Kullanım Kılavuzu Giriş

Transkript

1 Kullanım Kılavuzu Giriş 1.Kullanım Amacı 2 2. Klinik Uygulamalar ve Test prensibi 2 3. Kit İçeriği 2 4. Saklama ve Raf Ömrü 3 5. Kullanım önerileri 4 6. Numune toplama, hazırlama ve saklama 4 7. Test prosedürü 5 8. Sorun giderme 7 9. Şema Yorumlama Data Yorumlama Protokolü 13

2 1.Kullanım Amacı AESKUSLIDES ANA/AMA/ASMA/APCA insan serumunda mitokondrial-/düz kas-antijen/ dolaşan parietal hücreleri karşıtı otoantikorları tespite yönelik bir indirekt immunofloresans testidir. 2. Klinik Uygulama ve Test prensibi Otoimmun hastalıklar hücresel veya hümoral immunolojik reaksiyonların düzensizliği nedeniyle ortaya çıkar. Normal olarak dış etkilere karşı meydana gelen bu reaksiyonlar belli koşullar altında vücudun kendi aleyhine dönebilir ve dolayısıyla çeşitli hastalıklara sebep olabilir. ANA Anti-nükleer-antikorların varlığı, sağlanan her dokuda pozitif nükleer flüoresans ile tespit edilebilir. AMA Anti-mitokondrial antikor (AMA) mitokondrinin (fosfolipidlerce zengin) iç membranıyla belirgin olarak reaksiyon gösterir. AMA, primer biliyer siroz, psödo-le sendromu ve kronik agresif hepatitin çeşitli formları gibi hastalıklarda sıkça görünür. Yüksek titre AMA sonuçları esas olarak,iltahabi olmayan safra kesesi enfeksiyonları veya primer biliyer sirozda bulundu (yaklaşık 90 % da pozitif sonuçlar). Bu durumda antikorlar, klinik belirtiler ortaya çıkmadan önce gözükür ve hastalığın seyri esnasında ancak tedavi ile etkilenecektir. Düşük antikor titreleri skleroderma, sjögren sendromu, romatoid artrit ve diğer otoimmun hastalıklarla gözlenmektedir. ASMA Düzgü kas antikorları, akut ve kronik hepatitler, primer biliyer siroz, ve karaciğer sirozunun diğer formları gibi çeşitli karaciğer hastalıklarında meydana gelir. Ayrıca, ASMA'in tespiti bulaşıcı mononükleoz, meme ve yumurtalık kanseri, malin melanom ve SLE'in tanısını destekler. APCA Mide mukozasınını parietal hücresinin yapılarına karşı dolaşan antikorlar genellikle pernisiyöz anemi nedeniyledir. Bunun yanında, tiroit hastalıkları (Hashimoto tiroidit, miksödem) ve midenin diğer hastalıkları(kronik atrofik gastrit, ülser) ile de tespit edilebilirler ve yaşlı hastalarda demir eksikliği anemisi,diyabet mellitusla nadiren görülür. Antijen Karakterizasyonu Antijen substrat : sıçan midesi, böbreği Çapraz - reaktivite Çapraz-reaktiviteler bilinmemektedir. Antikorun tespiti indirekt immunofloresans test (IIFA) prensibi üzerine kurulmuştur. Cam mikroskop slaytları, doku kısımları veya hücreleri (HEp-2-cells (ANA), Granulocytes (ANCA) veya Crithidia luciliae (ndna)) ile kaplıdır. Eğer hastanın serumu spesifik antikorlar içerirse, antikorlar ilk inkübasyon sırasında bağlanacaklardır. Yıkama sırasında bağlanmayan materyallerin uzaklaştırılmasından sonra, bağlı antikorlar fluoresans konjuge anti-insan immünoglobulinlar tarafından ikinci inkübasyon sırasında tespit edilir. Antijen-antikorkompleksin spesifik bir yeşil fluoresan boyaması, bir fluoresan mikroskobu yardımıyla görüntülenebilir.

3 3. Kit İçeriği Hazırlanacaklar: 50xyıkama buffer Konsantre yıkama buffer 1:50 distile suda diluent edilir (örneğin: 20 ml ml ) İçerik: PBS, sodyum azit(koruyucu) 10xnumune buffer Konsantre numune buffer 1:10 distile suda diluent edilir (örneğin: 20 ml ml) İçerik: PBS, BSA sodyum azit(koruyucu) Kullanıma hazır: Cam mikroskop slaytları 10 x 5 kuyular, doku kısımlarıyla kaplı Pozitif kontrol İçerik: İnsan serumu (diluent), sodium azide (koruyucu) 0.5 ml Negatif kontrol İçerik: İnsan serumu (diluent), sodium azide (koruyucu) 0.5 ml Floresans (FITC) konjuge anti-insan Ig toplam polivalan 2.0 ml Evans Mavisi 2% 3.0 ml Örtücü sıvı (Mounting Medium) 12 ml Gerekli fakat sağlanmayan malzemeler: - Distile su, - Numune dilüsyonu için test tüpler, - Ölçme flaksı, - Volumetrik pipet, - Saat, - FITC sistemiyle fluoresan mikroskop, (490 nm eksitasyon filtre, 510 nm bariyer filtre) - İnkübatör tepsi, - Boyama küveti, - Pipet uçları, - Kapak slipler (24x60 mm).

4 4. Saklama ve Raf Ömrü 2 C - 8 C / F de tüm reaktifleri şiddetli ışıktan koruyarak saklayınız. Her bir komponentin son kullanım tarihi şişe etiketi üzerinde gösterilir. Son kullanım tarihi dışında reaktifleri kullanmayınız. Orijinal kaplarında 2-8 C/35-46 F da tüm reaktif ve slaytları saklayınız. Hazırlanan solüsyonlar 4 C/39 F de bir ay için uygundur ve en azından bir defa hazırlanır. Reaktifler ve slaytlar sadece her bir komponentde belirtilen son kullanım tarihi içinde kullanılmalıdır. 5. Kullanım önlemleri 5.1 Sağlık tehlike datası Bu ürün sadece in vitro diagnostik kullanım içindir. Bu nedenle, sadece in vitro diagnostiklerin eğitimli personel ve özel olarak önerilen metotlarında uygulanmalıdır. Bu ürün, normal kullanımda toksik ya da zaralı olmamasına rağmen aşağıdaki maksimum güvenlik önlemlerini yapmanız önerilir: Öneriler ve önlemler Bu kit potansiyel zararlı komponentler içerir. Kit reaktifleri gözler ve deri için tahriş edici olmamasına rağmen, göz ve deri ile temasından kaçınmanızı ve eldiven kullanmanızı öneririz. Bu kitteki bazı reaktifler (kontroller, standardlar gibi) için kullanılan tüm insan kaynaklı materyaller kabul görmüş metodlar ile test edilmiş ve HbsAg, Hepatit C ve HIV 1 için negatif bulunmuşlardır. Buna rağmen, hiçbir test materyallerde tamamen viral ajanların yok olduğunu garanti edemez. Bu nedenle, kit kontrolleri, standartlar ve hasta örnekleri sanki enfeksiyon ajanı taşıyormuş gibi ve uluslararası gerekliliklere göre kullanılmalıdır. 5.2 Kullanım için genel talimatlar 1. Ağızla pipeti çekmeyiniz. Test çalışması sırasında yemek yemeyiniz, içki ve sigara içmeyiniz. 2. Farklı lot numarasındaki reaktiflerin yerini değiştirmeyiniz veya karıştırmayınız. Bu durum sonuçlarda değişmelere yol açabilir. 3. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için kullandıktan sonra tüm şişeleri kapalı tutunuz. 4. Her zaman yeni steril pipet ipuçlarıyla tüm solüsyonları çekiniz. 5. Asla 37 C/ 98.6 F 'den daha yüksek sıcaklığa bileşenleri maruz bırakmayınız. 6. Tüm prosedür uygulanırken slayt kuyularının kurumasına asla izin vermeyiniz. 7. Asla slaytları dondurmayınız. Kendi uyguladığı prosedürlere göre her laboratuvar kendi tekniklerini, kontrollerini, ekipmanını ve hasta nüfusunu kendi kontrolleri üzerinden uygulamalıdır.

5 Kesin klinik tanı sadece bu test performansına dayanmamalıdır, doktor tarafından tüm klinik ve laboratuar bulguları araştırıldıktan sonra konulmalıdır. 6. Numune toplama, ambalajlama ve depolama Numunelerin hazırlanması Tercihen toplanan taze serum numuneleri kullanılır. Kan alınma işlemi ulusal şartlara uygun olmalıdır. Aseptik olarak kan numunelerini toplayın. İkterik, lipemik, hemolize veya mikrobial kontamine örnekler yanlış reaksiyonlara neden olabilir. Partiküllü serumlar düşük hızlı santrifüj (<1000xg) tarafından temizlenmiş olmalıdır. Kan numuneleri, temiz, kuru ve boş tüplerde toplanmalıdır. Ayrılmadan sonra serum numuneleri hemen kullanılmalı, sırasıyla üç gün den fazla 2-8 C/35-46 F da saklanmalı veya uzun periyotlarda -20 C/-4 F da dondurmalıdır. Tekrarlanan dondurulma ve erimeden kaçının. 7. Test prosedürü 7.1 Pipetlemeden önce hazırlıklar Kullanımdan önce oda sıcaklığına (20-26 C / 64-78,8 F) ulaşana kadar tüm bileşenlere bekletin, testin optimum bir performansı için önerilen inkübasyon şemasını takip edin ve iyi karıştırın. 1. Numune bufferı ve yıkama bufferı hazırlığı: Konsantre numune bufferını distile su ile 1:10 oranında ve yıkama bufferinı distile su ile1:50 oranında dilüe edin. 2. Numunelerin seyreltilmesi: Hasta serumunu hazırlanan numune bufferıyla 1/1 oranında (tarama titre için paragraf 10 a bakın) dilüe edin. Kontroller kullanıma hazırdır! 3. Bir protokol hazırlama: 11. sayfada verilen test protokolünün kullanılmasını öneririz. 7.2 Test prosedürü 1. Gerekli miktarda slaytı paketten çıkartın ve işaretleyin. Kuyulara dokunmayın. Slaytların kurumasına izin vermeyin. 2. İlk inkübasyon Uygun kuyu içine seyreltilen her serumu ve kontrolleri(kullanıma hazır olanları) uygun bir hacimde pipetleyin, slayt yüzeyiyle pipetin direkt temasından kaçının. Her kuyunun serum ile tamamen kaplı olduğundan emin olun. Test materyalinin kuyuyu kaplayacak kadar hacimdekullanılması önemlidir. Ama kuyudan kuyuya

6 geçmesinden kaçının, çünkü bu, yanlış sonuçlara sebep olabilir. Slayt(lar) nemli bir inkübatör tepsisinde oda sıcaklığında 30 dakika inkube edilir. 3. Yıkama Inkübasyondan sonra inkübatör tepsisinden slaytları çıkarın ve bir pipet kullanarak yıkama bufferıyla iyice durulamayın. Kuyulara doğrudan bufferı fışkırtmayın. NOT: Slayt üzerinde çapraz kontaminasyonu önlemek için, slaydın orta çizgisi boyunca doğrudan yıkama bufferını akıtın. Bir slayt boyama küvetinde yıkama bufferıyla 15 dakika slayt(lar)yıkayın. Optimal sonuçlar elde etmek için üç kere 5 dakika yıkadıktan sonra buffer solüsyonunun değişmesi gereklidir. Slaytı yıkama küvetinden çıkartın ve slaydda kalan fazla yıkama bufferını dikkatli şekilde uzaklaştırın. NOT: Prosedür esnasında kuyuların kurumaması veya substrata zarar gelmemesi önemlidir. Lütfen lekelemeyin veya herhangi bir biçimde slaytı kurutmayın veya birkaç saniyeden daha uzun süre için flüoresan antikor reaktifi olmadan slaytı bekletmeyin. 4. İkinci inkübasyon Yıkama prosedüründen hemen sonra slaytı inkübatör tepsisine koyun ve her kuyuyu 30 µl FITC-konjuge ile kapatın. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika slaytı(ları) inkübe edin. 5. Yıkama Inkübasyondan sonra inkübatör tepsisinden slaytları çıkarın ve bir pipet kullanarak yıkama bufferıyla iyice durulamayın. Kuyulara doğrudan bufferı fışkırtmayın. Bir slayt boyama küvetinde yıkama bufferıyla 10 dakika slaytı(ları)yıkayın. Optimal sonuçlar için iki kere 5 dakika yıkadıktan sonra buffer solüsyonunun değişmesi gereklidir 6. Opsiyonlu counterstain: Yıkama bufferında 1:3000 counterstainla (Evans Blue) diluent edin ve iyice karıştırın. Boyama küvetinde counterstain eğin ve onun içinde 3-5 dakika boyunca slaytları inkübe edin. Evans mavisi, özel olmayan arka plan flüoresansını kapatır. Mak. 5 dakika sonra slayti(ları) çıkarın ve yıkama bufferıyla kısa süre içinde durulayın. Slaytta kalan fazla yıkama bufferı uzaklaştırın. Lütfen herhangi bir şekilde slaytı kurutmayın ya da lekelemeyin. 7. Örtücü(Mounting) Örtücü sıvının(mounting medium) yeterli bir miktarını her slaydın orta çizgisi boyunca ekleyin. Dikkatlice hava baloncuklarından kaçınacak şekilde slaydın kapağını yerleştirin. 8. Floresan mikroskobuyla x toplam büyültmeyle slaytı(ları) hemen okuyun (490 nm eksitasyon filtre, 510 nm bariyer filtre).

7 7.3 İş akışı Test prosedürü için paragraf 9 a bakınız. Uygun kuyuların içine kontrolleri ve diluent edilmiş her serumu pipetleyin. Distillenmiş veya deionize edilmiş suyun küçük bir miktarını bir inkübatör tepsisine yerleştirin ve slaytı(lar) inkübatör tepsisine uygun şekilde yerleştirin. Oda sıcaklığında (20-26 C / 64-78,8 F) 30 dakika slaytı(ları) inkübe edin. İnkübatör tepsisinden slaytları çıkarın ve pipet kullanarak yıkama bufferı ile iyice durulayın. Boyama küvetinde üç kez 5 dakika slaytları yıkayın. İnkübatör tepsisi içinde 30µl FITC konjugat ile her kuyuyu kapatın. Oda sıcaklığında (20-26 C / 64-78,8 F) 30 dakika karanlıkta slaytı(ları) inkübe edin. İnkübatör tepsisinden slaytları çıkarın ve pipet kullanarak yıkama bufferı ile iyice durulayın. Boyama küvetinde iki kez 5 dakika slaytları yıkayın. Yıkama bufferında counterstain (Evans mavisi) 1:3000 diluent edin. 3-5 dakika seyreltilmiş counterstain ile slaytları inkübe edin. Max. 5 dakika sonra slaytları çıkarın ve yıkama bufferıyla iyice durulayın. Her slaytın orta çizgisi boyunca örtücü sıvı (mounting medium) ekleyin. Fluoresan mikroskobuyla x toplam büyültmeyle hemen slaytı(ları) okuyun. (490 nm uyarı filtre, 510 nm bariyer filtre). 8.Sorun Giderme HATA OLASI NEDENLER SOLÜSYON Düşük hücre yoğunluğu - Deionize su ile uzun süreli temasından sonra hücre eriyip yok olabilir - Kuyu içinde substrat üzerine doğrudan buffer fışkırtılmış olabilir -Proteolitk enzimler substrate bağlanabilir Arızalı floresans - Kenarda daha güçlü olan floresans, serumu kuyuda kurutmuş olabilir -Serum test kuyusunda kapatılmış olabilir -Kuyular arasında çaprazreaksiyon olabilir -Slayt üzerinde bir filmi gösteren mum kalemiyle slayt işaretlenebilir -Yıkama prosedürünü takip edin - Serumu inaktiv edin - Her zaman nemli ortamda inkübe edin - Test materyalin hacmini eşit şekilde ayırarak kullanın -İlk inkübasyon döneminde kuyular arasındaki süreklilikten kaçının - Bir kurşun kalem kullanın -Mikroskop yanlış ayarlanmış - Mikroskopun ayarlarını kontrol edin

8 olabilir - UV-lambasının servis ömrünü kontrol edin Dağılmış resim - Slayt kapak olmadan buzdolabında inkübe edilmiş olabilir - I.F. Mikroskop kirlidir. Lensin üzeri çizilmiş olabilir. Az yada hiç olmayan floresans - Konjugat ve slaytlar erimiş ve tekrar donmuş olabilir - Seyreltik kontroller olabilir - Serum veya konjugatun bakterial bulaşması olabilir - Mikroskop ayarlanmamış olabilir - Yıkama bufferının ph-değeri çok düşük olabilir (ph-değeri 7.4 ± 0.2) - Parafin mumu veya tırnak cilasıyla slaytı kapatın -Talimatlara göre mikroskobu temizleyin - 2 C - 8 C / F de konjugat ve slaytları saklayın - Talimatları kontrol edin, kullanılan kit kontrolleri kullanıma hazırlayın - Şartları kontrol edin - FITC konjugat ışığa maruz kalmış olabilir -Işıktan konjugatı koruyarak saklayın Floresans arka planı - Hatalı yıkama, - Kurumuş slayt, - Lipemik, hemolitik serum, - Mikroskop hatası olabilir. - Yıkama talimatlarını kontrol edin - Slaytların kurumasına izin vermeyin - Sadece taze serum kullanın - Doğru filtre veya nesne mi kullanılmış kontrol edin. 9.Şema 10. Yorumlama EMA Tarama titre 1:5 Endomysium, yemek borusunun üçüncüsünün ortasında bulunan düzgün ve çizgili kas liflerinin birleşimini çevreleyen destekleyici yapıdır. Henüz karakterize olmuş endomysial hedef ile beraber kolajen ve retikulin içerir. Gliadin, çölyak hastalığında alevlendirici antijen olan glütenin ethanol-çözünür fraksiyonudur. Antikorlar çölyak hastalığı ve dermatit herpetiformius ile bağlantılıdır. AMA Tarama titre 1:20

9 Mitokondrialin granül floresansı, gastrik hücreleri, kupfer hücreleri, karaciğer hücresi ve renal borucuklu hücrelerin sitoplazma hücresinde görünür. ANA/AMA/ASMA/APCA Tarama titre 1:20 Birleşik doku kısmı, bir test alanı içinde çeşitli antikorların ayrımını sağlar ve böylece takip eden otoimmun antikorlar için bir tanı testi olarak uygulanabilir(farklı antikorlar durumunda başka teşhisi tanıyıp aramak için önerilir). Değerlendirme her zaman pozitif ve negatif kontrollerle yapılmalıdır. ANA: Anti-nükleer-antikorların varlığı, pozitif nükleer flüoresansı tarafından sağlanan her dokuda tespit edilebilir. AMA: Anti-Mitokondrial-antikor varlığı, renal tubulusun ince granül bir sitoplazmatik flüoresansını görüntüler. Merkezden uzak tubulusler, mitokondrialda daha zengindir ve bu yüzden yakın tubuluslerin aksine daha şiddetli bir flüoresans gösterirler. ASMA: ASMA'in varlığı, mide mukozasının interbeze kasılabilen fibriline ek olarak kas tabakası ventriküli, kas tabaka mukozası, böbrek ve midenin kan damarlarının düzgün kas liflerinin bir flüoresansı ile gösterilir. APCA: Gastrik mukoza membranda parietal hücrelerinin ince granülli flüoresansını APCA gösterir. AMA parietal hücreleriyle de reaksiyon gösterdiğinden beri, anti-mitokondrial antikorlar (renal tubuller), APCA değerlendirmesine dahil edilmemelidir. AMA: 1:20-1:80 (e.g. 10µl Serum + 790µl Numune buffer) Pozitif bir reaksiyon, birkaç karaciğer hastalığında bulunur. >1:160 (e.g. 10µl Serum µl Numune buffer) Biliyer siroz gösterir. AMA titreler uzun süre üzerinde sabit kalır ve tedaviye rağmen, tedavi kontrolünün bir ölçüsü olarak titre tespitinin yararlı olmadığıdır. ASMA: 1:20-1:80 (e.g. 10µl Serum + 790µl Numune buffer) Pozitif bir reaksiyon, birkaç karaciğer hastalığı, viral hepatit ve primer biliyer sirozunda bulunur. Ancak titreler tespit sınırının aşağısına düşebilir. Düşük titreler safra kesesi enfeksiyonları, alkolik siroz, SLE hastalarda gözlenebilir ve normal, sağlıklı nüfusun %2 sinde görülür. >1:160 (e.g. 10 µl Serum µl Numune buffer) Kronik aktif hepatit gösterilir. Viral hepatitin aksine titreler sadece biraz düşer ve birkaç yıl devam edebilir. Bulaşıcı mononükleozla hastalar yüksek ASMA titreler de gösterebilir. APCA: APCA titre, hastanın hastalık durumu hakkında hiçbir bilgiyi sağlamaz. Antikor tespiti, entrensek faktör ve/veya histopatoloji sonuçlarının ölçümüyle beraber değerlendirilmelidir. Uygun son titer, basit pozitif bir flüoresans gösteren hasta serumudur. 1:20 ve 1:80 arasında titrelerli zayıf flüoresans veya klinik sonuçlara göre belirsizlik kontrol izleme yoluyla kontrol

10 edilmelidir. Böyle bir durumda numuneler, yaklaşık her 3 haftada bir toplanmalıdır ve benzer şekilde test edilmelidir. Dilüsyon için örnekler: 1:40 20µL Serum + 780µL Numune buffer 1:80 10µL Serum + 790µL Numune buffer (sırasıyla 1:40 Dilüsyonun 1:2) 1:160 10µL Serum µL Numune buffer 1:320 5µL Serum µL Numune buffer 1: µL Serum µL Numune buffer