T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİMYA ANABİLİM DALI

Transkript

1 T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİMYA ANABİLİM DALI KAPSAİSİN VE TARÇININ (CINNAMON) YÜKSEK GLUKOZ KONSANTRASYONLARINA MARUZ BIRAKILAN İNSAN ERİTROSİTLERİNDE (in vitro) PROTEİN GLİKOZİLASYONU, Na + -K + ATPaz, Ca +2 ATPaz VE LİPİD PEROKSİDASYONU DÜZEYLERİNE ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI YÜKSEK LİSANS TEZİ KAHRAMANMARAŞ Eylül

2 T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİMYA ANABİLİM DALI KAPSAİSİN VE TARÇININ (CINNAMON) YÜKSEK GLUKOZ KONSANTRASYONLARINA MARUZ BIRAKILAN İNSAN ERİTROSİTLERİNDE (in vitro) PROTEİN GLİKOZİLASYONU, Na + -K + ATPaz, Ca +2 ATPaz VE LİPİD PEROKSİDASYONU DÜZEYLERİNE ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI YÜKSEK LİSANS TEZİ Kod No : Bu Tez 14/09/2006 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oy Birliği ile Kabul Edilmiştir.... Yrd. Doç. Dr. Doç. Dr. Yrd. Doç. Dr. Naciye KURTUL Mehmet TÜMER M. Kemal SANGÜN DANIŞMAN ÜYE ÜYE Yukarıdaki imzaların adı geçen öğretim üyelerine ait olduğunu onaylarım. Prof. Dr. Özden GÖRÜCÜ Enstitü Müdürü Bu çalışma Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı tarafından desteklenmiştir. Proje No: 2005/1-24 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak göstermeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER SAYFA İÇİNDEKİLER I ÖZET..... III ABSTRACT.... V ÖNSÖZ.... VII ÇİZELGELER DİZİNİ.... VIII ŞEKİLLER DİZİNİ.... IX SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ.... XI 1. GİRİŞ Eritrosit Membranı Eritrosit Membranının Yapısı Eritrosit Membranının Fonksiyonları Hücre Membranı Transport Mekanizmaları Na + -K + ATPaz Hakkında Genel Bilgi Na + -K + ATPaz Enzimi Na + -K + ATPaz Enziminin Etki Mekanizması Glukoz transportu Na + -K + ATPaz Enziminin Aktivatörleri Na + -K + ATPaz Enziminin İnhibitörleri Digital Glikozidler Sülfidril Reaktifleri Oligomisin Ouabain Ca +2 ATPaz Hakkında Genel Bilgi Ca +2 ATPaz Enzimi Ca +2 ATPaz Enziminin Etki Mekanizması Ca +2 ATPaz Enziminin Aktivatörleri Ca +2 ATPaz Enziminin İnhibitörleri Rutenyum Kırmızısı Sülfidril Reaktifleri Lipid Peroksidasyonu Hakkında Genel Bilgi Lipid Peroksidasyonu ve Etki Mekanizması Lipid Peroksidasyonunun Kimyasal Yolu Lipid Peroksidasyonunun Patolojik Etkileri Hemoglobin A 1c Hakkında Genel Bilgi Tarçın Kapsaisin(Capsaicin; Capsicum annuum L) ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOT Materyal Kullanılan Kimyasal Maddeler Kullanılan Cihazlar Metot Eritrositlerin Glukoz, Kapsaisin ve Tarçınla İnkübasyonu Eritrosit Membranı Ayırma Na + -K + ATPaz Enzim Aktivitesinin Ölçülmesi I

4 İÇİNDEKİLER Ca +2 ATPaz Enzim Aktivitesinin Ölçülmesi İnorganik Fosfat Miktarının Tayini Lipid Peroksidasyonu Tayini Total Protein Tayini İstatistiksel Analiz BULGULAR VE TARTIŞMA Kapsaisin ve Tarçının Eritrosit Membranı Na + -K + ATPaz, Ca +2 ATPaz Aktiviteleri ile MDA ve HbA 1c Değerleri Kapsaisin Uygulanan Gruplarda Eritrosit Membranı Na + -K + ATPaz, Ca +2 ATPaz Aktiviteleri ile MDA ve HbA 1c Değerleri Tarçın Uygulanan Gruplarda Eritrosit Membranı Na + -K + ATPaz, Ca +2 ATPaz aktiviteleri ile MDA ve HbA 1c Değerleri SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ.. 52 II

5 ÖZET T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KİMYA ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ ÖZET KAPSAİSİN VE TARÇININ (CINNAMON) YÜKSEK GLUKOZ KONSANTRASYONLARINA MARUZ BIRAKILAN İNSAN ERİTROSİTLERİNDE (in vitro) PROTEİN GLİKOZİLASYONU, Na + -K + ATPaz, Ca +2 ATPaz VE LİPİD PEROKSİDASYONU DÜZEYLERİNE ETKİSİNİN ARAŞTIRILMASI DANIŞMAN : Yrd. Doç. Dr. Naciye KURTUL Yıl : 2006 Sayfa : 52 Jüri : Yrd. Doç. Dr. Naciye KURTUL : Doç. Dr. Mehmet TÜMER : Yrd. Doç. Dr. M. Kemal SANGÜN Bu çalışmada, yüksek glukoz konsantrasyonuna maruz bırakılan insan eritrositlerinde in vitro ortamda kapsaisin ve tarçının eritrosit membranı Na + -K + ATPaz ve Ca +2 ATPaz aktiviteleri ile glikozillenmiş hemoglobin (HbA 1c ) ve MDA düzeylerine etkisi araştırılmıştır. Sağlıklı bireylerden toplanan kan örneklerinden elde edilen eritrositler normal (6 mm) ve yüksek (45 mm) glukoz konsantrasyonlarına maruz bırakılarak farklı konsantrasyonlardaki kapsaisin (0.1 µm, 1 µm, 100 µm) ve tarçın (50 µm, 100 µm, 200 µm) ile bir saat süresince inkübe edilmiştir. Sadece 6 mm lık glukoza maruz bırakılan eritrositler kontrol grubu olarak kullanılmıştır. 45 mm glukoza maruz bırakılan eritrositlerde Na + -K + ATPaz ve Ca +2 ATPaz aktiviteleri 6 mm glukoza maruz bırakılan kontrol grubuna göre istatistiki olarak önemli düzeyde düşük bulunmuştur (p<0.001). Kapsaisin ve tarçın uygulanan gruplarda kapsaisin ve tarçın konsantrasyonlarına da bağlı olarak bu enzimlerin aktivitelerinin istatistiki olarak önemli düzeyde arttığı saptanmıştır. Yüksek konsantrasyondaki glukozun etkisi ile MDA ve HbA 1c değerlerinin normal konsantrasyonda glukoz uygulanan kontrol grubuna göre istatistiki olarak III

6 ÖZET önemli düzeyde arttığı, kapsaisin ve tarçının etkisi ile kapsaisin ve tarçın konsantrasyonlarına da bağlı olarak MDA ve HbA 1c değerlerinin azaldığı saptanmıştır. Sonuçta, kapsaisin ve tarçının eritrositlerde normal glukoz konsantrasyonlarında olduğu gibi yüksek glukoz konsantrasyonlarında da Na + -K + ATPaz ve Ca +2 ATPaz aktivitelerini artırıcı ve lipid peroksidasyonu ile protein glikozilasyonunu azaltıcı etkiye sahip olduğu görülmüş, bunun ise yüksek kan glukozu ile karakterize ve bütün dünyada yaygın bir hastalık olan diabetes mellitusta özel bir önem arz edebileceği düşünülmüştür. Anahtar Kelimeler: Kapsaisin, Tarçın(Cinnamon), Na + -K + ATPaz, Ca +2 ATPaz, Lipid Peroksidasyonu, Eritrosit Membranı, Protein Glikozilasyonu IV

7 ABSTRACT UNIVERSITY OF KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF CHEMISTRY MSc THESIS ABSTRACT INVESTIGATION THE EFFECT OF CINNAMON AND CAPSAICIN PROTEIN GLYCOSYLATION, Na + -K + ATPase, Ca +2 ATPase ACTIVITIES AND LIPID PEROXIDATION LEVELS IN HUMAN ERYTHROCYTES WHICH EXPOSED TO HIGH GLUCOSE CONCENTRATION SUPERVISOR : Asst. Prof. Dr. Naciye KURTUL Year: 2006 Pages: 52 Jury : Asst. Prof. Dr. Naciye KURTUL : Assoc. Prof. Dr. Mehmet TÜMER : Asst. Prof. Dr. M. Kemal SANGÜN In this study, the effect of cinnamon and capsaicin on protein glycosylation, Na + -K + ATPase, Ca +2 ATPase activities and lipid peroxidation levels in human erythrocytes which exposed to high glucose concentration in vitro is investigated. The blood samples obtained from healty individuals exposed to normal glucose (6 mm) and high glucose (45 mm) concentrations and then incubated with capsaicin at different concentrations (0.1 µm, 1 µm, 100 µm) and cinnamon at different concentrations (50 µm, 100 µm, 200 µm) for one hour. The samples which exposed to glucose only, is used as a control group. In erythrocyte samples which exposed to high glucose concentration, Na + -K + ATPase, Ca +2 ATPase activities are found lower than control group (normal glucose concentration), and the differences between these two groups are statistically significant (p<0.001). The groups which exposed to capsaicin and cinnamon, the activities of these two membrane enzymes are increased statistically due to the increase of capsaicin and cinnamon concentrations. MDA and HbA 1c levels are increased more in high glucose group than normal glucose group. And both MDA and HbA 1c levels are decreased proportionally with the increase of capsaicin and cinnamon concentration. V

8 ABSTRACT As a result, capsaicin and cinnamon increase the activities of Na + -K + ATPase ve Ca +2 ATPase and decrease the level of lipid peroxidation in high glucose concentration in erythrocytes, so do in normal glucose concentrations. It is concluded that the effects of capsaicin and cinnamon to these parametres have a special importance on diabetes mellitus, a disease known commonly all over the world, which is characterized with its high blood glucose level. Key Words: Capsaicin, Cinnamon, Na + -K + ATPase, Ca +2 ATPase, Lipid Peroxidation, Erythrocyte Membrane, Protein Glycosylation VI

9 ÖNSÖZ ÖNSÖZ Diabetes mellitus hem akut hem de kronik komplikasyonlarla seyreden, dünyada ve ülkemizde giderek artan, sürekli kontrol ve tedavi gerektiren bir hastalıktır. Diğer taraftan yüksek kan glukozu diabetin önemli karakteristiklerindendir. Son yıllarda doğal ve bitkisel kaynaklı ilaçların diabet tedavisinde yardımcı olduğu bildirilmekte olup; bunların arasında kapsaisin ve tarçın da dikkati çekmektedir. Bu tez çalışmasında yüksek ve normal glukoz konsantrasyonuna maruz bırakılan insan eritrositlerinde kapsaisin ve tarçının eritrosit membranı Na + -K + ATPaz, Ca +2 ATPaz aktiviteleri ile glikozillenmiş hemoglobin (HbA 1c ) ve MDA düzeyine etkisi araştırılmıştır. Yüksek lisans eğitimim boyunca değerli bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım, çalışmalarımın yönlendirilmesinde ve devam etmesinde her türlü desteğini benden esirgemeyen danışman hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Naciye KURTUL hanımefendiye en içten saygı ve teşekkürlerimi arz ederim. Çalışmalarım sırasında her türlü yardımlarından dolayı Serdar Altıntaş a ve deney aşamasında kullanılacak numuneler için gönüllü olarak kan vermek suretiyle bu çalışmaya iştirak eden kişilere teşekkür ederim. Bu tez çalışması Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığınca 2005/1-24 nolu proje ile desteklenmiş olup; bu bağlamda KSÜ Rektörlüğüne ve KSÜ Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığına teşekkür ederim. KAHRAMANMARAŞ Eylül, 2006 Nuri GÜLEŞÇİ VII

10 ÇİZELGELER DİZİNİ ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 4.1. Normal ve yüksek konsantrasyonlu ortamlarda eritrosit membranı Na + -K + ATPaz, Ca +2 ATPaz, eritrosit MDA ve HbA 1c değerleri Çizelge 4.2. Kapsaisin uygulanan gruplarda eritrosit membranı Na + -K + ATPaz ve Ca +2 ATPaz aktivite değerleri Çizelge 4.3. Kapsaisin uygulanan gruplarda eritrosit membranı Na + -K + ATPaz ve Ca +2 ATPaz istatistiksel sonuçları Çizelge 4.4. Kapsaisin uygulanan gruplarda eritrosit MDA ve HbA 1c değerleri Çizelge 4.5. Kapsaisin uygulanan gruplarda eritrosit MDA ve HbA 1c istatistiksel sonuçları Çizelge 4.6. Tarçın uygulanan gruplarda eritrosit membranı Na + -K + ATPaz ve Ca +2 ATPaz aktivite değerleri Çizelge 4.7. Tarçın uygulanan gruplarda eritrosit membranı Na + -K + ATPaz ve Ca +2 ATPaz için istatistiksel sonuçlar Çizelge 4.8. Tarçın uygulanan gruplarda eritrosit MDA ve HbA 1c değerleri Çizelge 4.9. Tarçın uygulanan gruplarda eritrosit MDA ve HbA 1c istatistiksel sonuçları VIII

11 ŞEKİLLER DİZİNİ ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Eritrosit Membranın Yapısı Şekil 1.2. Eritrosit Membranında Bulunan Proteinler Şekil 1.3. Na + -K + ATPaz enzimi Şekil 1.4. Na + ve K + İyonlarının Taşınması Şekil 1.5. Glukoz Transportu Şekil 1.6. Ouabainin Yapısı Şekil 1.7. Ouabainin Na + -K + ATPaz a Bağlanıp İnhibe Etmesi Şematik Gösterimi Şekil 1.8. Ca +2 ATPaz ın kimyasal yapısı Şekil 1.9. Ca +2 İyonlarının Taşınması Şekil Lipid peroksidasyonunun Zincir Reaksiyonları Şekil Lipid Peroksidasyonunun Kimyasal Yolu Şekil Kapsaisinin molekül yapısı Şekil 4.1. Kapsaisinin Na + -K + ATPaz aktivite değerlerinin grafiksel gösterimi Şekil 4.2. Kapsaisinin Ca +2 ATPaz aktivitesine etkisinin grafiksel gösterimi Şekil 4.3. Kapsaisinin MDA düzeyine etkisinin grafiksel gösterimi Şekil 4.4. Eritrosit örneklerinde kapsaisinin MDA düzeyine etkisinin zamana bağlı olarak (1 h, 24 h ve 48 h) değişimi Şekil 4.5. Kapsaisinin HbA 1c düzeyine etkisinin grafiksel gösterimi Şekil 4.6. Eritrosit örneklerinde kapsaisinin HbA 1c düzeyine etkisinin zamana bağlı olarak (1 h, 24 h ve 48 h) değişimi Şekil 4.7. Tarçının Na + -K + ATPaz aktivite değerlerinin grafiksel gösterimi Şekil 4.8. Tarçının Ca +2 ATPaz aktivite değerlerinin grafiksel gösterimi Şekil 4.9. Tarçının MDA düzeyine etkisinin grafiksel gösterimi IX

12 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Eritrosit örneklerinde tarçının MDA düzeyine etkisinin zamana bağlı olarak (1 h, 24 h ve 48 h) değişimi Şekil Tarçının HbA 1c düzeyine etkisinin grafiksel gösterimi Şekil Eritrosit örneklerinde tarçının HbA 1c düzeyine etkisinin zamana bağlı olarak (1 h, 24 h ve 48 h) değişimi. 40 X

13 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ nmol : Nanomol µmol : Mikromol mmol : Milimol M : Molar mg : Miligram g : Gram kg : Kilogram nm : Nanometre cm : Santimetre m : Metre µl : Mikrolitre ml : Mililitre dl : Desilitre L : Litre cal : Kalori C : Santigrad Derece Hb : Hemoglobin h : Saat ROOH : Lipid Hidroperoksit ADP : Adenozin Difosfat ATP : Adenozin Trifosfat BHT : Butylated Hydroxy Toluene; Bütillenmiş Hidroksi Toluen Pi : İnorganik Fosfat PBS : Phosphate Buffered Saline; Fosfatla Tamponlanmış Tuz Çözeltisi HbA 1c : Glikozillenmiş Hemoglobin K m : Michaelis Sabiti V max : Maksimum Hız MDA : Malondialdehit NEM : N-etil malelmid DTNB : 5,5 ditio bis (2-nitro benzoik asit) MHKP : Metil Hidroksi Kalkon Polimeri camp : Siklik Adenozin Monofosfat XI

14 GİRİŞ 1. GİRİŞ Bilindiği gibi doğada bulunan birçok bitki, tıbbi ve kimyasal olarak oldukça değerli olup, günümüzde hastalıklardan korunma ve hastalıkları tedavi amacı ile çeşitli bitkilerden yararlanılması giderek daha fazla önem kazanmaktadır. Bu bağlamda, bitkilerle ilgili çalışma sonuçlarına ihtiyaç duyulmaktadır. Diabetes Mellitus, mutlak ya da bağıl insülin eksikliği ya da insülin direnci nedeniyle ortaya çıkan ve karbonhidrat, lipit ve protein metabolizması bozukluğu ile karakterize, endokrin ve metabolik bir hastalıktır. Hastalığın seyri sırasında retinopati, nefropati, nöropati ve ateroskleroz gibi spesifik komplikasyonlar gelişmekte ve dünyada her yıl binlerce kişi diabet komplikasyonlarından ölmektedir. Diabette serbest oksijen radikali üretimi ve lipit peroksidasyonunun arttığı, antioksidan savunma sisteminin yetersiz olduğu bildirilmektedir. Serbest radikal üretiminin artması ise diabet komplikasyonlarının başlamasına ve ilerlemesine katkıda bulunmaktadır. Diabette yüksek glukoz düzeyi nedeniyle oksidatif hasara yol açan reaktif oksidanlar meydana gelmektedir. Nonenzimatik glikozilasyon, enerji metabolizmasındaki değişikliklerden kaynaklanan metabolik stres, sorbitol yolu aktivitesi, inflamatuar mediatörlerin düzeyleri ve antioksidan savunma sistemindeki değişiklikler sonucu oluşan lokalize doku hasarı diabette oksidatif stresi artıran mekanizmalardır (King ve Banskota, 1994; Maxwell ve ark.,1996; Orei ve ark., 2000). Glukozun hücre içine taşınmasında Na + iyonlarının rolü bilinmektedir. Glukoz hücre içine Na + ile birlikte glukoz-na + simport sistemi ile taşınmaktadır. Na + -K + ATPaz, ATP nin hidrolizini katalizleyen bir enzim olup, Na + ve K + iyonlarının, Ca +2 ATPaz da Ca +2 iyonun hücre içi ve hücre dışı derişimlerinin fizyolojik sınırlar içinde sabit tutulmasından sorumludur (Jain, 2000; Jain, 2001). Normale oranla artmış hücre dışı glukoz derişimine ve glukozun hücre içine alınarak kullanılmasına bağlı olarak doğrudan Na + ve dolaylı olarak ta Ca +2 iyonlarının hücre içi ve hücre dışı derişimlerinde değişiklik olması, dolayısıyla da Na + -K + ATPaz ve Ca +2 ATPaz enzim aktivitelerinin de bu değişmelerden etkilenebileceğini düşündürtmektedir. Önceki çalışmalarda diabetes mellitusun kronik komplikasyonlarının patofizyolojisinde bozulmuş sodyum transportu ve eritrosit membranında Na + -K + ATPaz aktivitesinin muhtemel rolüne işaret edilmiş; insan eritrositlerinde in vivo ve in vitro koşullarda yapılmış çeşitli çalışmalarda artmış glisemi ile birlikte Na + -K + ATPaz ve Ca +2 ATPaz aktivitelerinin değiştiği rapor edilmiştir (Davis ve ark., 1985; Bilgin, 1995; Kızıltunç ve ark., 1997; Gürbilek ve ark., 2004). Diğer taraftan, çeşitli bitkilerin diabetiklerde, hipoglisemik etkileri nedeniyle glukoz metabolizmasını iyileştirebilecekleri bildirilmiştir (Khan ve ark., 2003). Bu bitkiler arasında kırmızı biber (Capsicum annuum L.) ve tarçın (Cinnamon) da bulunmaktadır (Khan ve ark., 2003). Kırmızı biber, Kahramanmaraş bölgesinde oldukça bol yetişen ve Güneydoğu Anadolu bölgesinde tüketimi oldukça yaygın bir bitki türü olup, ilaç sanayiinde, kimya 1

15 GİRİŞ sanayiinde ve halk arasında oldukça sık kullanılmaktadır (Beis, 1990; Perucka ve Materska, 2001). Rat jejunumunda yapılan in vitro bir çalışmada kapsaisinin, doz bağımlı olarak, glukoz emilimini inhibe ettiği bildirilmiştir (Monsereenusorn ve Glinsukon, 1978). Başka bir çalışmada da kapsaisinin oral glukoz alınmasına bir cevap olarak, plazma glukoz düzeyini azaltan bir özelliğe sahip olduğu bildirilmiştir (Monsereenusorn ve Glinsukon, 1980). Önceki çalışmalarda kapsaisinin insan eritrosit osmotik frajilitesi ve asetilkolin esteraz aktivitesini etkilediği ve antioksidan etkilere sahip olduğu gösterilmiştir (Rizvi ve Luqman, 2003). Bunlardan başka, kapsaisinin vücut ısısını indüklediği, enerji harcanmasını ve kan akımını arttırdığı; oksidatif stresi önlediği (Lee ve ark., 2003) ve lipid peroksidasyonunu azalttığı bildirilmektedir (Carson, 1987). Yapılan çalışmalarda kapsaisinin serumda kolesterol düzeyini de etkilediği (Srinivasan ve Sambaiah, 1991); kapsikumun kan serum kolesterolü ve trigliserid değerlerini azaltmak yoluyla, ateroskleroz gelişme riskini azalttığı belirtilmektedir (Kawada ve ark., 1986). Tarçın da son zamanlarda diabette çok ilgilenilen ve hipoglisemik etkisinden söz edilen diğer bir bitki olup; tarçın ekstraktlarının in vitro glukoz alımını ve glikojen sentezini artırdığı ve insulin reseptörlerinin fosforillenmesini artırarak glukoz metabolizmasında olumlu etkilere sahip olabileceği bildirilmiştir (Khan ve ark., 2003). Bunun yanı sıra tarçının antioksidan etkiye de sahip olduğu bildirilmiştir (Blomhoff, 2004). Yapılan bazı çalışmalarda lipoik asid, piridoksin ve piridoksamin gibi bazı antioksidan özelliğe sahip maddelerin yüksek glukoz konsantrasyonlarında insan eritrositlerinde lipid peroksidasyonu, protein glikozilasyonu ve Na + -K + ATPaz enzim aktivitelerine etkisi araştırılmıştır (Jain ve Lim, 2000; Jain ve Lim, 2001). Diabette ve diabet komplikasyonlarının gelişmesinde lipid peroksidasyonu, proteinlerin nonenzimatik glikozilasyonu ve eritrosit membranı fonksiyonlarındaki değişiklikler önem arz ettiğinden, bu çalışmalar son derece değerlidir. Bu nedenle, bu tez çalışmasında bu konuda yapılmış ilk çalışma da olmak üzere hem antioksidan, hem de hipoglisemik etkilerinden söz edilen kapsaisin ve tarçının insan eritrositlerinde in vitro ortamda, yüksek glukoz konsantrasyonlarına cevaben lipid peroksidasyonu, hemoglobin glikozilasyonu ve Na + -K + ATPaz ve Ca +2 ATPaz enzim aktivitelerindeki değişim araştırılmıştır Eritrosit Membranı Eritrosit Membranının Yapısı Eritrosit membranı protein, lipid ve karbonhidratlardan oluşur. Özellikle fosfolipid ve serbest kolesterolden oluşan lipidler membranın yaklaşık % 50 sini oluşturur (Yenerel, 2004). Fosfolipidler lipid katmanı içerisine asimetrik bir şekilde dağılmışlardır. Lipid katmanının dış kısmı sfingomyelin, glikolipid ve fosfatidilkolin içerirken, sitoplazmaya bakan iç kısmı ise fosfatidilinositol, fosfatidilserin ve fosfatidiletanolamin gibi lipidlerden oluşmaktadır. Hücre içi ve hücre dışı sıvılarla temas edecek şekilde çift tabakalı olarak dizilmiş olan bu lipid yapısı sayesinde hücre içeriği dış ortamdan korunabilmektedir. 2

16 GİRİŞ Kolesterol ise membranın esnekliğinin ve kararlılığının devam ettirilmesinde görev yapmaktadır (Sadava, 1993). Bu lipid yapısı dışında eritrosit membranında 12 major ve yüzlerce minor protein mevcuttur. Proteinler membranın dış yüzeyine gevşek olarak yapışmış halde (periferik proteinler) ve lipid tabakanın içinde boylu boyunca gömülü (integral proteinler) haldedirler. İntegral proteinler, özellikle eriyik haldeki maddelerin hücre içi ile dışı arasındaki iletimini sağlar. Bunlar içinde en önemlileri spektrin, aktin, ankirin, band-3, glikoforin-a ve glikoforin-b proteinleridir. Hücre membranı ayrıca içerden hücre iskeleti olarak adlandırılan ve proteinlerden oluşan ağ şeklinde bir yapı ile güçlendirilmiştir (Discher ve ark., 2001). Hücre iskelet proteinleri membran proteinlerinin % lık kısmını oluşturmaktadır ve sodyum dodesil sülfat jel elektrofezi ile birbirinden ayırt edilebilirler (Yenerel, 2004). Eritrosit membranının yapısı Şekil 1.1 de gösterilmiştir. Şekil 1.1. Eritrosit membranının yapısı (Agre ve ark., 1989). Spektrin, kırmızı hücre zarı sito-iskelet bileşeni olup alfa ve beta izoform yapılarında bulunabilmektedir. Birbirlerine gevşekçe sarılı olan bu iki heliks biçimindeki yapılar her iki uçta birleşerek bir tetramer oluştururlar. Oluşan bu spektrin tetramerleri ise membrana ankirin proteinleri ile bağlıdır (Agre, 1989; Yalın ve Aksoy, 1997). Ankirin de band 3 adı verilen bir membran proteinine bağlıdır. Band 4.2 adı verilen proteinin ise ankirin ile band 3 proteini arasındaki bağlantıyı sağlamlaştırdığı düşünülmektedir (Sadava, 1993). Eritrosit membranının yapısında bulunan başlıca proteinler Şekil 1.2 de gösterilmiştir. 3

17 GİRİŞ Şekil 1.2. Eritrosit membranında bulunan proteinler (Sleep ve ark., 1999; Discher ve ark., 2001) Eritrosit Membranının Fonksiyonları Eritrosit membranının kolay elde edilebilirliği, onun, üzerinde en çok çalışma yapılan biyolojik membran olmasına neden olmuştur. Eritrosit membranının birçok görevi vardır: Klorür/bikarbonat değişimi esnasında ph ın sabit düzeyde tutulması, organik fosfatlar ve indirgenler gibi hayati önem taşıyan bileşiklerin korunması ve çeşitli metabolik artıkların organizma dışına atılması gibi birçok hayati önem taşıyan fonksiyonları yerine getirir (Patrick ve ark., 2004). Ayrıca glikolitik enzimleri inaktive ederek eritrosit metabolizmasının düzenlenmesi sağlar. Eritrosit membranının dış yüzünün kaygan olması kırmızı kan hücrelerinin endotel hücrelerine yapışmasına engel olmaktadır (Sikorski ve ark., 2000). Eritrosit membranı, hücreye esneklik ve dayanıklılık özelliği kazandırarak döngüsel stres esnasında hücrenin bütünlüğünün korunmasına imkan verir. Ayrıca hemoglobin sentezi için hücre içine demir alınmasını sağlar (Yalın ve Aksoy, 1997) Hücre Membranı Transport Mekanizmaları Bir hücre etrafındaki ortam ile devamlı bir madde-alışverişi halindedir. Bu nedenle birçok transport sistemlere sahiptir. Hücre membranında bu transport sistemlerden; difüzyon, kolaylaştırılmış difüzyon ve aktif taşıma önem arz etmektedir. a. Difüzyon: Moleküllerin yüksek konsantrasyonlu oratamdan daha düşük konsantrasyonlu ortama enerji harcamadan geçmelerine denir. Bu difüzyon olayı iki ortamdaki madde miktarı eşit olana dek sürer. Bir başka adı da pasif taşıma olan bu taşınım olayı hücre için hayati önem taşımaktadır. Molekül büyüklüğü ve şekli, membran lipidlerinin viskozitesi, molekülün membrandaki çözünürlüğü difüzyonu etkileyen parametrelerdir (Goodman, 2002). b. Kolaylaştrılmış Difüzyon: Taşınacak molekülün bir taşıyıcı moleküle bağlanarak membrandan geçebilme esasına dayanır. Taşıyıcı molekül olarak ise taşıyıcı proteinler rol alır. Kolaylaştırılmış difüzyona aynı zamanda taşıyıcı aracılığı ile difüzyon da denir. 4

18 GİRİŞ Taşıyıcı protein, molekül ya da iyonların hücre zarını geçmelerine yardımcı olur, onlara kimyasal olarak bağlanır ve hücre zarından bu şekilde geçişlerini sağlar (Murray ve ark., 1996). Taşınacak madde bağlandığında, taşıyıcı proteinde şekil değişikliği olur; içte kapalı olan hücre kanalının ucu açılır ve molekül buradan içeri girmeye başlar. Proteine zayıf bağlandığı için hücre içine yakın bir yere geldiğinde, termal hareketle protein, molekülden ayrılır ve molekül hücre içine girer (Ward ve ark., 2000). c. Aktif Taşıma: Hücre zarına maddelerin girişi yukarıdaki yöntemler dışında başka yollarla da gerçekleşir. Maddenin hücre zarından geçişi hücrenin enerji kullanmasıyla gerçekleşiyorsa bu olaya aktif taşıma denir. Aktif taşımada madde az yoğun ortamdan çok yoğun ortama doğru taşınır. Bu taşıma için gerekli enerji solunumla sağlanan ATP'den (hücresel enerji molekülü) karşılanır. Glukoz, bazı amino asitler ile sodyum ve potasyum iyonlarının hücre dışına ve içine taşınması için enerjiye ihtiyaç vardır. Bu geçişler zardaki enzimler yardımı ile yapılır ve bu taşımada hareketten kaynaklanan kinetik enerjinin yanı sıra, ek bir enerji kaynağına da gereksinim duyulur (Sweadner ve ark., 1980). Sodyum, potasyum, kalsiyum, karbon, demir, nitrojen, iyot, ürat iyonları, çeşitli amino asit ve şekerler için aktif taşıma gereklidir. Günlük hayatta beynimizden gelen emirle dış ve iç organlarımızdaki, her türlü fonksiyonun yapılması, hücrede bazı kontrol mekanizmalarının işlemesi, hücre reaksiyonlarının olabilmesi için potasyum, magnezyum, fosfat ve sülfat hücrenin iç kısmında fazla olmalıdır. Aynı zamanda hücrenin dış kısmında ise sodyum, kalsiyum ve bikarbonat fazla olmalıdır (Stein, 1986) Na + -K + ATPaz Hakkında Genel Bilgi Na + -K + ATPaz Enzimi Eritrosit membranı Na + -K + ATPaz enzimi üzerinde uzun süre çalışılmış aktif transport sistemlerinden biridir. Bu trans membran proteini ilk defa 1957 yılında Jens Skou tarafından sinir hücrelerinden izole edilmiştir. (Xie ve ark., 2002). Hücre içi K + iyonu düzeyini yüksek, Na + iyonu düzeyini düşük tutmak için, Na + ve K + un aktif transportundan sorumludur (Robinson, 1979). Na + -K + ATPaz enziminin yapısı Şekil 1.3 de şematize edilmiştir. Şekil 1.3. Na + -K + ATPaz enzimi (Dağlar, 2000). 5

19 GİRİŞ Na + -K + ATPaz enzimi, insan eritrositleri dahil hemen hemen her dokuda bulunan ve hücre membranından Na + ile K + transferini gerçekleştiren bir proteindir. Hayvansal hücrelerde hücre içi K + konsantrasyonu 140 mm, Na + konsantrasyonu ise 12 mm dır. Hücre dışında ise K + iyonu 4 mm iken Na + 145mM dır. Bu dengeyi ise Na + -K + ATPaz enzim sistemi sağlar (Gürel ve ark., 2004). Na + -K + ATPaz Na + /K + pompası integral bir zar proteini olup, alfa (α) ve beta (β) olarak adlandırılan iki alt üniteden oluşan bir tetramerdir. α alt ünitesi 1020, β alt ünitesi 302 amino asitten oluşmaktadır. Diğer proteinlerin birçoğu gibi Na + /K + pompasının α bileşeni değişik izoform yapıları (α 1, α 2, α 3 ) ile ifade edilir. Dokulardaki α 1 ve α 2 izoform oranlarının çeşitliliğinin ne anlama geldiği ve ne tür bir fonksiyonu olduğu hala aydınlatılmış değildir (Clausen, 1998). Na + -K + ATPaz, ATP nin hidrolizini katalizleyerek açığa çıkan enerji ile üç Na + iyonunu hücre dışına, iki K + iyonunu hücre içine transfer eder. Hücre membranı boyunca bu katyonların yer değiştirilmesini sağlayarak membran polaritesinin düzenlenmesi gibi hayati bir görev üstlenir (Schmidt ve ark., 1998) Na + -K + ATPaz Enziminin Etki Mekanizması Hemen hemen her hayvan hücresinde bulunan Na + -K + ATPaz pompasının ana görevi, birçok hücresel fonksiyonun gerçekleşebilmesi için hücre içindeki düşük Na + ve yüksek K + iyonu derişimlerinin korunmasını sağlamaktır. Na + /K + pompası ile Na + çıkışı ve K + girişi sırasında membranda elektriksel potansiyel oluşur ve osmotik basınçta değişme meydana gelir. Membran potansiyeli 50 mv ile 70 mv arası olup, Na + ve Cl - gibi iyonların hareketlerine etki ederek osmotik basıncın ayarlanmasında ve böylece hücre kararlılığının sağlanmasında rol alır (Clausen, 1998). Na + ve K + iyonlarının taşınması Şekil 1.4. de şematize edilmiştir. 1. basamakta; Na + iyonu konsantrasyonu düşük olan sitoplazmada üç adet Na + iyonu ATPaz la birleşir. Bu birleşme Na + -K + ATPaz transport proteininin Na + iyonuna olan yüksek ilgisinden kaynaklanır. 2. basamakta; transport proteini ATP molekülünü ADP ve fosfat iyonuna parçalar ve fosfat iyonu kendini transport proteinine bağlar. Proteininin fosforilasyonu enerji bakımından proteinin kararsız olmasına sebep olur ve protein tekrar stabil hale geçmek için yapısal değişikliklere uğrar. Bu değişim Na + iyonunun proteinin diğer ucuna hareket etmesine neden olur. Proteinin diğer ucuna geçmiş olan Na + iyonu buradan hücre dışına bırakılır. Çünkü transport proteini artık Na + iyonuna düşük ilgi göstermektedir. 3. basamakta; ortamın K + iyonu konsantrasyonu düşük olmasına rağmen proteinin yapısal durumu K + iyonuna yüksek ilgi göstermesine neden olur. Böylece protein iki K + iyonunu kendisine bağlar. Bu esnada proteine kovalent bağla bağlı olan fosfat grubu proteinden ayrılır ve bu ayrılış proteinin yapısal değişikliğe uğramasına sebep olur. 4. basamakta; yapısındaki değişiklikten dolayı K + iyonları proteinin diğer ucuna transfer olurlar. Bu yapısal değişiklik aynı zamanda proteinin K + iyonuna karşı olan ilgisinin azalmasına ve dolaysıyla K + iyonlarının sitoplazmaya dağılmasına neden olur. Bu işlemler ilk basamaktan başlayarak tekrar tekrar devam eder (Köksoy, 2002). 6

20 GİRİŞ Şekil 1.4. Na + ve K + iyonlarının taşınması (Köksoy, 2002). Na + -K + ATPaz, Na + ve K + iyonlarının konsantrasyonlarını kontrol ederek ekstrasellüler sıvı hacminin korunmasını, hücre membranının her iki tarafındaki iyon gradientlerinin düzenlenmesini ve kan basıncının ayarlanmasını sağlarken, kendisi de birçok molekülün kontrolü altındadır. Na + -K + ATPaz aktivitesi üzerinde etkili olan bu maddeler ise dopamin, aldesteron, angiotensin II ve nitrik oksittir (Beltowski ve ark., 2003) Glukoz Transportu Enerji kullanımında ilk basamak olarak glukoz, hücrelere girmelidir. Glukoz adipozitlere ve kasa, insulinin kolaylaştırdığı spesifik bir transport sistemi ile dahil olur. Transport ile ilgili değişiklikler primer olarak V max taki değişikliklere bağlıdır. Fakat K m deki değişiklikler de etkili olabilir. Glukoz transportu Şekil 1.5 de gösterilmiştir. Glukoz ve Na +, glukoz taşıyıcısındaki farklı konumlara bağlanırlar. Na + iyonu elektrokimyasal gradient boyunca hücre içine doğru hareket eder ve beraberinde glukozu da sürükler. Böylece Na + gradienti ne denli büyük olursa, o denli fazla miktarda glukoz hücreye girer ve eğer ekstrasellüler sıvıdaki Na + düşük olursa glukoz transportu durur. Dik bir Na + gradientinin eldesi için, söz konusu Na + /glukoz simportu düşük bir intrasellüler Na + konsantrasyonu sağlayan bir Na + /K + pompası tarafından oluşturulan gradientlere bağımlıdır. Benzer mekanizmalar diğer şekerlerin olduğu kadar amino asidlerin de transportunda kullanılırlar. Şekerlerin transsellüler hareketi, hücre içinde biriken glukozun, farklı bir yüzeyden yine bir dengeye doğru hareket etmesini sağlayan bir uniportu, yani ilave bir bileşiği kapsar, bu durum örneğin intestinal ve renal hücrelerde meydana gelir (Murray ve ark., 1996). 7