in Vitro Diagnostik kullanım Kullanılan Semboller REF Liste Numarası 2-8 C/ -20 C de saklayın Sadece Araştırma Kullanımı için RUO Dikkat!

Transkript

1 REF TV8-100FEP IVD in Vitro Diagnostik kullanım EL KİTABI Aladin (Sacace)'de End Point analizi (FEP) ile Flüoresan tespitinin ve HSV (Herpes simplex virus) DNA in nükleik asit amplifikasyonu için HSV FEP Kullanılan Semboller REF Liste Numarası 2-8 C/ -20 C de saklayın RUO Sadece Araştırma Kullanımı için Dikkat! LOT Lot Numarası VER Versiyon Son Kullanma Tarihi Reaktif İçerir Kullanım Bilgileri Üretici

2 İSİM HSV FEP GİRİŞ Herpes simpleks virüs-1 ve -2, Herpesviridae ailesinden Alpha-herpesvirinae aittir. Genomları çift-sarmal DNA lardan oluşur. HSV % 95 yayılma oranında en yaygın virüslerden biridir ve insan nufüsünün % de HSV-2 virüsü bulunur. Oral gerginlik olarak adlandırılan HSV-1 herpes labialis, herpetik stomatit ve keratitlere neden olur. HSV-2'ye genital gerilim denir ve ağırlıklı olarak genital herpese neden olur. Herpes lezyonları iki farklı formda lokalize şekilde bulunurlar bunlar: vücudun üst kısmında bulunan (dudak, yüz, ağız içinde) herpes lezyonlu labial herpes ve vücudun alt kısmında bulunan (genital, kalça, bacakların mukoz membranlarında) herpes lezyonlu genital herpesdir. Geçmişte, HSV-I sadece labial herpese ve HSV-II sadece genital herpese neden olduğuna inanılırdı. Virüslerin her iki türü için bu mevcut veriler çürütülmüştür. HSV teşhisinin laboratuvar yöntemleri, kan serumunda antikor tespiti için kültürel yöntem, sitolojik yöntem, bağışıklık-enzim testinden ve yayılmada HSV antijeni tespiti için immunoflorasan testten oluşur. Kültür yöntemi, hastadan alınan klinik materyalleri elde etmeyi, izli kültürleri kontamine etmeyi (ökaryotik hücrelerin transplantasyon yapabilen kültürleri, tavuk embriyoları ve benzeri ) ve ya ökaryotik hücrelerde sitopatik etkiyi yada immunofluoresans sonuçları dikkate alınarak kontaminasyon sonuçlarını analiz etmeyi sağlar. Kültür yöntemi, geçmişte HSV tanısında altın bir standart olmuştur. Yöntemin hassasiyeti ve özgüllüğü % ve % 100 dir. Doğal olarak zahmetli, kalıcı ve standart-olmadığı için, yöntem rutin teşhis pratiklerinde uygulanmaz. Sitolojik yöntem başka virüslerden ve HSV kaynaklanan değişiklikleri ayırt etmeye izin vermediği için düşük özgüllüğe sahip hastanın hücrelerinde virüsün sitopatojenik etkisini belirlemek için tasarlanmıştır. Doğrudan immunoflorasan yöntemi ürogenital yayılmalarda HSV tespiti için kullanılır çünkü uygulama kolaydır ve özel ekipman ve fazla para gerektirmez. Ancak, yöntem uçuk enfeksiyonunun subklinik formlarını tespit etmek için yeterli duyarlılığa sahip değildir. Serolojik analiz hamile kadınların muayenesi sırasında seronegatif kadınların tespitinde önemlidir, çünkü bu durumda, özellikle, enfeksiyon fetüs için son derece tehlikelidir. Çoğu sağlıklı insan klinik olarak HSV antikoruna sahiptir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) methodu HSV diagnosisde yüksek derecede hassas, spesifik ve az çalışır ve HSV in laboratuar teşhisinde çok önemlidir. KULLANIM AMACI HSV FEP tam kan, likör, ürogenital swablar, idrar ve prostatik sıvı ve diğer biyolojik materyallerde Herpes Simplex Virüs I ve II in kalitatif tespiti için bir testtir. TEST PRENSİBİ Kit HSV FEP üç temel aşamaya dayanır: örneklerden DNA izolasyonu, DNA amplifikasyonu ve Fluorescence End- Point (FEP) analiz. HSV DNA örneklerden ekstre edilir, amplifiye edilir ve HSV DNA ve Internal Kontrol için floresan reporter spesifik boya probları ile tespit edilir. İnternal Kontrol (IC) her biri tek tek işlenen örneğin amplifikasyon kontrolünü ve olası reaksiyon inhibisyonu tanımlanmasını sağlar. KİT İÇERİĞİ Part N 1 DNA-Sorb-B : örnek hazırlama; Part N 2 HSV FEP : amplifikasyon ve Fluorescence End-Point (FEP) kit. Part N 1 DNA-sorb-B : Lizis Solüsyonu, 2 x 15 ml; Yıkama Solüsyonu 1, 2 x 15 ml; Yıkama Solüsyonu 2, 2 x 50 ml; Sorbent, 2 x 1,25 ml; DNA-eluent, 2 x 5,0 ml. 100 test için gerekli reaktifler içerir. Part N 2 HSV FEP : PCR-mix-1-FEP 110 kullanıma hazır tek doz. PCR-mix-2-Flu, 0,77 ml; PCR-mix-Fon, 0,5 ml Positive Control C+, 0,2 ml; Negative Control C-, 1,2 ml; Internal Control IC, 1,0 ml; DNA-buffer, 0,5 ml; 110 test için gerekli reaktifler içerir.

3 KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Zone 1: örnek hazırlama: Biyolojik kabin eppendorf tipi tüpler için masa mikrosantrifüj (RCF max. 16,000 x g); Eppendorf 5415D ya da benzeri 60 C ± 2 C kuru ısı bloğu Vorteks mikser Aerosol bariyerli pipetörler ( 5-40 µl; µl; µl) 1,5 ml polipropilen steril tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf) Tek kullanımlık eldiven, pudrasız Tüp raklar Biyo tehlikeli atık konteynarı Buzdolabı Dondurucu Zone 2: Amplifikasyon: PCR Fluorescence Detector Aladin (Sacace) Workstation Pipetler (ayarlı) Tüp raklar UYARILAR VE ÖNLEMLER 1. Lizis Solusyonu, guanidine tiyosiyanat içerir. Guanidine tiyosiyanat solunursa, deri ile temas ederse ya da yutulursa zararlıdır. Asitler ile teması toksik gaz oluşumuna neden olur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). 2. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysisi ve göz koruyucu kullanın. Çalışmalardan sonra ellerinizi yıkayın. 3. Ağızla pipetleme yapmayın. 4. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. 5. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 6. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 7. Örnekler potansiyel enfeksiyon faktörü olarak kabul edilmeli ve biyolojik kabinlerde Biyo güvenlik Seviye 2 ya da diğer uygun biyo güvenlik pratiklerine göre çalışılmalıdır. 8. Dökülen tüm örnekler ya da reaktifleri 0,5% sodyum hipoklorit ya da uygun diğer dezenfektanlar ile temizleyin. 9. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun. 10. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 11. Bu kit DNA-Sorb ekstraksiyon kiti ile kullanılmak için dizayn edilmiştir. Eğer DNA-Sorb dan başka bir kit ile DNA ekstraksiyonu yapılıyorsa bu kullanıcı sorumluluğundadır. 12. Bu kiti ancak DNA amplifikasyon tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 13. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alanından başlayıp Amplifikasyon ve Belirleme alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin. SAKLAMA KOŞULLARI HSV I/II FEP +2-8 C de saklanabilir. KARARLILIK HSV FEP etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. Ürünün performansı etiket üzerinde yazılı kontrol tarihi ile sağlanacaktır. Işık, ısı ya da neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerin raf ömrünü etkileyebilir. Tekrarlanan çözdürme ve bu reaktiflerin dondurulması duyarlılığı azaltabildiği için bu durumdan kaçınılmalıdır. ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT HSV FEP aşağıdaki materyallerden ekstre edilmiş DNA lar ile analiz edilebilir: tam kan ACD veya EDTA tüplerinde toplanan; likör Eppendorf tüpte saklanan; doku ( 1,0 gr) cam çubuklar, teflon tokmak, skalpel ya da mekanik homojenizör ile homojenize edilmiş ve 1,0 ml tuzlu su ya da PBS sterilde çözülmüş 1,0 gr. Kuvvetlice vorteksleyin ve oda ısısında 30 dakika inkübe edin. Supernatantı yeni 1,5 ml tüpe aktarın; prostatik sıvı Eppendorf tüpte saklanan;

4 seminal sıvı: yaklaşık 30 μl seminal sıvıyı polipropilen tüplere (1,5 ml) aktarın ve 70 μl steril tuz solusyonu ekleyin; servikal, üretral, konjonktival swablar*: nükleaz-free 1,5 ml tüpe swabı ekleyin ve 0,2 ml Transport medyum ekleyin saniye boyunca ortamda swabı yavaşça sallayın. * DNA ekstraksiyonu için DNA-Sorb-A (REF K-1-1/A) kit kullanılmalıdır. 48 saatten daha uzun olmamak kaydıyla örnekleri 2 8 C de ya da daha uzun saklamak için 20/80 C de saklayın. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik ajanların transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır. ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Lizis Solüsyonu ve Yıkama Solüsyonu (diğerleri +2-8 C de saklanmasına rağmen) buz kristalleri çözülene kadar C ye kadar ısıtılır. Negatif Kontrol Ekstraksiyonu için bir tüp içeren 1,5 ml polipropilen tüplere gerekli miktarda hazırlayın. 2. Her bir tüpe 300 μl Lizis Solüsyonu ve 10 µl Internal Kontrol ekleyin. 3. Uygun tüplere 100 μl örnek ekleyin. 4. Aşağıdaki gibi Kontrolleri hazırlayın: Cneg işaretli tüpüne 100 μl C Negatif Kontrol ekleyin. 5.Tüpleri vorteksleyin ve 65 C de 5 dakika inkübe edin saniye santrifüj edin. Eğer örnek tamamen çözülmezse, maksimum hızda ( g.) 5 dakika tüpleri tekrar santirifüj edin ve DNA ekstraksiyonu için yeni bir tüp içine supernatantı aktarın. 6. Sorbenti şiddetlice vorteksleyin ve her bir tüpe 25 μl ekleyin saniye vorteksleyin ve tüm tüpleri oda ısısında 3 dakika inkübe edin. Bu adımı tekrar edin. 8. Tüm tüpleri 8000g de 30 sn santrifüj edin ve aerosol bariyerli mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 9. Her bir tüpe 300 μl Yıkama Solüsyonu 1 ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 8000g de 30 saniye santrifüjleyin. Her bir tüp için alın ve supernatantı atın. Tüpler arası geçişte pipet uçlarını değiştirin. 10.Her bir tüpe 500 μl Yıkama Solüsyonu 2 ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 8000g de 30 saniye santrifüjleyin. Her bir tüp için alın ve supernatantı atın. Tüpler arası geçişte pipet uçlarını değiştirin. 11. Adım 10 tekrar edin ve 65 C de 5 dakika açık kapakla bütün tüpleri inkübe edin. 12.Pelleti 50 μl DNA-eluent içinde yeniden suspense edin. 65 C de 5 dakika inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin. 13. Maksimum hızda ( g) 1 dakika boyunca tüpleri santrifüjleyin. Supernatant amplifikasyon için hazır DNA içerir. Eğer amplifikasyon aynı gün çalışılmayacaksa, işlenen örnekler 2-8 C de 5 güne kadar yada 20 /- 80 C de dondurularak saklanabilir. PCR PROTOKOL : 1. Örnekler ve kontroller için gerekli miktarlarda PCR-mix-1 FEP tüpleri hazırlayın. 2. Her bir tüpe 7 μl PCR-mix-2 Flu ekleyin. 3. Fon Kontrol hazırlayın: PCR-mix-1 FEP tüpe 17 µl PCR-mix-Fon ekleyin. 4. Uygun tüplere 10 μl ekstrat DNA ekleyin. 5. Her bir panel için 2 kontrol hazırlayın: Amplifikasyon Negatif Kontrol işaretli tüpe 10 µl DNA-buffer ekleyin; Amplifikasyon Pozitif Kontrol işaretli tüpe 10 µl Positive Control C+ ekleyin; 6. PCR-mix-1 FEP tüplerini kapatın ve ısısı 95 C ye yükselen termalcyclera koyun ve aşağıdaki programı başlatın. Aktif ısı düzenlemeleri ile Termocyclerlar GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems) Aktif ısı düzenlemeleri ile Termocyclerlar Gradient Palm Cycler (Corbett Research) Blok ısı düzenlemeleri ile Termocyclerlar Biometra, PTC-100 (MJ Research) Adım Zaman Döngü Zaman Döngü Zaman Döngü 0 95 С Durdur 95 С Durdur 95 С Durdur 1 95 С 5 dk 1 95 С 5 dk 1 95 С 5 dk 1 95 С 20 sn 95 С 20 sn 95 С 25 sn 65 С 25 sn С 20 sn С 40 sn С 30 sn 72 С 25 sn 72 С 40 sn 95 С 20 sn С 20 sn 95 С 25 sn 60 С 30sn 60 С 25 sn С 40 sn 24

5 3 72 С 30 sn 72 С 25 sn 72 С 40 sn 95 С 20 sn 95 С 20 sn 95 С 25 sn С 30 sn 60 С 25 sn 60 С 40 sn 5 10 С Adım 10 С Adım 10 С Adım 1 SONUÇ ANALİZLERİ Bu kiti kullanmadan önce lütfen Aladin Operating Manueli okuyun. 1. Ana menüde Edit (Yaz) ve Test System(Test sistemi) seçerek ALA-1 programı açın. 2. Yeni bir pencerede New(Yeni) seçin ve HSV adını girin (Eğer henüz eklenmemişse). OK basın. Fam ve Hex kanalını seçin. 3. Fam/HEX alanına bu değerleri ayarlayın: t- 1,9 ve t Hex kanalında İnternal Kontrol tespitini seçin ve İnternal Kontrol/Neg değerini 3.0 olarak ayarlayın. Save tıklayın. 5. Kanal penceresinde HSV ismini seçin ve FAM tıklayın. 6. Güvenlik aralığını % de 100 olarak ayarlayın. 7. Save(Kaydet) butonunu tıklayın. Fluorescence tespiti: 1. Gücü açın ve ALA_1 programı başlatın. 2. Yeni bir proje oluşturun. Bunu yapmak için, yeni bir proje oluşturmak için Project Create new menüsüne gidin. Açılan proje penceresinde yeni proje ayarlamayı seçin. Projenin adını girin, rotor türünü seçin (48 x 0.2), test-sistemini seçin ve sonrasında Sample kutusunda örnek için bir isim girin. 3. Ctrl+F komutu ile Fon Kontrolü ekleyin. 4. Sample kutusundaki sayılara göre Aladin in karüseli içine örnek ve kontrol tüplerini transfer edin. 5. Cihaz kapağını kapatın ve araç çubuğunda Run butonuna tıklayın ya da Project menüsüne gidin ve Run tıklayın. 6. Analiz tamamlandığında sonuçlar tabloda otomatik olarak gösterilir. File menüsünde Save as komutunu seçerek bir rapor dosyasında sonuçları kaydedin. 7. Pozitif örnek HSV-pozitif olarak, negatif HSV-negatif ve geçersiz HSV-geçersiz olarak görünür. Eğer örneklerin sayısı rotordaki soketlerden daha yüksekse, örneklerin sonraki serisi ilgili proje kolonunda yeni bir seri numarasına otomatik olarak sahip olacaktır. ÖZELLİKLER Analitik özgüllük Primerler ve probların analitik özgüllüğünü 100 negatif örnek ile doğrulanmıştır. Bu örnekler spesifik HSV 1/2 primerler ve problar ile sinyal vermezler. Kit HSV FEB ın potansiyel çapraz-reaktivitesi kontrol grubuna karşı aşağıdaki tabloda test edilmiştir. IC sonuçlar, HEX kanalında yorumlandığında HSV 1/2 sonucu Fam kanalında yorumlandı. Diğer patojenler ile herhangi bir çapraz-reaktivite gözlenmedi. Tablo 1: Başka patojenler ile kitin özgüllük testi: Kontrol Grubu HSV Fam Internal Control Joe/Cy3 Neisseria gonorrhoeae - + Ureaplasma urealyticum - + Gardnerella vaginalis - + Cytomegalovirus - + Epstein Barr virus - + Mycoplasma hominis - + Candida albicans - + Streptococcus pyogenus - + Treponema pallidum - + Listeria monocytogenes - + Chlamydia trachomatis - + HPV (11, 16, 18, 31,33) - + Mycoplasma genitalium - +

6 Analitik duyarlılığı ve tekrarlanabilirliği. HSV FEP kitin analitik duyarlılığı HSV ½ in Standart DNA kullanılarak tespit edildi. Bu standart DNA-buffer da seri şekilde dilüe edildi. Bu deneyin sonuçları aşağıdaki tabloda özetlenmiştir. Tablo 2: Kit HSV FEB in analitik duyarlığı Konsantrasyon (kopya/ml) Test sayısı Pozitif sonuç sayısı 5x x ,5 x Kit HSV FEP analitik duyarlılığı, 500 kopya/ml daha azdır. Hedef bölge: glikooprotein SORUN GİDERME 1. Ekstraksiyonun Negatif Kontrolu için IC (Hex) sinyal vermez ya da zayıf verir. PCR inhibe olur. Size önerilen DNA ekstraksiyon yöntemini kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını izlediğinizden emin olun. Ekstre edilmiş DNA pipetlenmeden önce maksimum hızda ( g) 2 dakika boyunca bütün tüpleri tekrar santrifüj edin ve dikkatlice süpernatantı alın. Reaksiyonda inhibe olan sorbent pellete dokunmayın. Reaktif saklama koşulları talimatlara uygun değildir. Saklama koşullarını kontrol edin. PCR koşulları talimatlara uygun değildir. PCR şartlarını ve protokolde rapor edilmiş flüoresans kanalını IC tespit için seçin. Reaktifleri pipetleme işlemi sırasında örneğe IC eklenmedi. DNA ekstraksiyon prosedürü sırasında dikkat edin. 2. Pozitif control sinyal vermez ya da zayıf verir. PCR koşulları talimatlara uygun değildi. Amplifikasyon protokolunu kontrol edin ve manuel de rapor edilmiş fluoresans kanalını seçin. 3. Negatif Kontrol ekstraksiyonu ile Fam sinyal verir. DNA ekstraksiyon prosedürü sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Ekstraksiyon prosedürü sırasında sadece filtre uçları kullanın. Tüpler arası geçişte uçları değiştirin. Reaktiflerin yeni bir seti ile DNA ekstraksiyonunu tekrar edin. 4. PCR Negatif Kontrolu (DNA-buffer) ile herhangi bir sinyal verir. PCR hazırlık işlemi sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleri ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Sonunda Pozitif kontrolü pipetleyin. Reaktiflerin yeni bir seti ile PCR hazırlanmasını tekrar edin. Sacace Biotechnologies Srl 44 Scalabrini str., Como, Italy