GENETĐK OMĐK TEKNOLOJĐLERĐ. Doç. Dr. Hilâl Özdağ D N A

Transkript

1 GENETĐK OMĐK TEKNOLOJĐLERĐ Doç. Dr. Hilâl Özdağ D N A 1

2 Mammals Other chordates Other eukaryotes Homo sapiens [NCI 35] browse what's new Vega Gallus gallus [WASHUC1] browse what's new Drosophila melanogaster [GDP 4] browse what's new Pan troglodytes [CHIMP1] browse what's new Xenopus tropicalis [JGI 3] browse what's new Anopheles gambiae [MOZ 2] browse what's new Macaca mulatta [Mmul 0.1] browse pre! site Danio rerio [WTSI Zv5] browse what's new Vega Apis mellifera [Amel 2.0] browse what's new Ensembl Mus musculus [NCI m34] browse what's new Vega Takifugu rubripes [Fugu 2.0] browse what's new Caenorhabditis elegans [WS140] browse what's new Rattus norvegicus [RGSC 3.4] browse what's new Canis familiaris [CanFam1.0] browse what's new Vega os taurus [tau 1.0] browse what's new pre! [tau 2.0] Monodelphis domestica [MonDom2] browse pre! site Tetraodon nigroviridis [TETRAODON 7] browse what's new Ciona intestinalis [JGI 1.95] browse what's new Saccharomyces cerevisiae [SGcurrent browse what's new Ensembl HIGH-THROUGHPUT YÜKSEK ĐŞLEM HACMĐ Data Resources Cancer Gene Census: Mutated genes causally implicated in human cancer. COSMIC: Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer Protein Kinases: Somatic mutations in protein kinase genes. NCI-60: Mutations in cancer genes in the NCI-60 cell lines. Overview The Foundation s Microbial Genome Sequencing Project was launched in April, 2004 after the American Society for Limnology and Oceanographymeetingin Honolulu, Hawaii. The Foundation was encouraged by scientists to increase the number of genome sequences of ecologically-relevant microorganisms. Over 200 microorganisms were nominated for sequencing 86 candidates were selected by a committee of preeminent marine microbiologists based on five selection criteria. Phase one of the project was initiated in the Fall, 2004 with a grant to the Institute of iological Energy Alternatives (now the J. Craig Venter Institute). Auto-annotatedgenome sequenceswill be depositedingenank. This website serves as a portal; consult Genank and the PI website for further information. Cancer Cell Line Project: Mutations of cancer cell lines. Copy Number Analysis: An analysis of copy number in cancer cell lines and tumours. 2

3 D N A nın sabit ortama aktarımı Southern lot (Edward M. Southern, 1975) Southern.exe mrna Analiz Yöntemleri Northern lot (Tek gen analizi) RT-PCR (Tek gen analizi) Mikroarray (Genom boyunca analiz) 3

4 NORTHERN LOT mrna lar boylarına göre jelde yürürler. mrna lar naylon membrana transfer edilir ve radyoaktif işaretli DNA probları ile hibridize edilir. Đşlem hacmi düşük olan bu teknikte miktar tayini hassas değildir. RT-PCR Total veya polya RNA üzerinden reverse transcriptase enzimi ile cdna sentezlenir. Gen spesifik (ekzon) primerler ile PCR yapılır. Özellikle eş zamanlı PCR (Real Time PCR) cihazları ile yüksek hassasiyette miktar tayini yapılabilmektedir. Đşlem hacmi northern blot tan yüksek mikroarraylerden düşüktür. 4

5 Mikroarray kullanım amaçları Hücre metabolizmasına global bakış Mikroarrayler vasıtasıyla bir hücreye yapılan bir uygulamanın hücreyi nasıl etkilediği hangi metabolik yolakların uyarıldığı hangilerinin sustuğu uygulama öncesine göre kıyasla ortaya konabilir. enzer yaklaşımla hastalıkların metabolizme üzerine etkilerinin belirlenmesi ve tedavi için hedef moleküllerin saptanması amacı ile hasta ve kontrol gruplarında mikroarrayler ile global ifade analizleri yapılabilmektedir. Tıbbi teşhis SNP mikroarraylerin de yardımı ile hastalığa veya hastalığa yatkınlığa neden olan genler saptanmaktadır insan geni içeren bir mikroarray ile myeloid lösemi ile limfoblastik lösemi 50 adet ifade farklılığı gösteren gen yardımı ile birbirinden ayrıldı Meme kanseri altgruplarını saptayabilen 70 adet gen saptandı yapılan global transkriptom analizi ile. DNA Mikroarray DNA Mikrodizin cdna array: bç uzunluğunda probların cam yüzeylere basılması ile üretilir. Oligo array: bç uzunluğundaki oligonükleotidlerin önce sentezlenip sonra çip yüzeyine immobilize edilmesi veya doğrudan çip üzerinde sentezlenmesi (fotolitografi) ile üretilir. 5

6 DNA Mikroarray DNA Mikrodizin 1) Prob (cdna/oligo) 2) Çip üretimi (Probların çipe yerleştirilmesi) 3) Hedef (floresan işaretli örnek) 4) Deney 5) Sonuç 6) ilişim oligonükleotid, cdna Fotolitografi, pipet, dokundurma, püskürtme (inkjet), RNA, (mrna==>) cdna Hibridizasyon, yıkama, tarama Floresans Đmaj işleme, WWW, biyobilişim, veri arama/tarama ve görüntüleme DNA Mikroarray DNA Mikrodizin 6

7 Affymetrix GeneChip Oligo Array Hibridize olmuş prob hücresi Tek zincirli, işaretlenmiş RNA hedef molekülü Oligonükleotit prob * * * * * 24µm 1.28cm Özgül oligonükleotit probun milyonlarca kopyası >200,000 farklı eşlenik prob Hibridize olmuş oligo array in görüntüsü RNA Nitelik ve Nicelik Tayini Fluorescence S 28S Time (seconds) 7

8 polya kontrolleri Affymetrix platformunda ifade analizi Total RNA veya Poly (A) + mrna AAAA RT cdna Hedef örneğin hazırlanışı IVT (bio-ntp) Đşaretli crna transkriptleri bio bio bio Fragment (Isı, Mg 2+ ) bio Tarama Yıkama & oyama Hibridize Hibridizasyon kontrolleri bio bio bio bio Đşaretli fragmentler Affymetrix platformunda hibridizasyon, boyama ve yıkama GeneChip + iotin Đşaretli crna Hibridize Array + SAPE Streptavidinfikoeritrin 8

9 Affymetrix platformunda tarama DNA Mikrodizin Genomik Dizi SNP 5 T / G 3 SNP prob = 25 baz Perfect Match Mismatch Perfect Match Mismatch Allel A Allel 9

10 DNA Mikrodizin SNP C / A TAGCCATCGGTA N GTA C TCAATGATCAGCT ATCGGTAGCCAT G ATCGGTAGCCAT C CAT G AGTTACTA CAT G AGTTACTA PM Allel MM Allel A A ATCGGTAGCCAT T ATCGGTAGCCAT A CAT G AGTTACTA CAT G AGTTACTA PM Allel MM Allel DNA Mikrodizin PM A MM PM MM A Prob Çift Seti (Kuartet) SNP başına 56 olasılık Oryantasyon başına 28 Dağıtılmış yerleşim Düz zincir 5 3 PM A MM PM MM A 3 5 Ters zincir 10

11 DNA Mikrodizin PMA PMA PMA PMA PMA PMA PMA MMA MMA MMA MMA MMA MMA MMA PM PM PM PM PM PM PM MM MM MM MM MM MM MM 14 kuartet değerlendirilip en iyi 10 tanesi herbir TNP yi temsil etmek üzere seçilir. Seçilen bu 10 kuartet herbir TNP nin varlığını hem düz hem de ters zincirde inceler. Tek bir TNP yi sorgulamak üzere toplam 40 prob kullanılmaktadır. Tek Primer Amplifikasyonu ile Karmaşıklığın Ortadan Kaldırılması 11

12 DNA Mikrodizin 250 ng Genomik DNA Xba Xba Xba RE muamelesi Tek primer ile amplifikasyon Adaptörün bağlanması 4 PCR Reaksiyonu Fragmentasyon ve işaretleme Hibridizasyon Ve Tarama DNA Mikrodizin Mikrosatellit 10K # Marker ,000 Çözünürlülük 10 cm (10 M) 1 cm (1 M) * # PCR Reak/örnek # PCR Primer/örnek 200 (2x multipleks) 800 Süre (400 örnek) > 8 hafta 4-6 hafta 4 1 elirteç başına DNA Deney başına DNA 40 ng 16,000 ng.025 ng 250 ng 12

13 DNA Mikrodizin Farklılıklar 100k 10K Dizin sayısı 2 1 Enzim sayısı 2: Xba1 ve HindIII 1: Xba aşlangıç DNA miktarı 250 ng X2 enzim = 500 ng 250 ng PCR Amplifikasyon oyutu bp bp Fragmente edilecek miktar 40ug 20ug Tarama Yüksek çözünülürlüklü tarama Rutin tarama Fragmentasyon reaktifinin konsantrasyonu 0.06U/uL 0.048U/uL Algoritma ve yazılım DM Algoritma ve GTT MPAM ve GDAS 2.0 Ana uygulama alanı Asosiyasyon çalışmaları ağlantı TNP ler Perlegen ve Kamu Kamu DNA Mikrodizin 13

14 DNA Mikrodizin DNA Mikrodizin 14

15 DNA Mikrodizin <> <> Resequencing Tiling Strategy ATCGGTAGCCATACATGAGTTACTA ATCGGTAGCCATTCATGAGTTACTA 12 bases A T C ATCGGTAGCCATCCATGAGTTACTA ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA G ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT TAGCCATCGGTAGGTACTCAATGAT A T C G TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT TAGCCATCGGTATGTACTCAATGAT TAGCCATCGGTAAGTACTCAATGAT CAGCT GTCGA 15

16 Resequencing Tiling Strategy TCGGTAGCCATGAATGAGTTACTAC TCGGTAGCCATGCATGAGTTACTAC TCGGTAGCCATGGATGAGTTACTAC TCGGTAGCCATGTATGAGTTACTAC ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT AGCCATCGGTAGATACTCAATGATG AGCCATCGGTAGCTACTCAATGATG AGCCATCGGTAGGTACTCAATGATG AGCCATCGGTAGTTACTCAATGATG CAGCT GTCGA Resequencing Tiling Strategy CGGTAGCCATGCATGAGTTACTACA CGGTAGCCATGCCTGAGTTACTACA CGGTAGCCATGCGTGAGTTACTACA CGGTAGCCATGCTTGAGTTACTACA ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA CAGCT TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT GTCGA GCCATCGGTACGAACTCAATGATGT GCCATCGGTACGCACTCAATGATGT GCCATCGGTACGGACTCAATGATGT GCCATCGGTACGTACTCAATGATGT 16

17 Resequencing Tiling Strategy GGTAGCCATGCAAGAGTTACTACAG GGTAGCCATGCACGAGTTACTACAG GGTAGCCATGCAGGAGTTACTACAG GGTAGCCATGCATGAGTTACTACAG ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT CAGCT GTCGA CCATCGGTACGTACTCAATGATGTC CCATCGGTACGTCCTCAATGATGTC CCATCGGTACGTGCTCAATGATGTC CCATCGGTACGTTCTCAATGATGTC Resequencing Tiling Strategy GTAGCCATGCATAAGTTACTACAGC GTAGCCATGCATCAGTTACTACAGC GTAGCCATGCATGAGTTACTACAGC GTAGCCATGCATTAGTTACTACAGC ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT CAGCT GTCGA CATCGGTACGTAATCAATGATGTCG CATCGGTACGTACTCAATGATGTCG CATCGGTACGTAGTCAATGATGTCG CATCGGTACGTATTCAATGATGTCG 17

18 Resequencing Tiling Strategy TAGCCATGCATGAGTTACTACAGCT TAGCCATGCATGCGTTACTACAGCT TAGCCATGCATGGGTTACTACAGCT TAGCCATGCATGTGTTACTACAGCT ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT CAGCT GTCGA ATCGGTACGTACACAATGATGTCGA ATCGGTACGTACCCAATGATGTCGA ATCGGTACGTACGCAATGATGTCGA ATCGGTACGTATTCAATGATGTCGA Resequencing Tiling Strategy TAGCCATGCATGAGTTACTACAGCT TAGCCATGCATGCGTTACTACAGCT TAGCCATGCATGGGTTACTACAGCT TAGCCATGCATGTGTTACTACAGCT ATCGGTAGCCATGCATGAGTTACTA TAGCCATCGGTACGTACTCAATGAT CAGCT GTCGA ATCGGTACGTACACAATGATGTCGA ATCGGTACGTACCCAATGATGTCGA ATCGGTACGTACGCAATGATGTCGA ATCGGTACGTATTCAATGATGTCGA 18

19 CustomSeq Resequencing Dizinleri A C G T AGCGT ACCGT A C G T Çip başına 30 kb çift zincirli DNA dizilimi okunabiliyor. Toplam 60 kb. CustomSeq Deney Protokolü Kontrol Kalıp/Primerler Genomik DNA Kısa Ölçekli PCR Uzun Ölçekli PCR Miktar tayini-örneklerin Karıştırılması Fragmentasyon reaktifi Fragment Đşaret Hibridizasyon için oligo kontrolleri Hibridizasyon Veri analizi 19

20 Deney Akışı Đlgilenilen genlerin belirlenmesi Karıştırma ve Fragmentasyonasyon DNA fragmentleri Genomik DNA PCR Ürünleri Đşaretleme Geceboyu hibridizasyon Tarama Yıkama Đstasyonu: Yıkama/oyama Sondan işaretli fragmentler Affymetrix CustomSeq Arrays iological Sample Probe Array 2.5 Days Wash & Stain >chr21: gtggcatgatcttggctcactgcagttcaagcaattctcctgccttagc cccctgagtagctgggattacaggtgcctgctaccaccctcagctaat tttttgtatttttaatagagacggggtttcaccatgttggccaggctggtc tcgaactcctgacctcgtgattcgtctgcctcggccttccaaagtgctg ggagtacaggcatga gccaccgcacccggcctgtatatcttttttaaaaggaaaagaacatat cccagaagtttccaactgagtttccctctgggtcaataccagaattgg gtgggggtcttcagctcacccctaaactcatcattgataagcagaatg aatgaccatggctggtttagaca. Scan ~30 Kb 20

21 DNA Analiz Yazılımı Cihaz Kontrolü.DAT dosyasının oluşturulması GCOS.CEL dosyasının oluşturulması.chp dosyasının oluşturulması.chp veri karşılaştırılması GeneChip DNA Analysis Software 2.0 (GDAS) Proteombilim-Metabolombilim Tyers & Mann, 2003, Nature, 422:

22 Proteombilim-Metabolombilim Tyers & Mann, 2003, Nature, 422: Proteombilim-Metabolombilim Seller& Mann, 2003, Nature, 422:

23 Proteombilim-Metabolombilim Proteombilim-Metabolombilim

24 Proteombilim-Metabolombilim Proteombilim-Metabolombilim 24

25 Proteombilim-Metabolombilim Transkriptom analizinin gen işlevlerinin karakterizasyonundaki ne kadar yararlı olduğu açık iken unutulmamalıdır ki genlerin çoğunun nihai ürünü proteinlerdir. Proteombilim bu ürünlerin doğrudan analizini mümkün kılar ve bu transkriptom analizinin iki sınırlamasını açığa çıkarması açısından önemlidir. Proteombilim-Metabolombilim Đlk olarak kısmen transkripsiyon sonrası düzenlenme nedeniyle hücre içindeki mrna ların hepsi transle olmaz bu nedenle transkriptom proteomda bulunmayan gen ürünlerini içerebilir. una paralel olarak protein sentezi ve protein yapım-yıkım hızı transkriptler arasında farklılık gösterebileceğinden bir transkriptin miktarı kodladığı proteinin miktarı ile örtüşmeyebilir. u nedenlerle transkriptom niteliksel veya niceliksel anlamda proteomu doğru bir şekilde yansıtmayabilir. 25

26 Proteombilim-Metabolombilim Đkinci olarak protein aktivitesi genellikle ilgili transkriptin miktarından hareketle tahmin edilemeyecek olan translasyon sonrası modifikasyonlara bağlıdır. Hücrede tepkimeye girmeyen halde bulunan birçok proteinin proteolitik kesim veya fosforilasyon benzeri işlemlerle aktive olması gerekmektedir. Özgül bir translasyon sonrası varyantın miktarındaki oynamaların dikkate değer olduğu durumlarda yalnızca proteombilim gen ifadesi ile işlevi arasındaki bağı kurmak için gerekli bilgiyi sağlayacaktır. Đki oyutlu Jel Elektroforezi (2DGE) Karmaşık bir protein örneği denatüre edici bir poliakrilamid jele yüklendikten sonra ilk boyutta izoelektrik odaklama ile ayrılır. u teknikte proteinler bir ph gradienti içinde izoelektrik noktalarına (yüklerinin yerel ph ya göre nötr olduğu pozisyon) ulaşıncaya dek göç ederler. Standart prosedür tamponlayıcı grupların kayıp uzun jel yürümeleri sırasında kararsız hale gelmelerini engellemek üzere poliakrilamid matrikse bağlandığı immobilize ph gradient (IPG) jelinin hazırlanmasıdır. 26

27 Kütle Spektrofotometresi Kütle spektrometresi (MS) belirli bir örnek veya analitte bulunan moleküllerin doğru kütlelerinin belirlenmesinde kullanılmaktadır. MS ile yapılan protein anotasyonunun prensibi arama veritabanlarında doğru moleküler kütleleri sorgu terimi olarak kullanmaktır (Mann ve ark., 2001; Aebersold ve Mann, 2003). u yöntem alternatifi olan Edman degradasyonu ile yapılan doğrudan protein dizilemesine göre daha hızlı sonuç verir ve yüksek işlem hacimli örnek analizi için otomasyona uyarlanması kolaydır. u özellikle iki boyutlu jelden binlerce nokta veya HPLC den yüzlerce fraksiyonun işlenmesi gereği ortaya çıktığında önem kazanır. Kütle Spektrofotometresi Yakın zaman öncesine kadar MS ionizasyon işlemi sırasında rasgele fragmentlere ayrılmaları nedeniyle protein ve nükleik asit gibi büyük moleküllere uygulanamıyordu. Matriks aracılı lazer dersorpsiyon/ionizasyon (MALDI-Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation) ve elektrosprey ionizasyon (ESI) gibi (yumuşak ionizasyon yöntemleri ile bu tip moleküller artık fragmente olmadan ionize edilebilmektedir. 27

28 Kütle Spektrofotometresi Proteinlerin veya daha sıklıkla proteazlar aracılığıyla bu proteinlerden oluşturulan peptid fragmentlerin kütleleri deneysel olarak belirlenmiş kütlelerin veritabanındaki dizilimlerden tahmin edilenlerle bağdaştırılması sonucunda proteinler tanımlanabilir. Kütle Spektrofotometresi Proteinlerin veya daha sıklıkla proteazlar aracılığıyla bu proteinlerden oluşturulan peptid fragmentlerin kütleleri deneysel olarak belirlenmiş kütlelerin veritabanındaki dizilimlerden tahmin edilenlerle bağdaştırılması sonucunda proteinler tanımlanabilir. 28

29 Faj Gösterisi (Phage Display) Faj gösterisi yabancı DNA fragmentlerinin bir bakteriyofajın kılıf protein genine takıldığı bir çeşit ifade klonlamasıdır (kn Kısım ve urton, 1995). Rekombinant protein virionla birleşmiş ve fajın yüzeyinde bulunan bir füzyon protein olarak ifade edilir (Şekil 19.17). Füzyon faj, yüzeyinde bulunan yabancı bileşenle etkileşen her proteine bağlanır. Etkileşim taraması proteomdaki herbir proteinin faj yüzeyinde bulunduğu bir faj gösteri kütüphanesi oluşturarak gerçekleştirilir. Faj Gösterisi (Phage Display) ir mikroplakanın kuyuları belirli avcı proteinlerle kaplanıp herbir kuyuya faj gösteri kütüphanesi pipetlenir. Yüzeylerinde etkileşen proteinleri taşıyan fajlar kuyu yüzeylerine bağlı kalırken etkileşim vermeyen protein taşıyanlar yıkanıp giderler. u tekniğin önemli bir avantajı etkileşen proteinleri taşıyan tutulmuş fajın kuyulardan alınıp E.coli nin enfekte edilmesinde kullanılarak ilgili cdna diziliminin yüksek miktarda amplifikasyonu sonuçlanması ve bu dizilimin elde edilmesi ile veritabanı sorgulanarak etkileşen proteinler tanımlanmasıdır. 29

30 Faj Gösterisi (Phage Display) Faj Gösterisi (Phage Display)

31 Maya Đkili Hibrit (Yeast Two Hybrid) Etkileşim taramasından en yaygın olarak kullanılan kütüphane yöntemi etkileşim tuzak sistemi olarak da bilinen maya ikili hibrit sistemidir (Fields ve Sternglanz, 1994). u yöntem incelenen bir proteine bağlanan proteinleri belirlemenin yanısıra etkileşim için gerekli bölge veya reziduların tanımlanmasında da kullanılabilir. Fiziksel olarak etkileşen proteinler aktif bir transkripsiyon faktörü oluşturabilme özellikleri ve böylece bir raportör gen ve/veya seçilebilir bir belirteci aktive etmesi ile saptanırlar. Maya Đkili Hibrit (Yeast Two Hybrid) Đkili hibrit yönteminin anahtarı transkripsiyon faktörlerinin biri DNA bağlayıcı diğeri transaktivasyon bölgesi olmak üzere iki ayrı bölgeden oluştuğunun saptanmış olmasıdır. irçok doğal transkripsiyon faktöründe DNA bağlayıcı ve aktivasyon bölgeleri aynı polipeptit üzerinde yeralır (bkn Kısım ). ununla beraber bu bölgeleri ayrı olarak taşıyan etkileşen iki protein biraraya gelerek de aktif bir transkripsiyon faktörü oluşturabilir. Đkili hibrit sistemi ve türevi olan tekniklerin hedefi transkripsiyon faktörünün gerekli bir bileşenine bağlanmış etkileşen bir proteini özgül olarak tanımlamak üzere hedef proteinin avcı olarak kullanılmasıdır. 31

32 Maya Đkili Hibrit (Yeast Two Hybrid)