ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ AŞAĞI SEYHAN OVASI DRENAJ SİSTEMLERİNDEKİ KİRLİLİK ETMENLERİNİN Clarias gariepinus da TOKSİK ETKİLERİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ AŞAĞI SEYHAN OVASI DRENAJ SİSTEMLERİNDEKİ KİRLİLİK ETMENLERİNİN Clarias gariepinus da TOKSİK ETKİLERİ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez 06/08/2010 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza İmza: İmza: Prof. Dr. Nevin ÜNER Prof. Dr. Cahit ERDEM Doç. Dr. Bedii CİCİK DANIŞMAN ÜYE ÜYE İmza: İmza: Yard. Doç. Dr. Özcan AY Yard. Doç. Dr. Yusuf SEVGİLER ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir. Proje No: FEF2005D13 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ DOKTORA TEZİ AŞAĞI SEYHAN OVASI DRENAJ SİSTEMLERİNDEKİ KİRLİLİK ETMENLERİNİN Clarias gariepinus da TOKSİK ETKİLERİ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman: Prof. Dr. Nevin ÜNER Yıl: 2010, Sayfa: 145 Jüri : Prof. Dr. Nevin ÜNER Prof. Dr. Cahit ERDEM Doç. Dr. Bedii CİCİK Yrd. Doç. Dr. Özcan AY Yrd. Doç. Dr. Yusuf SEVGİLER Bu çalışmada Aşağı Seyhan Ovası drenaj kanallarında seçilen beş istasyonda su kalitesi, dokuda metal birikimleri ve kirleticilerin Clarias gariepinus da karaciğer, kas ve beyin dokularında GSH (Glutatyon) redoks durumuna, oksidatif stres ve nörotoksisite oluşturma potansiyelleri ile biyometrik özelliklerine etkileri incelenmiştir. Su kalite değerlendirmelerinde 1. istasyonun diğer istasyonlardan temiz olduğu gözlenmiş ve bulgular bu istasyona göre değerlendirilmiştir. Drenaj sularının bazı değişkenlere göre sulama suyu olarak kullanılmaya ve balıkların sağlıklı gelişmelerine uygun olmadığı gözlenmiştir. Fe, Cu, Zn, Co, Cr ve Cd en yüksek karaciğerde en düşük kasta birikim göstermiştir. Fe, Cu ve Zn için dokular arasındaki fark önemlidir. Pb derişimi beyin>karaciğer>kas şeklindedir. Kas dokusu metal derişimleri genel olarak kabul edilebilir düzeylerdedir. Fe için tüm istasyonlarda ve Pb için 3. istasyonda kabul edilebilir limitlerin üst sınırına yakındır, deşarjların devam etmesi durumunda, halk sağlığı açısından tehlike oluşabilecektir. C. gariepinus da karaciğer, kas ve beyin dokularında yürütülen biyokimyasal analizler ve biyoindikatör hesaplamalarının sonuçları tüm istasyonlarda balıkların kirliliğe karşı çeşitli adaptasyonlar geliştirdiklerini ve C. gariepinus un kirliliğe karşı dayanıklı bir tür olduğunu göstermektedir. Su kalitesi, doku kirletici düzeyleri, biyomarkır ve biyoindikatörlerin birlikte incelenmeleri çevresel kirlilik düzeylerinin ve balıklara etkilerinin belirlenmesinde aydınlatıcı sonuçlar sağlamaktadır. Anahtar kelimeler: Aşağı Seyhan Ovası, Su Kalitesi, Clarias gariepinus, Biyomarkırlar, Biyoindikatörler. I

4 ABSTRACT Ph.D. THESIS TOXIC EFFECT of POLLUTION FACTORS on Clarias gariepinus in LOWER SEYHAN PLAIN DRAINAGE SYSYTEM Hülya DURMAZ BEKMEZCİ UNIVERSITY of ÇUKUROVA INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES DEPARTMENT of BIOLOGY Supervisor: Prof. Dr. Nevin Üner Year: 2010, Page: 145 Jury : Prof. Dr. Nevin ÜNER Prof. Dr. Cahit ERDEM Assoc. Prof. Dr. Bedii CİCİK Asst. Prof. Dr. Özcan AY Asst. Prof. Dr. Yusuf SEVGİLER In this study, water quality, metal accumulation in tissues and effects of contaminants to GSH (Glutathione) redox status, oxidative stress and neurotoxicity potential in liver, muscle and brain tissues together with biometric features in Clarias gariepinus were assessed at five selected stations in Lower Seyhan Plain drainage channels. In the water quality assessments, the 1 st station was observed to be cleaner than other stations and other results were evaluated according to the results of this station. Drainage water was found to be not suitable for irrigation and healthy development of fish. Accumulation of Fe, Cu, Zn, Co, Cr, and Cd were highest in liver and lowest in muscle. The difference between tissues for Fe, Cu, and Zn was statistically significant. The order for Pb is brain>liver>muscle. Metal concentrations in muscle tissue were generally within the permissible safety levels. Fe concentration in all stations and Pb concentration in the 3 rd station are around the upper limit of permissible safety levels. The bioaccumulation under current progress will be likely to raise dangerous levels for public health.the results of biochemical analysis conducted in liver, muscle and brain tissues and examined bioindicators in C. garipinus, show that C. gariepinus have developed several adaptations to increased pollution. Findings showed that C. gariepinus is a resistant species to environmental pollution. Combined investigation of water quality parameters, tissue contaminant levels, biomarkers and bioindicators were enable obtaining more effective results when determining pollution levels and their effects to fish. Keywords: Lower Seyhan Plain, Water Quality, Clarias gariepinus, Biomarkers, Bioindicators. II

5 TEŞEKKÜR Tez çalışmalarım süresince her konuda yardım ve desteklerini esirgemeyen tez danışmanım Prof. Dr. Nevin ÜNER e, Prof. Dr. Cahit ERDEM, Doç. Dr. Bedii CİCİK, Yard. Doç. Dr. Özcan AY ve Yard. Doç. Dr. Yusuf SEVGİLER e, Arazi etüt çalışmalarında yardımcı olan, Devlet Su İşleri VI. Bölge Müdürlüğünden Yük. Zir. Müh. Vahap KIRMACI ve Uzm. Biyolog Erdal NEVŞAT a, ve örnek toplama sırasında yardımlarını gördüğümüz Zir. Müh. Nuri ÖZKARDEŞLER ve Coşkun AKDEMİRBEY e, Çalışmalarım sırasındaki yardımlarından ve desteklerinden dolayı bölüm arkadaşlarım Yard. Doç. Dr. Petek PİNER, Uzm. Biyolog Uğur KARADUMAN, Uzm. Biyolog Mehmet Eren ÖZASLAN, Uzm. Biyolog Emine ÇINKILOĞLU ve Uzm. Biyolog Çağlar TİMOÇİN e, İstatistik analizlerin yürütülmesinde yardımcı olan Fen-Edebiyat Fakültesi İstatistik Bölümü Öğretim Üyesi Prof. Dr. Hamza EROL ve Zootekni Bölümü Biyometri Anabilim Dalı Arş. Gör. Uzm. Biyolog Nurşen YILDIRIM a, Bütün akademik eğitimim boyunca bana olan inançlarını kaybetmeyerek yanımda olup, maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen babam Yusuf DURMAZ, annem Meryem DURMAZ kardeşlerim Özgür Derya DURMAZ ve Volkan DURMAZ ile eşim Ozan Kadir BEKMEZCİ ye sonsuz teşekkürlerimi sunarım. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT. II TEŞEKKÜR. III İÇİNDEKİLER IV ÇİZELGELER DİZİNİ VII ŞEKİLER DİZİNİ X 1.GİRİŞ Su Kirliliği Çözünmüş Oksijen Besin Tuzları Miktarlarındaki Artış Askıda Katı Maddeler Toksik Kimyasallar Asitler Klor Amonyak Metaller Pestisitler Biyotransformasyon Mekanizmaları Reaktif Metabolitler Lipid peroksidasyonu Antioksidant Sistem Enzimatik Olmayan Antioksidant: Glutatyon Enzimatik Antioksidanlar Glutatyon Peroksidaz Glutatyon S-Transferaz Süperoksit Dismutaz Katalaz Biyomarkırlar Kolinesterazlar.. 18 IV

7 Asetilkolinesteraz Bütirilkolinesteraz Biyoindikatörler Biyoindikatör Canlı: Clarias gariepinus Aşağı Seyhan Ovası ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL ve YÖNTEM Arazi Çalışmaları İstasyonların Seçilmesi Su Örneklerinin Alınması Balık Örneklerinin Toplanması Laboratuvar Çalışmaları Kimyasal Maddeler Cihazlar ve Diğer Gereçler Suda Toplam Katı, Askıda Katı ve Çökebilen Katı Madde Miktarlarının Belirlenmesi Balıklarda Omurgadan Yaş Tayini Metal Derişimlerinin Belirlenmesi Su Örneklerinde Metal Derişimlerinin Belirlenmesi Dokuda Metal Derişimlerinin Belirlenmesi Biyokimyasal Analiz Yöntemleri Toplam GSH ve GSSG Yöntemi Glutatyon Peroksidaz Yöntemi Glutatyon S-Transferaz Yöntemi Süperoksit Dismutaz Yöntemi Katalaz Yöntemi AChE ve BChE Yöntemi Malondialdehit Yöntemi Protein Yöntemi Biyoindikatörlerin Belirlenmesi İstatistiksel Analiz 67 V

8 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Bulgular Arazi Çalışmaları Suyun Fiziksel ve Kimyasal Özellikleri Laboratuvar Çalışmaları Suda Metal Derişimleri Dokuda Metal Derişimleri Biyokimyasal Biyomarkırlar (1). Hücresel GSH Redoks Durumu ve GSH İlgili Enzimler (2). Antioksidan Enzimler (3). Lipid Peroksidasyonu (4). Asetilkolinesteraz ve Bütirilkolinesteraz (5). Protein Miktarı Biyoindikatörler Tartışma SONUÇ ve ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ VI

9 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. ICP-AES de Metallerin Okunduğu Dalga Boyları Çizelge 3.2. Total Glutatyon ve Okside Glutatyon Yöntemi Çizelge 3.3. Glutatyon Peroksidaz Yöntemi Çizelge 3.4. Glutatyon S-Transferaz Yöntemi Çizelge 3.5. Süperoksit Dismutaz Yöntemi. 60 Çizelge 3.6. Katalaz Yöntemi Çizelge 3.7. Asetilkolinesteraz ve Bütirilkolinesteraz Yöntemi.. 62 Çizelge 3.8. Malondialdehit Yöntemi.. 64 Çizelge 3.9. Protein Yöntemi Çizelge 4.1. Araştırma istasyonlarından alınan suların fiziksel ve kimyasal özellikleri: Çizelge 4.2. Araştırma istasyonlarından alınan suların fiziksel ve kimyasal özellikleri: Çizelge 4.3. Araştırma istasyonlarından alınan su örneklerindeki metal derişimleri (µg metal/l) 73 Çizelge 4.4. Suyun fizikokimyasal özellikleri ile metal derişimleri arasında Pearson korelasyon katsayıları.. 74 Çizelge C. gariepinus da karaciğer dokusunda metal derişimleri (µg metal/g k.a.) Çizelge 4.6. Çizelge 4.7. Çizelge 4.8. Çizelge 4.9. C. gariepinus da kas dokusunda metal derişimleri (µg metal/g k.a.) C. gariepinus da beyin dokusunda metal derişimleri (µg metal/g k.a.) C. gariepnus da karaciğer dokusunda tgsh, GSH ve GSSG miktarları (µm/mg pr.), GSH/GSSG oranı ve GST ve GPx spesifik aktivitesinin (U/mg pr.) istasyonlara göre dağılımı. 87 C. gariepinus da kas dokusunda tgsh, GSH ve GSSG VII

10 miktarları (µm/mg pr.), GSH/GSSG oranı ve GST ve GPx spesifik aktivitesinin (U/mg pr.) istasyonlara göre dağılımı. 88 Çizelge C. gariepinus da beyin dokusunda tgsh, GSH ve GSSG miktarları (µm/mg pr.), GSH/GSSG oranı ve GST ve GPx spesifik aktivitesinin (U/mg pr.) istasyonlara göre dağılımı. 89 Çizelge Glutatyon bağımlı enzimler ile GSH ve ilgili değişkenler arasındaki Pearson korelasyon katsayıları 91 Çizelge C. gariepinus da karaciğer dokusunda antioksidant enzimler, CAT ve SOD ve nörotransmitter enzimler AChE ve BChE spesifik aktiviteleri (U/mg pr.) ve MDA (nmol/mg pr.) ile Protein (mg/ml) miktarlarının istasyonlara göre dağılımı Çizelge C. gariepinus da kas dokusunda antioksidant enzimler, CAT ve SOD ve nörotransmitter enzimler AChE ve BChE spesifik aktiviteleri (U/mg pr.) ve MDA (nmol/mg pr.) ile Protein (mg/ml) miktarlarının istasyonlara göre dağılımı.. 94 Çizelge C. gariepinus da beyin dokusunda antioksidant enzimler, CAT ve SOD ve nörotransmitter enzimler AChE ve BChE spesifik aktiviteleri (U/mg pr.) ve MDA (nmol/mg pr.) ile Protein (mg/ml) miktarlarının istasyonlara göre dağılımı 95 Çizelge MDA miktarı ile diğer değişkenler arasındaki Pearson korelasyon katsayıları Çizelge Karaciğer dokusunda AChE ve BChE spesifik enzim aktivitelerine ait Pearson korelasyon katsayıları Çizelge Kas dokusunda AChE ve BChE spesifik enzim aktivitelerine ait Pearson korelasyon katsayıları Çizelge 4.18 Beyin dokusunda AChE ve BChE spesifik enzim aktivitelerine ait Pearson korelasyon katsayıları. 99 Çizelge Balık örneklerinin boy ve ağırlıkları. 101 Çizelge Balıkların büyüklükleri ile doku metal derişimleri ve biyokimyasal değişkenler arasındaki Pearson korelasyon VIII

11 katsayıları Çizelge Kondüsyon Faktörü ve HSI nin istasyonlara göre dağılımı Çizelge Kondüsyon Faktörü ve HSI ya ait Pearson korelasyon katsayıları IX

12 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Kirleticilerin kan dolaşımına katıldıktan sonraki hareket yönlerinin şeması.. 6 Şekil 1.2. Serbest radikallerin detoksifikasyonu Şekil 1.3. Glutatyonun (GSH) yapısı; L-γ-glutamil-L-sisteinilglisin 12 Şekil 1.4. Glutatyon metabolizması.. 13 Şekil 1.5. C. gariepinus. 24 Şekil İstasyon. Referans istasyon; Seyhan Nehri üzerinde, Eski Baraj.. 43 Şekil İstasyon. Abdioğlu Köyü civarı, YD1 drenaj kanalı. Narenciye Bahçeleri.. 44 Şekil İstasyon, Tabaklar Köyü civarı YD4 drenaj kanalı. Çeltik Tarlaları. 45 Şekil İstasyon, Yolgeçen Köyü civarı, Sanayi bölgesi, TD7 drenaj kanalı. 46 Şekil İstasyon, Küçük Karataş Köyü civarı, Pompa istasyonu, YD2 drenaj kanalı.. 47 Şekil 3.6. Aşağı Seyhan Ovası Drenaj Kanalları ve Örnekleme İstasyonları 48 Şekil 3.7. C. gariepinus diseksiyonu. 50 Şekil 4.1. Karaciğer, kas ve beyin dokusunda Fe derişimlerinin istasyonlara göre karşılaştırılması. 75 Şekil 4.2. Karaciğer, kas ve beyin dokusunda Cu derişimlerinin istasyonlara göre karşılaştırılması. 76 Şekil 4.3. Karaciğer, kas ve beyin dokusunda Zn derişimlerinin istasyonlara göre karşılaştırılması Şekil 4.4. Karaciğer, kas ve beyin dokusunda Ni derişimlerinin istasyonlara göre karşılaştırılması Şekil 4.5. Karaciğer, kas ve beyin dokusunda Co derişimlerinin istasyonlara göre karşılaştırılması. 77 X

13 Şekil 4.6. Karaciğer, kas ve beyin dokusunda Cr derişimlerinin istasyonlara göre karşılaştırılması 78 Şekil 4.7. Karaciğer, kas ve beyin dokusunda Cd derişimlerinin istasyonlara göre karşılaştırılması 78 Şekil 4.8. Karaciğer, kas ve beyin dokusunda Pb derişimlerinin istasyonlara göre karşılaştırılması Şekil 4.9. Karaciğer, Kas ve Beyin dokularında (a) tgsh, (b) GSH, (c) GSSG miktarları ve (d) GSH/GSSG oranlarının istasyonlara göre dağılımı. 84 Şekil Karaciğer dokusunda tgsh, GSH, GSSG miktarları (µm/mg pr.) ve GSH/GSSG oranlarının istasyonlara göre dağılımı Şekil Kas dokusunda tgsh, GSH, GSSG miktarları (µm/mg pr.) ve GSH/GSSG oranlarının istasyonlara göre dağılımı.. 86 Şekil Beyin dokusunda tgsh, GSH, GSSG miktarları (µm/mg pr.) ve GSH/GSSG oranlarının istasyonlara göre dağılımı.. 86 Şekil Karaciğer, Kas ve Beyin dokularında (a) GST, (b) GPx, spesifik aktivitelerinin istasyonlar ve dokulara göre dağılımı Şekil Karaciğer, Kas ve Beyin dokularında (a) CAT ve (b) SOD spesifik aktivitelerinin istasyonlar ve dokulara göre dağılımı.. 92 Şekil Karaciğer, kas ve beyin dokularında MDA miktarlarının istasyonlar göre dağılımı Şekil Karaciğer, Kas ve Beyin dokularında (a) AChE ve (b) BChE spesifik aktivitelerinin istasyonlar ve dokulara göre dağılımı.. 98 Şekil Karaciğer, kas ve beyin dokularında protein miktarlarının istasyonlar göre dağılımı XI

14 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ 1. GİRİŞ 1.1. Su Kirliliği Çeşitli yollarla sucul sistemlere katılan kirleticiler, burada bulunan canlılara zarar verecek ölçüde suyun kimyasal bileşimini, sıcaklığını veya mikrobiyal bileşimini değiştirerek su kalitesinin bozulmasına ve su kirliliğine yol açar (Lloyd, 1992). Tarımsal mücadele ilaçları, kimyasal gübreler ile evsel ve endüstriyel atıklar günümüzde su kirliliğini oluşturan başlıca etmenlerdir. Ağır metaller de dahil çeşitli toksik kimyasalları taşıyan sular arıtmasız sanayi tesislerinden ve tarla drenaj sistemlerinden drenaj kanalları yoluyla akarsulara ve sonuçta denizlere kadar taşınmakta ve kirliliği ciddi boyutlara ulaştırabilmektedir (Basha ve Rani, 2003). Drenaj suları sulamadan dönen suların yanı sıra, endüstriyel ve evsel atık suları da alırlar. Bu yüzden besin tuzları, pestisitler ve ağır metaller gibi tarımsal kimyasallar ile evsel ve endüstriyel atıklardan gelen patojenler gibi farklı kirleticileri içermektedirler (Khallaf ve ark., 2003). Su kirliliğine neden olan ve sucul ekosistemlerde su kalitesini etkileyen etmenler ve etki şekilleri aşağıda ayrıntılı olarak sunulmuştur Çözünmüş Oksijen Çözünmüş oksijen (ÇO) suda yaşayan canlılar için önemli kriterlerden biridir. Havadaki oksijen derişiminin yaklaşık %21 olmasına karşın, suda çözünürlüğü daha düşüktür. Oksijen doygunluğu sıcak sularda 7 mg/l den soğuk sularda 15 mg/l ye kadar değişebilir ve 20 o C de atmosferik basınçta ve deniz seviyesinde 9.2 mg/l dir. Sucul ekosistemde biyolojik aktivitenin tipi ve miktarı ortamda bulunan çözünmüş oksijen derişimine bağlıdır. Sudaki organik maddelerin mikroorganizmalar tarafından parçalanması suda çözünmüş oksijen derişiminin azalmasına ve sonuç olarak sucul canlıların gereksinim duyduğu oksijen (O 2 ) miktarının (Biyolojik oksijen ihtiyacı; BOD) artmasına neden olur (Hauser, 1996). 1

15 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ Besin Tuzları Miktarlarındaki Artış Tarımsal atıklarla besleyici tuzların fazla miktarlarda sucul ortamlara katılması, birincil üreticiler olan fitoplanktonların gelişimini arttırır. Fosfat ve azot tüm canlılar için yaşamsal besleyicilerdir. Evsel atık sulardaki fosfatın çoğu protein atıkların yıkımından, geriye kalanın büyük bir kısmı ise sentetik deterjanlardan ve endüstriyel yıkama işlemleri ve korozyondan korunmak için kullanılan fosfatlardan gelir. Biyolojik atık su arıtma işlemleri fosfatın yalnızca bir kısmını uzaklaştırabilir ve geriye kalanı alıcı ortama geçer. Bütün fosfatlar doğal sularda kademeli olarak ortofosfat şeklinde hidroliz olurlar. Sudaki ortofosfat, toplam fosfat miktarı olarak ifade edilir ve özellikle atık su arıtma sistemlerinin çıktılarında sık olarak test edilir (Hauser, 1996). Sudaki amonyağın (NH 3 ) başlıca kaynağını, bitkisel ve hayvansal organizmaların atıkları ile ölü bitki ve hayvanların mikrobiyal parçalanması oluşturur. Amonyak nitrosomonas ve nitrobakter gibi nitrifikasyon bakterileri tarafından bitkilerin kullanabileceği nitrata (NO - 3 ) dönüştürülür. Oksidasyon Redüksiyon - NH > NO > NO > NO > N 2 Nitrosomonas Nitrobakter Denitrifiye edici Anaeroblar Nitrifikasyon Denitrifikasyon Amonyak nitrite (NO - 2 ) oksitlenir veya nitrata indirgenir. Nitrit iyonu (NO - 2 ) stabil olmayıp nitrata dönüşme eğilimindedir. Bunun için bulunduğu ortamdan oksijen yakalar ve sudaki çözünmüş oksijen derişiminin azalmasına neden olur. Atık suların işlenmesi sırasında gerçekleşen nitrifikasyon sıcaklık, ph ve atık suyun kimyasal özelliklerine bağlı olarak değişim gösterir (Hauser, 1996). Nitrat stabildir, doğal sularda bulunan azotun en okside şeklidir. Normal olarak yalnızca düşük derişimlerde (<1 mg/l) bulunur. Yıkanma nedeniyle yüzey sularında veya sızıntı nedeni ile yeraltı sularında daha yüksek derişimlerde bulunabilir. Bebeklerde methemoglobinemi oluşumuna neden olduğundan içme sularında nitrat derişimi sınırlanmıştır. Atık su deşarjlarındaki kabul edilebilir nitrat derişimi genellikle 5 mg/l nin altındadır (Hauser, 1996). 2

16 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ Askıda Katı Maddeler Sudaki katı maddeler, buharlaşma ve 103 o C de kurutmadan sonra kalan rezidüler olarak tanımlanır. Aşırı katı birikimi suda yaşam için bulunan çözünmüş oksijenin azalmasına ve ortamda ötrifikasyon oluşmasına katkıda bulunur (Hauser,1996). Su kütlelerinde askıda katı maddenin en yaygın şekli genellikle sürülerek ya da kazınarak bozulmuş toprakların akması ile oluşan alüvyon ve arıtma sistemleri olmayan fabrikaların deşarjlarıdır. Ayrıca ortamdaki ağaç lifleri de askıda katı kirliliğinin önemli bir şeklidir (Heath, 1995) Toksik Kimyasallar Asitler Asitlerin sucul canlılığa temel etkileri suyun ph sını değiştirmelerinden kaynaklanır. Ortamın asiditesindeki artış özellikle ağır metal komplekslerinin çözünürlüğünü arttırarak geniş alanlara yayılmasına, sucul organizmalar tarafından kolayca ortamdan alınmasına, birikime ve toksik etkilere neden olur (Heath, 1995; Donkin ve ark., 2000) Klor Klor gazı suya endüstriyel soğutma sistemlerinde koruyucu veya kanalizasyon atıklarında dezenfektan olarak eklenir. Serbest klor gazı suda herhangi bir zaman periyodunda bulunmaz, hemen hipokloroz asit (HOCl - ), hipoklorit (OCl - ) ve hidroklorik asit (HCl) oluşturur, bunlar yaygın olarak serbest klor olarak ifade edilir. Cl 2 + HOH > HOCl + (OCl) - + HCl Amonyak varlığında, serbest klorun bir kısmı ya da tamamı amonyak ile kloraminler oluşturmak üzere tepkimeye girecektir. Kloraminlerin toplam derişimi kombine klor rezidüleri olarak adlandırılır. 3

17 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ Toplam rezidüel klor serbest ve kombine derişimlerin toplamıdır. Klorun bu iki şeklinin kısmi stabilitesi ve toksisitesi belirgin şekilde farklıdır. Serbest klor daha toksiktir fakat kombine şekli daha stabildir ve bu yüzden uzun süre kalıcıdır (Heath, 1995; Hauser, 1996). Atık su çıktılarındaki klor rezidüleri genellikle kombine klor rezidüleridir. Atık su işleme fabrikaları tarafından alıcı ortama boşaltılan klor düşük derişimlerde bile oradaki yaşam için zararlı olabilir (Hauser, 1996) Amonyak Bu bileşik birçok atıkta bulunmakla birlikte özellikle ortamdaki organik maddelerin doğal bozunmaları ve amonyak ve nitrat bileşikler içeren sentetik gübrelerin topraktan yıkanmaları ile sucul sistemlere katılmaktadır. Nötral ya da daha düşük ph da suda çözündüğünde, neredeyse tamamen amonyum iyonları şeklinde bulunur. Asitlik azaldığında iyonize olmayan gaz formuna dönüşür (Hauser, 1996). Amonyum iyonu mikroorganizmalar için potansiyel bir besindir, ortamda bakteri ve alg gelişimini stimule eder. Amonyağın iyonize olmayan şekli balıklar için toksiktir, çok düşük derişimlerde bile sucul yaşam için zararlı olabilir, fakat toksisitesi suyun ph ve sıcaklığına bağlı olarak farklılık gösterir. Sıcaklık ya da ph nın artması durumunda, amonyağın çoğu iyonize olmamış forma geçeceğinden, toksisite artar. Doğal sularda ph ve sıcaklık gün boyunca hızla değişir, bu yüzden amonyak toksisitesinin değerlendirilmesi zor olmaktadır (Heath, 1995; Hauser, 1996) Metaller Metaller doğada bol miktarda bulunan ve doğal bozulmaya dirençli elementlerdir. Metaller jeolojik ve biyolojik yollarla doğada hareket ederler. Yağmur suları ile kayalar ve maden yataklarından çözülerek akıntılar ile toprağa, nehirlere, denizlere ve sedimente ulaşır. Biyolojik döngü ise bitki ve hayvanlar tarafından metallerin biriktirilip besin zincirine katılmalarını kapsar. Boşaltım ve ölü canlıların 4

18 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ çürümesi ile tekrar çevreye katılırlar (Donkin ve ark., 2000; Goyer ve Clarkson, 2001). Metallerin jeolojik ve biyolojik doğal döngülerine ek olarak madencilik ve endüstriyel aktiviteler gibi antropolojik faktörler metallerin çevredeki hareketliliği, dönüşümleri ve taşınmalarında büyük rol oynar. Metaller sıklıkla metal içeren ürünlerin atılması, üretim atıklarının boşaltılması veya maden döküntülerinin boşaltılması ile tekrar çevreye katılırlar (Donkin ve ark., 2000). Metaller ya doğrudan vücutta birikerek ya da besin zincirinin bir sonraki trofik düzeyine taşınarak canlıları etkileyebilirler (Altındağ ve Yiğit, 2005). Bir kez kan dolaşımına girdiklerinde, tüm vücuda dağılarak doku ve organlarda birikirler. (Donkin ve ark., 2000). Ağır metaller enzim olarak iş gören proteinlerin sülfhidril gruplarına bağlanarak enzim aktivitelerinde inhibisyona, membranın yapısal bileşimini değiştirerek madde iletiminin bozulmasına, metabolik, fizyolojik ve biyokimyasal olaylarda değişikliklere neden olurlar (Kakkar ve Jaffery, 2005). Sudaki metaller organik ve inorganik kimyasallar ile kompleks oluşturma eğilimindedirler (Heath, 1995). İyonize metaller, kloridler, sülfatlar, nitratlar, karbonatlar ve asetatlar gibi ortamda bulunan negatif yüklü gruplar ile birleşerek farklı toksikolojik özelliklere sahip çeşitli kompleksler oluşturabilirler. Metal kompleksler, metallerin canlı organizma tarafından alınmalarını ve canlıdaki dağılımlarını etkileyen farklı şekillerde davranabilirler (Donkin ve ark., 2000) Pestisitler Sucul ekosistemlerde kirliliğe neden olan faktörlerden biri de pestisitler olup, önemli kaynağını tarımsal aktiviteler oluşturur (Sancho ve ark., 1993). Balıklarda pestisit toksisitesi ile ilgili çok sayıda araştırma yapılmış ve organoklorlu insektisitlerin (OC) akut toksisitesinin organofosfat (OP) olanlardan çok daha fazla olduğu belirlenmiştir. Organofosfat bileşikler için genellikle 96 saat LC 50 miktarı litrede miligram aralığında iken OC ler için LC 50 miktarı litrede mikrogram düzeylerindedir. Piretroidlerin balıklardaki toksisiteleri OC lere benzemekle birlikte kısmen düşüktür (Heath, 1995). 5

19 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ 1.2. Biyotransformasyon Mekanizmaları Kirleticilerin balıklardaki etkilerini belirlemede kimyasalın ortamdan alınım, birikim ve atılım mekanizmalarının incelenmesi gereklidir. Toksik etkili bileşiklerin balıklar tarafından ortamdan vücuda alındıktan sonraki hareketleri Şekil 1.1 de gösterilmiştir. Biyotransformasyon Kimyasal Yağ Karaciğer Karaciğer Böbrek Böbrek Metabolit Depolalma Mukus Deri Kas Solungaçlar Karaciğer Safra Bağırsak Anüs Böbrek Üre Uzaklaştırma Şekil 1.1. Kirleticilerin kan dolaşımına katıldıktan sonraki hareket yönlerinin şeması (Heath, 1995) Balıklar tarafından kimyasal bir maddenin ortamdan alınımı başlıca dört yolla olur. Bunlar solungaçlar, besin, içme suyu ve deridir (Heath, 1995). Balıklarda solungaç ya da bağırsak yolu ile vücuda giren kimyasal dolaşım sistemine geçer ve taşıyıcı bir protein aracılığı ile yağ dokuya ya da detoksifikasyon merkezi olan karaciğere taşınır. Karaciğer tarafından transforme edilirse, orada depolanabilir, safra ile atılabilir veya böbrek ve solungaçlar tarafından uzaklaştırılmak veya yağ gibi ekstrahepatik dokularda depolanmak üzere tekrar kana verilebilir. Dolayısıyla kimyasalın birikim ve toksik etkileri, ortamdaki derişimi ve etkide kalma süresinin yanı sıra canlının metabolik aktivitesine de bağlı olarak değişir (Heath, 1995). Biyotransformasyon tepkimeleri kısmen lipofilik ana bileşiği daha hidrofilik ve daha polar yapma eğilimindedir. Dokulara giren ksenobiyotiklerin çoğu lipofiliktir, 6

20 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ bu özellik lipit membranlardan penetre olabilmelerini ve vücut sıvılarında lipoproteinler ile taşınmalarını sağlar. Hidrofilik bileşikler genellikle daha az yağda çözünebilir, daha fazla polar, daha kolay elimine edilebilir ve daha az toksiktirler. Hücre membranlarından geçebilirlikleri daha düşük olduğundan dokularda daha az birikirler (Heath, 1995; Leblanck ve Dauterman, 2001). Biyotransformasyon tepkimeleri yaygın olarak asentetik (Faz I) ve sentetik (Faz II) olmak üzere iki faz şeklinde yürür. Faz I boyunca, moleküllere polar gruplar katılır, bu molekün suda çözünürlüğünü artırmasına karşın, en önemli etki ksenobiyotiğin faz II tepkimeleri için uygun bir substrat haline getirilmesidir. Oksidasyon, redüksiyon ve hidroliz tepkimelerini içerir (Heath, 1995). Sentetik tepkimelerde genellikle Faz I basamaklarında oluşan metabolitler hücre içerisinde bulunan glukuronid, sülfat, glutatyon (GSH) veya taurin gibi küçük, endojen moleküllere bağlanır, böylece yabancı bileşiklerin transformasyonu gerçekleşir. Bu birleşme tipik olarak hidrofilik bileşikler oluşturarak, toksik bileşik reaktivitesini ve hücredeki toksisitesini azaltır. Toksik bileşiğin boşaltım sistemi aracılığı ile vücuttan uzaklaştırılmasını kolaylaştırır. Birleşme tepkimeleri sırasında lipofilik bileşikler de oluşabilir. Bu durumda yabancı bileşikler canlının yağ dokusunda depolanır ve uzaklaştırılması gecikir (Leblanck ve Dauterman, 2001). Toksikantların hücresel eliminasyonu membran proteinleri tarafından kolaylaştırılmış aktif transport ile Faz I ve Faz II tepkime ürünlerinin hücre dışına taşınması ile olur. Aktif hücresel eliminasyon işlemleri genellikle Faz III detoksifikasyon/eliminasyon işlemleri olarak ifade edilir (Heath, 1995; Leblanck ve Dauterman, 2001). Birleşme kesin olarak bir detoksifikasyon tepkimesi değildir, bazı durumlarda ara bileşikler veya son ürün ana bileşikten daha toksiktir, ve bu durum aktivasyon veya intoksikasyon mekanizması olarak ifade edilir. Faz I metabolizması da toksisiteye neden olan hayati öneme sahip hücreler arası makromoleküller ile etkileşebilen oldukça reaktif metabolitler de üretebilir (Leblanck ve Dauterman, 2001). 7

21 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ 1.3. Reaktif Metabolitler Reaktif metabolitler genellikle elektrofildirler (pozitif merkez içeren moleküller) ve GSH, proteinler ve nükleik asitler gibi doku nükleofillerine (negatif merkez içeren moleküller) kovalent olarak bağlanabilirler. Ayrıca, reaktif ara bileşikler dış orbitallerinde bir ya da daha fazla eşleşmemiş elektrona sahip bağımsız kimyasal türler olan serbest radikaller olabilir ve radikal üreticiler olarak hareket edebilirler ve oksijen ile etkileşimleri serbest oksijen radikallerini (ROS) üretmektedir. Membranlar, DNA ve diğer makromoleküllerle etkileşerek onlara zarar verme gücüne sahiptirler (Halliwell, 1991; Leblanck ve Dauterman, 2001; Reed, 2001). Geçiş metal iyonları elektron taşıma yetenekleri ile serbest radikallerin üretilmesinde önemli bir yer tutar. Örneğin; süperoksit anyonu (O.- 2 ) sulu çözeltilerde kısmen reaktif değildir, ancak hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ve Fe 3+ gibi bir geçiş metal iyonunun varlığında çok reaktif olan hidroksil radikali (HO. ) oluşturabilir. Demir (Fe) katalizli Haber-Weiss tepkimesi olarak bilinen bu yol Fenton kimyasının bir tipidir (Kehrer, 1993). Haber-Weiss Tepkimesi; Fe O 2 Fe 2+ + O 2 Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + HO - + HO. O H 2 O 2 O 2 + HO. + OH - Radikaller eşleşmemiş elektronunu radikal olmayan bir moleküle verebilir veya bir çift oluşturmak üzere diğer molekülden elektron alabilir. Radikal ayrıca radikal olmayan bir moleküle de katılabilir. Bu üç tür tepkimeden hangisi olursa olsun radikal olmayan türlerden radikal türler oluşur (Halliwell, 1991). Radikallerin beş temel tepkimeleri vardır; Hidrojen alınması: A.- + RH AH + R. Elektron transferi: X.- + Y X + Y.- Ekleme: X. + RCH=CHR Sonlanma: A. + A. A 2 X R.. R Disproporsiyon: CH 3 CH 2. + CH 3 CH 2. CH 3 CH 3 + CH 2 =CH 2 8

22 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ Bu tepkimeler DNA, protein ve lipitler gibi biyolojik moleküllerde gerçekleşir ve aerobik organizmalarda sürekli olarak meydana gelmektedir. Süperoksit radikali hemen tüm aerobik hücrelerde O 2 ye bir elektron transferi ile üretilir. Mitokondri, kloroplast ve endoplazmik retikulumda bulunan hücresel elektron taşıma zincirlerinin çeşitli bileşenlerinden O 2 ye elektron sızması önemli kaynaklarından biridir. Nötrofiller, monositler, makrofajlar ve eozinofiller gibi fagositik hücrelerin solunum sırasında O.- 2 ürettikleri bilinmektedir. Süperoksit radikali in vivo olarak uzaklaştırılmaya değer bir radikal türüdür. Süperoksit dismutaz (SOD; EC ) O.- 2 yi substrat olarak kullanan bir enzimdir, aerob organizmaların O 2 varlığında aşırı DNA hasarına uğramadan büyüyebilmeleri için gerekli olan bir antioksidanttır. SOD O.- 2 nin H 2 O 2 ye dönüşüm tepkimesini yaklaşık dört kat hızlandırır. Ortamdan H 2 O 2 nin uzaklaştırılması için katalaz (CAT; EC ) ve glutatyon peroksidaz (GPx; EC ) gibi enzimlerle birlikte çalışırken O.- 2 nin uzaklaştırılabilmesi için önemli düzeyde H 2 O 2 üretimine yol açar (Halliwell ve Gutteridge, 1990; Cadenas, 1995). Hidrojen peroksit O.- 2 nin enzimatik olmayan veya SOD katalizli dismutasyonu ve glikolat ve ürat oksidazlar gibi birkaç oksidaz ile iki elektron transferi yoluyla doğrudan üretilir. H 2 O 2 eşleşmemiş elektronlara sahip olmadığından bir radikal değildir ve ılımlı bir kimyasal reaktivite oluşturur. Ancak bu kimyasal reaktivite daha sonra H 2 O 2 in iki özelliği ile artar. Birincisi, H 2 O 2 sınırlanmış bir aktiviteye sahip olmasına karşın membranlardan kolayca geçebilmektedir. İkincisi ise H 2 O 2 metal şelatlar ve hemoproteinler ile tepkimeye girerek HO. ve oksoferil kompleksleri (Fe(IV)=O) gibi daha güçlü oksidantların oluşumuna neden olur (Halliwell ve Gutteridge, 1990). Hidroksil radikali, suyun yüksek enerjili iyonize radyasyonun etkisinde kalması ile oluşmaktadır. Canlı hücrelerde bulunan hemen her moleküle hızla saldırır ve zarar verir. Normal şartlarda, HO. nın metal bağlı in vivo oluşumu yalnızca Fe ile gerçekleşir. Fenton tepkimesi denilen H 2 O 2 nin ferro demire (Fe 2+ ) bağlı ayrışması ile sonuçta HO. oluşur (Haber-Weiss Tepkimesi). Hidroksil radikali oldukça reaktif bir bileşiktir ve üretildiği yerde veya yakın 9

23 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ olan yerlerde hızla tepkimeye girer. Bir biyomolekülün HO. ile tepkimesi daha az reaktif olan radikallerin oluşumunu sağlar. Lipitlerden hidrojen çıkarılmasıyla lipit peroksidasyonunun başlaması ve peroksil radikallerin oluşması bu duruma verilebilecek en iyi örnektir (Halliwell ve Gutteridge, 1990; Halliwell, 1991; Cadenas, 1995). Hidroksil radikali enzimler ile elimine edilemez, etkili tek koruma oluşumunun engellenmesidir. Bu O.- 2 nin H 2 O 2 ye ve H 2 O 2 nin suya dönüşümlerinin birleştirilmesi ile yapılabilir (Şekil 1.2). Bu tepkimelerin birincisi sitosol ve mitokondrilerde bulunan yüksek kapasiteli SOD enzimi ile katalizlenir. İkinci tepkime sitosoldeki selenoenzim GPx ve peroksizomlardaki CAT ile katalizlenir. Peroksidazlar tarafından üretilen serbest radikaller GSH a elektron transferi ile de elimine edilir (Gregus ve Klaassen, 1996). O O 2 O 2 SOD H 2 O 2 2H + 2GSH GPx CAT GSSG 2H 2 O 2H 2 O H 2 O 2 O 2 Şekil 1.2. Serbest radikallerin detoksifikasyonu (Gregus ve Klaassen, 1996) 1.4. Lipit Peroksidasyonu Poliansatüre yağ asitleri (PUFA) lipit peroksidasyonu için uygun substratlardır. Aktive edilmiş metilen birimlerde karbon-hidrojen bağları (C-H) daha düşük bağ disosiyasyon enerjisine sahiptir ve bunlardan radikal tepkimeleri için hidrojen atomu koparılması çok daha kolaydır. Duyarlılık, yapıda bulunan doymamış alanların miktarına bağlı olarak artar. Biyolojik sistemlerde lipit peroksidasyonu başlama, ilerleme ve sonlanma olmak üzere üç basamakta ilerleyen bir zincir tepkimesi 10

24 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ şeklinde gerçekleşir. Metilen grubundan (-CH 2 -) bir hidrojen atomu kopartmak üzere yeterli reaktiviteye sahip singlet oksijen ( 1 O 2 ), O.- 2, HO. ve peroksi radikal gibi radikallerin membranda bulunan PUFA ya saldırmasıyla ve daha önceden var olan lipit hidroperoksitlerin geçiş metalleri ile yıkımıyla lipit peroksidasyonu başlar. Metilen gruptan bir hidrojen atomunun ayrılması ile geride eşleşmemiş bir elektrona sahip karbon atomu (-C. H-) na sahip karbon-merkezli lipit radikali (L. ) oluşur. Yağ asitinde çift bağın varlığı, çift bağa yakın karbon atomundaki C-H bağını zayıflatarak hidrojenin uzaklaştırılmasını kolaylaştırır. Bu nedenle PUFA yan zincirleri peroksidasyona özellikle daha duyarlıdır. Karbon merkezli radikal başka bir yağ asitinden hidrojen atomu koparabilme yeteneğindedir ve böylece bir zincir tepkime meydana gelir. Zincir tepkimenin son ürünleri çeşitli lipit peroksitler ve siklik peroksitlerdir (Jobling, 1996). Lipit peroksidasyon ürünleri biyolojik membranların akışkanlığını azaltıp geçirgenliğini artırarak membranların fiziksel yapısını değiştirirler. Membranda oluşan zararın tamiri için bu ürünlerin membrandan uzaklaştırılması gerekmektedir. Hücre membranlarının lipit peroksidasyonuna karşı korunması iki geniş antioksidant sınıfı ile sağlanabilir. Bunlar, L. nin oluşum hızını düşürerek lipit peroksidasyon zincir tepkimenin başlamasını engelleyen engelleyici antoksidantlar (CAT ve GPx enzimleri) ve hidroperoksit radikali ile bağlanma ve temizleme yeteneğine sahip zincir kırıcı antioksidantlardır (askorbik asit, E vitamini ve tokoferoller) (Halliwell ve Gutteridge 1990; Ahmad, 1995) Antioksidant Sistem Oksijen aktivasyonu ve ROS detoksikasyonu arasındaki denge, aktivasyon yönüne kaydığında oluşan durum oksidatif stres olarak ifade edilir. Reaktif oksijen türleri hücresel makromoleküllerin oksidasyonu ve lipitler ve diğer hassas hücresel bileşenlerin peroksidasyonuna yol açabilir. Serbest radikallerin oluşturduğu hasara karşı koruma antioksidant sistem tarafından sağlanır (Reed, 2001). Antioksidant sistemler suda çözünen askorbik asit, GSH, karotenler (özellikle 11

25 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ b-karoten) ve yağda çözünen retinol (vitamin A), a-tokoferol (α-toh, vitamin E) gibi düşük molekül ağırlıklı serbest radikal temizleyiciler ve SOD, CAT, GPx, glutatyon redüktaz (GR; EC ), glutatyon S-transferaz (GST; EC ) ve NAD(P)H bağımlı DT-diaforaz (DT-d) gibi özel antioksidant enzimleri içerirler (Livingstone, 2001) Enzimatik Olmayan Antioksidant: Glutatyon Glutatyon glutamat, sistein ve glisinden oluşan bir tripeptiddir. Glutamat ve sistein arasında bir γ-peptit bağı meydana gelir. Böyle bir bağ GSH ı birçok proteaz ile hidrolizden korur. GSH, öncüleri sistein ve γ-glutamilsisteinden daha zor okside edilir. GSH bir çok memeli ve prokaryotik hücrelerde bulunur ve çok yaygın hücresel tiyollerdir, hücre tipine bağlı olarak değişmekle birlikte milimolar düzeylerde bulunur ( mm) (Reed, 2001). Sistein rezidüsü nedeni ile elektrofilik maddeler tarafından enzimatik olmayan yolla glutatyon disülfide (GSSG) yükseltgenir. Hücresel GSH, GR ile tiyol formunda tutulur ve %5 inden daha azı ise GSSG şeklindedir (Anderson,1998). Şekil 1.3. Glutatyonun (GSH) yapısı; L-γ-glutamil-L-sisteinilglisin (Anderson 1998) Glutatyon birçok önemli hücresel işleve sahiptir; enzimatik veya kimyasal yollar ile çeşitli bileşikleri ve metabolitlerini elektrofilik merkezleri tiyoeter bağlara dönüştüren yakalayıcı nükleofil olarak ve hidroperoksitlerin GPx aracılıklı yıkımında bir kofaktör olarak etki gösterir. Birleşme tepkimeleri ile hücreleri ROS tarafından oluşturulan oksidatif strese karşı korur. Hücresel GSH sitosolde yüksek oranlarda (%85-90) bulunur, geriye kalan kısmı mitokondri, çekirdek ve peroksizomlarda yer 12

26 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ alır. Döngü mitokondride sitosolden daha hızlıdır. Bu yüzden mitokondri GSH:GSSG deki redoks değişikliklerine ve buna bağlı olarak oksidatif stresin zararlarına karşı sitosolden daha duyarlıdır. Sitosolik GSH havuzu hücresel savunma işlevi ile tanımlanırken, mitokondriyal havuzun daha çok mitokondrilerin işlevlerinin korunmasında gerekli olduğu düşünülmektedir. Hücresel GSH derişimi yabancı bileşiklerin detoksifikasyonu, protein yetersizliği, oksidatif stres ve birçok patolojik durumda azalabilmektedir. Azalma %15-20 arasında olduğunda hücrelerin toksik etkilere karşı savunması zayıflayabilir, hücre hasarı ve ölümüne yol açabilir. Ancak adaptasyon mekanizmalarının etkisi ile oksidatif strese karşı koyabilmek üzere miktarı artmaktadır (Anderson, 1998; Donald, 2001; Wu ve ark., 2004; Zhang ve ark., 2005). Şekil 1.4. Glutatyon metabolizması (Anderson, 1998) Reaktif oksijen türlerinin detoksifikasyonunda GSH ya doğrudan ROS la tepkimeye girerek ya da GPx in katalizlediği peroksitlerin indirgenme tepkimelerinde elektron kaynağı olmak üzere iki şekilde yer almaktadır. Peroksitlerin indirgenmesi sırasında iki GSH molekülü GPx ile GSSG ye dönüşür, GSSG de GR 13

27 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ enzimi ile katalizlenen NADPH ın elektron vericisi olarak kullanıldığı tepkimelerle yeniden GSH a indirgenir. Bu nedenle NADPH üretim yollarından oluşabilecek herhangi bir bozukluk, GR enzim inaktivasyonuna ve buna bağlı olarak hücre içi GSH miktarında azalmaya neden olabilir (Sen, 1997; Camera ve Picardo, 2002). Glutatyon ayrıca yabancı bileşiklerin detoksifikasyonunda Faz II konjugasyon tepkimelerinde de kullanılmaktadır. İçerdiği nükleofilik tiyol grubu ile elektrofilik bileşiklerin ve metabolitlerinin detoksifikasyonunu sağlamaktadır. GSH konjugasyonu non-enzimatik olabileceği gibi GST enzimi ile de katalizlenmektedir (Ioannides, 2002). İndirgenme ve yükseltgenme tepkimeleri arasındaki denge hücrenin redoks durumunu yansıtmaktadır. Hücresel redoks durumunun indikatörü olarak değerlendirilen GSH/GSSG oranı antioksidatif kapasiteyi belirleyen en önemli redoks çiftidir. GSH redoks sistemi birçok hücresel metabolik işlemin düzenlenmesinde önemli bir yer tutar. GSH redoks sistemi GSH, GPx, GR ve NADPH dan oluşmaktadır (Jokanovic, 2001; Jefferies ve ark., 2003; Wu ve ark., 2004). Redoks sistemde ve Faz II detoksifikasyonda yer alan GSH bağımlı GPx ve GST enzimleri aynı zamanda enzimatik antioksidantlardır ve aşağıda ayrıntısı ile sunulmaktadır Enzimatik Antioksidantlar Glutatyon Peroksidaz Glutatyon peroksidaz birçok hücrede H 2 O 2 nin detoksifikasyonunda önemli olan sitoplazma ve mitokondrilerde bulunan bir enzimdir. Molekül ağırlığı kda olan tetramerik bir selenoproteindir. Aktif merkezde normal bir sisteinin yerine bir selenosistein amino asiti içerir. Bu amino asitte kükürtün yerini alan selenyum (Se) nükleofilik özellikleri arttırır ve çok daha kolay proton verilmesini sağlar. Omurgalı türlerinde enzimin katalitik aktivitesinde bir hidrojen donörü olarak GSH a gereksinim vardır. Glutatyon peroksidaz H 2 O 2 yi iki su (H 2 O) molekülüne ve membran 14

28 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ peroksitlerini (ROOH/LOOH) bir molekül H 2 O ve zararsız bir bileşik olan alkole (ROH/LOH) indirger. H 2 O 2 tepkimelerinin katalizi birkaç basamakta yürür. Önce enzimin katalitik merkezi H 2 O 2 yi indirger ve enzim okside edilir. İkinci basamakta, okside enzim bir molekül GSH ile bir kompleks oluşturur. Üçüncü basamakta; kompleks başka bir GSH molekülünü kullanır ve indirgenerek başlangıç durumuna dönerken, iki molekül GSH, GSSG ye okside olur. H 2 O GSH GPx 2H 2 O + GSSG GPx LOOH +2 GSH H 2 O + LOH + GSSG Enzim aynı inkübasyon şartlarında H 2 O 2, etil hidroperoksit, tertbütilhidroperoksit, linoleik asit hidroperoksit ve nükleotid veya steroid türevi hidroperoksitleri birbirlerine yakın hızlarda ürünlere dönüştürür (Ahmad, 1995) Glutatyon S-Transferaz Glutatyon S-transferazlar, GSH ile elektrofilik gruplar taşıyan bileşikler arasındaki konjugasyonu katalizleyen çok işlevli Faz II biyotransformasyon enzim ailesidir (Hamed ve ark., 2003). Bu enzim ailesi çok sayıda, farklı bileşiğin konjugasyonunu sağlamaktadır. Bunun nedeni spesifik olmayan bir substrat bağlama bölgesinin varlığı ve çok sayıda izoziminin bulunmasıdır. Böylece GST karsinojenik bileşikler, çevresel kirleticiler, ilaçlar ve diğer bir çok bileşiği substrat olarak kullanmaktadır (Cnubben ve ark., 2001). Bir enzim molekülünü oluşturan her iki alt birimin aktif merkezlerinde iki farklı işlevsel bölge vardır. GSH ı bağlayan hidrofilik G-bölgesi ve elektrofilik substatların bağlandığı hidrofobik H-bölgesi. G-bölgesi yüksek GSH spesifitesi ile tüm GST lerde oldukça benzerdir. H-bölgesi ise GST ler arasında tamamen farklı ve substrat bağlama kapasitesi ve çeşitliliği son derece değişkendir. Enzimin yüksek substrat çeşitliliğinin nedeni H-bölgesidir (Armstrong, 1997). Enzimin katalizlediği tepkime şu şekilde gösterilebilir: GST GSH + R-X GSR + HX 15

29 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ Bu konjugasyon tepkimelerine ek olarak GST, GSH-bağımlı tepkimelerle hidroperoksitlere karşı katalitik aktivite göstererek bir antioksidant olarak çalışmaktadır. GST nin peroksidaz aktivitesi Se-bağımlı değildir. Tepkime iki basamakta yürümektedir; (1) Peroksitin alkole enzimatik olarak indirgenmesi ve hidroksillenmiş GSH üretimi ve (2) hidroksillenmiş GSH ın bir molekül GSH ile spontan tepkimesi ile GSSG ve su meydana gelir. Selenyum bağımlı olmadığından Se eksikliği durumunda GPx aktivitesinin azalmasından dolayı GST devreye girer. Se varlığında enzimin bu görevi baskılanmaktadır (Leblanck ve Dauterman, 2001; Sherratt ve Hayes, 2002) Süperoksit Dismutaz Süperoksit dismutaz O.- 2 nin O 2 ve H 2 O 2 ye dismutasyonunu katalizleyerek oksidatif hasara karşı koruma sağlar. O O H + H 2 O 2 + O 2 Bakır-çinko SOD (CuZnSOD) moleküler ağırlığı ortalama 32 kda olan dimerik bir proteindir. Birçok izozimleri olduğu bildirilmiştir. Mangan SOD (MnSOD) ortalama 86 kda moleküler ağırlıklı tetramerik bir proteindir. Demir SOD (FeSOD) 41 kda moleküler ağırlıklı dimerik bir proteindir. Metal kofaktör ne olursa olsun, SOD lerin bütün türleri benzer mekanizmaları paylaşır ve O.- 2 nin dismutasyonunu hızlandırırlar. CuZnSOD nin katalitik mekanizması iyi bir şekilde karakterize edilmiştir. MnSOD ve FeSOD nin katalitik mekanizmaları CuZnSOD kadar ayrıntılı çalışılmamıştır, içerdikleri aktif alan konfigürasyonu ve metal redüksiyonu ve reoksidasyonunun ardışık meydana gelmesi ile benzerlik gösterirler. Prooksidantlar tarafından oluşturulan aşırı oksidatif stres altında ökaryotik CuZnSOD genellikle daha hızlı tetiklenir (Ahmad, 1995) Katalaz Süperoksit radikallerinin dismutasyonu O 2.- den daha yüksek oksidasyon yeteneğine sahip olan H 2 O 2 üretimine neden olur. Üretilen H 2 O 2, peroksidazlar 16

30 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ ve/veya CAT tarafından detoksifiye edilir. CAT her monomer için bir tane protohem IX grubu içeren homotetramerik bir hemoproteindir. Memelilerde ortalama molekül ağırlığı kda dur. CAT, H 2 O 2 nin su ve oksijene dismutasyonunu katalizler. H 2 O 2 + H 2 O 2 2H 2 O + O 2 CAT-Fe(III) + H 2 O 2 Kompleks I Kompleks I + H 2 O 2 CAT-Fe(III) + 2H 2 O + O 2 Kompleks I + DH 2 CAT-Fe(III) + 2H 2 O + D Hidroperoksitlerin karakteristiği olarak CAT çift aktivite sergiler; birincisi iki H 2 O 2 molekülünün dismute edildiği katalitik aktivite dir. Burada molekülün biri ardışık iki basamakta bir redüktant iken (Hidrojen donörü), diğeri bir oksidant olarak davranır. Diğer tepkime peroksidatif olarak adlandırılır; burada redüktant (DH 2 ) hidrojen donörüdür. Metanol, etanol, formik asit, fenoller ve aminler DH 2 ye örnektir. Her iki tepkimede de kompleks I olarak adlandırılan bir aktif enzim-h 2 O 2 ara bileşiği oluşturulur. CAT ın tipik katalitik aktivitesinde kompleks I ve H 2 O 2 nin diğer molekülü arasındaki tepkime oldukça hızlı bir şekilde ilerlerken, peroksidatif tepkime daha yavaştır. Katalaz birçok ökaryotik hücrede sitosol ve mitokondrilerde daha düşük düzeydir. H 2 O 2 üretici oksidazların biyogenezleri ekstraperoksizomal olarak sentezlenmiş öncülerde olmasına karşın esas olarak peroksizomlarda lokalize oldukları için katalaz peroksizomlarda daha fazladır (Ahmad, 1995; Kelly ve ark., 1998) Biyomarkırlar Çevresel kalite değerlendirmelerinde moleküler ve hücresel düzeylerde biyolojik etkilerin ölçümü erken uyarı olarak kullanılmaktadır (Cajaraville ve ark., 2000). Biyomarkırlar tipik olarak biyolojik sistemlerde değişikliklere neden olan ksenobiyotiklerin etkisine karşı vücut sıvıları, hücre, doku veya organlarda oluşan hücresel, biyokimyasal, moleküler ve fizyolojik değişiklikleri kapsayan biyolojik yanıtların kantitatif ölçümü olarak tanımlanabilir. Biyomarkır terimi sub-organizmal değişimler için sınırlandığından organizmal ve daha yüksek düzeylerdeki yanıtlardan 17

31 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ daha önce gerçekleşerek erken uyarı sağlamaktadır (Lam ve Gray, 2003). Antioksidant enzimler hücre homeostazisinin korunmasında önemli rol oynarlar. Çeşitli stres faktörlerinin etkisinde, stresin yoğunluğuna, süresine ve etkide kalan canlıların duyarlılıklarına bağlı olarak tetiklenebilir veya inhibe olabilirler. İndüksiyon canlının toksisiteyi engellemeye karşı oluşturduğu bir adaptasyon olarak değerlendirilirken, inhibisyon strese karşı yüksek duyarlılık olarak tanımlanır ve olumsuz etkilere neden olabilir. Antioksidant sistem elemanları yabancı bileşiklerin etkisinde kalmayı ve oluşan toksisiteyi yansıtan kullanışlı biyomarkırlar olarak kullanılmaktadırlar (Doyotte ve ark., 1997; Cossu ve ark., 2000). Lipit peroksidasyonu antioksidant enzimler ile birlikte kirleticiler tarafından tetiklenmiş oksidatif stresin biyomarkırı olarak değerlendirilmektedir (Vasseur, ve Cossu-Leguille, 2003; Pandey ve ark., 2003). Glutatyon düzeyi ve GSH a bağlı enzimlerin aktivitelerindeki değişiklikler ksenobiyotiklerin bazı türler üzerindeki etkilerinin belirlenmesinde kullanılan biyomarkırlardır (Almar ve ark., 1998). Balıkların oksidatif toksisite mekanizmaları ve oksidatif strese karşı oluşturdukları yanıtlar memelilerle benzer olduğundan oksidatif stres çalışmalarında uygun model organizmalar olarak kullanılmaktadırlar (Almeida ve ark., 2002). Özellikle OP ve karbamat (C) pestisitlerin tespiti ve etkilerinin değerlendirilmesinde kolinesteraz (ChE) enzimlerin aktivitelerinin ölçülmesi biyomarkır olarak yaygın olarak kullanılır. Bu bileşiklerin ortamda bulunan çok düşük derişimlerine yanıt verebilmektedir (Vasseur ve Cossu-Leguille, 2003) Kolinesterazlar Kolinesterazlar; asetilkolin (ACh), bütirilkolin (BCh) ve asetiltiyokoliniyodür gibi çeşitli kolin türlerinin ayrıştırılma tepkimelerini katalizleyen enzimlerdir. Substrat seçicilikleri ve inhibitörlere duyarlılıkları farklıdır. Katalitik özelliklerine göre ACh yi hidroliz eden asetilkolinesteraz (AChE; EC ) ve ACh ile BCh nin hidrolizini sağlayan bütirilkolinesteraz (BChE; E.C ) olmak üzere iki tipi vardır. Kolinesterazlar, lipazlar, peptidazlar, dehalojenazlar ve hatta adhezyon 18

32 1.GİRİŞ Hülya DURMAZ BEKMEZCİ proteinlerinin de yer aldığı geniş bir protein ailesinin üyeleridir (Chang ve Strichartz, 2005) Asetilkolinesteraz Asetilkolinesteraz, nörotransmitter ACh nin kolin ve asetata hidrolizi ile biyolojik aktivitelerinin sonlandırılması ve sonraki yıkımlarından sorumludur. Enzimde esteratik ve anyonik olarak bilinen iki etkin kısım vardır. Anyonik kısım negatif yüklüdür ve glutamat aminoasitinin iyonize karboksil (COOH) grubundan oluşur; ACh nin katyonik azotu buraya elektrostatik olarak bağlanır. Esteratik kısım pozitif yüklü olup iki farklı kısımdan oluşur. İlki serin amino asitinin hidroksil (OH) grubudur ve ACh molekülündeki karbonil atomu buraya kovalent olarak bağlanır. İkincisi ise histidin amino asitinin bazik imidazol halkasıdır. Bu bölge serin amino asitinin OH grubuna hidrojen bağları ile bağlanarak onun etkinliğini artırır. Ayrıca ACh nin katyonik azotuna bağlı iki metil grubu da enzimin anyonik kısmına van der Waals bağları ile bağlanır. Enzime bağlanması ile birlikte kolin asetil grubundan ayrılır, böylece enzim asetillenir. Daha sonra enzime bağlı asetil grubunun elektrofilik karbon atomu bir su molekülü alarak enzimden ayrılır ve enzim yeniden kazanılır. Organofosfatlar AChE enziminin aktif merkezine dialkil fosfat (dialkil fosforil veya dialkilfosfonil) grubunu transfer ederler. Fosforile olmuş enzimler bir tür fosfat esteri olarak kabul edilebilirler. Fosfor atomu ile esteratik noktanın serin aminoasit rezidüsünün OH grubu arasındaki kovalent bağ su ile çok yavaş bir şekilde koparılarak hidrolize edilebilir (Kaya ve ark.,1995). Karbamat pestisitler de benzer bir mekanizma ile AChE yi karbamile ederek inhibisyona ve kolinerjik sinapslarda ACh birikmesine yol açarak nörotoksik etkiye neden olur (Kaya ve ark., 1995; Perkins ve Schlenk, 2000). Kuş, balık ve omurgasızlarda AChE aktivitesindeki %20 veya daha fazla inhibisyonu OP pestisitlerin etkisini, %50 veya daha fazla inhibisyon yaşamı tehdit eden bir durumu belirtmektedir (Day ve Scott, 1990). Bazı hayvanlarda daha yüksek inhibisyon düzeylerinde yaşamın devam ettiği görülmektedir (Pan ve Dutta, 1998; 19