlardaki öneminin/katılımının belirlenebilmesi ve söz konusu durumların moleküler mekanizmalarına enzim bağlamında açıklık getirebilmek amacı ile arjinazın moleküler özelliklerinin incelendiği çok sayıda araştırma bulunmaktadır (1,6,8,10). Bu araştırmalarda ağırlıklı olarak fare, sıçan, kobay, sığır ve insana ait başta karaciğer ve böbrek olmak üzere çeşitli dokularda arjinaz aktivitesinin varlığı gösterilmiştir. Enzimin biyokimyasal ve kinetik özelliklerinin belirlenmesi in vitro da saflaştırılması sonrası yapılan çalışmalarla belirlenmiştir. Bu çalışmalarda ağırlıklı olarak sıçan ve insan dokuları (karaciğer ve böbrek) kullanılmıştır (1,8). 1

2 Testiste arjinazın varlığı ve özellikleri ile ilişkili araştırmaların sayısı oldukça azdır (10). Bu çalışmada, koç testisinde arjinaz aktivitesinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Enzimin yabancı proteinlerden ayrıştırılması sonrası kinetik davranışı incelenecek ve akrilamid kaynaklı olası kovalan modifikasyon çalışmaları gerçekleştirilecektir. Protein NO Üre Endojen Sentez Arjinin Arjinaz Prolin Ornitin Poliaminler Diyet Glutamat Agmatin Kreatin Şekil1. Memelilerde arjinin metabolizması ve metabolizmada arjinazın işlevi GEREÇ VE YÖNTEM Araştırmada bir yaşında kıvırcık cinsi koç testisleri kullanılmıştır. Soğuk zincire uyularak koçların kesiminden bir gün sonra ticari olarak sağlanan testisler laboratuarda zarları, yağ ve damarları temizlendikten sonra bütün olarak -24 o C da saklanmıştır. Çalışmada kullanılan kimyasal ve biyokimyasallar Sigma firmasından sağlanmış olup, veriler çift çalışmanın aritmetik ortalamasıdır. Arjinaz aktivite analizi Testis dokusu soğukta makas kullanılarak parçalandıktan sonra % 0,25 TritonX-100 içeren 0,1 M Tris.HCl ph 7,57 de cam-teflon homojenizatör kullanılarak homojenize edilmiştir (300mg/ml olacak şekilde). Homojenat 26500xg de 30 dakika santrifüj edildikten sonra elde edilen süpernatan enzim kaynağı olarak kullanılmıştır. Testis arjinaz aktivite analizi 37 o C da 65mM Tris.HCl/ 0,1mM Mn 2+ ph 8,6 da 25mM arjinin varlığında gerçekleştirilmiştir. Tepkime sonrası oluşan üre Geyer ve Dabich yöntemi kullanılarak saptanmıştır (7). Aktivite U/ml, U/g doku, özgül aktivite veya ilk hız çalışmalarında A 520 /10 dakika olarak ifade edilmiştir. Bir ünite enzim deney şartlarında dakikada bir mikromol üre oluşumuna neden olan enzim miktarı olarak ifade edilmiştir. Örneklerde protein analizi Bradford yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir (2). Yabancı proteinlerin uzaklaştırılması ve kinetik davranışın belirlenmesi İstenmeyen proteinlerin uzaklaştırılması ve arjinazın kinetik davranışının incelenebilmesi amacı ile 4 o C da (NH 4 ) 2 SO 4 çöktürmesi gerçekleştirilmiştir. Çalışmada 26500xg de 30 2

3 dakika santrifüj edildikten sonra elde edilen süpernatan, son derişimleri 1 mm olacak şekilde merkaptoetanol (ME) ve Mn 2+ ilavesi sonrası kullanılmıştır. Kesintili olarak gerçekleştirilen çöktürme sonrası aktivite ve total protein analizleri gerçekleştirilmiştir. Testis arjinazının kinetik davranışının incelenmesi, tuz çöktürmesinin % aralığından elde edilen enzim kaynağı (1,0-1,1 U/ml) ile gerçekleştirilmiş ve substrat olarak 2,5-25 mm arjinin çözeltileri ph 8,6 kullanılmıştır. Aktivite A 520 /10 dakika olarak ifade edilmiştir. Olası ileri saflaştırma ve/veya enzimin yükünün belirlenmesi amacı ile katyon değiştirici ön kolon (Oasis) uygulaması gerçekleştirilmiştir. Uygulama, % aralığından elde edilen enzim kaynağı kullanılarak kesintili olarak gerçekleştirilmiştir. Örneğin kolona uygulanması sonrası kesintili olarak sırası ile 0,1 M Tris.HCl ph 7,57 ; 0,15 M ve 0,5 M KCl çözeltileri kullanılarak proteinlerin kolondan alınması yoluna gidilmiştir. Kolon çıktı örneklerinde aktivite ( A 520 /10 dakika) ve protein (A 280 ) ölçümleri gerçekleştirilmiştir. Akrilamid uygulaması Kovalan modifikasyon çalışmaları 37 o C da 0,1 M Tris. HCl ph 7,57 de gerçekleştirilmiştir. Tepkime, akrilamid ilavesi ile başlatılmıştır. Modifikasyon ortamından farklı zaman dilimlerinde alınan örnekler, enzim aktivite analizinin gerçekleştirileceği tüplere aktarılmıştır. Akrilamid tepkimelerinin sonlandırılması, aktivite analiz ortamında bulunan 15 mm ME ile sağlanmıştır. Kalan aktivitenin belirlenmesi ve çalışma süresi boyunca enzimin kararlılığı kontrol deneyleri ile saptanmıştır. BULGULAR Testis arjinaz aktivitesi Testis dokusunda arjinaz aktivitesinin varlığı kademeli (differential) santrifügasyon tekniği kullanılarak araştırılmıştır. Bu amaçla doku, % 0,25 TritonX-100 içeren 0,1 M Tris.HCl ph 7,57 içerisinde cam-teflon homojenizatör kullanılarak homojenize edilmiş ve kesintili olmak üzere farklı hızlarda santrifügasyon işlemi uygulanmıştır. İşlemin her bir basamağından örnekler alınarak enzim aktivite ve protein analizleri gerçekleştirilmiştir. Analizlerin sonuçları Tablo 1 de verilmektedir. Enzim aktivitesi ağırlıklı olarak 26500xg de elde edilen süpernatanda bulunmaktadır. Tablo1. Kademeli santrifügasyon örneklerinde total arjinaz aktivitesi ve total protein derişimi Örnek Total Protein (mg) Total Aktivite (U) 2000xg çökelti 0,84 0,7 (tam hücre,çekirdek,vs) 26500xg çökelti 0,70 0,6 (mitokondria,lizozom, vs) 26500xg süpernatan (mikrozomlar,vs) 6,5 1,5 Enzimin biyolojik zarlarla olası ilişkisinin ve olası Mn 2+ gereksiniminin araştırılması amacı ile dokular deterjan varlığında ve yokluğunda 0,1 M Tris.HCl ph 7,57 içerisinde cam-teflon homojenizatör kullanılarak homojenize edilmiş ve 26500xg elde edilen lizatta, enzim aktivitesi Mn 2+ ile zenginleştirilme işleminin oda sıcaklığında (25 o C) ve 55 o C da gerçekleştirilmesi sonrası analiz edilmiştir. Ayrıca deterjan varlığında ve yokluğunda protein derişimleri saptanmıştır (Tablo 2). Deterjan uygulaması ve 55 o C da gerçekleştirilen enzimin Mn 2+ ile zenginleştirilmesi aktivitenin artmasına neden olmuştur. Protein derişimi de deterjan uygulanan doku örneklerine ait lizatlarda yaklaşık % 39 artmaktadır. 3

4 Tablo 2. Enzim aktivitesi ve protein derişimini etkileyen faktörler Deterjan uygulaması Aktivite (U/ml) Protein (mg/ml) 25 o C 55 o C var 0,23 0,31 1,29 yok 0,12 0,22 0,93 Enzim aktivitesinin saklama koşullarına bağlı zaman içindeki kararlılığı incelenmiştir. Bu amaçla aktivite analizi, C da bütün olarak saklanan dokuda (Tablo 3) ve C ile 4 0 C da saklanan 26500xg de elde edilen lizatta (Şekil 2) gerçekleştirilmiştir. Tablo 3. Testis arjinazının C da kararlılığı Gün Aktivite Protein Özgül Aktivite (U/ml) (U/g doku) (mg/ml) (U/mg) 1 0,30 1,0 1,31 0,23 2 0,28 0,92 1,30 0, ,25 0,83 1,30 0,20 Aktivite (U/ml) 0,4 0,3 0,2 0, Gün Şekil x g elde edilen lizatın C ve 4 0 C da kararlılığı Dokunun bütün olarak C da saklanması aktivitede (sırası ile U/ml ve U/g doku olarak) 2. gün % 6,77 ve % 8; 21. gün ise % 16,77 ve % 17 azalmaya neden olmuştur. Özgül aktivite ise 2. gün % 8,7; 21. gün % 13 düşmektedir. (Tablo 3). Şekil 2 de görüldüğü gibi 26500xg de elde edilen lizatta enzim aktivitesi (-24 0 C ve 4 0 C da saklanma sonrası) 7. günün sonunda % 8,33 düşmektedir. Kinetik davranışın belirlenmesi Testis arjinazının kinetik özelliklerinin belirlenmesi amacı ile 26500xg de elde edilen lizatta yabancı/istenmeyen proteinlerin uzaklaştırılması yoluna gidilmiştir. Bir ön çalışma niteliğinde gerçekleşen bu işlem, 4 o C da (NH 4 ) 2 SO 4 çöktürmesi ile gerçekleştirilmiştir. 4

5 Tuz çöktürmesi % 30-45, % ve % kesitlerinde olmak üzere uygulanmıştır. Her bir doygunluk sonrası çökelti, 26500xg de 30 dakika santrifüj sonrası elde edilmiştir. Çökelti 0,1 M Tris.HCl ph 7,57 içerisinde çözünmüş ve aktivite analizi ile protein derişimleri saptanmıştır. Özgül aktivitenin en yüksek olduğu %50-75 çökelti özütü kinetik çalışmalarda kullanılmıştır. Söz konusu özüt, yabancı proteinlerden yaklaşık 2 faktör saflaştırılmış ve geri kazanım ise % 33 olarak saptanmıştır (Tablo 4). Tablo 4. Testis arjinazının kısmıi saflaştırılması Örnek Total Aktivite Saflaştırma Geri Protein Özgül Total Faktörü Kazanım (mg) (U/mg) (U) 26500xg özütü 48,10 0,21 10, % (NH 4 ) 2 SO 4 özütü 8,72 0,39 3,4 1,86 % 33 Koç testis arjinazının Michaelis-Menten kinetiğine uygunluğu ve substratı olan arjinine ilgisinin (K m ) saptanması amacı ile ph 8,6 da elde edilen Lineweaver-Burk grafiği Şekil 3 de verilmektedir. Enzim, Michaelis-Menten kinetiğine uymakta olup, arjinin için K m değeri 6,67 mm olarak saptanmıştır. v ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 S -1, mm -1 Şekil 3. Arjinin için ph 8,6 da Lineweaver-Burk grafiği. Aktivite A 520 /10 dakika olarak ifade edilmiştir. Testis arjinazının ph 7,57 de olası yükü ile ilişkili ön kolon verileri Şekil 4 de görülmektedir. Kromatogram, enzimin söz konusu ph da eksi yüklü olduğunu düşündürmektedir. 5

6 Aktivite 4 0,4 A ,3 A ,15 M KCl 0,5 M KCl 0,2 1 0, Tüp numarası 0 Şekil 4. Testis arjinazının katyon değiştirici kolon kromatografisi. ( A 520 /10 dakika olarak ifade edilmiştir. ): A 280, (------): A 520. Aktivite Akrilamid tepkimeleri Testis arjinaz aktivitesinin (%50-75 çökelti özütünün ph 7,57 de) 30 mm akrilamid varlığında zamana bağlı değişimi Şekil 5 de verilmektedir. Enzim aktivitesi çalışılan zaman diliminde değişmemektedir. 0,4 0,3 0,2 0, Dakika Şekil 5. Testis arjinaz aktivitesinin 30 mm akrilamid varlığında inaktivasyonu. Kontrol ( ), Akrilamid ( ). Aktivite A 520 /10 dakika olarak ifade edilmiştir. TARTIŞMA Arjinaz, üreotelik organizmaların dokularında yaygın olarak bulunmaktadır. Organizmadan organizmaya ve aynı organizmaya ait farklı dokularda enzim aktivitesi değişiklik göstermektedir. Testis dokusunda enzimin aktivitesi ve özelliklerinin tanımlandığı çalışmaların çok kısıtlı olduğu belirlenmiştir. Boğa testis dokusunda enzimin varlığı ve aktivitesinin 0,43 U/g doku olduğu Porembska ve arkadaşlarının gerçekleştirdiği bir çalışmada bildirilmektedir (10). Araştırmamızda, koç testis dokusunda arjinaz aktivitesinin varlığı kanıtlanmıştır. Deney şartlarımızda aktivite gram dokuda 1,0 ünitedir. 6

7 Memelilerde enzimin hücre içindeki yerleşimi çeşitli araştırmacılar tarafından incelenmiştir (1,8,10). Genel olarak alt birim çeşitliliği ve doku farklılığı dikkate alınarak derişimleri farklı olmak üzere enzimin mikrozomal, mitokondrial, lizozomal, sitozolik ve plazma zarına bağlı olabileceği bildirilmektedir. Araştırmamızda enzim aktivitesi bir nötral deterjan olan TritonX- 100 varlığında ve yokluğunda kademeli santrifügasyon sonrası elde edilen lizat örneklerinde araştırılmıştır. Enzim aktivitesinin deterjan uygulaması sonrası artması, enzimin biyolojik zarla ilişkili ve/veya organel yapılanmasında da yer aldığını göstermektedir. Enzimin katalizden doğrudan sorumlu mutlak Mn 2+ gereksinimi bulunmaktadır. Mn 2+ ın yapıdan uzaklaştırılması aktivite kaybı ile sonuçlanmaktadır. Çalışmamızda, zenginleştirme işleminin gerçekleştiği sıcaklık ile aktivite arasındaki ilişki incelenmiştir. Bu amaç ile deterjan varlığında ve yokluğunda elde edilen 26500xg de lizat örneklerinde, Mn 2+ ile zenginleştirme işlemi oda sıcaklığında ve 55 C de gerçekleştirilmiştir. Uygulama her iki koşulda da 1 mm Mn 2+ varlığında gerçekleştirilmiştir. Zenginleştirme işlemi deterjan varlığında ve yokluğunda enzim aktivitesinde artışa neden olmuştur. Aktivitedeki artış, enzimde konformasyonel değişikliğin olmasına ve bu değişiklik sonucu, enzimin Mn 2+ bağlanma bölgelerine daha fazla Mn 2+ ulaşmasının sağlanmasıyla ilişkilendirilmiştir. Artış oranı, zenginleştirme işleminin uygulandığı sıcaklığa bağlı olarak değişmektedir. Enzim aktivitesinin saklama koşullarına bağlı olarak zaman içindeki kararlılığı incelemiştir. Parçalanmadan bütün olarak -24 o C de saklanan doku örneklerinde ve -24 o C ile 4 o C da saklanan (26500xg de detarjan varlığında elde edilen) lizat örneklerinde yapılan çalışmalar ile enzim aktivitesinin kararlılık gösterdiği saptanmıştır. Enzimin kinetik davranışının belirlenmesi için yabancı proteinlerin uzaklaştırılması /saflaştırma işlemi olanaklarımız doğrultusunda bir ön çalışma olarak gerçekleştirilmiştir. Kısmi saflaştırma sonrası enzim yaklaşık iki faktör saflaştırılmış ve geri kazanım ise %33 olarak hesaplanmıştır. Bu sonuç saflaştırma işleminde tuz çöktürmesi önce farklı bir yöntemin uygulanması gerekliliğini ve sistemde olası inhibitör varlığını düşündürmektedir. Testis arjinaz aktivitesinin kinetik davranışı, ph 8,6 da gerçekleştirilen çalışmalar sonrası elde edilen Lineweaver- Burk grafiği ile saptanmıştır. Doğrusal olarak elde edilen Lineweaver- Burk grafiği, enzimin Michaelis-Menten kinetiğine uyduğunu doğrulamaktadır. Enzimin substratı olan arjinine ilgisini gösteren K m değeri ise 6,67 mm olarak belirlenmiştir. Memeli arjinazlarının Km değerleri, çalışılan doku ve kullanılan yönteme bağlı olarak farklılıklar göstermektedir. Bildirilen Km değerleri karaciğerde 1-10 mm ve diğer dokularda ise 4-35 mm dır (8,14). Memeli arjinazları, yük açısından da farklılıklar göstermektedir. Genel olarak bazik özellik taşımalarına karşın, farklı dokularda farklı yüklere sahip formların varlığı bildirilmektedir (1,8,10). Çalışmamızda, koç testis arjinazının ph 7,57 de olası yükünün belirlenmesi amacıyla katyon değiştirici ön kolon uygulaması gerçekleştirilmiştir. Örneğin (0,62 mg protein) uygulama sonrası kolona tutunmaması ve yüksek derişimde olmak üzere tek tüpte alınması (0,52 mg protein) koç testis arjinazının ağırlıklı olarak eksi yüklü olduğunu düşündürmektedir. İzoformların ve/veya izoenzimlerin ayrıştırılabilmesi için olasılıkla anyonik-katyonik iyon değiştirici kromotografisileri çalışmalar yapılması gerekmektedir. Kovalan modifikasyonlar, enzimlerin yapısal ve katalitik özelliklerinin belirlenmesinde kullanılan temel yöntemdir. Modifikasyonlar, gruba özgü ajanların uygun şartlarda 7

8 kullanılması ile gerçekleştirilir. Çalışmalarda, ajanın birden fazla gruba duyarlı olması ve enzimin çalışılan ph da uygun iyonize formda olması gibi nedenlerden dolayı aynı hedefe duyarlı farklı ajanlarla modifikasyonun doğrulanması gerekmektedir. Bu çalışmada, testis arjinazının aktif bölgesinde katalizde olası işlevi olan sülfidril grubunun varlığı araştırılmıştır. Sülfidril grubuna duyarlı alkilasyon ajanı olarak akrilamid uygulaması gerçekleştirilmiştir. Akrilamid, endüstride yaygın olarak kullanılan toksik bir kimyasaldır. Sigara dumanında ve yüksek sıcaklıkta pişirme yöntemi uygulanan gıda maddelerinde bulunduğu bildirilmektedir. In vivo da CYP2E1 ile aktivasyonu sonrası oluşan epoksiti, glisidamid, potansiyel bir mutajendir. Araştırmalar, in vivo da akrilamidin nörotoksik, genotoksik, karsinojenik doz-bağımlı etkileri olduğunu ve üreme sistemlerinde hasara yol açtığını bildirmektedir (12,15). Sıçan ve fare testislerinde yapılan araştırmalarda doz-bağımlı olarak akrilamid, testosteron düzeyi ve sperm stoklarının azalmasına; tübüler fonksiyonu düzenleyen ve testosteron salgılayan leydig hücrelerinin, germ hücrelerinin kaybıyla ilişkilendirilen bir şekilde hiperplaziye uğradığı bildirilmektedir. Bunun yanı sıra seminifer tübülde histopatolojik lezyonlar oluşmasına ve tümör görülme sıklığının artmasına neden olmuştur (15). Akrilamidin söz konusu etkilerinin testiste arjinazın fizyopatolojik bir süreçte ortaya çıkan ve NO sentezini kısıtlayan aktivitesiyle ilgili olabileceğini düşündürmektedir. Araştırmamızda akrilamid ile gerçekleştirilen inaktivasyon çalışmaları, enzimin katalitik bölgesinda kritik sülfidril gruplarının olmadığını göstermektedir. Benzer sonuçlara, insan ve sığır karaciğer arjinazında da ulaşılmış olup, sülfidril gruplarının proteinin dördüncül yapısının oluşmasında önemli olduğu bildirilmiştir (14). In vitro da deneysel şartlarımızda akrilamid, testis arjinaz aktivitesi üzerine etki göstermemektedir. Akrilamidin enzim aktivitesi üzerine doğrudan ve/veya dolaylı etkisinin in vivo şartlarda araştırılması gerekmektedir. SONUÇ Çalışmamızda koç testisinde arjinazın varlığı, hücre içinde sitozolik ve biyolojik zarla ilişkili olarak bulunduğu, Michaelis-Menten kinetiğine uyduğu, ph 8,6 da arjinin için Km inin 6,67 mm olduğu, fizyolojik ph da olasılıkla eksi yüklü olarak bulunduğu ve katalitik bölgesinde kritik sülfidril grubunun olmadığı saptanmıştır. Herhangi bir molekülün canlı organizmada iyilik veya hastalık halinde etkisinin anlaşılabilmesi için bu molekülle ilgili olarak yapılan in vitro biyokimyasal çalışmalar son derece önemli ve gereklidir. Özellikle söz konusu molekül bir enzimse; bu enzimin yapısının, organizmadaki yerleşiminin ve biyokimyasal davranışlarının belirlenmesi, enzimin dahil olabileceği süreçlerin anlaşılmasına ışık tutmaktadır. Koç testis arjinazının birçok özelliğini belirlediğimiz bu çalışmanın, testis sağlığı ve hastalıklarında arjinazın rolü/önemi ile ilişkili araştırmalarda katkısı olabileceğini düşünmekteyiz. 8

9 KAYNAKÇA 1. Ash D.E Structure and Function of Arginases 2004;134:2760S-2764S. 2.Bradford, M.M. A rapid and sensitivite method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Chem., 1996;72(1-2), Bivalacqua T.J. et al. Overexpression of arginase in the aged mouse penis impairs erectile function and decreases enos activity: influence of in vivo gene therapy of anti-arginase, Am J Physiol Heart Circ Physiol 292, Cederbaum S.D. Arginases I and II: do their functions overlap?, Mol. Genet. Metab., USA;2004;81: Chrzanowska A., Krawczyk M., Barańczyk-Kuźma A. Changes in arginase isoenzymes pattern in human hepatocellular carcinoma, Biochem. and Biophys. Res. Comm., 2006;377: Dowling D.P. et al. Evolution of the arginasse fold and functional diversity, Cell. Mol. Life Sci. 2008;65: Geyer,J.W. ve Dabich,D. Rapid Method for Determination of Arginase Activity in Tissue Homogenates, Anal.Biochem.,1971;39: Jenkinson P. et al. Comparativde Properties of Arginases, Comp. Biochem. Physiol. Vol. 114B;1996;1: Morris S.M. Recent advances in arginine metabolism: roles and regulation of the arginases, Br. J. Pharm.,2009;157: Nadolska-Lutyk J., Grabon W. and Porembska Z. Arginase in Bull Testis 1990;27(3). 11.Nikolic J. et al. The role of L-arginine in toxic liver failure: interrelation of arginase, polyamine catabolic enzymes and nitric oxide synthase Amino Acids (2007) 32: Özturan Özer H.E. Akrilamid Kaynaklı Olası Oksidatif Stresin Sıçan Doku Arjinaz ve Nitrik oksit Sentaz Aktivitelerine Etkisi, Biyokimya Programı Yüksek Lisans Tezi,Ankara; Que L.G. Effects of Arginase Isoforms on NO Production by nnos,nitric oxide Vol. 6,2002; Türkoğlu, E.S. Inactivation of Bovine Liver Arginase by 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminoproply) Carbodiimide, Doctor of Philosophy Degree in Biochemistry Middle East Technical University,1989 March. 15.Wang H. Reproductive toxicity of acrylamide-treated male rats, Reproductive Toxicology 29,USA,2010;

10 16.Wei C.L. et al. Induction of Arginase II in Livers of Bile Duct-Ligated Rats, Biochem. Pharm., 2002;1738: