Kromozom Elde Etmede Kullanılan Solüsyonlar Phytohemaglutinin (PHA) lyofilize halde 5 ml distile su ile sulandırılmaktadır.+4 C'de saklanmaktadır.

Transkript

1 Stok Solüsyonlar Periferik Kan Lenfosit Kültür Medyumları RPMI 1640 bazal medyum +4 C de saklanmaktadır. Fetal Bovine Serum(FBS) -20 C'de saklanmaktadır. L-Glutamin -20 C'de saklanmaktadır. Penisilin-Streptomisin-Amfoterisin (PSA) -20 C'de saklanmaktadır. Medyum Hazırlanması: 100 ml RPMI ml FBS + % 2 L-Glutamin + % 1.5 PSA -20 C saklanan hazırlanmış medyumlar kullanılmadan önce etüvde 37 C de ısıtılmaktadır. Kromozom Elde Etmede Kullanılan Solüsyonlar Phytohemaglutinin (PHA) lyofilize halde 5 ml distile su ile sulandırılmaktadır.+4 C'de saklanmaktadır. Sol A ve Sol B (Synchroset) -20 C'de saklanmaktadır. High Resolution Banding (HRB) için kullanılmaktadır. Kolşisin (kolsemid) (Biolojical Industries) +4 C de saklanmaktadır. Hipotonik solüsyon M KCL (Sigma) = 5.6 gr KCL ml distile su (37 C'lik etüvde saklanmaktadır). Carnoy fiksatifi: Methanol + Asetik asit (Merck) 3:1 FISH Solüsyonları 20xSSC (Standart Saline Sitrat) +4 C'de saklanmaktadır. 0.4xSSC = 1 ml 20xSSC + 49 ml distile su 2xSSC = 5 ml 20xSSC + 45 ml distile su Tween 20 stok solüsyonu (oda sıcaklığında saklanmaktadır). Tween 20 yıkama solüsyonu : 2xSSC + 40 µl Tween 20

2 Oda ısısında % 70, % 85 ve % 100 lük alkol serisi Hibridizasyon solüsyonu ( Cytocell) -20 C' de saklanmaktadır. DAPI Antifade ( µg /µl ) -20 C' de saklanmaktadır. FISH probları -20 C' de saklanmaktadır. Periferik Kan Lenfosit Kültürü Önceden 12 ml' lik kırmızı kapaklı u dipli grainer tüplere 5' er ml koyarak hazırladığımız periferik kan kültür medyumları -20 C' den çıkartılarak 37 C' de ısıtılarak eritilir. Her olgu için 2' şer tüp çıkarılır. Eritilen medyumlarımızın üzerine steril ortamda tüpler ve enjektör alevden geçirilerek 6 damla heparinli enjektöre aldığımız olgunun kanından 6 damla damlatılır. Üzerine 5ml distile su ile sulandırılmış phytohemaglutinin solüsyonundan 4 damla damlatılır. Tüpün ağzı ve kapağı alevden geçirilerek sıkıca kapatıldıktan sonra hafifçe çalkalanarak yaklaşık olarak 60 derece eğimli bir şekilde kültür sporlarına koyularak 37 C'lik etüvde 72 saatlik inkübasyona bırakılır. Ekim yapıldıktan sonra gün bitiminde ve diğer iş gününün başlangıcında tüpler hafif şekilde çalkalanır. Bu çalkalama işlemi harvest (çıkış) yapılan zamana kadar devam ettirilir. Her olgunun 2. tüplerine 48. saatte sol A solüsyonundan 20 µl ve kapağı alevden geçirilerek tekrar 37 C'lik etüvde inkübasyona bırakılır. koyulur ve tüpün ağzı 67. saatte sol A solüsyonları koyulan 2. tüplerimize yıkama işlevi gören sol A solüsyonunu uzaklaştırıp etkisini yok eden sol B solüsyonundan 20 µl alevden geçirme işlemleri tekrarlanıp 37 C'lik etüvde inkübasyona bırakılır. koyulur ve 72. saatin dolmasına 1.5 saat kala tüm kültür tüplerimize 5 ml'lik enjektöre çektiğimiz kolşisin(kolsemid) solüsyonundan 2 damla damlatılır.

3 Kromozom Elde Etme İşlemi(Harvest) 72. saatlik kültür sonunda tüpler 1200 rpm' de 10 dakika santrifüj edilir. Süpernatant uzaklaştırılır ve 3 ml'lik plastik pastör pipetleriyle ilk pipet yavaş ve damla damla olacak şekilde tüplerimize vorteksleyerek 37 C' de bekleyen M KCL'den (hipotonik solüsyon) 5-7 ml ekleme yapılır. Yaklaşık olarak 8-10 dakika arası 37 C'lik etüvde bekletilir(hipotonik şok). Hipotonik şok süresi dolarken tüpler alınıp santrifüje koyulur ve 1200 rpm' de 10 dakika santrifüj edilir. Santrifüjden sonra süpernatant uzaklaştırılıp vorteksleyerek pellet üzerine taze hazırlanmış Carnoy fiksatifinden ilk pipet yavaş ve damla damla olmak üzere 5-7 ml bırakılır ve tekrar 1200 rpm' de 10 dakika santrifüj edilir. Bu işlem 2 kere daha uygulandıktan sonra süpernatant uzaklaştırılır. Dip materyali pastör pipetle iyice karıştırılır. Lamların üzerine FISH probunu koyacağımız bölgeye göre dip materyalinden damlatarak preparatlar hazırlanır. Inverted mikroskopta yapılan yayma kontrolünde preparatların mitotik indeksi ve kalitesi uygun ise yayma işlemine devam edilir. Eğer uygun değilse istenilen kalite sağlanana kadar işleme devam edilir. Preparatlar yaklaşık 60 C'lik bir eğimle yayma yapılan ortamda kurutulur. Floresan İn Situ Hibridizasyon Lamel Hazırlanması Alkol ile temizlediğimiz lamel üzerine kuruduktan sonra numunemizden damlatılır. Oda sıcaklığında (RT) 2 dakika 2 x SSC ile yıkanır. Etanol serisinde ( %70, %85, %100 ) her birinde 2 dakika RT'de geçirilir. Kurumaya bırakılır.

4 Prob Hazırlanması Prob ve hibridizasyon solüsyonu -20 C'deki dondurucudan çıkartılarak oda sıcaklığında ısınmaya bırakılır. 2 µl probtan 8 µl hibridizasyon solüsyonundan ependorfun içine alınır. İyice pipetaj yapılarak karıştırılır. Denatürasyon 10 µl prob karışımı numune üzerine dikkatlice damlatılır ve 24 x 24 mm lamel ile kapatılır. Rubber cement solüsyonu ile yapıştırılır ve kurumaya bırakılır. Hibridizasyon cihazında 75 C'de (artı/eksi 1 C ) ısıtılarak 2 dakika denature edilir. Hibridizasyon Hibridizasyon cihazında 37 C'de (artı/eksi 1 C ) bir gece süresince inkübe edilir. Hibridizasyon Sonrası Yıkamalar Lamel ve kalan yapışkan dikkatlice çıkarılır. Bir plastik şale içerisinde lam 0.4 x SSC, Ph7.0'de 72 C'de (artı/eksi 1 C ) 2 dakika nazik bir şekilde yıkanır. Lam kurulanır ve 2 x SSC, %0.05 Tween-20'de (ph 7.0) RT'de 30 saniye yıkanır. Lam kurutulduktan sonra probun koyulduğu bölgeye 8-10 µl 24 x 24mm lamelle kapatılır. DAPI damlatılır ve üzeri Lam karanlıkta ışık geçirmeyen bir kutuda en az 5 dakika en fazla 1 ay bekletildikten sonra floresan mikroskobunda incelenir.

5 Subtelomerik Yeniden Düzenlenmeleri Araştırmada FISH Tekniğinin Avantaj ve Dezavantajları Yaklaşık olarak popülasyonun 1% ini etkileyen epilepsi ve 1-3% ünü etkileyen mental retardasyonun ortaya çıkmasında önemli rol oynayan subtelomerikyeniden düzenlenmeler konvansiyonel sitogenetik metodlarla ortayaçıkarılamayabilmektedir. Bu anlamda FISH yöntemi kromozom yapısı ve fonksiyonuile ilgili çalışmalarda yeni bir çığır açtı denilebilir. Moleküler ve sitolojik çalışmalarınbir kombinasyonu olarak en büyük avantajlarından birisi tek hücre düzeyinde bilgiyi koruyarak DNA analizi ve kromozomal araştırmalar arasında ara kat rolü oynamasıdır. İnsan genom projesi dizileme ve büyük ölçekli haritalama çalışmalarında destek olarak kullanılmıştır. FISH sağlık alanının çok farklı uygulamarında kendisine yer bulmuştur. Bunlar klinik genetik, nörobilim, üreme, toksikoloji, mikrobiyal ekoloji, evrimsel biyoloji, karşılaştırmalı genomik, hücresel genomik ve kromozom biyolojisi olarak sıralanabilir. Normal karyotipe sahip hastalarda; Subtelomerik FISH testinin yararı daha hızlı tanıya ulaşabilme, hastanın prognozu hakkında daha iyi bilgi ve daha doğru genetik danışma verilebilmesidir. Bunun yanında dezavantajları da söz konusudur. İlk akla gelen zahmetli ve pahalı olmasıdır. FISH subtelomerik taramalar için yaygın bir şekilde kullanılmıştır ama küçük subtelomerik duplikasyonlar için güvenilir değildir. MLPA tekniği geliştirildikten sonra subtelomerik kopya sayısı artışları daha kolay tanımlanmıştır ve mental retardasyonun ortaya çıkmasına sıklıkla neden olduğu düşünülmektedir. Subtelomerik mikroduplikasyonların klinik önemi ve sıklığı hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Önceki çalışmalarda mikroduplikasyonların sıklığı % 0-2 olarak bildirilmektedir. Literatürde bildirilen duplikasyon ve delesyonların ortaya çıkarılması büyüklüğüne bağlı olmaktadır. Bunun anlamı kromozom boyunca farklı lokalizasyonlara sahip problar olduğu için bazı anormalliklerin MLPA yöntemi ile ortaya çıkarılıp FISH ile konfirme edilememesidir. FISH probları MLPA' dan

6 daha büyük dizileri ortaya çıkarabilmektedir. Bu yüzden küçük delesyon, duplikasyon ve tandem duplikasyonlar FISH tekniği ile ortaya çıkarılamamaktadır. FISH yöntemiyle fark edilemeyen kısmi mikroduplikasyonlar ve submikroskobik kromozom yeniden düzenlenmelerin yokluğunu konfirme etmede yüksek çözünürlüklü array CGH yararlı olacaktır. Bizim bu çalışmada kullandığımız subtelomerik FISH problarıyla tüm hastalarda normal sonuçlar elde edildi. Bunlardan birinin sebebi sınırlı sayıda prob kullanmamız (maliyetinin yüksek olması bütçenin kısıtlı olması) diğer sebep ise daha küçük kopya sayısı değişikliklerinin FISH yöntemi ile saptananamasıdır.