ÖZET Yüksek Lisans Tezi NAR ŞARAPLARINDA ANTİOKSİDAN FENOLİK BİLEŞİKLERİN BELİRLENMESİ Arda Can AKALIN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıd

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ NAR ŞARAPLARINDA ANTİOKSİDAN FENOLİK BİLEŞİKLERİN BELİRLENMESİ Arda Can AKALIN GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ANKARA 2011 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi NAR ŞARAPLARINDA ANTİOKSİDAN FENOLİK BİLEŞİKLERİN BELİRLENMESİ Arda Can AKALIN Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. R. Ertan ANLI Bu çalışmada Hicaz nar çeşitlerinde mikrovinikasyon ile meyve şarabı üretim koşulları incelenmiş ve nar şarabının fenolik bileşimi üzerinde çalışılmıştır. Şarapların suda çözünen kuru madde, toplam asitlik, toplam fenolik bileşikler, toplam monomerik antosiyanin miktarı ve polimerik renk, toplam antioksidan kapasite, alkol, uçar asit gibi kimyasal anlizleri yanında, HPLC ile bazı antioksidan fenolik bileşiklerin dağılımı incelenmiştir. Şarap üretiminde klasik maserasyon (N), çekirdek ilaveli maserasyon (Ç) ve enzim ve çekirdek ilaveli maserasyon (E) olmak üzere 3 yöntem uygulanmıştır. Toplam fenolik madde miktarları, nar şırasında ve 18 ay depolanan nar şaraplarında sırası ile 1896±100 mg/l (şıra) ve 1663±195 mg/l (N), 1339±173 mg/l (E), 1414±58 mg/l (Ç) olarak belirlenmiştir. Nar şırası ve nar şaraplarında fenolik bileşiklerden; gallik asit, kateşin, vanilik asit, kafeik asit, ferulik asit, p-kumarik asit, epikateşin ve hidroksisinamik asit saptanmıştır. Nar şırası ve şaraplarının tümünde gallik asit ve kateşin sırasıyla en fazla bulunan fenolik bileşikler olarak belirlenmiştir. Ayrıca, nar şırası ve nar şaraplarında toplam antioksidan kapasite değerleri sırası ile ortalama 9,84 mm/l (şıra) ve 9, 76 mm/l (N), 9,68 mm/l (E), 9,50 mm/l (Ç) trolox eşdeğeri olarak belirlenmiştir. Temmuz 2011, 57 sayfa Anahtar Kelimeler : Nar şarabı, HPLC, fenolik bileşikler, antioksidan kapasite i

3 ABSTRACT Master Thesis DETERMINATION OF ANTIOXIDANT PHENOLIC COMPOUNDS IN POMEGRANATE WINE Arda Can AKALIN Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering Supervisor: Prof. Dr. R. Ertan ANLI Different types of pomegranate wine production were realised by microvinification scale using Pomegranate of Hicaz in this study. The produced wines were compared each other according to their chemical, phenolic and antioxidant properties. Water soluble dry matter, acidity, density, alcohol content, volatile acidity, total monomeric anthocyanins and polarized color intensity and indivudual phenolic compounds were analysed as chemical analysis. Three different method - classical maseration (N), maseration with seed adding (Ç) and maseration with seed and enzyme adding (E) - were applied in production. Total phenolic compounds were determined in pomegranate juice and wines (N, E, and Ç; after 18 months storage) as 1896±100 mg/l and 1663±195 mg/l, 1339±173 mg/l, 1414±58 mg/l respectively. Phenolic compounds were identified in pomegranate juices and wine. The gallic acid, vanilic acid, caffeic acid, ferrulic acid, p-coumaric acid, hydroxycynamic acid, epicatechin, and catechin were determined by HPLC. According to the research result; the amounts of gallic acid and catechin was the highest phenolic compounds in pomegranate juice and wine. The total antioxidant capacity was also determined in pomegranate juice and wines (N,E and Ç) as 9,84 mm/l and 9, 76 mm/l; 9,68 mm/l and 9,50 mm/l, respectively. July 2011, 57 pages Key Words: Pomegranate wine, HPLC, phenolic compounds, antioxidant capacity ii

4 TEŞEKKÜR Tezimin hazırlanmasında, bana araştırma olanağı sağlayan ve desteğini esirgemeyen danışman hocam Sayın Prof. Dr. R. Ertan Anlı (Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı) ya, çalışmamın bütün analizlerinde yardımını esirgemeyen Sayın Araş. Gör. Mustafa Bayram a ve tez çalışmamda bana yardımcı olan bütün hocalarıma ve arkadaşlarıma teşekkür ederim. Arda C. Akalın Ankara, Temmuz 2011 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET... i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii SİMGELER DİZİNİ... vi ŞEKİLLER DİZİNİ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ. viii 1.GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Serbest Radikaller Antioksidanlar Fenolik Bileşikler Fenolik Asitler Flavonoidler Antosiyanidinler Flavonlar ve Flavonoller Kateşinler ve Löykoantosiyanidinler Proantosiyanidinler (Kondense Tanenler) Hidrolize Olabilen Tanenler Kırmızı Şaraplarda Renk Nar Meyvesi ve Kimyasal Bileşimi Nardaki Fenolik Bileşikler Narın Antioksidan Kapasitesi Narın Sağlık Üzerine Etkileri MATERYAL VE YÖNTEM Materyal ve Yöntem Kimyasal Analizler Kurumadde Tayini Genel Asitlik Tayini ph Tayini Yoğunluk Tayini Uçar Asit Analizi Alkol Tayini İndirgen Şeker Tayini Toplam Monomerik Antosiyanin Tayini Polimerik Renk Miktarı Tayini Toplam Fenolik Madde Miktarı Tayini Antioksidan Kapasitenin Belirlenmesi Fenolik Bileşik Dağılımının Belirlenmesi iv

6 3.6.1 HPLC Koşulları Örneklerin HPLC için Hazırlanması Duyusal Analiz ANALİZ VE BULGULAR Kurumadde Tayini Genel Asitlik Analizi ph Tayini Yoğunluk Tayini Uçar Asit Tayini Alkol Tayini İndirgen Şeker Tayini Toplam Monomerik Antosiyanin Tayini Polimerik Renk Miktarı Tayini Toplam Fenolik Madde Miktarı Analizi Fenolik Bileşik Dağılımının Belirlenmesi Toplam Antioksidan Kapasitenin Belirlenmesi Duyusal Analiz SONUÇ ve TARTIŞMA 42 KAYNAKLAR EK 1 Nar Şarapları ve Şıra Örneklerinin 520nm deki HPLC Kromatogramları EK 2 Fenolik Bileşik Standartlarına Ait Kalibrasyon Kurveleri.. 56 ÖZGEÇMİŞ v

7 SİMGELER DİZİNİ ATBS GAE HDL HPLC LDP Mal-3-Gli ROS Siy-3-Gli TAS Trolox (2,2'-Azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulphonate]) Gallik Asit Eşdeğeri Yüksek Yoğunluklu Lipoprotein Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatoğrafisi Düşük Yoğunluklu Lipoprotein Malvidin-3-Glikozit Reaktif Oksijen Türleri Siyanidin-3-Glikozit Toplam Antioksidan Kapasite 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman -2-carboxylic acid vi

8 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Fenolik asitlerin kimyasal yapıları... 5 Şekil 2.2 Flavonoidlerin genel yapısı... 6 Şekil 2.3 Antosiyanidinlerin kimyasal yapısı... 7 Şekil 2.4 Flavonlar ve flavonollerin kimyasal yapısı... 8 Şekil 2.5 Kateşin ve epikateşin in kimyasal yapıları... 9 Şekil 2.6 Prosiyanidin ve prodelfidin in kimyasal yapısı Şekil 2.7 Hidrolize olabilen tanenlerin kimyasal yapıları Şekil 2.8 Renksiz kastavinol ün renkli antosiyanin e dönüşümü Şekil 2.9 Proantosiyanidin B3 ün asit ortamda hidrolizi Şekil 3.1 Nar şaraplarının genel görüntüsü Şekil 3.2 Renksiz antosiyanin oluşumu Şekil 3.3 Fenolik maddelerin 280 nm deki HPLC kromatogramı Şekil 3.4 Fenolik maddelerin 320nm deki HPLC kromatogramı Şekil 3.5 Fenolik maddelerin 360nm deki HPLC kromatogramı Şekil 4.1 Nar şarplarında fermentasyon süresince yoğunluk değişimi Şekil 4.2 Toplam monomerik antosiyanin ölçümü Şekil 4.3 Toplam fenolik madde analizi ölçümleri Şekil 4.4 Galik asit kurvesi Şekil 4.5 Nar şarabında 280nm deki HPLC kromatogramı 40 Şekil 4.6 Nar şarabında 320nm deki HPLC kromatogramı 40 Şekil 4.7 Nar şarabında 3600nm deki HPLC kromatogramı Şekil 4.8 N, E ve Ç nar şaraplarının görünümleri vii

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Antosiyaninlerin model solüsyonda depolama... süresince absorbans ve renk yoğunluğu değişimleri Çizelge 3.1 HPLC çözücü akış profili Çizelge 3.2 Fenolik asit standartlarına ait tutulma zamanı,....maksimum absorbans ve R 2 değerleri Çizelge 3.3 Duyusal analiz kriterleri Çizelge 4.1 Nar şırasında kuru madde miktarı Çizelge 4.2 Nar şaraplarında ve şırada genel asitlik miktarları Çizelge 4.3 Nar şırasında ve şaraplarinda ph değerleri Çizelge 4.4 Nar şırası ve şaraplarında yoğunluk miktarları Çizelge 4.5 Nar şaraplarının uçar asit değerleri Çizelge 4.6 Nar şaraplarının alkol miktarları Çizelge 4.7 Nar şaraplarında indirgen şeker miktarları Çizelge 4.8 Nar şaraplarında ve şırada toplam monomerik... antosiyanin miktarlari Çizelge 4.9 Nar şaraplarında ve şırada polimerik renk Çizelge 4.10 Nar şaraplarında ve şırada toplam fenolik madde.....miktarları Çizelge 4.11 Nar şaraplarında ve şırada fenolik bileşik miktarları.. 39 Çizelge 4.12 Nar şaraplarının antioksidan kapasitesi Çizelge 4.13 Duyusal analiz sonuçları viii

10 1. GİRİŞ Nar (Punica granatum L.) yenilebilen en eski meyvelerden birisidir ve sıklıkla tropikal ve yarı tropikal bölgelerde yetişir. Orta Doğu kökeninde, Akdeniz den Güneydoğu Asya ve Güneybatı Amerika bölgelerine kadar değişen bir alanda yetiştirilir (Lansky ve Newman 2007, Çam ve Durmaz 2009). Günümüzde nar yetiştiriciliği ABD, Afganistan, Çin, Fas, Filistin, Hindistan, Irak, İran, İspanya, İsrail, İtalya, Kıbrıs, Mısır, Suriye, Suudi Arabistan, Tayland, Tunus, Türkiye ve diğer bazı ülkelerde yapılmaktadır. Nar ülkemizde de yıllardır yetiştirilen geleneksel bir meyvedir (Özgüven ve Yılmaz 2000). Epidemiyolojik çalışmalar nar gibi yüksek fenolik bileşik içeren meyve ve sebzelerin tüketiminin kardiyovasküler ve serebrovasküler rahatsızlıklar ve kanser ölümlerini azalttığını göstermiştir. Meyvelerde bulunan fenolik bileşikler faydalı etkilerini serbest radikalleri süpürerek gösterebilirler. Son yıllarda, diyetlerde bulunan fenolik bileşiklerin belirlenmesine yönelik yapılan çalışmalar giderek artmaktadır. Üzümsü ve çileksi meyvelerin suları gibi kırmızı meyve suları antioksidan aktiviteleri açısından dikkat çekmektedir. Nar suyu ise önemli biyolojik etkilerinden dolayı diğer meyvelerden daha fazla gündemdedir (Gil vd. 2000). Bununla bağlantılı olarak düşünüldüğünde, günde bir ve ya iki bardak sarap tüketiminin yaklaşık olarak % arasında koroner kalp hastalığı riskini azalttığı savunulmaktadır. Akdeniz insanlarında koroner kalp hastalıkları vakalarının düşük olması beslenme alışkanlıklarının yanı sıra, kısmen şarap veya alkol alımı ile de ilişkili bulunmaktadır ( Yücel ve Ötleş 2001). Nar kabuğunda bulunan tanenlerin (punicacortein in) antioksidan ve antitümör aktiviteleri, nar suyunun antioksidan aktivitesi ve fenolik dağılımı ve fermente nar suyunun antioksidan aktiviteleri daha önce yapılan çalışmalarda bildirilmiştir (Gil vd. 2000). Ancak nar şarabının üretim koşullarına bağlı olarak içerdiği fenolik bileşikler ve antioksidan aktivitelerine dair kapsamlı bir araştırma henüz yapılmamıştır. Bu çalışmada nar suyundan farklı koşullarda mikrovinifikasyon yöntemi ile şarap 1

11 üretilerek nar şarabı üretim koşulları araştırılmıştır. Elde edilen şarapların genel kimyasal yapı ve duyusal özellikleri yanında toplam fenolik madde miktarı, fenolik bileşiklerin dağılımı ve antioksidan kapasitesi belirlenmiş, nardan kaliteli şarap üretimi için farklı üretim koşulları değerlendirilmiştir. 2

12 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Serbest Radikaller Kimyasal bileşikler, iki veya daha çok elementin aralarında kimyasal bağ oluşturması ile meydana gelir. Bu bağlar negatif yüklü elektronlarla sarılmıştır ve bu elektronların düzeni bileşiğe kararlılık sağlar. Kararlı bileşiklerin elektronları çiftlenmiş halde bulunur. Eğer elektron çiftlenmemiş ise molekül daha reaktif ve kararsız duruma geçer. Bir ya da daha fazla sayıda çiftlenmemiş elektrona sahip element veya bileşiklere serbest radikaller denir. Serbest radikallerdeki çiftlenmemiş elektronlar kararlı duruma geçmek ister ve kararlı halde bulunan bir bileşikten elektron alarak, bu bileşiği yeni bir serbest radikal haline dönüştürür. Serbest radikallerin başlattığı bu zincirleme reaksiyonlar dizisi, antioksidanlar tarafından durduruluncaya kadar devam eder. Bu durum aslında hayatın her evresinde yaşamakta olduğumuz doğal bir süreçtir (Gökpınar vd. 2006). Organizmada serbest radikaller gerek normal metabolik faaliyetlerin bir yan ürünü olarak, gerekse radyasyon, ilaçlar ve diğer zararlı kimyasalların etkisi ile oluşur. Metabolizma yan ürünleri olarak süperoksit anyonları (O 2, O:), hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) ve hidroksil radikali (OH) gibi mutajenler meydana gelir. Ayrıca NADPH oksidaz gibi bazı enzimler küçük miktarlarda Reaktif Oksijen Türleri (ROS) üretir (Kazanç 1997, Gökpınar vd. 2006). 2.2 Antioksidanlar Antioksidan, bir başka molekülün oksidasyonunu yavaşlatabilen veya önleyebilen bir molekül olarak tanımlanabilir (Moon ve Shibamoto 2009). Antioksidanlar vücutta serbest radikaller ile reaksiyona girerek oto oksidasyonu önleyen savunma mekanizmalarıdır. Yaşamsal olayların devamlılığı için gerekli olan oksijen aynı zamanda bir çok hastalık ve dejeneratif gelişimin nedeni olarak görülmektedir. İnsanlarda metabolik olaylar sırasında oksijen kullanımına bağlı olarak süperoksit (O 2 ), hidroksil (OH ), peroksil (ROO ), alkoksil (RO ), semikuinon (Q ), nitrik oksit (NO ) 3

13 kökleri ile hidrojen peroksit (H 2 O 2 ), peroksinitrit (ONOO ) ve singlet oksijen (¹O 2 ) gibi aktif oksijen formları meydana gelmektedir. Ayrıca radyasyon, çeşitli gazlar, ağır metaller, herbisitler, pestisitler ile tedavi amaçlı kullanılan birçok ilaç, oksidatif stres nedeni olarak gösterilen aktif oksijen oluşumuna neden olurlar. Oksidatif stres, normal metabolik faaliyetler için gerekli olan aktif oksijen-antioksidan dengesini aktif oksijen lehine bozarak; DNA, protein, karbonhidrat ve lipidlerde zararlanmaya yol açmakta ve basta koroner hastalıklar, kanser, diyabet ve karaciğer tahribatı olmak üzere birçok hastalığa neden olmaktadır (Yücel ve Ötleş 2001). Antioksidanlar başlıca dört yolla oksidanları etkisiz hale getirirler; 1. Süpürme etkisi (Scavenging): Oksidanları daha zayıf yeni bir moleküle dönüştürerek etkisizleştirir. Antioksidan enzimler ve mikromoleküller bu yolla etki eder. 2. Söndürme etkisi (Quenching): Oksidanlara bir hidrojen aktararak inaktive etmesine denir. Vitaminler, flavanoidler, timetazidin ve mannitol bu şekide etki eder. 3. Zincir reaksiyonlarını kırma etkisi (Chain Breaking): Hemoglobin, serüloplazmin ve ağır mineraller oksidanları kendilerine bağlar ve inaktive eder. 4. Onarma etkisi (Repair): Oksidatif hasar görmüş biyomolekülü onarırlar (Gökpınar vd. 2006). Vitamin E ve C, karotenoidler ve fenolik bileşikler antioksidan özellikleri ile dikkat çeken maddelerdir. Vitamin C, süperoksit, hidrojen peroksit, hipoklorit, hidroksil ve peroksil kökleri ile singlet oksijen formundaki aktif oksijenlerin temizlenmesinde en etkili antioksidandır. Vitamin E ise hidroksil, alkoksil, peroksil kökleri ve singlet oksijen gibi aktif oksijen formlarının neden oldugu oksidasyonu önler. ß-karoten antioksidan özelligini singlet oksijen aktivitesi (vücudun ışığa hassasiyet reaksiyonu) ve peroksil köklerine karşı göstermektedir ( Yücel ve Ötleş 2001). Konuyla ilgili yapılan çalışmalarda, antioksidan yapıların etki mekanizmaları ile birçok hastalığı önleyebildiği belirlenmiştir. Son zamanlarda araştırmacılar doğal antioksidan olarak değerlendirebileceğimiz, bitkilerde bulunan polifenoller ve flavonoidlere daha çok ilgi göstermektedirler (Frankel ve Finley 2008, Moon ve Shibamoto 2009). 4

14 2.3 Fenolik Bileşikler Benzen halkası içeren organik maddeler genel olarak fenolik Bileşikler olarak adlandırılmakta olup bunlar bitkiler aleminde bulunan ikincil metabolitlerdir. Kimyasal açıdan flavonoid olmayanlar (hidroksisinnamik, hidroksibenzoik asit ve türevleri, fenolik alkoller) ve flavonoidler (antosiyaninler, flavon-3-ol monomerleri ve polimerleri, flavonoller ve proantosiyanidinler) olmak üzere iki gruba ayrılmaktadır. Benzoik asitlerin esterleşmesi sonucu oluşan hidrolize olabilen tanenler ve proantosiyanidinler (kondense tanenler), tanenler kategorisinde değerlendirilebilir (Ribéreau-Gayon vd. 2000) Fenolik Asitler Fenolik asitler, kimyasal yönden hidroksisinnamik (sinamik) ve hidroksibenzoik (benzoik) asitler olmak üzere iki gruba ayrılmaktadır (Şekil 2.1). Hidroksibenzoik asitler C 6 -C 1 (fenilmetan), hidroksisinamik asitler ise C 6 -C 3 (fenilpropan) yapısındadır. Benzoik asit türevlerine örnek olarak, protokateşuik asit, p-hidroksibenzoik asit, vanilik asit, salisilik asit ve gensitik asit verilebilir. Kumarik asit, kafeik asit, ferulik asit ve sinapik asit ise sinamik asit türevlerindendir (Ribéreau-Gayon vd. 2000, Yücel ve Ötleş 2001, Nizamoğlu ve Nas 2010). Şekil 2.1 Fenolik asitlerin kimyasal yapıları (Jackson 2000, Fraga 2010) 5

15 2.3.2 Flavonoidler Flavonoidler (flavon türevleri) yapısında C 6 -C 3 -C 6 (difenilpropan) formunda iki fenil halkasının propan zinciri ile birleşmesinden oluşur ve 15 karbon atomu içerirler. Antosiyanidinler, flavonlar, flavonoller, kateşin ve lökoantosiyanidinler ile protoantosiyanidinler olmak üzere 5 alt grupta incelenirler. Flavonoidlerin yapısındaki OH grupları, reaktif özelliklerinden dolayı kolaylıkla glikozitlenir (Ribéreau-Gayon vd. 2000, Yücel ve Ötleş 2001, Nizamlıoğlu ve Nas 2010). Şekil 2.2 Flavonoidlerin genel yapısı (Fraga 2010) Antosiyanidinler Doğada serbest halde bulunmazlar, şekerlerle glikozit yapmış olarak bulunurlar ve antosiyanin adını alırlar. Antosiyaninler meyve ve sebzelerin pembe, kırmızı ve mor tondaki çeşitli renklerini veren suda çözünebilir nitelikteki renk pigmentleridir. Antosiyaninler, bağlanan şekerlere ve bağlanma pozisyonuna göre adlandırılırlar (Nizamlıoğlu ve Nas 2010). Antosiyanin molekülündeki hidroksil grubu (-OH) sayısı arttıkça renk maviye doğru dönmekte, metoksil grubu (-OCH 3 ) sayısındaki artış kırmızı tonun güçlenmesine neden olmaktadır. Örneğin, renkteki kırmızılık siyanidinden peonidine doğru artış göstermektedir (Canbaş 1983). Antosiyanin bileşiklerinin ph ya bağlı renk kaybının ph: 3,2-3,5 aralığında en fazla olduğu belirlenmiştir. Antosiyaninler asit ortamda 6

16 kırmızı renkli flavilyum katyonu halindeyken, nötr ve bazik ortamlarda mavi renkli bileşikler haline dönüşmektedir (Ribéreau-Gayon vd. 2000). Şekil 2.3 Antosiyanidinlerin kimyasal yapısı (Jackson 2000, Moreno-Arribas ve Polo 2009, Fraga 2010) Antosiyaninler bir aglikon (antosiyanidin), şeker ve bazen fenolik ve minör organik asitlerden oluşur. Şeker kısmı genellikle ramnoz, galaktoz, ksiloz ve arabinozdan meydana gelir. Ayrıca p-kumarik, kafeik ve ferulik asit gibi asitlerle de açillenmiş olabilir. Açillenmiş antosiyaninlerin, açillenmemiş olanlara göre daha stabil olduğu belirlenmiştir (Nizamlıoğlu ve Nas 2010). Kırmızı şarap üretiminde antosiyaninlerin şaraba geçişi, maserasyon süresi, ekstraksiyon şekli ve üretim teknolojisi gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. Kırmızı şarapta pektolitik enzim uygulaması, özellikle antosiyanin miktarını artırmak için uygulanan yöntemlerden birisidir. Bu durum şarabın kromatik karakteristiğini artırsa bile, yüksek fenolik bileşik içeriğinin herzaman kırmızı renk yoğunluğunu ve tonunu artırmadığı belirtilmiştir (Revilla ve González-Sanjosé 2001). Antosiyanin stabilitesi ve reaktivitesi, oksijen ve asetaldehit varlığı veya pigment ve kopigment konsantrasyonuna bağlı olarak değişir. Ayrıca kırmızı şarap üretimlerinde enzim uygulandığında, depolama süresince yeni antosiyanin pigmentlerinin oluştuğu ve geliştiği de bildirilmiştir. Kırmızı şaraplarda bu pigmentlere antosiyaninlerin glikozit, asetik ve sinamik türevleri, yeni oluşan antosiyanin Vitisin B, antosiyaninin pürivik türevi vitisin A ve malvidin-kateşin kondense bileşikleri örnek olarak verilebilir 7

17 (Revilla ve González-Sanjosé 2001) Flavonlar ve Flavonoller Temel flovonoid molekülünüde orta halkanın 3. karbon atomuna flavonlarda (H), flavonollarda (OH) grubu bağlanmıştır. Antosiyanidinler gibi bunlarda şekerlerle glikozit halinde bağlanmış olarak bulunurlar (Nizamlıoğlu ve Nas 2010). Şekil 2.4 Flavonlar ve flavonollerin kimyasal yapısı (Jackson 2000, Fraga 2010) Kateşinler ve Löykoantosiyanidinler Hidroksil grubu ve üçüncü karbon atomunda doymuş bağ içeren flavonoidler, flavonoller olarak bilinir. Flavan-3,4-diol ler ve flavan-3-ol ler bu gruba dahildir. Bunların meyvelerde bulunanları (+)-kateşin, (-)-epikateşin, (+)-gallokateşin ve (-)- epigallokateşindir (Margalit 2004). Kateşinler, hem kimyasal hem de enzimatik olarak hava oksijeni ile kolaylıkla kondanse olarak proantosiyanidinleri oluştururlar (Nizamlıoğlu ve Nas 2010). Şarabın duyusal özellikerini önemli derecede etkilerler. (-)- Epikateşin, (+)-kateşine göre daha yüksek acılık ve burukluğa sahiptir. Yüksek oranda (-)-epikateşin içeren oligomerler ise yüksek oranda (+)-kateşin içerenlere göre daha fazla burukluğa sahiptir (He vd. 2008). 8

18 Şekil 2.5 Kateşin ve epikateşin in kimyasal yapıları (Jackson 2000, Fraga 2010) Proantosiyanidinler (Kondense Tanenler) Kateşinlerden veya löykoantosiyanidinlerden oluşan polimerik yapılara proantosiyanidinler adı verilir. Bu yapı, sadece epikateşin ve kateşin kondensasyonu ile oluşuyorsa prosiyanidin, kateşin ve gallokateşin kondensasyonu ile oluşuyorsa prodelfinidin adını alır. Bitkisel gıdalarda yaygın olarak bulunan proantosiyanidinler; (-)-epikateşin ve (+)-kateşin kombinasyonlarından oluşan dimerlerdir (Nizamlıoğlu ve Nas 2010). Kımızı şaraplarda proantosiyanidinler, çekirdek gibi bölümlerden maserasyon, fermentasyon ve presleme işlemlerinde şaraba geçerler. Şaraplarda yıllandırma süresince, proantosiyanidinler, flavonoller ve antosiyaninler çeşitli kimyasal reaksiyonlar sonucu tat ve renk değişimlerine yol açarlar (He vd. 2008). Depolama ve şarabın yıllandırılması sırasında, proantosiyandin ve antosiyanin miktarları sürekli olarak değişir. Bu durum, burukluğun ve acılığın azalmasına ve rengin kırmızıdan kiremit kırmızıya dönmesine neden olur. Bu tip değişmeler, proantosiyanidinlerin polimerizasyonuyla yakından ilgilidir ve antosiyaninlerin ve flavanollerin kondensasyonu sonucunda yüksek molakül ağırlıklı proantosiyanidin antosiyanin kompleksleri oluşur (He vd. 2008). 9

19 Şekil 2.6 Prosiyanidin ve prodelfidin in kimyasal yapısı (Fennema, 1996) Hidrolize olabilen tanenler Hidrolize olabilelen tanenler, gallik asitin ve hegzahidroksidifenik asitin glikoz poliesterleridir. En önemlileri glikozun gallik asitle bağlanmış formu ve bu dimerin lakton formu olan elajik asittir.yapılarındaki şeker genellike D-glikozdur. Asit, alkali ortamda veya enzim aktivitesi ile hidrolize olabilirler. Gallotanenlerin hidrolizi sonucu gallik asit, elajitaninlerin hidrolizi sonucu ellajik asit ortaya çıkar (Fennema 1996, deman 1999). 10

20 Şekil 2.7 Hidrolize olabilen tanenlerin kimyasal yapıları (Moreno-Arribas ve Polo 2009). Fenolik bileşikler gıdalarda buruk (prosiyanidinlerin 6-8 monomerli olanları) ve acı (prosiyanidinlerin 3-5 monomerli olanları) tadın kaynağıdırlar. Bu bileşikler, proteinlerle kompleks yaparak tortu oluşturabilir ve berraklığı olumsuz etkileyebilirler. Ayrıca, renk değişimlerinde (enzimatik esmerleşmeler ve şaraplarda siyah kırılma) önemli rol oynarlar (Yücel ve Ötleş 2001). Sebze ve meyvelerde çok fazla sayı ve tipte bulunan fenolik bileşiklerden şarapta bulunan belli başlıları; fenolik asitler, antosiyanidinler, flavonol glikozitleri, sinamik asit türevleri, kateşinler ve protoantosiyanidinlerdir. Şaraba özellik kazandıran fenolik bileşikler şarabın sadece rengi, burukluğu, sertligi ve oksidatif düzeyine degil, aynı zamanda antioksidan olarak sağlık üzerine de doğrudan yararlı etki gösterirler. Ayrıca, fenolik bileşikler anti-bakteriyel aktiviteye sahip olduklarından varlıkları şarap kalitesini arttırır. Şaraplarda bulunan fenolik bileşiklerin konsantrasyonunu etkileyen en önemli faktörler; uygulanan şarap yapım teknolojisi, maserasyon süresi, etil alkol konsantrasyonu, fermentasyon sıcaklığı, maserasyon, pres basıncı ve şarabın 11

21 olgunlaştırılması sırasındaki dönüşümlerdir (Yücel ve Ötleş 2001) Kırmızı şaraplarda renk Jensen vd. (2008), kırmızı şaraplarda rengin, büyük ölçüde antosiyaninler, antosiyanin türevleri ve polimerik pigmentler olmak üzere şarabın fenolik içeriğine bağlı olduğunu belirtmiştir. Ayrıca fenolik bileşiklerin fermentasyon ve olgunlaşma basamaklarında farklı reaksiyonlarına girebileceğini belirtmiştir. Şaraplarda yıllandırma süresince, proantosiyanidinler, flavonoller ve antosiyaninler çeşitli kimyasal reaksiyonlar sonucu tat ve renk değişimlerine yol açarlar (He vd. 2008). Antosiyaninlerin şaraba geçişi; maserasyon süresi, ekstraksiyon şekli ve üretim teknolojisi gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. Kırmızı şaraplarda pektolitik enzim uygulaması, özellikle antosiyanin miktarını artırmak için uygulanan yöntemlerden birisidir. Bu durum şarabın kromatik karakteristiğini artırabilir. Ancak, yüksek fenolik bileşik miktarlarındaki artış, her zaman kırmızı renk yoğunluğunu ve tonundaki artışla paralellik göstermeyebilir (Revilla ve González-Sanjosé 2001). Kırmızı şaraplarda üretim sürecinde proantosiyanidinler, çekirdek gibi bölümlerden maserasyon, fermentasyon ve presleme işlemlerinde şaraba geçerler (He vd. 2008). Flavanol-3-ol ler (sıklıkla (+)-kateşin veya (-)-epikateşin) antosiyaninler ve flavonollerle polimerik pigmentler oluşturabilirler. Şarapta düşük molekül ağırlıklı proantosiyanidin-antosiyanin pigmentleri, direkt olarak proantosiyanidin ve antosiyaninlerin reaksiyonu sonucu oluşabilirler. Flavan-3-ol ler ve flavonoller de renksiz dimerler veya kiremit kırmızı-yeşil tonda dimerler oluşturabilir (He vd. 2008). Depolama ve şarabın yıllandırılması sırasında, proantosiyandin ve antosiyanin miktarları sürekli olarak değişir. Bu durum, burukluğun ve acılığın azalmasına ve rengin kırmızıdan kiremit kırmızıya dönmesine neden olur. Bu tip değişmeler, proantosiyanidinlerin polimerizasyonuyla yakından ilgilidir ve antosiyaninlerin ve flavonollerin kondensasyonu sonucunda yüksek molakül ağırlıklı proantosiyanidin antosiyanin kompleksi oluşmasıyla da ilişkilidir. Yapılan araştırmalar göstermiştir ki, şaraptaki proantosiyanidin reaksiyonları büyük ve küçük polimerler oluşturabilmektedir 12

22 (He vd. 2008). Ayrıca depolama süresince kırmızı şarapların fenol içeriğinde ciddi bir düşüş veya dönüşüm olmaktadır. Bu durum, kondense veya polimerik pigmentlerin oluşumuyla yakın ilişki göstermektedir. Kırmızı şaraplardaki renk modifikasyonunun birincil temeli budur. Şaraplardaki polimerik pigmentlerin bazıları, orjinal bileşiklerden daha stabildir. Bir yıl eskitilmiş şaraplarda bu bileşiklerin oranı %50 den daha fazla olabilir. Kırmızı şaraplarda kondensasyon oluşumu, serbest antosiyaninlerin azalarak, yerlerine yeni polimerik bileşiklerin oluşmasıyla açıklanabilir. Yapısal modifikasyonlar, renk tonunun tam kırmızıdan turuncu kahverengiye karakteristik dönüşümü ile sonuçlanır (Revilla ve González-Sanjosé 2001). Yüksek molekül ağırlığındaki kompleks proantosiyanidinler, şarapta hala çözünebilir formdadır ve şarabın rengi, burukluğu ve acılığından hala sorumludurlar (Sun vd. 2001, He vd. 2008). Enzim uygulanmış kırmızı şaraplarda düşük düzeydeki antosiyanin-mono-glikozit miktarı, enzim uygulaması sounucunda kateşin, proantosiyanidin ve flavonol konsantrasyonlarında değişime neden olarak, bu bileşiklerin serbest antosiyaninlerle (özellikle antosiyanin-3-glikozit) kondense olmasından kaynaklanabilmektedir. Yapılan bir araştırmada; Rapidase çeşidi enzimlerin antosiyaninlerin pürivik türevlerini önemli derecede arttırdığı belirlenmiştir (Revilla ve González-Sanjosé 2001). Pektolitik enzim ve renk enzimi uygulaması yapılan örneklerde, kontrol örneklerine göre daha yüksek miktarda malvidin-kateşin kondense bileşikleri (dimer ve polimerleri) belirlenmiştir (Revilla ve González-Sanjosé 2001). Revilla ve González-Sanjosé (2001) enzim uygulamasının şaraplarda renk üzerine etkisi üzerine yaptıkları araştırmalarında enzim uygulanmayan kontrol örneklerinin enzim uygulananlara göre önemli derecede daha bulanık olduğu ve bu bulanıklığın kolloidal polimerlerin yüksek pektin içermesi nedeniyle stabilize olmasından ileri geldiğini belirlemişleridir. Bu bulanıklık optik yoğunluk üzerine etki etmektedir. Sonuç olarak beklenenin aksine, kontrol örneklerinin renk açısından yüksek renk yoğunluğu değerlerine sahip olduğu belirtilmiştir. 13

23 Bakker vd. (1993), şaraplarda eskitme sürecinde renk değişimlerini inceledikleri çalışmalarında kırmızı şarapların ana renk bileşiği olan malvidin-3-glikozit i temel alarak, kateşin, asetaldehit ve demir iyonlarının renk ve polimerizasyon üzerine olan etkilerini araştırmışlar. Sonuç olarak, depolama sürecinde malvidin-3-glikozit ve kateşin miktarlarının, özellikle asetaldehit varlığında ciddi bir azalma gösterdiğini bulmuşlardır. Bu azalma, malvidin-3-glikozit ve kateşin ile malvidin-3-glikozit, kateşin ve demir iyonlarının birlikte bulunduğu örneklere göre daha fazla miktarda belirlenmiştir. Antosiyaninlerin oksidatif yıkımları araştırıldığında, asitlendirilmiş (%0,1 HCl) alkol solüsyonunda ve ışık varlığında birkaç gün sonrasında renklerini kaybettikleri belirlenmiştir. Bu reaksiyon; temel olarak alkol konsantrasyonu ve ortamdaki alkolün çeşitine (etanol ve metanol gibi) bağlıdır. Oksijen ve ışık bu reaksiyonu katalizlemektedir. Reaksiyon sonucunda, ortamda dihidroflavonol bileşikleri belirlenmiştir (Ribéreau-Gayon ve Glories 2006). Antosiyaninlerin kanıtlanmış bir diğer özelliği de α-dikarbonil grubu (-CH 3 COCOCH 3 ) içeren diasetil gibi bileşiklerle reaksiyona girmeleridir. Bu reaksiyon sonucunda kastavinol bileşiği oluşur. Üzümlerde olmayıp, kırmızı şaraplarda kendiliğinden oluşan bu bileşik, renksiz formdadır ve asit ortamda prosiyanidinlerin antosiyaninlere dönüşmesi gibi, tekrar renkli antosiyanin molekülüne dönüşebilir. Proantosiyanidin in siyanidin e dönüşümü yüksek sıcaklık ve asitlik gerektirebilir ancak, kastavinol için buna gerek yoktur ve reaksiyon eskitme sürecinde kendiğinden gerçekleşir (Ribéreau- Gayon ve Glories 2006). 14

24 Şekil 2.8 Rensiz Kastavinol ün Renkli Antosiyanin e dönüşümü (Ribéreau- Gayon ve Glories 2006). Kırmızı şaraplarda oda sıcaklığında depolamanın antosiyaninler üzerine olan etkileri, %10 etanol, 5 mg/l tartarik asit ve ph: 3,2 deki 500 mg/l antosiyanin içeren model solüsyonda belirlenmiştir. Bulunan sonuçlar çizelge 2.1 de verilmiştir (Ribéreau-Gayon ve Glories 2006). 15

25 Çizelge 2.1 Antosiyaninlerin model solüsyonda depolama süresince absorbans ve renk yoğunluğu değişimleri (Ribéreau-Gayon ve Glories 2006). Proantosiyanidinler asidik ortamda ısıtıldığında, C-C bağlarının kopması soucunda merkezdeki flavan ünitesinin oligomerden karbokasyon sonucu ayrıldığı ve daha sonra okside olarak renkli antosiyanine dönüştüğü belirlenmiştir (Belitz vd. 2009). Şarap üzerinde yapılan bir model çalışmada ise, proantosiyanidin B3 ün 3,2 ph daki asit ve alkol ortamında karbokasyonu sonucu etandiol gibi nükleofilik bileşiklerle kolaylıkla reaksiyona girebildiği belirlenmiştir. Araştırmada, ortamda (+)-kateşinin türevi olan 4-α-etiltiyoflavan-3-ol izole edilmiştir (Ribéreau-Gayon ve Glories 2006). 16

26 Şekil 2.9 Proantosiyanidin B3 ün asit ortamda hidrolizi (Ribéreau-Gayon ve Glories 2006) 17

27 2.4 Nar Meyvesi ve Kimyasal Bileşimi Nar, içerdiği belirli grup bileşiklerin hastalık önlemede yararlı olması nedeniyle insan beslenmesinde önemli etkilere sahiptir. Bunun sonucunda günümüzde nar üzerineki ilgi giderek artmaktadır. Nar ın yenilebilir kısmı önemli miktarda şeker, vitamin, polisakkarit, fenolik bileşik ve mineral içermektedir. Taze olarak tüketilebileceği gibi meyve suyu, reçel, şurup, şarap ve sos olarak da tüketilir (Çam vd. 2009). Nar meyvesinin toplam ağırlığının yaklaşık yarısı, yenilebilir kısmı olan meyve tanesi kısmıdır. Bunun %78 i nar suyundan, %22 si ise çekirdek kısmından oluşmaktadır (El Nemr vd. 1990). Narın yenilebilir kısmında sitrik ve malik asit başta olmak üzere asetik, fumarik ve laktik asitler değişik miktarlarda bulunur. Olgun narın yenilebilir meyve kısmında protein, toplam fenolik madde ve askorbik asit miktarları yaklaşık olarak sırası ile 500 mg/kg, 1500 mg/kg ve 100 mg/kg dır. Nar suyu askorbik asit, antosiyaninler ve punikalajin, ellajik ve gallik asit gibi fenolik bileşikleri içermektedir (Malik vd. 2005, Seram vd. 2005, Lansky 2006, Tezcan vd. 2009). Taze sıkılmış nar suyunda şeker oranı yaklaşık % 16 dır. Yapılan araştırmalara göre, narın suda çözünebilir kuru madde oranı %16-18, şeker miktarının g/l, titrasyon asitliği ise 2-55,2 g/l arasında değiştiği bildirilmiştir (Ünal vd. 1995, El Nemr vd. 1990, Poyrazoğlu vd. 2002). Ülkemizde farklı bölgelerde yetişen narların çekirdek bileşimleri üzerine yapılan bir araştırmada nar çekirdeği, nar çeşitlerine göre değişmekle birlikte, %13,95-24,13 yağ, %12,35-21,28 protein ve %1,50-3,96 oranlarında kül içermektedir. Nar çekirdekleri yine kurumadde bazında; %0,308-1,399 potasyum, %0,252-0,650 fosfor, %0, kalsiyum, % ,276 magnezyum, mg/kg sodyum, 26,69-81,12 mg/kg demir, 15,23-40,26 mg/kg çinko, 24,03-38,53 mg/kg bakır ve 6,18-13,12 mg/kg değerleri arasında değişen oranlarda da mangan içermektedir (Gölükçü vd. 2007). 18

28 2.5 Nardaki Fenolik Bileşikler Nar, renkli ve renksiz fenolik bileşikler bakımından oldukça zengindir. Nar suyundaki çözünebilen polifenol miktarının çeşite göre değişmekle birlikte % 0.2 ile %1 arasında olduğu ve çoğunlukla antosiyaninlerle birlikte (siyanidin-3-glikozit, siyanidin-3,5- diglikozit, ve delfindin-3-glikozit), kateşinler, ellajik tannenler ve gallik ve ellajik asitleri içerdiği bildirilmiştir (Aviram vd. 2000, Çam vd. 2009). Nar suyundaki baskın antosiyanin delfinidin-3,5-diglikozit dir. Nar çekirdeği zarı (seed coat) delfinidin-3- glikozit, delfinidin-3,5-diglikozit, siyanidin-3-glikozit, siyanidin-3,5-diglikozit, pelargonidin-3-glikozit ve pelargonidin-3,5-diglikozit içermektedir (Noda vd. 2002). Hicaz narları üzerine yapılan bir çalışmada nar şırasında belirlenen antosiyaninlerin toplam miktarı 273,8 mg/l dir. Toplam antosiyaninlerin önemli bir kısmını siyanidin- 3,5-diglikozit (%41.6) oluşturmuş ve bu bileşiğin miktarı mg/l olarak belirlenmiştir. Bununla birlikte, siyanidin-3-glikozit (66.35 mg/l), delfinidin-3,5- diglikozit (57.06 mg/l), pelargonidin-3,5-diglikozit (25.23 mg/l), delfinidin-3-glikozit (6.61 mg/l) ve pelargonidin-3-glikozit (4.72 mg/l) hicaz narlarında belirlenen antosiyaninlerdir (Kelebek ve Canbaş 2010). Nar suyu üzerinde yapılan bir başka çalışmada fenolik bileşenleri 34,9 mg/kg gallik asit, 21,6 mg/kg vanilik asit, 3,9 mg/kg protokateşuik asit, 42,3 mg/kg p-hidrosibenzoik asit, 100,1 mg/kg p-kumarik asit ve 139,5 mg/kg ferulik asit olarak belirlenmiştir. Buna ek olarak nar suyundaki fenolik bileşik miktarının ananas, mango ve portakal suyu fenolik bileşiklerine kıyasla daha fazla olduğu belirlenmiştir (Swatsitang vd. 1999). Wonderful nar çeşiti üzerine yapılan bir çalışmada ise, nar suyundaki toplam fenolik bileşiklerin yaklaşık %40 ının flavonoid grubuna ait bileşiklerin (kateşinler, fenolikler ve antosiyaninler) oluşturduğu bildirilmiştir (Aviram vd. 2000). Ülkemizde farklı illerde yetişen 13 farklı nar çeşidindeki 10 fenolik bileşiğin incelendiği bir çalışmada çeşitlerin ortalamasına göre fenolik bileşiklerin miktarları; 4,55±8,55 mg/l gallik asit, 3,72±2,29 mg/l kateşin, 0,84±0,64 mg/l protokateşuik asit, 0,78±0,79 19

29 mg/l kafeik asit, 1,24±1,42 mg/l klorojenik asit, 0,01±0,02 mg/l ferulik asit, 0,06±0,07 mg/l p-kumarik asit, 0,017±0,08 mg/l o-kumarik asit, 0,99±1,47 mg/l floridzin ve 2,50±1,96 mg/l kuersetin olarak belirlenmiştir (Poyrazoğlu vd. 2002). Nar çekirdeği üzerine yapılan bir araştırmada, kurutulmuş nar çekirdeği kuru ağırlığının toplam fenolik içeriği 2427 mg/kg ve proantosiyanidin içeriği 505 mg/kg olarak belirlenmiştir. Nar çekirdeği kalıntılarındaki fenolik bileşiklerin kütle spektrumu analizlerinde fenolik asitlerden di-kafeik asit, ferulik asit türevleri ve kafeik asit; flavan- 3-ol lerden, proantosiyanidin trimerleri, prosiyanidin dimerleri, prosiyanidin ve kateşin; flavonoidlerden, kuersetin-3-ramnozid, kaempferol-3-glikozit ve kaempferol-3- rutinozid; hidrolize olabilen tanenlerden, pendunkunlajin, 3-galloglukopiranoz, 4- galloglukopiranoz ve 5-galloglukopiranoz belirlenmiştir (He vd. 2011). Ülkemizde nar çekirdekleri üzerine yapılan bir başka araştırmada ise; nar çekirdeklerinin 1535 ile 3701 mg/kg aralığında toplam fenolik madde içerdiği belirlenmiştir (Gölükçü vd. 2007). Türkiye de yetiştirilen Kalecik karası, Öküzgözü, Boğazkere ve Papazkarası üzüm çeşitlerinden elde edilen kırmızı şaraplar arasındaki karakteristik farkları belirlemek için, sekiz fenolik asit (ferulik, o-kumarik, p-kumarik, kafeik, şirincik, trans-sinamik, klorojenik ve gallik asitler) ile beş flavonoid ((+)-kateşin, (-)-epikateşin, kuersetin, vanillin ve rutin) standartı kullanılmıştır. Şarap örneklerinde en fazla bulunan fenolik bileşikler, flavonoidlerden (+)-kateşin (17,82 33,59 mg/l) ve fenolik asitlerden de gallik asit (13,25-16,39 mg/l) olarak belirlenmiştir (Özkan ve Göktürk Baydar 2006). Farklı nar sularının fenolik bileşik içeriği üzerinde de nar çeşiti, iklim koşulları gibi çevresel faktörler oldukça etkili olduğu bildirilmiştir (Schwartz vd. 2009). Şarap üretiminde bu faktörlere ek olarak üretim yöntemlerinden gelen farklılıkların da ekleneceği düşünüldüğünde elde edilecek şarabın fenolik bileşik içeriğinin değişkenlik göstermesi kaçınılmazdır. 20

30 Türkiyede yapılan bir araştırmada nar şarabının kırmızı şaraba kıyasla daha fazla fenolik madde içerdiği belirlenmiştir. Bu çalışmada kırmızı şarabın 815 mg/l, nar şarabının ise 4,850mg/L gallik asite eşdeğer fenolik madde içerdiği ve toplam antioksidan aktivitelerinin de nar şarabında 39,5%, kırmızı şarapta ise 33,7% olduğu belirlenmiştir (Sezer vd. 2007). 2.6 Narın Antioksidan Kapasitesi Nar suyunun antioksidan kapasitesi diğer meyvelerde olduğu gibi çeşit, yetiştiği bölge, iklim ve olgunluğa bağlıdır. Ayrıca meyve suyu üretiminde kullanılan yöntem ve teknoloji de antioksidan kapasiteyi etkileyebilir. Özellikle nar kabuğunun antioksidan kapasitesinin oldukça yüksek olduğu belirlenmiştir. Yapılan çalışmalar, nar suyunun başta antosiyaninler olmak üzere yüksek düzeyde hidrolize olabilen tanen içerdiğini göstermiştir. Hidrolize olabilen tanen içeriği açısından, nar suyunun ortalama olarak kırmızı şarap ve yeşil çaydakinden 3 kat; üzüm suyu, greyfurt ve portakal suyunda belirlenen miktarlardan 6-8 kat daha fazla olduğu görülmektedir (Gil vd. 2000, Negi vd. 2003, Tzulker vd. 2007). Yapılan diğer çalışmalarda ise nar ve nardan elde edilen yan ürünlerin güçlü bir serbest radikal süpürücü ve etkili bir antioksidan aktiviteye sahip olduğu belirtilmiştir (De-Nigris vd. 2005, Balasundram vd. 2006, Rosenblat vd. 2006). Elma, üzüm, armut, ayva ve nar meyvelerinin kullanılarak yapıldığı bir çalışmada narın en yüksek antioksidan aktiviteye (%62,7) sahip meyve olduğu belirlenmiştir. Araştırmada narın toplam flavonoid içeriğinin 459±67 mg/kg toplam fenol içeriğinin ise 2408±38,9 mg/kg olduğu belirlenmiştir (Karadeniz vd. 1997). Ayrıca, 28 farklı meyve türünün kabuk, meyve eti ve tohumundaki antioksidan (toplam fenolik ve flavonoidler) aktivitelerinin incelendiği başka bir çalışmada özellikle nar kabuğu ve üzüm çekirdeği gibi bazı meyvelerin tohum ve kabuk kısımlarının yüksek antioksidan aktiviteye sahip oldukları belirlenmiştir (Guo vd. 2003). 21

31 Çin de yaygın olarak yetişen beyaz nar çeşitinin antioksidan özellikleri üzerinde yapılan çalışmada narın kabuk parçalarının meyve etine göre daha yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir. Bu çalışmada fenolik maddeler, kabukta 2494 mg/kg, meyve etinde 244 mg/kg; flavonoidler kabukta 591 mg/kg, meyve etinde 1720 mg/kg; proantosiyanidinler ise kabukta 1090 mg/kg ve meyve etinde 85 mg/kg olarak bulunmuştur (Li vd. 2006). 2.7 Narın Sağlık Üzerine Etkileri İnsan organizmasında bulunan serbest radikaller; yağlar, proteinler ve nükleik asitler gibi farklı moleküllerin oksidasyonuna neden olmaktadır. Antioksidan bileşikler, serbest radikalleri etkisiz hale getirme yeteneğine sahiptir (Clifford 1998). Fenolik bileşiklerin antioksidan aktivitesi serbest radikalleri temizlemesi ve hidrojen atomlarını veya elektronlarını vermesinden kaynaklanmaktadır (Balasundram vd. 2005). Son yıllarda yapılan araştırmalarda meyve ve sebzelerin vitamin C, E ve karatenoidler gibi farklı antioksidan bileşikleri içerdiği belirlenmiştir. Bunlara ek olarak flavonoidler gibi polifenol bileşiklerinin de insan sağlığına olumlu etkilerinin olduğu ve bu bileşiklerin antioksidan kapasitelerinin vitamin E ve C den daha fazla olduğu belirlenmiştir (Bors vd. 1990, Rene vd. 2001). Fenolik bileşiklerin sağlığı koruyucu ve hastalık önleyici etkilerini desteklemek amacıyla yapılan bir çalışmada, sağlıklı bireylerde nar ekstraktı tüketiminin ardından fenolik bileşiklerin vücuttaki emilimleri ve antioksidan aktiviteleri araştırılmış, sonuçlar nar ekstraktının tüketiminin ardından elajik asitin vücutta emiliminin varlığını desteklemiş ve plazmada belirli bir antioksidan aktivite artışı belirlenmiştir (Mertens-Talcott vd. 2006). Fenolik bileşiklerce zengin ahududu, böğürtlen, nar, çilek, vişne, kiraz, erik, üzüm, lahana, pancar, patlıcan gibi koyu kırmızı ve mor renkli meyve ve sebzelerin bazı kanser tipleri, damar ve kalp rahatsızlıkları gibi erken ölümlere neden olan bazı hastalıkların ortaya çıkışını engellemede çok etkili olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir ve narda bulunan fenolik bileşiklerin de insan sağlığı açısından birçok yararlı etkisinin olduğu belirtilmiştir (El Nemr vd. 1990). Günümüzde narın kanser 22

32 önleyici (Afag vd. 2005, Lansky 2005), antiproliferatif apoptotik (Seram vd. 2005) HIV-I inhibitör, antimikrobiyel (Al-Zoreky 2009), mikrobisit (Neurath vd. 2004), kardioprotektif (Summer vd. 2005), antihiperlipidemik (Fuhrman vd. 2005) gibi sağlık açısından birçok olumlu etkiye sahip olduğu tespit edilmiştir. Yapılan klinik araştırmalarda nar suyunun, LDL, HDL ve kolesterol gibi bazı kan değerlerinde değişiklikler yaptığı (Aviram vd. 2000), prostat kanserini önlediği, kalp rahatsızlıklarına (Sumner vd. 2005), kansere ve alzaymıra karşı etkili olduğu ve erkek hastalarda sperm kalitesi artırdığı ve erektil disfonksiyonun düzelmesini sağladığı bildirilmiştir (Tezcan vd. 2009). Nardaki bazı asit ve polifenollerin prostoglandin etki mekanizmasında faydalı olduğu düşünülmektedir. Prostoglandinler adı verilen bir grup molekül metabolizmada, kanda pıhtı oluşumunu önleme ve kan damarlarının çapının ayarlanması gibi önemli etkilere sahiptir. Nar, portakal ve kırmızı üzüm suları karşılaştırıldığında, nar suyunun insan hücrelerinde prostoglandin sentezini arttırdığı belirlenmiştir. Ayrıca, nar suyunun antioksidan etkisinin de diğer meyve sularından daha fazla olduğu bulunmuştur. Laboratuvar şartlarında kanserli hücrelerin ilaçlara karşı direncinin önlenmesinde, nardan saflaştırılan kateşin molekülünün olumlu etkisi olduğu gözlemlenmiştir. Deney hayvanlarına azoksimetan verilerek oluşturulan kolon kanserinin, nar çekirdeği diyetiyle kontrol grubuna göre gerilediği belirlenmiştir. Nar çekirdeği yağının, kanser tümörünün vücuda yayılma sürecinde yeni kan damarları meydana gelmesini (anjiogenezis) yavaşlatarak, tümörün vücuda yayılmasının gecikmesinde rol oynadığı görülmüştür. Nar suyu ve çekirdeğinin hormona bağlı olmayan farklı kanser hücrelerinde seçici olarak proğramlı hücre ölümüne (apoptozis) sebep olduğu belirlenmiş, prostat kanserlerinde ise proğramlı hücre ölümlerini hızlandırıcı (pro-apoptotik) etkisi belirlenmiştir (Toi vd. 2003, Mirdehghan ve Rahemi 2007). Nar suyunun damar tıkanıklığı veya başka bir sebeple kalbin yeterli miktarda oksijen yetersizliğinden koroner kalp hastalarındaki etkisini incelemek amacıyla yapılan bir araştırmada, hastalara 240 mililitre nar suyu üç ay boyunca günlük olarak içirilmiştir. Kontrol hastalarına ise renkli ve aynı kaloriyi taşıyan sıvı verilmiştir. Bu süre içerisinde her iki gruba almakta oldukları diğer ilaçlar da verilmiştir. Günlük nar suyu içen 23

33 hastalarda (kontrol grubuna kıyasla) iskeminin iyileşebileceğine dair belirtiler elde edilmiştir (Mirdehghan ve Rahemi 2007). Nar şarabı da kuşkusuz, nar suyu ve üretim şekline göre nar çekirdeğinde bulunan fenolik bileşikleri içereceğinden sağlık açısından düşünüldüğünde önemli bir yere sahip olacaktır. 24

34 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal ve Yöntem Bu çalışmada, farklı proses koşullarında üretilen nar şaraplarının kimyasal bileşimi ve duyusal özellikleri yanında, farklı proses koşullarının fenolik bileşiklerin dağılımı üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Şarap üretiminde, 2009 yılı hasatında Mersin den temin edilen Hicaz çeşiti nar meyvesi kullanılmıştır. Narlar kabukların ayrıldıktan sonra tanelenmiş ve ardından Ankara Üniversitesi Meyve Suyu İşletmesi nde paket preste preslenmiştir. Preslemenin ardından elde edilen şıranın şeker miktarı için öksele değeri ölçümü yapılmış ve başlangıç ökselesi olan 68º Ö, şeker ilavesi ile 90 º Ö ye tamamlanmıştır. Fermentasyonda N (klasik maserasyon), Ç (çekirdek ilaveli maserasyon) ve E (enzim ve çekirdek ilaveli maserasyon) olarak isimlendirilen 3 farklı yöntem kullanılmış ve üretimler üçer paralel olarak gerçekleştirilmiştir. Şekil 3.1 Nar Şaraplarının Genel Görüntüsü 25

35 İlk olarak N şarapları için şeker miktarı ayarlanmış şıraya 2 g/l aktif kuru maya eklenerek fermentasyona başlanmıştır. İkinci yöntemde Ç şaraplarında, şıra+nar çekiderdeği ile birlikte yine 2 g/l aktif kuru maya eklenerek fermentasyona başlanmıştır. Son olarak E şarapları için ikinci yönteme ek olarak şıraya pektolitik enzim ilave edilmiştir. Fermentasyonda, SIHA Aktivhefe V (Saccharomyces cerevisiae Brennerhefe) aktif kuru maya kullanılmıştır. Enzim uygulanan şaraplarda kullanılan enzimler Rapidase CX pektolitik enzim ve Rapidase EX Color dur. Fermentasyonda tüm metodlarda eş zamanda aşılama yapılmış ve fermentasyon sıcaklıkları 24 C yi geçmemiş, ortalama olarak 21 C de sürdürülmüştür. Fermentasyonun tamamlanasının ardından şaraplar tortularından ayrılarak 0,75L lik yeşil cam şişelere alınmış ve mantarlanmışlardır. Fermentasyon tamamlandıktan sonra alınan örnekler -18 C de muhafaza edilmiştir. Şişelenen örnekler soğutucuda +4 C de 18 ay depolanmıştır. 3.2 Kimyasal Analizler Kurumadde Tayini Suda çözünebilir kuru madde miktarı Anonim (1986) ya (TS 4890) göre yapılmıştır Genel Asitlik Tayini Genel asitlik, Kourkoutas vd. (2002) nın yöntemi modifiye edilerek titrimetrik olarak tayin edilmiştir ph Tayini ph tayini, Anonim (1986) ya (TS 4890) göre yapılmıştır. ph tayininde Cyberscan 510 elekronik ph metre kullanılmıştır. 26

36 3.2.4 Yoğunluk Tayini Şıranın yoğunluğu, Fidan (1975) e göre tayin edilmiştir Uçar Asit Analizi Uçar asit analizi, yarı mikro metotla yapılmıştır (Aktan ve Kalkan 2000) Alkol Tayini Şarabın alkol miktarı, Yavuzeser (1989) a göre tayin edilmiştir İndirgen Şeker Tayini Şarapta indirgen şeker analizi, Yavuzeser (1989) a göre tayin edilmiştir Toplam Monomerik Antosiyanin Tayini Şaraplarda ve şırada toplam monomerik antosiyanin tayini AOAC Official Method (2005) a göre spektrofotometrik yöntemle yapılmıştır. Bu yöntemin prensibi antosiyaninlerin farklı ph değerlerinde (ph: 1 renkli okzonyum ve ph: 4,5 renksiz hemikal form) geri dönüşümlü olarak renkli ve rensiz formlar oluşturmasına ve bu değerlerin spektrofotometrik olarak 520 nm deki absorbans ölçümleri arasındaki farklılıklara dayanmaktadır. Sonuçlar siyanidin-3-glikozit olarak belirlenmektedir. Çalışmada Shimadzu UV-1700 Pharmaspec UV-Vis spektrofotometre ve TCC sıcaklık kontrol ünitesi kullanılmıştır Polimerik Renk Miktarı Tayini Şaraplarda ve şırada polimerik renk yüzdesi Somers ve Evans (1974) e göre spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. Bu yöntemin prensibi, monomerik antosiyaninlerin potasyum meta-bisülfit ile reaksiyonu sonucu renklerini kaybetmeleri, 27

37 ancak polimerize antosiyaninlerin bu reaksiyona girmeyerek renklerini korumalarına dayanmaktadır. Kullanılan spektrofotometre Shimadzu UV-1700 Pharmaspec UV-Vis spektrofotometre ve TCC sıcaklık kontrol ünitesidir. Şekil 3.2 Renksiz antosiyanin oluşumu (Giusti ve Wrolstad 2001) 3.4 Toplam Fenolik Madde Miktarı Tayini Toplam fenolik madde miktarı, Folin-Ciocalteu ve indis yöntemleri kullanılarak spektrofotometrik olarak belirlenmiştir (Negro vd. 2003). Kullanılan spektrofotometre Shimadzu UV-1700 Pharmaspec UV-Vis spektrofotometre ve TCC sıcaklık kontrol ünitesidir. 3.5 Antioksidan Kapasitenin Belirlenmesi Şaraplarda antioksidan kapasite Randox kiti ile (NX23332, Randox Laboratories Ltd., U.K.) ile belirlenmiştir (Landrault vd. 2001). Analiz, ABTS (2,2'-Azino-di-[3- ethylbenzthiazoline sulphonate]) nin peroksidaz (metmyoglobin) ve H 2 O 2 ile inkübasyonu ile ABTS+ radikal katyonun oluşturulması esasına dayanmaktadır. Kullanılan spektrofotometre Shimadzu UV-1700 Pharmaspec UV-Vis spektrofotometre ve TCC sıcaklık kontrol ünitesidir. 3.6 Fenolik Bileşik Dağılımının Belirlenmesi Nar şarabında sinamik asitlerden, p-kumarik asit, kafeik asit, ferulik asit, ve hidroksisinamik asit; benzoik asitlerden, gallik asit ve vanilik asit, flavonollerden 28

38 kateşin, epikateşin ve kuersetin kalitatif ve kantitatif olarak yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile belirlenmiştir. HPLC analizlerinde Özkan ve Göktürk Baydar (2006) ın şaraplarda fenolik bileşikleri belirlediği metod modifiye edilerek uygulanmıştır HPLC Koşulları Ekipman: Simadzu Degazör: DGU-20 A5 Prominence (gradient valf) Pompa: LC-20 AT Prominence Kontrol Ünitesi: CBM-20A Prominence Dedektör: SPD-M10AVP DAD Otomatik Örnek Enjeksiyon Ünitesi: SIL-10AXL Kolon Fırını: CTO-10A Kolon: Intersil ODS-3 Ters Faz (5 µm-25x4.6 mm) Çözücü A: Metanol Çözücü B: %2 Asetik Asit Analizlerde kullanılan Metanol G Gromasolv ve Asetik Asit (%100) Sigma-Aldrich (Almanya) den temin edilmiştir. Çizelge 3.1 HPLC Çözücü Akış Profili Süre (dk) A Konsantrasyonu (%) B Konsantrasyonu (%) Kalibrasyon eğrisi çiziminde kullanılan, saf fenolik bileşik standartları Sigma-Aldrich (Almanya) den temin edilmiş ve bu standartlardan metanolde, 0,1 mg/l, 0,5 mg/l, 1 29