T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ)

Transkript

1 T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ) ALLERJİK ASTIMDA T HÜCRELERDE KEMOKİN EKSPRESYONU VE SİTOKİNLER LAÇİN CEVHERTAŞ DANIŞMAN DOÇ. DR. GAYE ERTEN İMMÜNOLOJİ ANABİLİM DALI İMMÜNOLOJİ PROGRAMI İSTANBUL-2015

2 ii

3

4 iii BEYAN Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına kadar bütün safhalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmayla elde edilmeyen bütün bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici bir davranışımın olmadığı beyan ederim. Laçin Cevhertaş (İmza)

5 iv İTHAF Anne ve babama ithaf ediyorum.

6 v TEŞEKKÜR Yüksek Lisans Tez çalışmamda engin desteğini gördüğüm, beni her zaman cesaretlendiren danışmanım Doç. Dr. Gaye ERTEN e ve çalışmamın her aşamasında yardımlarını esirgemeyen İmmünoloji Anabilim Dalı Başkanı Sayın Prof. Dr. Günnur DENİZ e, deneylerim sırasında bana her açıdan destek olan çalışma arkadaşlarım Abdullah YILMAZ, Msc. İlhan TAHRALI ve Dr. Yusuf Metin GELMEZ e, klinik katkılarından dolayı Dr. Ayşe Bilge ÖZTÜRK, Prof. Dr. Bilun GEMİCİOĞLU ve tezimin istatistik hesaplamalarındaki yardımlarından dolayı Doç. Dr. Umut Can KÜÇÜKSEZER e teşekkür etmeyi bir borç bilirim. Sıkıntılarımı paylaşan ve bana zor anlarımda daima yanımda olduklarını gösteren özellikle Funda Pehlevan, Pınar İrfan, Gülce Özçit, Murat Giriş, Canan Ulusoy, Çiğdem Şener, Demet Sapan, Müşerref Kocabalkan, Nilgün Sallakçı ve diğer arkadaşlarıma Öğrenim hayatım boyunca bana destek olan aileme ve tezimde emeği geçen herkese ayrı ayrı teşekkürlerimi sunarım. Laçin CEVHERTAŞ Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: 25996

7 vi İÇİNDEKİLER TEZ ONAYI... İİ BEYAN... İİİ İTHAF... İV TEŞEKKÜR... V İÇİNDEKİLER... Vİ TABLOLAR LİSTESİ... İX ŞEKİLLER LİSTESİ... X SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ... Xİİ ÖZET... XİV ABSTRACT... XV 1. GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİLER Astım Tanım ve Sınıflandırma Belirtiler Sıklık - Epidemiyoloji Etiyoloji Kişisel Faktörler Çevresel Faktörler Epigenetik Tanı Kriterleri Klinik Seyir Allerjik Astım Non-Allerjik Astım Astım ve Bağışıklık Sistemi İlişkisi T hücreler T hücre Astım İlişkisi Sitokinler ve Astım İlişkisi İnterlökin-4 (IL-4) Interlökin 10 (IL-10)... 12

8 vii İnterferon- (IFN-γ) Kemokinler ve Astım İlişkisi CCR CCR CXCR GEREÇ VE YÖNTEM Olgular Gönüllülerin Araştırmaya Dahil Edilme Kriterleri Gönüllülerin Araştırmaya Dahil Edilmeme Kriterleri Non - allerjik Astım Allerjik Astım Deneylerde Kullanılan Kimyasallar PBS (Fosfat Tampon Tuz Çözeltisi) RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute-1640) Fiksasyon ve Permeabilizasyon Kiti Hücre Yüzey Molekül Ekspresyonlarının Belirlenmesi Periferik Kan Mononükleer Hücre (PKMH) Eldesi PKMH Kültürü Hücre Yüzey Molekülleri ve Hücre İçi Sitokin Tayini Hücre Yüzey Boyaması Hücre İçi Boyama Analiz ve İstatistikler BULGULAR Periferik Kan T Hücrelerin Hücre İçi Sitokin İçeriği Allerjik Astım Olguları Allerjik Olmayan Astım Olguları Allerjik ve Non-allerjik Astım Hasta Grupları Kıyaslaması Periferik Kan T hücrelerin Kemokin Reseptörü Ekspresyon Profili Allerjik Astım Olguları Allerjik Olmayan Astım Olguları Allerjik ve Non-allerjik Astım Hasta Gruplarının Karşılaştırılması Periferik Kan T Hücrelerin Kemokin Reseptör Profillerine Göre Sitokin İçerikleri... 31

9 viii Allerjik Astım Olguları Allerjik Olmayan Astım Olguları Allerjik ve Non-allerjik Astım Hasta Gruplarının Karşılaştırılması Periferik Kan CD4 + ve CD8 + T Hücrelerin Sitokin İçeriklerine Göre Karşılaştırılması Allerjik Astım Olguları Non-allerjik Astım Olguları TARTIŞMA KAYNAKLAR FORMLAR ETİK KURUL KARARI PATENT HAKKI İZNİ TELİF HAKKI İZNİ ÖZGEÇMİŞ... 53

10 ix TABLOLAR LİSTESİ Tablo 3-1: Hücre yüzey boyamada kullanılan monoklonal antikorlar Tablo 3-2: Hücre kültüründe kullanılan uyaranlar ve kimyasallar... 22

11 x ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil 3-1: Uyarımsız koşulda, CD4 + T hücre CCR4 ve CD8 + T hücre CCR4 ekspresyonu akan hücre ölçer görüntüsü Şekil 3-2: PMA/iyonomisin sonrası CD4 + T hücresi IL-4 ve uyarımsız CD8 + CCR4 + T hücresi IL-10 sitokin içeriği akan hücre ölçer görüntüsü Şekil 3-3: Total lenfositler (R1), CD8 + hücreler (R2) ve CD4 + hücreler (R3) akan hücre ölçer görüntüsü Şekil 4-1: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD4 + T hücre IFN-γ ve IL-4 düzeyleri Şekil 4-2: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD8 + T hücre IFN-γ, IL-4 ve IL-10 düzeyleri Şekil 4-3: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD4 + T hücre IFN-γ, IL-4 ve IL-10 düzeyleri Şekil 4-4: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD8 + T hücre IFN-γ, IL-4 ve IL-10 düzeyleri Şekil 4-5: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD4 + T hücrelerin CXCR3, CCR3 ve CCR4 yüzey ekspresyon değişimleri Şekil 4-6: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD8 + T hücrelerin CXCR3 ve CCR4 yüzey ekspresyon değişimleri Şekil 4-7: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD8 + T hücrelerin CCR3 yüzey ekspresyon değişimleri Şekil 4-8: PMA/iyonomisin uyarımı öncesi ve sonrasında allerjik ve non-allerjik astım olgularının CD8 + CCR4 + hücre oranları Şekil 4-9: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD4 + T hücre CXCR3 + IFN-γ, CXCR3 + IL- 4, CCR3 + IFN-γ, CCR3 + IL-4, CCR3 + IL-10, CCR4 + IL-10 değişimleri Şekil 4-10: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD8 + T hücre CCR3 + IFN-γ, CCR3 + IL-4, CCR3 + IL-10, CCR4 + IL-4, CCR4 + IL-10 değişimleri Şekil 4-11: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD4 + T hücre CXCR3 + IFN-γ, CXCR3 + IL-4, CXCR3 + IL-10, CCR3 + IFN-γ, CCR3 + IL-4, CCR3 + IL-10 değişimleri. 33 Şekil 4-12: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD8 + T hücre CXCR3 + IFN-γ ve CXCR3 + IL-10 değişimleri... 34

12 xi Şekil 4-13: Uyarımsız koşulda allerjik ve non-allerjik astım olgularının CD4 + T hücre CCR4 + IFN-γ ve CCR4 + IL-10 düzeyleri Şekil 4-14: Uyarımsız koşulda allerjik astım olgularında CD4 + ve CD8 + T hücrelerinde IFN-γ ve IL-10 hücre içi sitokin düzeyleri Şekil 4-15: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası allerjik astım olgularının CD4 + ve CD8 + T hücre popülasyonlarında CXCR3 ekspresyonu Şekil 4-16: Uyarımsız koşulda allerjik astım olgularının CD4 + ve CD8 + T hücre popülasyonlarında CCR3 + IFN-γ yüzdeleri Şekil 4-17: Uyarımsız koşulda allerjik olmayan astım olgularının CD4 + ve CD8 + T hücre popülasyonlarında hücre içi IFN-γ, IL-10 sitokin düzeyi ve CCR4 ekspresyonu 37

13 xii SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ AHR: Hava yolu aşırı duyarlılığı (Airway hyperresponsiveness) AP-1: Aktivatör protein 1 (Activator protein 1) ASH: Antijen sunucu hücre BAL: Bronkoalveolar lavaj CCR4: CC kemokin reseptörü 4 DH: Dendritik hücre FSC: Önden saçılım (Forward scatter) GCPR: G-protein-eşlikçi reseptör GWAS: Tüm genom studies) ilişkilendirme çalışmaları (Genome-wide association HRV: Human rhino virüs IFN-γ: İnterferon gamma IG: İmmünoglobülin ILCs: Doğal lenfoid hücreler (Innate lymhoid cells) IL-4: İnterlökin 4 IL-10: İnterlökin 10 MHC sınıf : Doku uyumluluk kompleksi sınıf II (Major histocompatibility complex class ) MKP-1: Mitojenle aktive protein kinaz fosfataz-1 (Mitogen-activated protein kinase phospatase-1) NF-κB: Nükleer faktör kappa B (Nuclear factor kappa B) NKT: Doğal öldürücü T hücre (Natural Killer T cell) PBS: Fosfat tampon tuz çözeltisi (Phosphate-buffered saline) PMNH: Periferik mononükleer hücre (Peripheral blood mononuclear cell)

14 xiii PKC: Protein kinaz C PMA: Forbol miristat asetat (Phorbol myristate acetate) PMs: Partiküler maddeler (Particular matters) PUFA: Çoklu doymamış yağ asidi (Polyunsaturated fatty acid) RPMI-1640: Roswell Park Memorial Institute-1640 RSV: Respiratory syncytial virus SARP: Severe asthma research program SSC: Yandan saçılım (Side scatter) Tc1: Sitotoksik T hücresi 1 Tcreg: Sitotoksik regülatör T hücresi Tfh: Foliküler T hücre Th1: Yardımcı T hücresi 1 Th2: Yardımcı T hücre 2 THR: T hücre reseptörü Treg: Regülatör T hücre US: Uyarımsız (Unstimule)

15 xiv ÖZET Cevhertaş L. Allerjik Astımda T hücrelerde kemokin ekspresyonu ve sitokinler. İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Deneysel Tıp ve Araştırma Enstitüsü, İmmünoloji ABD. Yüksek Lisans Tezi. İstanbul Allerjik ve allerjik olmayan astım gelişiminde T hücre alt grupları önemli rol oynamaktadır. Bu çalışmada GINA 2014 Rehberine göre en az 1 yıl önce astım tanısı konulmuş, orta-yüksek doz inhale steroid ve uzun etkili beta agonist tedavisine yanıtsız, FEV1 değeri < %80 olan ve sigara içmeyen veya 10 yıl altında içip en az 6 ay önce bırakmış olan allerjik (n:4, yaş ort. 47,2±8,6) ve nonallerjik (n:5, yaş ort. 47,25±10,3) bireylerde periferik kan mononükleer hücrelerin (PKMH) hücre yüzey belirteçleri (CD4, CD8, CCR3, CCR4, CXCR3) ve hücre içi sitokin (IFN-g, IL-4 ve IL-10) düzeyleri PMA/iyonomisin uyarımlı ve uyarımsız olarak akan hücre ölçer ile değerlendirilmiştir. Uyarım sonrasında, allerjik astımlı hastalarda yardımcı T (Th) hücre CXCR3 + IFN-g, CXCR3 + IL-4, CCR3 + IFN-g, CCR3 + IL-4, CCR3 + IL-10, CCR4 + IL-10; allerjik olmayan astımlılarda ise CXCR3 + IFN-g, CXCR3 + IL-4, CXCR3 + IL-10, CCR3 + IFN-g, CCR3 + IL-4 ve CCR3 + IL-10 ekspresyonu artmıştır. Sitotoksik T hücreler uyarıldığında ise; CCR3 + IFN-g, CCR3 + IL-4, CCR3 + IL-10, CCR4 + IL-4, CCR4 + IL-10 ekspresyonunda artış saptanmıştır. Allerjik olmayan astımda ise hem CD8 + CXCR3 + IFN-g hem de CD8 + CXCR3 + IL-10 seviyelerinde artış gözlenmiştir. Çalışmamızda, sitokin içerikleri açısından gruplar arasında anlamlı fark saptanmamasına karşılık düzeylerde artma eğilimi gözlenmiştir. Hasta grupları karşılaştırıldığında, allerjik astımda CCR3 + ve CCR4 + yardımcı T hücrelerinin uyarım sonrasında CD4 + CXCR3 + hücrelere kıyasla daha fazla IL-10 içerdikleri; allerjik astımda uyarımsız CD4 + CCR4 + hücrelerin IFN-g seviyelerinin; allerjik olmayan astımlılarda ise IL-10 içeriğinin yüksek olduğu saptanmıştır. Çalışmamız astım patogenezinde T hücrelerinin önemli rolünü göstermekle beraber, hastalık gelişiminin sadece Tip 1 ve 2 paradigması kullanılarak açıklanamayacağını ortaya koymaktadır. Anahtar Kelimeler: Astım, Allerji, Kemokin, Sitokin, Th1/Th2 Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje No: 25996

16 xv ABSTRACT Cevhertas L. Chemokine expression and cytokines on T cells in allergic asthma. Istanbul University, Institute of Health Science, Institute for Experimental Medicine, Immunology Department, Msc Thesis. Istanbul T cell subgroups are known to play important roles in pathogenesis of allergic and nonallergic asthma. The study group consisted of allergic (n:4, mean age 47,2±8,6) and nonallergic (n:5, mean age 47,25±10,3) patients with asthma diagnosed according to GINA criteria (disease duration 1 year, FEV1<80%, resistant to moderate-high dose inhaled steroids/long acting beta agonists; nonsmokers or quitted smoking at least 6 months ago after 10 years smoking). In this study the expression of surface markers including CD4, CD8, CCR3, CCR4, CXCR3 and intracytoplasmic cytokines (IFN-g, IL-4 and IL-10) of PBMCs in stimulated (PMA/ionomicin) and unstimulated conditions in both groups were investigated by flow cytometry. Stimulated Th cells increased their CXCR3 + IFN-g, CXCR3 + IL-4, CCR3 + IFN-g, CCR3 + IL-4, CCR3 + IL-10, CCR4 + IL- 10 expressions in allergic asthma; but CXCR3 + IFN-g, CXCR3 + IL-4, CXCR3 + IL-10, CCR3 + IFN-g, CCR3 + IL-4 and CCR3 + IL-10 in non-allergic asthma. Tc cells in allergic asthma expressed higher CCR3 + IFN-g, CCR3 + IL-4, CCR3 + IL-10, CCR4 + IL-4, CCR4 + IL-10 after stimulation. CD8 + CXCR3 + IFN-g and CD8 + CXCR3 + IL-10 increased in non-allergic asthma under the same stimulation. In our study T cells tended to elevate their intracellular cytokine levels in all groups under both conditions. Comparing allergic and non-allergic asthma patients, CCR3 + and CCR4 + Type 2 Th cells produced higher amounts of IL-10 compared to Type 1 CD4 + CXCR3 + cells in allergic asthma. CD4 + CCR4 + cells expressed higher IFN-g and IL-10 without stimulation in allergic and non-allergic asthma respectively. In summary, our results indicate the role of T cells in pathogenesis of allergic/nonallergic asthma, but also the complexity of disease which can not be explained by using only Th1/Th2 paradigma. Key Words: Asthma, Allergy, Chemokine receptors, Cytokine, Th1/Th2 The present work was supported by the Research Fund of Istanbul University. Project No: 25996

17 1. GİRİŞ VE AMAÇ Astım dünya genelinde yaklaşık 300 milyon kişiyi etkileyen hava yollarının kronik inflamatuvar bir hastalığıdır. Hava yolu inflamasyonunun astım patogenezine katkısı olduğu bilinmekle beraber, inflamasyon ve hava yolu aşırı duyarlılığı (airway hyperresponsiveness, AHR) arasındaki ilişki henüz tamamen aydınlatılamamıştır [1]. Astımlı çoğu hasta nefes yolu ile alınan anti-inflamatuvar kortikosteroid tedavisine yanıt verir. Ancak, hastaların % 5-10 luk bir kısmı çoğunlukla uzun süreli agonist ve diğer kontrol nitelikli terapilere ilaveten kortikosteroid tedavisine rağmen devam eden astım semptomları göstermektedir. Bu hastalar ağır veya terapi-dirençli astmatikler olarak farklı fenotiplere sahip heterojen bir hasta grubunu oluşturmaktadır [2]. Hava yolunun yapısal ve inflamatuvar hücrelerin katıldığı kronik inflamasyon ve bronş aşırı duyarlılığı, astımın temel özelliklerindendir. Astımla ilişkili çok sayıda medyatör mevcut olup, bu mediyatörler hava yollarındaki karmaşık inflamasyonu yönetirler. Astım patogenezinde rol alan anahtar medyatörler kemokinler ve sisteinil lökotrienlerdir [3]. Kemokinler, inflamatuvar hücreleri alevlenen dokuya çekerek immün yanıtı yönetirler [4]. Pek çok araştırma farklı T hücre alt gruplarının kendilerine özgü kemokin reseptörleri eksprese ettiklerini göstermiştir [5]. Yardımcı T hücresi 1 (Th1) ve sitotoksik T hücresi 1 (Tc1) CXCR3 reseptörünü eksprese ederken, Th2 ve Tc2 grubu CCR3 ve CCR4 moleküllerini seçici olarak eksprese eder. Astmatik hastalar antijene maruz kaldıklarında CCR4 eksprese eden hücrelerin akciğerde kümeleştiği, geç-faz allerjik reaksiyonlarda CCR4 ligandlarının arttığı, CCR4 ün antijen-spesifik Th2 hücreleri allerjik inflamasyon bölgesine çektiği yapılan çalışmalarla gösterilmiştir [5]. Astım modeli oluşturulan farelerde, CCR4, CCR8 ve CXCR3 ligandlarının allerjene maruz bırakıldıktan sonra akciğer ve bronkoalveolar lavaj içinde (BAL) arttığı bulunmuştur [6]. T lenfositler CD4 ve CD8 T hücreler olarak iki ana gruba ayrılır. Sitokin profillerine bakıldığında; CD4 yardımcı T hücreler Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, CD8 sitotoksik T hücreler ise Tc1, Tc2 ve Tcreg (Sitotoksik T regülatör hücreler) alt

18 2 gruplarına ayrılmaktadır [7]. Th1 hücreleri hücresel immün yanıta teşvik ederken; Th2 tipi hücrelerin allerjik yanıtları desteklediği gösterilmiştir. Th1 ve Tc1 hücreleri baskın olarak interferon gamma (IFN-γ) üretiminden sorumludur. Th2 hücreleri, interlökin (IL)-4, IL-5, IL-9 ve IL-13 üretiminden sorumlu olup, B hücrelerinden allerjene özgü immünoglobülin (Ig) E üretimi, eozinofil oluşumu ve birikimi, mukus üretimi ve düz kas kasılması gibi çeşitli efektör ve düzenleyici mekanizmaları tetikler [8]. İmmün sistemi baskılayıcı fonksiyonlara sahip IL-10 salgılayan, başka bir T hücre alt grubu olan T regülatör hücrelerinin (Treg) allerjik yanıtları baskılayabildiği bilinmektedir [8, 9]. Tc1 hücrelerin inflamasyonu hafifletebilme yeteneğine sahip oldukları ve hava yolu aşırı yanıtını baskıladığı, Tc2 hücrelerin astımda üstün oldukları ve uygunsuz immün yanıtları arttırabilecekleri kabul edilmiştir. Hem insan hem de hayvan modelleri üzerindeki çalışmalar, astımlı deneklerin akciğerlerinde Tc2 hücrelerin hastalık gelişimine neden olabileceği gösterilmiştir [10]. Bu çalışmada esas olarak nonallerjik ve allerjik astımda T hücreleri üzerindeki olası kemokin reseptör ekspresyon farklılıklarının ve salgıladıkları sitokinler arasındaki ilişkinin gösterilmesi amaçlanmıştır. Yardımcı ve sitotoksik T hücrelerinde CXCR3, CCR3 ve CCR4 kemokin reseptör ekspresyonlarının IFN-γ, IL-4 ve IL-10 sitokin üretimlerine göre değerlendirilmesi ve hastalıkla olan ilişkilerinin ortaya çıkarılması amaçlanmıştır. Özellikle astmatik süreçte inflamatuvar hücrelerin hava yollarına göçünü azaltmak üzere çeşitli çalışmalar yürütülmektedir. Astım tedavisi için inflamatuvar hücre trafiğine aracılık eden kemokin reseptörlerinin hedef alınması araştırılan alternatif bir yolaktır. İnsan astım patogenezini anlayabilmek ve tedavi edebilmek amacıyla yürütülen pek çok çalışmanın hayvan modelinde yapılması ve insan çalışmalarının sayıca azlığı araştırmanın önemini vurgulamaktadır.

19 3 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Astım Tanım ve Sınıflandırma Astım, alt hava yollarının kronik inflamasyonu ile karakterize zaman içinde ağırlığı ve sıklığı değişen hırıltı/hışıltı (wheezing), öksürük, göğüste baskı hissi ve nefes darlığı semptomlarının görüldüğü, değişken hava yolu darlığı saptanan heterojen bir hastalıktır [11]. Astım çok sayıda çevresel faktörün, 100 den fazla minör ve majör duyarlı genin kombinasyonunun neden olduğu, kişiye özgü özellik gösteren ve bir çok farklı formu veya fenotipi bulunan bir hastalıktır [11]. Severe Asthma Research Program (SARP) klinik küme analizi (cluster analysis) yaparak, astım alt fenotiplerini erken başlangıçlı allerjik astım, geç başlangıçlı şiddetli astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı niteliklerine sahip şiddetli astım olarak tanımlamıştır [12]. Yapılan başka bir çalışmada dört farklı astım alt fenotipi tanımlanarak; hastalığın şiddet yelpazesini minimal/eozinofil baskın sputum inflamasyonlu hafif-orta allerjik astım ve nötrofil baskın/karışık granülosit inflamasyonlu orta-ağır astım şeklinde tarif etmektedir [12]. Eozinofilik astım patolojik açıdan taban zarının incelmesi ve farmakolojik yönden kortikosteroidlere duyarlılık ile ilişkilendirilen farklı bir astım fenotipidir. Buna karşın; nötrofilik astım, ağır astım hastalarında görülmekle beraber nispeten kortikosteroid dirençlidir [13] Belirtiler Astımın klinik belirtileri ve semptomları hastadan hastaya değişkenlik gösterir [13]. Kronik hava yolu inflamasyonu ve ilişkili bronş aşırı duyarlılığı özellikle geceyarısı veya sabaha karşı hırıltı/hışıltılı solunum, nefes darlığı, göğüste sıkışıklık ve öksürük nöbetlerine yol açar. Bu ataklar genellikle değişen derecede hava yolu obstrüksiyonu ile birlikte olup, sıklıkla tedaviyle veya kendiliğinden düzelmektedir [3].

20 Sıklık - Epidemiyoloji Dünya Sağlık Örgütü (The World Health Organization, WHO) dünya çapında 300 milyon kişinin astımdan etkilendiğini öngörmektedir. Ülkemiz için bu rakam yaklaşık 3,5 milyon kişiye tekabül etmektedir [3]. Astım, çocuklar arasındaki en yaygın kronik hastalık olup, yılda çocuğun ölümünden sorumludur. Görülme sıklığı dünya genelinde % 7-10 olmasına rağmen, global prevalansında bölgesel eşitsizlik mevcuttur. Gelişmiş ve batılılaşmış ülkelerde, gelişmekte olan ülkelere göre daha hızlı bir artış göstermektedir [14]. Zengin toplumlarda daha yaygın olan bu hastalık neredeyse her 10 çocuktan ve her 12 yetişkinden birini etkiler [15] ve kadınlarda daha yaygın görülür Etiyoloji Astım ve allerjik hastalıkların etiyolojisi oldukça kompleks olmakla beraber bileşenleri genetik ve çevresel etmenlerdir [16]. Fizyopatogenezi halen tam olarak bilinmeyen astımın gelişiminde kişisel faktörler, poligenik geçişli genetik yatkınlık ve çevresel maruziyetlerin etiyolojide birlikte rol aldığı düşünülmektedir [17]. Hastalığın oluşumunda rol oynadığı düşünülen etmenler şu başlıklar altında toplanabilir: Kişisel Faktörler a. Genetik Anne ve babadan birinin astımlı olması durumunda çocukta astım görülme riski % a yükselmekte, ebeveynlerin her ikisinin de astımlı olması durumunda bu risk % e ulaşmaktadır [3]. Tüm genom ilişkilendirme çalışmaları (Genom Genomewide association studies, GWAS) IL1RL1, TSLP ve IL-33 gibi farklı gen lokuslarındaki polimorfizmlerin astım ile olan ilişkisini, Avrupa toplumunda yaptıkları başka bir çalışmada ise; ILR1RL1, WDR36 ve IL-33 genetik varyantlarının eozinofillerin sayısını ve aynı zamanda astım ve allerjik astım ile bağlantısını göstermiştir [18, 19]. b. Obezite Obezite astım için bir risk faktörüdür. Astım vücut kitle indeksi >30 kg/m 2 olan bireylerde daha sık gözlenmekte ve kontrolü daha güç olmaktadır [20, 21]. Obezitenin genetik duyarlılık, hormonal ve nörojenik etkilerine ilave olarak akciğer üzerinden solunum yolu fonksiyonlarını etkilediği, ayrıca adipoz dokudan IL-6, tümör nekroz

21 5 faktör (TNF) ve eotaksine ilaveten çeşitli proinflamatuvar sitokinlerin ve leptin gibi çeşitli medyatörlerin salınımına sebep olduğu gösterilmiştir [3, 22]. c. Cinsiyet Erkek cinsiyet çocukluk dönemi için önemli bir risk faktörüdür. Yaş ilerledikçe astım kadınlarda daha sık görülür hale gelmektedir [23] Çevresel Faktörler Çevre faktörü, ana rahminde başlayarak yaşın ilerlemesine paralel olarak etkisini sürdürür ve astımın gelişimini, klinik fenotipini ve semptomların şiddetini belirler [16]. a. Allerjenler Allerjen teması ve çocuklardaki duyarlanma arasındaki ilişkinin allerjene, doz ve maruziyet dönemine, yaş ve genetik faktörlere bağlı olduğu düşünülmektedir [3]. Hamam böceği, kedi ve köpek tüyü, Aspergillus cinsi küfler, çeşitli ev tozu akarları ve polenler astım gelişimi için risk oluşturan allerjenlerdir [3, 24]. b. İnfeksiyonlar Yapılan son araştırmalarda elde edilen veriler astım gelişimi ve alevlenmesinde solunum yolu virüslerinin rolü olduğunu desteklemektedir. Virüslerin indüklediği mekanizmanın yetersiz IFN-γ ve IL-10 yanıtı ve artmış IL-4, IL-5 ve IL-10 yanıtı ile ilişkili olduğu görülmüştür. Özellikle insan rhino virüs (HRV) varlığında duyarlı bireylerin aşılandıktan sonra astımlarının indüklendiği gözlenmiştir [25]. Ayrıca tek zincir RNA virüsü olan respiratory syncytial virus (RSV) ün allerjik astım riskini arttırdığı uzun dönem süren bir çalışma ile gösterilmiştir. Bebeklik döneminde geçirilen akut RSV infeksiyonlu 47 çocuk, 18 yaşına kadar takip edilmiş; hastalarda astım görülüş sıklığının ve allerjene duyarlılığın arttığı gözlemlenmiştir [26]. c. Meslek astımına neden olan faktörler İzosiyanat gibi yüksek derecede reaktif küçük moleküller, immünojen olarak bilinen ve hava yolu yanıtını etkileyen platinyum tuzu, nikel tuzu gibi irritanlar ile IgE yapımını uyaran un, kahve tozu vb. kompleks bitki ve hayvan ürünleri gibi üç yüzden fazla maddenin mesleksel astım ile ilişkili olduğu bulunmuştur [3]. d. Sigara

22 6 Sigara kullanımı (aktif) ve/veya dumanına maruz kalma astımlı kişilerin akciğer fonksiyon bozukluklarının şiddetlenmesine, astım semptomları ve hastalığın ciddiyetinde artışa yol açmaktadır [23]. Tütün dumanı inhale tedavi ve sistemik steroidlerin etkilerinin azalmasına ve astım kontrolününün zorlaşmasına neden olmaktadır [3]. e. Hava kirliliği (İç ve Dış Ortam) Hava kirliliğine çevresel maruziyet sonucu oksidatif stres oluşur. Hava kirliliği komponentlerinden gaz ve partiküler maddelere (particulate matters, PMs) ilaveten krom, demir, mangan, vanadyum ve bakır gibi değişken metallerin de reaktif oksijen ürünlerinin doğrudan uyarılması ile astımı indüklediği bilinmektedir. Oksidatif stresin çok sayıda etkileri olduğu ve inflamatuvar hücrelerin aktivasyonu, proinflamatuvar sitokin ve medyatörlerin salınımı ile ilişkili olduğu gösterilmiştir [27]. Hava kirliliğinin olduğu ortamda büyüyen çocuklarda akciğer gelişiminin kısıtlı olduğu görülmüştür; fakat bu durumla astım arasında olası net bir ilişki gösterilememiştir [23]. Diğer yandan, astıma bağlı hastahane başvuruları ve astım alevlenmeleri ile hava kirliliği düzeylerindeki artışlar arasında ilişki olduğu bir çok çalışmada gözlenmiştir [3, 23]. f. Diyet Çocuk ve erişkinlerde sürdürülen epidemiyolojik çalışmalardan bir kaçı besinsel antioksidan ve lipidlerin, astım ve atopik hastalık parametreleri ile ilişkili olduğunu bildirmiştir [3, 28]. İnek sütü veya soya proteini içeren hazır mamalar ile beslenen çocuklarda, emzirilen çocuklara göre daha yüksek oranlarda wheezing ortaya çıktığı bulunmuştur [29]. Artmış oranlarda hazır gıda ile beslenme, düşük antioksidan (meyve, sebze) alımı, margarin ve bitkisel yağlarda bulunan artmış n-6 çoklu doymamış yağ asidi (Polyunsaturated fatty acid, PUFA) ve yetersiz oranlarda n-3 PUFA alımlarının son zamanlarda astım ve atopik hastalıklarda görülen artışa katkıda bulunduğu ileri sürülmektedir [28] Epigenetik Gen ekspresyonlarının epigenetik kontrolü immün sistemin gelişim, farklılaşma ve regülasyonunda önemlidir. Kalıtsal ya da kazanılmış epigenetik mekanizmalar genler

23 7 ve çevresel etkileşimin bir sonucudur [17]. Astımın genetik faktörü, doğum öncesi (prenatal) ve erken dönemde tütün, sigara, endotoksin ve hava kirliliği gibi etmenlere maruz kalınması ile iç içe geçerek astımı etkiler [16]. DNA metilasyonu, histon modifikasyonu ve mirna ile yapılan genetik modifikasyonlar; astım gelişimi ile ilişkili yolakları, ilaveten T efektör ve regülatör genetik yolaklarındaki transkripsiyonel aktiviteyi etkileyebilmektedir [16]. Aspirin ile ilişkili allerjik astım ve hırıltı/hışıltılı ısrarcı astım ile ilişkili genlerde DNA da hipo- ve hipermetilasyon alanları saptanmıştır [17] Tanı Kriterleri Astımda ortaya çıkan bir çok semptomun (öksürük, dispne, göğüste baskı hissi ve wheezing) zaman içinde ağırlık ve sıklığının değişmesi çeşitli etkenlerle ortaya çıkması öyküde tanı koydurucu olarak kabul edilir. Spirometri ile hava yolu darlığının varlığı ve bunun düzelebilir olduğunun gösterilmesi veya pozitif metakolin provokasyon testi ile tanı konulmaktadır [25]. Astım klinikte iki sınıf olarak tanımlanmıştır. Çoğu çocuk ve yetişkinlerin tahminen % 50 si allerjik astımdır. Allerjik astım hastanın duyarlı madde ile yakınmalarının artması yanında ev tozu akarları, evcil hayvan tüyleri, mantar sporları, bitki veya ağaç polenleri ve hamam böceği gibi yaygın olarak solunan veya yutularak vücuda alınan allerjenler olan (lipo)proteinlere karşı pozitif deri-prik testi ve/veya serum IgE antikorlarının varlığı ile eş zamanlı allerjik duyarlılık ile tanımlanır [15]. Bunun dışında kalan kokular, viral infeksiyonlar, sigara dumanı, psikolojik sebepler gibi tetikçilerle oluşan diğer grup ise non-allerjik olarak isimlendirilmektedir. Çoğu kronik inflamatuvar hastalıkta olduğu gibi astımı sadece iki klinik sınıfa ayırmak hastalığı basitleştirmektir. Herbiri ayrı patolojiye sahip farklı astım fenotipleri, astım endotipleri (alt grup) olarak sınıflandırılmaktadır Klinik Seyir Hastalık kişiye özgü değişken klinik tablo ve dereceler göstermektedir [3]. Güncel astım tedavisi semptomların kontrol ve ciddiyeti temel alınarak uygulanan, inhale kortikosteroid içeren yaklaşımlardır [25]. Çoğu hasta inhalasyon terapiden fayda sağlarken, daha şiddetli astıma sahip hastalar tedaviye bağlı kalmayı başaramayarak kontrol edilemez olgular olarak kalır [30]. İnflamasyonun ve bronş lümeninin daralmasının klinik sonucu olan hava akışı darlığı, özellikle nötrofil baskın olanlara

24 8 nazaran eozinofil baskın astım fenotipindeki hastalarda glukokortikoidler kullanıldığında genellikle geriye döner [25]. Kısa astım atakları genellikle β2 agonistlerin inhalasyonuna iyi tepki verirken, ısrarcı astım kortikosteroid inhalasyonuna yanıt verir. Daha şiddetli veya tedaviye cevap vermeyen durumlarda, ek olarak lökotrien-antagonistleri ve antikolinerjik ilaçlar kullanılabilmektedir [30]. Kortikosteroidler, hücre membranını geçerek sitoplazmadaki glukokortikoid reseptörüne bağlanarak değişik yolakları tetiklemektedir. Kortikosteroidler nükleer faktör-kappa B (nuclear factor-kappa B, NF-κB) ve aktivatör protein-1 (activator protein-1, AP-1) gibi proinflamatuvar proteinlerin transkripsiyonunu baskılayarak veya proinflamatuvar genleri içeren MAPK yolağının inhibisyonunu sağlamak üzere mitojenle aktive protein kinaz fosfataz-1 (mitogen-activated protein kinase phosphatase- 1, MKP-1) gibi genlerin transkripsiyonunu sağlayarak etki gösterir [25]. Ancak; sitokinlerin immün aracılı disregülasyonu ya da ilaçların immün aracılı glukokortikoid reseptörüne bağlanmasında veya nükleusa girmesinde bir defekt mevcut ise astımın tedavisi zorlaşmaktadır [31]. Günlük dozu 20 mg prednizole eşdeğer olmak üzere bir hafta uygulanan oral steroid tedavisine rağmen FEV1 in % 15 yükselmemesi, klinikte steroide dirençli astım olarak tanımlanır. Astmatik hastalar % 0.01 oranında bu alt sınıfa dahildir Allerjik Astım Bu hastalarının çoğunluğunda atopi mevcuttur. Allerjik astımın ayırıcı özelliği; eozinofillerin bronşiyal mukozaya infiltrasyonu ve devamlı olmasıdır [13]. Bununla birlikte hastalar, yüksek düzeylerde bulunan allerjen spesifik IgE yüksekliği ile ilişkilendirilmektedir [32]. Sayıca artmış eozinofiller kanda, havayolu mukozasında ve bronkoalveolar lavaj sıvısında bulunabilmektedir [13] Non-Allerjik Astım Allerjik olmayan astım çoğunlukla hayatın ilerleyen döneminde gelişir. Serumda allerjenlere spesifik IgE reaksiyonu görülmez. Deri testleri negatiftir [15]. Astımın allerjik olmayan biçimi; sigara dumanı, dizel partikülleri, ozon gibi hava kirliliğine neden olan maddeler veya viral infeksiyonlar, aspirin, egzersiz, obezite veya stres gibi faktörler tarafından nöral mekanizmaların C lifleri ve non-adrenerjik non-kolinerjik mekanizmaların tetiklenmesi ile başlar, bunlar da immün sistem hücrelerini tetikleyerek

25 9 Th2 baskın veya baskın olmayan eozinofilik veya nötrofilik veya hücreden fakir inflamasyona neden olur [11] Astım ve Bağışıklık Sistemi İlişkisi Oldukça heterojen bir hastalık olan astımın farklı patojenik mekanizmalara sahip birçok klinik formu veya fenotipi bulunmaktadır. Bu mekanizmalar allerjik yolaklar (edinsel immünite) ve allerjene maruziyet, viral infeksiyon, oksidatif stres ile beraber eozinofiller, bazofiller, Tip 2 yardımcı T hücreler (Th2), dendritik hücreler (DH), nötrofiller, doğal öldürücü T hücreler (NKT), doğal lenfoid hücreler (ILCs), epitelyal hücreler, Th17 hücreler ve makrofajları içeren geniş bir hücre grubu tarafından indüklenen yolaklardır [11]. Allerjik astımlı hastaların hava yollarına, hücre yüzeylerinde FcεRI reseptörlerine bağlı allerjen spesifik IgE bulunan mast hücreleri infiltre olur. Bu reseptörlerin allerjen tarafından birbirlerine çapraz bağlanması, mast hücrelerinin degranülasyonuna ve inflamatuvar medyatörler olan histamin, lipid medyatörler, enzimler, sitokin ve büyüme faktörlerinin salınmasına neden olur [32]. Aeroallerjen ve virüslere beraber maruz kalma, inflamatuvar yolakları tetikler. IFN ile ilişkili ilk sinyaller, infekte olmuş hava yolu mukozasında erken dönemde oluşturularak, astımda inflamasyonu şiddetlendirmektedir. Bu sinyaller yerleşik dendritik hücreler üzerindeki FcεRI ekspresyonunu arttırmaktadır. Ayrıca kemik iliğine Th2 ve IFN sinyallerinin beraber translokasyonu, akciğerde yerleşik alternatif olarak aktive olmuş doku tamiri ve yeniden düzenlenmeyle ilişkili makrofajların üretimiyle sonuçlanmaktadır [33] T hücreler Edinsel immünitenin hücreleri olan lenfositler, vücutta klonal ekspresyona sahip dağılmış antijen reseptörleri bulunan ve her biri spesifik, farklı antijenik etmeni tanıyan tek hücre grubudur. Sağlıklı bir erişkinde toplam lenfosit sayısı yaklaşık dir. Bunların % 2 si kanda, % 10 u kemik iliği içerisinde, % 15 i gastrointestinal ve solunum yolları içerisindeki mukozal lenfoid dokularda, % 65 i ise lenfoid organlarda (çoğunlukla lenf düğümleri ve dalak) bulunur [34]. En büyük T hücre alt grupları αβ antijen reseptörünü eksprese eden yardımcı CD4 + T lenfositleri ve CD8 + sitotoksik T lenfositleridir. CD4 + regülatör T hücreler ise,

26 10 αβ reseptör eksprese eden üçüncü özgün T hücre alt grubudur. CD4 + yardımcı T lenfositler CD3 +, CD4 +, CD8 - fenotipik işaretleyicilere sahip olup, insanda kanda, lenf düğümünde, hem de dalaktaki tüm lenfositlerin yarısı oranında bulunurken, CD3 +, CD8 +, CD4 - özelliğindeki sitotoksik T lenfositler bu organlarda sırasıyla % 20-25, % ve % oranında görülmektedir. En yaygın fenotipi CD3 + CD4 + CD25 + olan ancak farklı fenotipleri mevcut olan Treg ler kanda nadir bulunurken, lenf düğümlerinde ve dalakta % 10 oranında bulunmaktadır. Hücresel bağışıklığın aracısı olan T lenfositlerin öncülleri, kemik iliğinden kaynaklanır, timusa göç eder ve olgunlaşır. Antijenle karşılaşmayan naif lenfositler 1-3 ay içerisinde ölmektedir [34]. Antijenin uyarması ile aktive olan naif T hücreleri, efektör hale geçerek ikincil lenf dokularından lenf direnajı vasıtasıyla çıkarak sistemik kana katılır. Dolaşımdaki efektör T hücrelerin, periferik dokulardan infeksiyonlu bölgelere göçü; selektin-, integrin- ve kemokin bağımlı çok basamaklı bir süreçtir [34]. Farklılaşmış efektör hücre alt gruplarını; ürettikleri sitokinler, eksprese ettikleri transkripsiyonel faktörler ve sitokin gen lokuslarındaki epigenetik değişiklikler belirlemektedir [35]. Naif CD4 + T hücreler çevresel sitokinler eşliğinde dendritik hücreler tarafından antijen-spesifik uyarımdan sonra Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, foliküler yardımcı T (Tfh) ve Treg lere farklılaşmaktadır [36]. Bu CD4 + T hücre alt grupları farklı sitokinler üreterek patojenlerin temizlenmesini, otoimmünitenin kontrolünü, immün dengenin kurulmasını ve tümörlere karşı immün yanıt oluşumunu sağlayarak edinsel immüniteye katkıda bulunmaktadır [36, 37]. CD8 + T hücre farklılaşma süreci antijenin dozu, eş-uyaran molekül ve sitokinler tarafından yönetilmektedir. Bu çevresel başlatıcıların transkripsiyon faktörlerini uyarması ile CD8 + T hücreler Tc1, Tc2, Tc9, Tc17 veya CD8 + regülatör T hücreler olmak üzere farklılaşmaktadır [38]. CD4 + Th1 farklılaşmasına benzer olarak IFN-γ üreten ve ana kemokin reseptörleri CCR5 ve CXCR3 olan hücreler Tip 1 sitotoksik T (Tc1) hücreleri olarak isimlendirilmektedir. Th2 hücrelere benzer şekilde IL-4, IL-5 ve IL-13 gibi Tip 2 sitokinleri salgılayan ve CCR4 eksprese eden CD8 + T hücreler ise Tip 2 sitotoksik T hücreleri (Tc2) olarak adlandırılmaktadır [39, 40]. Son bahsedilen gruptaki hücreler Tc1 hücrelerle kıyaslandıklarında azalmış sitotoksik aktivite gösterirler [40]. Th1 aracılı yanıtı bastıran Tc9 hücreler, allerjik süreçte Th2 ilişkili immüniteyi

27 11 arttırmakta ve Th9 hücrelerle benzer olarak IL-9 bağımlı güçlü bir antitümör yanıt oluşturmaktadır [38]. Farklı bir alt grup olarak; CCR6 ve/veya CD161 eksprese eden ve IL-17 salgılayan Tc17 hücreler proinflamatuvar özelliklere sahiptir. [39]. IL-10 üreten CD8 + T hücrelerin ise regülatör fonksiyonlara sahip oldukları yapılan çalışmalarla tanımlanmıştır [39]. Sitotoksik T lenfositlerin proliferasyonu, farklılaşması ve fonksiyonel hale geçmesi; bir çok hücre içi patojen, virüs ve bakterilere karşı bağışıklığı sağlamaktadır [36]. Bu hücreler aynı zamanda otoimmünite ve allerjik hastalıklar gibi patolojik süreçlerin düzenlenmesine katkıda bulunmaktadır [38] T hücre Astım İlişkisi Son zamanlarda yapılan araştırmalar klinik astımın Th1, Th2, Th9 ve Th17 hücrelerin katıldığı oldukça karışık bir T yardımcı hücre profiline sahip olduğunu göstermiştir [41, 42]. Hayvan modellerinde yapılan çalışmalar sonucu CD8 + T hücrelerin, astımın karakteristik özellikleri olan AHR ve allerjik akciğer inflamasyonunda kritik rol oynadıklarını, CD4 + T hücrelere ilaveten CD8 + T hücrelerin de Th2 sitokinleri yapabildikleri, aynı zamanda allerjik inflamasyon ve hava yolu duyarlılığı içinde de rol oynadıkları gösterilmiştir [43, 44]. Akciğerde bulunan CD8 + T hücre sayılarının, CD4 + T hücrelerle benzer oldukları ve son zamanlarda bu hücrelerin astıma bağlı ölümlerde rol oynadıkları kanıtlanmıştır [43] Sitokinler ve Astım İlişkisi Sitokinler hücrelerin sinyalizasyonunda önemli immün modülatör proteinlerdir. Sitokinler, reseptör alt ünitelerinin dimerizasyonu aracılığı ile hücre içi JAK/STAT aktivasyonunu başlatarak hücrelerin ana fonksiyonları olan farklılaşma, çoğalma ve apoptozunu düzenlemektedir [45]. Sitokinler immün sistem hücrelerinden makrofaj, B ve T lenfositleri ve bunlara ilaveten pek çok hücre tipi tarafından üretilip, salgılanmaktadır [9]. Sitokinlerin esas görevi allerjen, virüs ve çevresel kirleticilere karşı oluşan inflamatuvar, immün ve rejeneratif yanıtın kontrolüdür [46]. Hücreler arası etkileşimlerde kritik rol oynayan sitokinler; allerjik, inflamatuvar ve otoimmün hastalıkların immünolojik mekanizmalarını yönetirler.

28 12 Astımın koordinasyonu geniş bir sitokin ağı tarafından sağlanmaktadır [9]. Th2 hücreler tarafından üretilen proinflamatuvar sitokinlerin, kronik inflamasyonda IgE disregülasyonu (IL-4, IL-13), eozinofili (IL-3, IL-5), mast hücre proliferasyonu (IL-3, IL-9), IgE izotip dönüşümü (IL-4, IL-13), mukus hipersekresyonu ve hava yolu aşırı duyarlılığının regülasyonu olmak üzere önemli rolleri bulunur. IL-10 proinflamatuvar sitokin sentezini engelleyen bir diğer sitokindir [47] İnterlökin-4 (IL-4) IL-4, klasik 4 adet α-heliks demetine sahip bir sitokin olup, birincil bağlayıcı zinciri IL-4Rα dır [45]. Tip 1 hematopoietin süper ailesine ait 17kDa luk monomerik bir glikoprotein olmakla beraber Th2 hücre, NKT hücre, mast hücre ve bazofiller tarafından salgılanmaktadır [48]. IL-4, Th2 hücre gelişimsel belirleyicisi, T/B hücre büyüme faktörü, IgE/IgG1 izotip dönüşümü tetikleyicisi ve kas hücre kasılması indükleyicisi olmak üzere çeşitli fonksiyonlara sahiptir [49]. IL-4 astım patofizyolojisine, Th2 hücre farklılaşması ve genişlemesi, B hücrelerden IgE sentezi için izotip dönüşümü, eozinofillerin katılımı ile mast hücrelerin gelişimini indükleyerek katkıda bulunur. IL-4 ayrıca kollajen ve fibronektin yapımını arttırarak hava yolu yeniden düzenlenmesinde de görev almaktadır [50] Interlökin 10 (IL-10) IL-10 bir homodimer oluşturarak IL-10R1 ve IL-10R2 reseptör kompleksi üzerinden biyolojik fonksiyonunu gerçekleştiren bir sitokindir [51]. Uzun bir süre boyunca güçlü ve geniş spektrumlu antiinflamatuvar olarak bilinen IL-10 nun çeşitli infeksiyonlarda, inflamasyon ve kanserde rol oynadığı çeşitli araştırmalar sayesinde belirlenmiştir [52]. Tip 2 sitokinlerden biri olan IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26, IL-28 ve IL-29 gibi sitokinleri içeren ailenin kurucu üyesidir [51]. Başlıca T hücre IL-10 kaynakları Th2 hücreler, Tr1 olarak tanımlanan regülatör T hücre alt grubu, Th1 ve Th17 hücrelerdir. Aynı zamanda CD8 + T hücreler de IL-10 üretmektedir. Monositler, uygun uyarımı alan makrofajlar ile DH lerin bazı alt grupları da diğer önemli IL-10 üreten hücrelerdir [52]. B hücreler ile eozinofil ve mast hücreleri de potansiyel IL-10

29 13 üreten hücreler arasında bulunmaktadır [53, 54]. Keratinositler, epitelyal hücreler ve hatta tümör hücreleri immün olmayan (non-immün) IL-10 kaynaklarındandır [55, 56]. Güncel çalışmalar, Th1 ve Th17 hücrelerin de IL-10 üretebilme yetenekleri olduğunu, hatta infeksiyöz hastalıklar sırasında önemli bir IL-10 kaynağı olabildiklerini ortaya koymuştur [57, 58]. Ancak; bu homeostatik mekanizmanın kontrolsüz T hücre aktivasyonunu engellemek adına oluşabileceği kuvvetle muhtemeldir [52]. Birçok biyoaktivitesi mevcut olan IL-10 antijen sunumunda kuvvetli bir inhibitördür. MHC sınıf II (major histocompatibility complex class II) ekspresyonu ile birlikte eş-uyaran moleküller olan CD80 ve CD86 ekspresyon artışını inhibe etmektedir. Birçok immüno-inhibitör özellikleri bulunan IL-10 sitokininin; antijen sunan hücreler üzerine olan etkileri Th1 ilişkili sitokinler olan IL-2 ve IFN-γ ile Th2 ilişkili IL-4 ve IL- 5 in yapımının engellenmesi şeklinde özetlenebilmektedir [52]. İmmün yanıtları baskılamasının yanı sıra IL-10, bir büyüme faktörü gibi davranarak, CD8 + T hücrelerin belirli alt gruplarının sayıca çoğalmalarını uyarmaktadır [52]. Eş-uyaran olarak B hücre aktivasyonu ve izotip değişimine katkıda bulunan IL-10, aynı zamanda NK hücrelerin çoğalması ve sitokin yapımında yardımcı uyaran olarak görev almaktadır [59]. Yapılan çalışmalarda sağlıklı ve astmatik olgularda BAL sıvısında IL-10 konsantrasyonları hastalarda daha düşük bulunmuştur [47]. Astımda IL-10 yokluğu, astmatik hava yolu inflamasyonuna katkı sağlayan IL-6, IL-5, IL-4, TNF-α, GM-CSF ve IL-1 gibi proinflamatuvar sitokinlerin devamlı olarak salgılanmasına neden olmaktadır [47] İnterferon- (IFN-γ) Tip II interferonların temsilcisi olan IFN-γ, doğal ve hücre aracılı immün yanıtları düzenleyen önemli bir sitokindir ve homodimer bir yapıya sahiptir [60]. Bu sitokinin aktivitesi IFN-γR1 ve IFN-γR2 genlerinden oluşan 4 adet zincir demetinden meydana gelen reseptör kompleksine bağlanması sonucu ortaya çıkmaktadır [60]. Araştırmalar, IFN-γ nın immün modülasyon, anti-viral yanıt ve anti-tümoral aktivite ile ilişkili genlerin transkripsiyonunu arttırdığını göstermiştir [61]. IFN-γ hem doğal hem de hücre-aracılı immün yanıtların düzenlenmesinde görev alan ana sitokindir [60]. İnsan ve farelerde yapılan kapsamlı çalışmalar, IFN-γ nın

30 14 çoğunlukla NK hücreler, CD8 + T hücreler ve Th1 hücreleri içeren T lenfositler tarafından salındığını göstermiştir [62]. B hücrelerin, NKT hücrelerin ve profesyonel ASH lerin de IFN-γ üretebildikleri bildirilmiştir [60]. Mikroçevreye göre IFN-γ nın pro- veya antiinflamatuvar sitokin olmak üzere çift rolü bulunmaktadır [61]. IFN-γ; makrofajların sitotoksik ve fagositik aktivitelerini, ASH lerde bulunan MHC sınıf I ve sınıf II moleküllerinin yüzey ekspresyonlarını arttırmaktadır [61]. Antiviral aktivitesine ilaveten IFN-γ işlevleri arasında; antijen sunumunun arttırılması, hücre büyümesi ve apoptozu, lökosit trafiği ve lökosit endotel etkileşimi, B hücrelerin antikor izotip dönüşümü [62], Th2 hücre gelişiminin inhibisyonu ve naif CD4 + T lenfositlerinin Th1 yardımcı alt gruba farklılaşmaları [61], CD4 + T hücrelerin Foxp3 ekspresyonuna teşvik edilmesi ve graft toleransı gibi immün düzenleyici mekanizmalar sayılabilmektedir [62]. Astımlı çocuklarda IFN-γ nın serumda sağlıklı kontrollere göre düşük bulunması ve erişkin astmatiklerde serum IFN-γ seviyelerinin akciğer fonksiyonlarındaki düşüş ile olan ilişkisi göz önünde bulundurulduğunda, IFN-γ nın astım patogenezine katkı sağlayabilecek bir sitokin olabileceği düşünülmektedir [63] Kemokinler ve Astım İlişkisi Kemokinler düşük molekül ağırlıklı bir protein ailesinin üyesidir. Esas rolü homeostaz ve inflamasyon sırasında lökosit trafiğini kontrol etmek olan kemokinler, inflamatuvar hücreleri alevlenen dokuya çekerek immün yanıtı yönetmektedir [4, 64]. Bilinen 50 kemokin ve 20 kemokin reseptörü mevcuttur. N-terminal uçtaki sistein kalıntılarının dizilimlerine göre C, CC, CXC ve CX3C şeklinde sınıflandırılmaktadır [65]. Çoğu kemokin reseptörü birçok kemokin ligandına sahiptir [66]. Astım hastalarının hava yollarına infiltre olan lenfosit ve eozinofil popülasyonlarının farklı kemokin reseptör ekspresyonlarının astım patogenezini önemli derecede etkilemesi nedeniyle [44], bu moleküller inflamatuvar hücrelerin hava yollarına akımını azaltmak amacıyla astım tedavisinde yeni hedefler haline gelmiştir.

31 CCR3 Bütün kemokin reseptörleri gibi bir hücre yüzey G-protein-eşlikçi reseptörü (GCPR) olan CCR3, A sınıfının bir alt sınıfı olan rodopsin-benzeri reseptör ailesinin bir üyesidir [65]. Yaklaşık 350 a.a uzunluğundaki reseptör, 7 transmembran burgudan oluşmakta ve 7 hidrofobik bölge içermektedir [65]. CCR3; eozinofil, Th2 lenfositler, bazofil ve mast hücrelerinin yüzeylerinde eksprese edilmektedir [67]. Bu hücrelerin üzerindeki CCR3 ekspresyonu kalıcı veya geçici olarak sitokinler tarafından indüklenebilmektedir [65]. Allerjik hava yolu inflamasyonu oluşturulmuş hayvan modellerinde CCR3 ligandlarının (CCL11/eotaksin ve CCL24) allerjik reaksiyonlarda yükseldiği gösterilmiştir [65, 68]. Bir kemokin reseptörü olan CCR3 ün astım, atopik dermatit ve allerjik rinit gibi allerjik hastalıkların gelişmesinde rol oynadığı düşünülmektedir CCR4 Tercihen Th2 hücrelerin üzerinde eksprese olan CC kemokin reseptörü 4 (CCR4) ve ligandları CCL17 ve CCL22/MDC (önceden bilinen adlarıyla: makrofaj kaynaklı kemokin, timus ve aktivasyonla düzenlenen kemokin) astımda, bronşiyal dokulara T hücre kemotaksisinde önemli rol oynamaktadır [69]. Yüksek düzeyde CCR4 ekspresyonu ilk olarak timusta ve periferik mononükleer hücrelerde (PMNH) gösterilmiştir. Sonraki çalışmalar CCR4 ün Th2 hücreler, Treg ler ve mast hücreler tarafından da eksprese edildiğini ve allerjik hastalıklarda rol oynadığını göstermiştir [70, 71]. In vivo koşullarda allerjik inflamasyon gelişiminde CCR4 ün katkısı CCR4 veya CCR4 ligandlarını nötralize eden antikorlar veya CCR4 geni bozulmuş farede çalışılmıştır [5, 6]. Yapılan çalışmalar allerjik astım olgularında antijene maruziyet sonrasında, CCR4 eksprese eden T hücrelerin akciğerde toplandıklarını göstermiştir [72, 73]. Değişik araştırmalarda astmatik akciğerlerde geç faz reaksiyonları sırasında CCR4 ligandlarının yükseldiği görülmüştür [73, 74]. Astımlı bireylerde yapılan araştırmalar hafif, steroid kullanmayan astım olgularında CCR4 + hücre sayılarının ve CCR4 ligandlarının ekspresyon seviyelerinin allerjene maruziyetten sonra arttığını göstermiştir [69].

32 CXCR3 Özellikle naif T hücrelerin aktivasyonu sonrası yüzeylerinde süratle indüklenen inflamatuvar bir kemokin reseptörüdür. CXCR3, indüklenebilen IFN-γ ligandları CXCL9, CXCL10 ve CXCL11 tarafından aktive olmaktadır [66]. Bu ligandların hem immün yanıtın başlatılmasını hem de periferik T hücre trafiğini indükleyebildikleri gösterilmiştir [75]. Th2 tip hücreler başta olmak üzere, efektör CD8 + T hücreler ve NK, NKT gibi doğal lenfositler üzerinde ekspresyon düzeyi yüksek saptanmıştır [66]. Bunlara ilaveten CXCR3 eksprese eden plazmasitoid DH ler ve B hücre alt gruplarının da lenf düğümü içerisindeki göçlerde rol oynadığı düşünülmektedir [66, 76]. Naif T hücre yüzeyinde bulunan CXCR3 ün, DH lerin indüklediği T hücre aktivasyonunu takiben, ekspresyonunun süratle yükseldiği gözlenmiştir [77]. CXCR3 ligandlarının geçici veya doku spesifik ekspresyon farklılıkları, CXCR3 eksprese eden T hücrelerin lenfoid kompartımandan, yangılı periferik dokuya hareketini yönetmektedir. CXCR3-bağımlı inflamatuvar döngünün, sitotoksik T lenfositlerin periferik dokuya katılımlarına ilaveten oluşumlarının artmasında da olası rolü olduğu düşünülmektedir [66]. In vivo bir çalışmada CXCR3 yoksun (KO) farelerin OVA uyarımı sonrası CD4 + T hücrelerinin akciğere infiltrasyonunda azalma gösterilmiştir [44]. Allerjik astma hastalarında yapılan başka bir çalışmada ise; alınan BAL örneklerinde 24 saatlik allerjen uyarımı sonrasında CD4 + ve CD8 + T hücrelerin kemoatraktan reseptör profillerine bakılmış, hücrelerin CCR6 ve CXCR3 ekspresyonlarının azaldığı, diğer kemokinlerde ise önemli bir değişim olmadığı gösterilmiştir [78].

33 17 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Olgular Çalışmaya dahil edilen hasta grupları İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı tarafından Aralık 2013-Eylül 2014 tarihleri arasında takip edilen allerjik (n: 4; 1 erkek - 3 kadın, ortalama yaş 47,2±8,6) ve nonallerjik (n: 5; 1 erkek - 4 kadın, ortalama yaş 47,25±10,3) astım hastalarından oluşturulmuştur. Allerjik astım grubuna ait heparinize periferik kan örnekleri, İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı'ndan temin edilmiş ve çalışmanın deneysel aşamaları İstanbul Üniversitesi, Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü, İmmünoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı nda gerçekleştirilmiştir Gönüllülerin Araştırmaya Dahil Edilme Kriterleri a yaş aralığındaki GINA 2014 Rehberi ve TTD Astım Tanı ve Tedavi Rehberine uygun olarak en az bir yıl önce astım tanısı almış olmak, b. Orta, yüksek doz inhale steroid ve uzun etkili beta agonist tedavisine rağmen (basamak 4) kontrolün sağlanamamış olması (astım kontrol testi < 20), c. FEV1 değerinin <%80 olması, d. Sigara içmemiş veya 10 yıl altında içip en az 6 ay önce bırakmış olmak Gönüllülerin Araştırmaya Dahil Edilmeme Kriterleri a. Komorbit hastalıklarına veya astıma bağlı olarak son bir ay içerisinde sistemik steroid veya immünosüpresif kullanımı, b. Komorbit hastalıklarda kontrolsüzlük, c. Diyabet veya immün profili etkileyebilecek başka bir hastalık veya hamilelik durumunun bulunması, d. Önceden bilinen bir kanser hikayesi olması, e. Son bir ay içerisinde operasyon geçirilmesi Non - allerjik Astım Non-allerjik astım, allerji ile beraber gözlenmeyen astım fenotipidir. Bu hastaların sputum örneklerinde nötrofilik, eozinofilik veya az sayıda inflamatuvar hücre içeren alt tipleri mevcuttur. Non-allerjik astım olguları Bilgilendirilmiş Gönüllü Olur

34 18 formlarını imzalamalarının ardından çalışmaya dahil edilmiştir (n: 5; 1 erkek - 4 kadın). Bu hastalarda deri prik testleri negatif, inhale kortikosteroidlere tedavi yanıtı ise allerjiklere nazaran düşüktür Allerjik Astım Allerjik astım, en kolay tanı alan astım fenotipidir. Sıklıkla çocukluk çağında ortaya çıkan allerjik astım olgularında geçmiş veya ailesel allerjik hastalık (egzema, allerjik rinit, gıda veya ilaç allerjisi) hikayesi mevcuttur. Tedavi öncesi yapılan sputum testlerinde eozinofilik bir hava yolu inflamasyonu gözlenmektedir. Bu hastalar inhale kortikosteroid tedavisine sıklıkla iyi yanıt vermektedir. Çalışmamıza alınan ve deri prik testleri pozitif olan allerjik astımlı bireylere Bilgilendirilmiş Gönüllü Olur formları imzalatılmıştır (n: 4; 1 erkek - 3 kadın) Deneylerde Kullanılan Kimyasallar PBS (Fosfat Tampon Tuz Çözeltisi) PBS (Sigma-Aldrich, USA), hücre canlılığının korunması için önemli olan stabil bir fizyolojik Ph değeri sağlar. Kan ile izotonik bir çözelti (Ph=7,4) olma özelliğinden dolayı, hücre süspansiyonu hazırlama ve santrifüj ile hücre yıkamada kullanılmaktadır RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute-1640) RPMI medyumu doku ve hücre kültüründe özellikle insan lenfoid hücrelerin serumsuz ortamda büyümesini sağlamak amacıyla üretilmiştir. İlaveten yüksek miktarda fosfat ve atmosferde bulunan % 5 lik karbondioksit seviyesinde kullanılmak üzere formüle edilmiştir. Özellikle T/B lenfositler, kemik iliği hücreleri ve hibridoma hücreleri gibi pek çok hücrenin ekimi için besi yeri malzemesi olarak kullanılan RPMI (Gibco, Life Technologies, UK) antibiyotik, antimikotik ve zenginleştirme maddelerinin eklenmesiyle in vitro deneyler için hazır hale getirilmektedir. Zenginleştirmede kullanılan malzemeler: - % 10 FBS (Fetal sığır serumu - Gibco, UK) - % 1 L-glutamin (Gibco, UK) - % 1 Streptomisin ve penisilin (Gibco, UK)

35 Fiksasyon ve Permeabilizasyon Kiti Hücre içi Fiksasyon & Permeabilizasyon Tampon seti (ebioscience, Inc., San Diego, USA) hücre içi sitoplazmik proteinleri boyama ve akan hücre ölçer analizi için tasarlanmış olup, özellikle florokrom işaretli spesifik olmayan boyanmanın azaltılması ve floresan sinyal oranlarının arttırılması için formüle edilmiştir. 1x konsantrasyondaki 125 ml lik fiksasyon çözeltisi % 4 formaldehit içermekte olup, hücre yüzeyini sabitlemek amacıyla kullanılmaktadır. Permeabilizasyon çözeltisi ise 10x konsantrasyonda olup, kullanılmadan önce oda ısısına getirilip 1:10 oranında distile suyla sulandırılması gerekmektedir. 1x permeabilizasyon çözeltisi % 0,1 oranında saponin ve % 0,09 oranında sodyum azid içermektedir. İlk aşamada canlı hücreler fiksasyon tampon ile proteinler çapraz bağlanarak fikse edilir. İkinci aşamada kullanılan permeabilizasyon tampon ise membran içerisinde delikler oluşturarak antikorların etkin olarak hücre içine girmesini sağlar Hücre Yüzey Molekül Ekspresyonlarının Belirlenmesi Heparinli tüp içerisinde gönüllülerden alınan 15 ml periferik venöz kan örneklerinde hücre yüzey molekül ekspresyonlarını saptamak amacıyla; anti-cd4 FITC, anti-cd8a PE-Cy5, anti-cd183 APC, anti-cd193 APC, anti-cd194 APC monoklonal antikorlar ve izotip kontrol olarak IgG1/IgG2a FITC/PE ve PE-cy5/APC ikili boyaları kullanılarak boyama yapılmıştır (Tablo 3-1).

36 20 Monoklonal Antikor Renk Firma IgG1/IgG2a FITC/PE PE-Cy5/APC BD/Simultest, San Jose, CA CD4 FITC Diaclone, Besançon Cedex, France CD8a PE-Cy5 BioLegend, San Diego, CA CD183 APC ebioscience, San Diego, CA CD193 APC ebioscience, San Diego, CA CD194 APC Biolegend, San Diego, CA IFN-γ PE Diaclone, Besançon Cedex, France IL-4 PE Diaclone, Besançon Cedex, France IL-10 PE Diaclone, Besançon Cedex, France Tablo 3-1: Hücre yüzey boyamada kullanılan monoklonal antikorlar 3.4. Periferik Kan Mononükleer Hücre (PKMH) Eldesi Laminar akım altında heparinli tüp içerisine alınan 15 ml periferik venöz kan örneği, 50 ml lik steril falcon tüpü içerisine aktarıldıktan sonra, 1:1 oranında PBS ile sulandırıldı ve steril pastör pipeti ile üç-dört kez (çekip-verme) karıştırıldı. Ayrı bir 50 ml lik falcon tüpüne alınan kan örneği ile aynı hacimli oda sıcaklığındaki steril Biocoll (Biochrom AG, Berlin, Germany - yoğunluk: 1,077 gr/ml) üzerine, sulandırılan kan pastör pipeti vasıtasıyla tüpün yan duvarından yavaşça sızdırılarak bırakıldı, ficoll ile örneğin karışmamasına özen gösterildi.

37 21 Falcon tüpleri içindeki örneklerin 2000 devirde, 20 dakika ve +20 C'de santrifüj edilmesinin ardından, katmanlara ayrılmış olan kan-pbs karışımının en üstte kalan plazma kısmı pastör pipeti ile uzaklaştırıldıktan sonra PKMH'lerin bulunduğu, ficoll ile plazma arasında ince bir tabaka şeklinde gözüken beyaz bulutumsu katman, en alta çöken eritrositlere dikkat edilerek pastör pipeti kullanılarak 15 ml'lik konik tabanlı steril falcon tüpüne toplandı. Üzerine 15 ml'ye tamamlanacak şekilde steril PBS çözeltisi eklendikten sonra, 2000 devirde, 10 dakika ve +8 C'de santrifüj edildi. Santrifüj sonrası üst sıvının uzaklaştırılması ile elde edilen PKMH'lerin üzerine içinde kalmış olası eritrositleri lize etmek amacıyla µl distile su eklendi, 1000 lik mikropipet ile hücreler karıştırılarak (çekme-verme) kırk beş saniye inkübe edildi. İnkübasyon sonrası hücrelerin üzerine 15 ml steril PBS eklenerek 5 dakika 1250 devirde ve +4 C'de ikinci kez yıkama işlemi yapıldı. Yıkamadan sonra üst sıvıları uzaklaştırılan PKMH'lerin üzerine +4 C'deki 2 ml zenginleştirilmiş kültür ortamı RPMI-1640 eklenerek hücre sayımı aşamasına geçildi. Trypan blue (tripan mavisi) boyasının yalnız ölü hücreleri boyama özelliğinden faydalanıldı. 20 μl PKMH hücre süspansiyonu, 20 μl tripan mavisi boyasıyla 96 kuyucuklu plağın bir kuyucuğunda karıştırıldıktan sonra, Neubauer sayma kamarasına enjekte edildi, boyayı içine almayan canlı hücreler ışık mikroskobunda sayılarak 1 ml'de bulunan canlı PKMH sayısı hesaplandı PKMH Kültürü CD4 + T ve CD8 + T lenfositlerini uyarmak için T hücre reseptörü (THR) bağımsız T hücre aktivasyonu ve proliferasyonu için forbol miristat asetat (Phorbol myristate acetate, PMA) ve iyonomisin kombinasyonu uygulanan yöntem kullanıldı. Küçük organik bir komponent olan PMA, hücre membranından difüzyon ile sitoplazmaya geçerek doğrudan Protein Kinaz C (PKC) enzimini aktive eder. İyonomisin ise, NFAT sinyalizasyonu için gerekli olan kalsiyum salınımını tetikleyen bir kalsiyum iyonoforudur [79]. PKMH'ler PMA ve iyonomisin varlığı ve yokluğunda (unstimüle - US) kültüre edildi (Tablo 3-2). Bu amaçla PKMH'ler, 5 er saat ve her kuyucukta 1x10 6 hücre olacak şekilde 24 kuyucuklu düz tabanlı ve kapaklı steril kültür plaklarına alındı. Her bir kuyucuğa, totalde 1 ml olacak şekilde zenginleştirilmiş RPMI-1640 medyumu eklendi ve pipetaj yapılarak hücrelerin homojen bir şekilde dağılması sağlandı. Kültür plakları

38 22 37 C sıcaklıkta % 5 CO2 içeren etüve konulduktan 1 saat sonra, her bir kuyucuğa bir protein transport inhibitörü olan Brefeldin A (ebioscience, San Diego, CA) ilave edildi ve pipetaj yapılarak süspansiyonların karışması sağlandıktan sonra toplam 5 saat inkübe edildi. Uyaran Kullanım Dozu Marka PMA 10 μg/ml Sigma-Aldrich Brefeldin A 3 μg/ml ebioscience İyonomisin 5 μg/ml Sigma-Aldrich Tablo 3-2: Hücre kültüründe kullanılan uyaranlar ve kimyasallar 3.6. Hücre Yüzey Molekülleri ve Hücre İçi Sitokin Tayini Hücreler, 5 saatlik kültürün sonunda plaktan akan hücre ölçer tüplerine alınıp, üzerlerine 2 ml PBS eklenerek 1800 devirde 10 dakika santrifüj edildi. Üst sıvılar uzaklaştırıldıktan sonra tüplere 300 er l PBS eklenerek PKMH hücre süspansiyonu elde edildi. PKMH süspansiyonunda hücre yüzey boyaması yapılarak CD4 + ve CD8 + T hücre grupları ve takiben hücre içi IFN-, IL-4 ve IL-10 sitokin seviyeleri akan hücre ölçer cihazı ile saptandı (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, USA) Hücre Yüzey Boyaması Anti-CD4 FITC ve anti-cd8a PeCy5 işaretli monoklonal antikorlar birlikte 3 ayrı tüpe konuldu. Her bir tüpe sırasıyla anti-cd183 APC (CXCR3), anti-cd193 APC (CCR3) veya anti-cd194 APC (CCR4) işaretli antikorlar eklendi. Antikor konmuş her bir tüpe 3x10 5 hücre içerecek miktarda PMA uyarımlı ve uyarımsız koşullara sahip PKMH süspansiyonu eklenerek karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dk inkübe edildi. İnkübasyonu takiben üzerlerine 2 ml PBS eklenen tüpler, 1800 devirde 10 dk santrifüj edildikten sonra hücre içi boyama aşamalarına geçildi.

39 23 Şekil 3-1: Uyarımsız koşulda, CD4 + T hücre CCR4 ve CD8 + T hücre CCR4 ekspresyonu akan hücre ölçer görüntüsü Hücre İçi Boyama Hücre içi sitokin miktarlarını belirlemek için Fiksasyon & Permeabilizasyon kiti (ebioscience Inc., San Diego, CA) kullanıldı. Bu amaçla öncelikle üst sıvılar uzaklaştırılıp tüplere 100 l 1x fiksasyon çözeltisi eklenip vorteks ile karıştırıldıktan sonra 20 dakika karanlık ve oda sıcaklığında inkübe edildi. Fiksasyon işleminin ardından tüplerin içine 2 ml 1x permeabilizasyon sıvısı eklendi ve hücreler santrifüjde 1800 devirde 5 dakika yıkandı. Üst sıvı uzaklaştırıldıktan sonra tüplere 100 l 1x permeabilizasyon sıvısı ve ayrı tüplerde olmak üzere anti-ifn- PE Gen-Probe Inc., San Diego, USA), anti-il-4 PE ve anti-il-10 PE (BioLegend, San Diego, CA) monoklonal antikorlar ilave edilip vorteks ile karıştırıldıktan sonra oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi. İnkübasyonu takiben tüplere 2 ml 1x permeabilizasyon sıvısı eklenerek 1800 devirde 5 dk santrifüj edildi. Üst sıvılar uzaklaştırıldıktan sonra hücrelerin üzerine 300 l FACS flow sheat sıvısı eklenip analize kadar olan süre içerisinde hücre süspansiyonları karanlıkta ve +4 C de saklandı.

40 24 Şekil 3-2: PMA/iyonomisin sonrası CD4 + T hücresi IL-4 ve uyarımsız CD8 + CCR4 + T hücresi IL-10 sitokin içeriği akan hücre ölçer görüntüsü Örnekler akan hücre ölçerde değerlendirildi. Önden saçılım (Forward scatter, FSC) - yandan saçılım (Side scatter, SSC) grafiğinde lenfositler R1 ismiyle kapılandıktan sonra CD8 + T ve CD4 + T hücreler R1 kapısı içinde sırasıyla R2 ve R3 olmak üzere işaretlendi. Şekil 3-1, kapılama stratejisini göstermektedir. Şekil 3-3: Total lenfositler (R1), CD8 + hücreler (R2) ve CD4 + hücreler (R3) akan hücre ölçer görüntüsü 3.7. Analiz ve İstatistikler Çalışmada gerçekleştirilen tüm deneylerin sayım ve analizleri BD CellQuest yazılımı kullanılarak yapıldı. Verilerin istatistiksel analizleri için SPSS 21 programı kullanıldı. Gruplar arası farkların değerlendirilmesinde non-parametrik Mann-Whitney

41 25 U testi kullanılırken; grup içi parametrelerin değerlendirilmesi için Wilcoxon testi kullanıldı. Anlamlılık düzeyi p 0,05 kabul edildi.

42 26 4. BULGULAR 4.1. Periferik Kan T Hücrelerin Hücre İçi Sitokin İçeriği PKMH ler PMA ve iyonomisin varlığında ve yokluğunda in vitro koşulda 5 saat kültüre edildikten sonra CD4 + T ve CD8 + T hücrelerin hücre içi sitokin düzeyleri akan hücre ölçer ile değerlendirilmiştir Allerjik Astım Olguları PMA ve iyonomisin uyarımını takiben CD4 + T yardımcı hücrelerin IFN-γ ve IL- 4 sitokin düzeylerinde anlamlı bir artış (p< 0,05) görülürken, IL-10 düzeyinde saptanan artış istatiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p= 0,072). Şekil 4-1: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD4 + T hücre IFN-γ ve IL-4 düzeyleri (*p= 0,034) Uyarımı takiben CD8 + sitotoksik T hücrelere bakıldığında ise, tüm sitokin düzeylerinde anlamlı derecede artış görülmüştür (p< 0,05).

43 27 Şekil 4-2: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD8 + T hücre IFN-γ, IL-4 ve IL-10 düzeyleri (*p= 0,034) Allerjik Olmayan Astım Olguları PMA/iyonomisin uyarımı altında CD4 + T yardımcı hücrelerin hücre içi IFN-γ, IL-4 ve IL-10 sitokin seviyelerinin anlamlı düzeyde yükseldiği gözlenmiştir (p< 0,05). Şekil 4-3: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD4 + T hücre IFN-γ, IL-4 ve IL-10 düzeyleri (*p= 0,0265) Aynı şekilde uyarım altındaki CD8 + sitotoksik T hücreleri de hücre içi IFN-γ, IL-4 ve IL-10 sitokin seviyeleri açısından anlamlı artış göstermiştir (p< 0,05).

44 28 Şekil 4-4: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD8 + T hücre IFN-γ, IL-4 ve IL-10 düzeyleri (*p= 0,0265; **p= 0,0215) Allerjik ve Non-allerjik Astım Hasta Grupları Kıyaslaması Uyarımsız ve uyarımlı koşullar altında, CD4 + T ve CD8 + T hücrelerin IL-4, IL- 10, IFN-γ hücre içi sitokin seviyeleri incelendiğinde, allerjik ve non-allerjik astım grupları arasında istatiksel olarak anlamlı bir sonuç saptanmamıştır. Tüm hücreler uyarım sonrasında sitokin seviyelerinde anlamlılık göstermeyen bir artış göstermiştir Periferik Kan T hücrelerin Kemokin Reseptörü Ekspresyon Profili Allerjik Astım Olguları PMA ve iyonomisin varlığında CD4 + T hücrelerinin yüzeyinde bulunan CXCR3 ve CCR4 kemokin reseptörlerinin ekspresyon seviyelerinde anlamlı bir düşüş (p< 0,05) görülürken, CCR3 kemokin ekspresyonunda anlamlı derecede bir artış (p< 0,05) gözlenmiştir.

45 29 Şekil 4-5: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD4 + T hücrelerin CXCR3, CCR3 ve CCR4 yüzey ekspresyon değişimleri (*p= 0,037; **p= 0,034) CD8 + sitotoksik T hücrelerine bakıldığında, uyarım sonucu CCR3 ekspresyonunda anlamlı bir değişim görülmezken, CXCR3 ve CCR4 kemokin ekspresyon düzeylerinde anlamlı derecede bir artış saptanmıştır (p< 0,05). Şekil 4-6: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD8 + T hücrelerin CXCR3 ve CCR4 yüzey ekspresyon değişimleri (*p= 0,034) Allerjik Olmayan Astım Olguları PMA ve iyonomisin uyarımı sonrası astım hastalarının CD4 + yardımcı T hücrelerin CXCR3, CCR3 ve CCR4 kemokin ekspresyon seviyelerinde anlamlı bir değişim saptanmamış ancak, CD8 + T sitotoksik hücrelerin yüzeyinde bulunan CCR3 kemokin reseptör ekspresyonunun anlamlı derecede düştüğü gözlenmiştir (p< 0,05).

46 30 Şekil 4-7: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD8 + T hücrelerin CCR3 yüzey ekspresyon değişimleri (*p= 0,04) Allerjik ve Non-allerjik Astım Hasta Gruplarının Karşılaştırılması Farklı hasta grupları arasında, CD4 + T yardımcı hücre CXCR3, CCR3 ve CCR4 kemokin reseptör ekspresyonları kıyaslandığında, uyarımlı/uyarımsız her iki durumda da istatiksel olarak anlamlılık tespit edilmemiştir. Uyarıma maruz kalan CD4 + T hücre grubunda CCR4 ekspresyonunun non-allerjik astmatiklerde daha yüksek olmasına karşın bu artış istatiksel olarak anlamlılık göstermemiştir (p= 0,086). CD8 + sitotoksik T hücrelerin kemokin reseptörleri her iki koşulda da incelendiğinde, sadece CCR4 ekspresyonu allerjik olmayan astmatiklerde, allerjik astımlı gruba nazaran daha yüksek bulunmuştur (p< 0,05). US PMA Şekil 4-8: PMA/iyonomisin uyarımı öncesi ve sonrasında allerjik ve non-allerjik astım olgularının CD8 + CCR4 + hücre oranları (*p= 0,014, **p= 0,05)

47 Periferik Kan T Hücrelerin Kemokin Reseptör Profillerine Göre Sitokin İçerikleri Allerjik Astım Olguları PMA ve iyonomisin uyarımını takiben CD4 + T hücreleri incelendiğinde, CXCR3 kemokin reseptörünü eksprese eden hücre popülasyonunda (CD4 + CXCR3 + ) hücre içi IFN-γ ve IL-4 sitokin miktarlarında anlamlı bir artış gözlenmiştir (p< 0,05). CD4 + CCR3 + T hücrelerin hücre içi IFN-γ, IL-4 ve IL-10 seviyeleri uyarım sonucu anlamlı düzeyde artarken (p< 0,05), CD4 + CCR4 + hücre grubunda sadece IL-10 düzeyinde anlamlı artış (p< 0,05) saptanmıştır. Şekil 4-9: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD4 + T hücre CXCR3 + IFN-γ, CXCR3 + IL-4, CCR3 + IFN-γ, CCR3 + IL-4, CCR3 + IL-10, CCR4 + IL-10 değişimleri (*p= 0,027, p= 0,034, ***p= 0,043).

48 32 Aynı koşullardaki CD8 + sitotoksik T hücrelerin CXCR3 eksprese eden popülasyonunda anlamlı bir değişim gözlenmemekle beraber CD8 + CCR3 + hücre grubunda IFN-γ, IL-4, ve IL-10 anlamlı bir artışa (p< 0,05) ek olarak; CD8 + CCR4 + popülasyonunda IL-4 ve IL-10 içeriklerinde anlamlı derecede artış saptanmıştır (p< 0,05). Şekil 4-10: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD8 + T hücre CCR3 + IFN-γ, CCR3 + IL-4, CCR3 + IL-10, CCR4 + IL-4, CCR4 + IL-10 değişimleri (*p= 0,034, **p= 0,04) Allerjik Olmayan Astım Olguları PMA ve iyonomisin uyarımına yanıt olarak allerjik olmayan astım hastalarına ait CD4 + T hücrelere bakıldığında, CXCR3 + grupta IFN-γ, IL-4 ve IL-10 sitokin içerikleri anlamlı düzeyde artış göstermiştir (p< 0,05). Aynı şekilde CCR3 kemokin reseptör ekspresyonuna sahip CD4 + T hücre popülasyonunun hücre içi IFN-γ, IL-4 ve

49 33 IL-10 miktarlarının anlamlı derecede arttığı saptanmıştır (p< 0,05). CD4 + CCR4 + T hücrelerin sitokin içeriklerinde istatiksel olarak anlamlı bir değişim tespit edilmemiştir. Şekil 4-11: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD4 + T hücre CXCR3 + IFN-γ, CXCR3 + IL-4, CXCR3 + IL-10, CCR3 + IFN-γ, CCR3 + IL-4, CCR3 + IL-10 değişimleri (*p= 0,0215, **p= 0,028, ***p= 0,043) Uyarım koşullarına cevap olarak CD8 + sitotoksik T hücrelerine bakıldığında, sadece CXCR3 kemokin reseptörünü eksprese eden grupta hücre içi IFN-γ ve IL-10 sitokin miktarlarında istatiksel olarak anlamlı düzeyde artış görülmüştür (p< 0,05).