iq icycler (Bio-Rad)* ile kullanılan Real Time Kit HSV I/II Typing Real-TM

Transkript

1 iq icycler (Bio-Rad)* ile kullanılan Real Time Kit HSV I/II Typing Real-TM Kullanılan Semboller REF Liste Numarası 2-8 C/ -20 C de saklayın REF TV38-100FRT RUO Sadece Araştırma Kullanımı için Dikkat! LOT Lot Numarası VER Versiyon Son Kullanma Tarihi Reaktif İçerir Kullanım Bilgileri Üretici İSİM HSV I/II Typing Real-TM GİRİŞ Herpes simpleks virüs-1 ve -2, Herpesviridae ailesinden Alpha-herpesvirinae aittir. Genomları çift-sarmal DNA lardan oluşur. HSV % 95 yayılma oranında en yaygın virüslerden biridir ve insan nufüsünün % de HSV-2 virüsü bulunur. Oral gerginlik olarak adlandırılan HSV-1 herpes labialis, herpetik stomatit ve keratitlere neden olur. HSV-2'ye genital gerilim denir ve ağırlıklı olarak genital herpese neden olur. Herpes lezyonları iki farklı formda lokalize şekilde bulunurlar bunlar: vücudun üst kısmında bulunan (dudak, yüz, ağız içinde) herpes lezyonlu labial herpes ve vücudun alt kısmında bulunan (genital, kalça, bacakların mukoz membranlarında) herpes lezyonlu genital herpesdir. Geçmişte, HSV-I sadece labial herpese ve HSV-II sadece genital herpese neden olduğuna inanılırdı. Virüslerin her iki türü için bu mevcut veriler çürütülmüştür. HSV teşhisinin laboratuvar yöntemleri, kan serumunda antikor tespiti için kültürel yöntem, sitolojik yöntem, bağışıklık-enzim testinden ve yayılmada HSV antijeni tespiti için immunoflorasan testten oluşur. Kültür yöntemi, hastadan alınan klinik materyalleri elde etmeyi, izli kültürleri kontamine etmeyi (ökaryotik hücrelerin transplantasyon yapabilen kültürleri, tavuk embriyoları ve benzeri ) ve ya ökaryotik hücrelerde sitopatik etkiyi yada immunofluoresans sonuçları dikkate alınarak kontaminasyon sonuçlarını analiz etmeyi sağlar. Kültür yöntemi, geçmişte HSV tanısında altın bir standart olmuştur. Yöntemin hassasiyeti ve özgüllüğü % ve % 100 dir. Doğal olarak zahmetli, kalıcı ve standart-olmadığı için, yöntem rutin teşhis pratiklerinde uygulanmaz. Sitolojik yöntem başka virüslerden ve HSV kaynaklanan değişiklikleri ayırt etmeye izin vermediği için düşük özgüllüğe sahip hastanın hücrelerinde virüsün sitopatojenik etkisini belirlemek için tasarlanmıştır. Doğrudan immunoflorasan yöntemi ürogenital yayılmalarda HSV tespiti için kullanılır çünkü uygulama kolaydır ve özel ekipman ve fazla para gerektirmez. Ancak, yöntem uçuk enfeksiyonunun subklinik formlarını tespit etmek için yeterli duyarlılığa sahip değildir. Serolojik analiz hamile kadınların muayenesi sırasında seronegatif kadınların tespitinde önemlidir, çünkü bu durumda, özellikle, enfeksiyon fetüs için son derece tehlikelidir. Çoğu sağlıklı insan klinik olarak HSV antikoruna sahiptir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) methodu HSV diagnosisde yüksek derecede hassas, spesifik ve az çalışır ve HSV in laboratuar teşhisinde çok önemlidir.

2 KULLANIM AMACI Kit HSV I/II Typing Real-TM tam kan, plazma, likör, ürogenital swablar, idrar, prastatik sıvı ve diğer biyolojik materyallerde Herpes Simplex Virüs type I ve Herpes Simplex Virüs in farklılaşması ve kalitatif tespiti için bir testtir. TEST PRENSİBİ Kit HSV I/II Typing Real-TM iki temel aşamaya dayanır: örneklerden DNA izolasyonu ve Real Time amplifikasyon. Herpes Simplex Virüs DNA örneklerden ekstre edilir, Real-Time kullanılarak amplifiye edilir ve iq icycler (Bio-Rad) da tespit edilir. KİT İÇERİĞİ Part N 1 DNA-Sorb-B : örnek hazırlama; Part N 2 HSV I/II TYPING REAL-TM : Real Time amplifikasyon. Part N 1 DNA-sorb-B : Lizis Solüsyonu, 2 x 15 ml; Yıkama Solüsyonu 1, 2 x 15 ml; Yıkama Solüsyonu 2, 2 x 50 ml; Sorbent, 2 x 1,25 ml; DNA-eluent, 2 x 5,0 ml. 100 test için gerekli reaktifler içerir. Part N 2 HSV I/II TYPING REAL-TM : PCR-mix-1 HSV-typing, 110 kullanıma hazır tek-doz test tüpleri; PCR-mix-2-Flu, 0,77 ml; HSV-1 C+, 0,2 ml; HSV-2 C+, 0,2 ml; Negatif Kontrol C-, 1,2 ml; DNA-buffer, 0,5 ml; Internal Kontrol IC, 1,0 ml. 110 test için gerekli reaktifler içerir. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Zone 1: örnek hazırlama: Biyolojik kabin eppendorf tipi tüpler için masa mikrosantrifüj (RCF max. 16,000 x g); Eppendorf 5415D ya da benzeri 60 C ± 2 C kuru ısı bloğu Vorteks mikser Aerosol bariyerli pipetörler ( 5-40 µl; µl; µl) 1,5 ml polipropilen steril tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf) Tek kullanımlık eldiven, pudrasız Biyo tehlikeli atık konteynarı Buzdolabı, Dondurucu Zone 2: Real Time amplifikasyon: Real Time Thermalcycler iq icycler (Bio-Rad) Workstation Aerosol bariyerli pipetörler (0,5-10 μl; 5-40 μl) Tüp raklar UYARILAR VE ÖNLEMLER

3 1. Lizis Solusyonu, guanidine tiyosiyanat içerir. Guanidine tiyosiyanat solunursa, deri ile temas ederse ya da yutulursa zararlıdır. Asitler ile teması toksik gaz oluşumuna neden olur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). 2. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysisi ve göz koruyucu kullanın. Çalışmalardan sonra ellerinizi yıkayın. 3. Ağızla pipetleme yapmayın. 4. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. 5. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 6. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 7. Örnekler potansiyel enfeksiyon faktörü olarak kabul edilmeli ve biyolojik kabinlerde Biyo güvenlik Seviye 2 ya da diğer uygun biyo güvenlik pratiklerine göre çalışılmalıdır. 8. Dökülen tüm örnekler ya da reaktifleri 0,5% sodyum hipoklorit ya da uygun diğer dezenfektanlar ile temizleyin. 9. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun. 10. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 11. Bu kit DNA-Sorb ekstraksiyon kiti ile kullanılmak için dizayn edilmiştir. Eğer DNA-Sorb dan başka bir kit ile DNA ekstraksiyonu yapılıyorsa bu kullanıcı sorumluluğundadır. 12. Bu kiti ancak DNA amplifikasyon tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 13. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alanından başlayıp Amplifikasyon ve Belirleme alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin. SAKLAMA KOŞULLARI HSV I/II Real-TM +2-8 C de saklanabilir. KARARLILIK HSV I/II Real-TM etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT HSV I/II Real-TM aşağıdaki materyallerden DNA-Sorb-B (REF K-1-1/B) ile ekstre edilmiş DNA lar ile analiz edilebilir: tam kan ACD veya EDTA tüplerinde toplanan; likör Eppendorf tüpte saklanan; doku ( 1,0 gr) cam çubuklar, teflon tokmak, skalpel ya da mekanik homojenizör ile homojenize edilmiş ve 1,0 ml tuzlu su ya da PBS sterilde çözülmüş 1,0 gr. Kuvvetlice vorteksleyin ve oda ısısında 30 dakika inkübe edin. Supernatantı yeni 1,5 ml tüpe aktarın; prostatik sıvı Eppendorf tüpte saklanan; seminal sıvı: yaklaşık 30 μl seminal sıvıyı polipropilen tüplere (1,5 ml) aktarın ve 70 μl steril tuz solusyonu ekleyin; servikal, üretral, konjonktival swablar*: nükleaz-free 1,5 ml tüpe swabı ekleyin ve 0,2 ml Transport medyum ekleyin saniye boyunca ortamda swabı yavaşça sallayın. 48 saatten daha uzun olmamak kaydıyla örnekleri 2 8 C de ya da daha uzun saklamak için 20/80 C de saklayın. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik ajanların transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır * DNA ekstraksiyonu için bu kit önerilir: DNA-Sorb-A (REF K-1-1/A) ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Lizis Solüsyonu ve Yıkama Solüsyonu (diğerleri +2-8 C de saklanmasına rağmen) buz kristalleri çözülene kadar C ye kadar ısıtılır. Negatif Kontrol Ekstraksiyonu için bir tüp içeren 1,5 ml polipropilen tüplere gerekli miktarda hazırlayın. 2. Her bir tüpe 300 μl Lizis Solüsyonu ve 10 µl Internal Kontrol ekleyin. 3. Uygun tüplere 100 μl örnek ekleyin.

4 4. Aşağıdaki gibi Kontrolleri hazırlayın: Cneg işaretli tüpüne 100 μl C Negatif Kontrol ekleyin. 5.Tüpleri vorteksleyin ve 65 C de 5 dakika inkübe edin saniye santrifüj edin. Eğer örnek tamamen çözülmezse, maksimum hızda ( g.) 5 dakika tüpleri tekrar santirifüj edin ve DNA ekstraksiyonu için yeni bir tüp içine supernatantı aktarın. 6. Sorbenti şiddetlice vorteksleyin ve her bir tüpe 25 μl ekleyin saniye vorteksleyin ve tüm tüpleri oda ısısında 3 dakika inkübe edin. Bu adımı tekrar edin. 8. Tüm tüpleri 8000g de 30 sn santrifüj edin ve aerosol bariyerli mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 9. Her bir tüpe 300 μl Yıkama Solüsyonu 1 ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 8000g de 30 saniye santrifüjleyin. Her bir tüp için alın ve supernatantı atın. Tüpler arası geçişte pipet uçlarını değiştirin. 10.Her bir tüpe 500 μl Yıkama Solüsyonu 2 ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 8000g de 30 saniye santrifüjleyin. Her bir tüp için alın ve supernatantı atın. Tüpler arası geçişte pipet uçlarını değiştirin. 11. Adım 10 tekrar edin ve 65 C de 5 dakika açık kapakla bütün tüpleri inkübe edin. 12.Pelleti 50 μl DNA-eluent içinde yeniden suspense edin. 65 C de 5 dakika inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin. 13. Maksimum hızda ( g) 1 dakika boyunca tüpleri santrifüjleyin. Supernatant amplifikasyon için hazır DNA içerir. Eğer amplifikasyon aynı gün çalışılmayacaksa, işlenen örnekler 2-8 C de 5 güne kadar yada 20 /-80 C de dondurularak saklanabilir. PROTOKOL 1. Örnekler ve kontroller için gerekli miktarlarda PCR-mix-1 HSV-typing tüpleri hazıralyın. 2. Her bir tüpe 7 µl PCR-mix-2 Flu ekleyin. 3. Uygun tüplere 10 μl ekstrat DNA ekleyin. 4. Her bir panel için 3 kontrol hazırlayın: Amplifikasyon Pozitif Kontrol işaretli tüpe 10 µl DNA-buffer ekleyin; C1+ işaretli tüpe 10 µl HSV-1 C+ ekleyin; C2+ işaretli tüpe 10 µl HSV-2 C+ ekleyin. iq icycler (Bio-Rad) ile Real Time Amplifikasyonu icycler iq Real Time PCR Detection System Operating kılavuzunda icycler programıyla ilgili daha fazla bilgi bulabilirsiniz. 1. Protokol Çalışmasında Plate Setup (plaka kur) yazın ve kaydedin: örneklerin konumları girin ve fluorophores (Fam, Joe (ya da Hex) ve Rox ( 4xiQiCycler için) seçin. 2. icycler de ( dış kuyu faktör solüsyonu ) aynı bileşimli kuyu faktör plakasını koyun. 3. Protokol Çalışmasında termal protokol " iq" oluşturun ve kaydedin: 95 C 3 dk 30 sn 10 döngü: 95 C 20 sn, 65 C 20 sn, 72 C 20 sn 35 döngü: 95 C 20 sn, 60 C 30 sn, 72 C 25 sn 2ci adımda Fam ve HEX kanallarında flüoresan tespiti (60 C) SONUÇ ANALİZLERİ 1. Data Analiz modulün PCR Quantification pencersini seçin. HSV II tipi tespit için Select a Reporter da FAM-490 simgesini ayarlayın. Threshold Position alanına 100 girin. Recalculate Threshold Cycles tıklayın. Select Analysis Mode penceresinde PCR Baseline Subtracted Curve Fit seçildiğinden emin olun. 2. Data Analiz modulün PCR Quantification pencersini seçin. HSV I tipi tespit için Select a Reporter da JOE (HEX)-530 simgesini ayarlayın. Threshold Position alanına 100 girin. Recalculate Threshold Cycles tıklayın. Select Analysis Mode penceresinde PCR Baseline Subtracted Curve Fit seçildiğinden emin olun. 3. ROX kanalı (Internal Control) için benzer bir prosedür uygulayın. Eşik (threshold) pozisyonununda gösterilmiş User Defined tıklayın ve Threshold Position alanına 20 girin.

5 Recalculate Threshold Cycles tıklayın. PCR Base Line Subtracted Curve Fit seçilip seçilmediğini kontrol edin. 4. Eğer Ct nin değeri Joe (HEX) kanalında sıfırdan farklı ise, örnek HSV 1 type için pozitiftir. 5. Eğer Ct nin değeri Fam kanalında sıfırdan farklı ise, örnek HSV 2 type için pozitiftir. 6. Eğer Fam ve Joe Ct değeri belirlenemezse (flüoresans eğrisi eşik çizgisi ile kesişmez) ve Rox (only 4xiQiCycler) kanalında sonuç tablosunda Ct değeri 30 dan düşüktür. 7. Sonuçlar, amplifikasyonun Negatif ve Pozitif Kontrolu ve DNA izolasyonu geçerli olduğunda sadece önemli olarak kabul edilir. Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Testin kontrol Ct kanal Rox Yorumlama Ct kanal Fam Ct kanal Joe edilen aşaması NCS DNA izolasyonu Neg Neg < 30 Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon Neg Neg Neg Geçerli sonuç HSV 1 C+ Amplifikasyon Neg < 30 Neg Geçerli sonuç HSV 2 C+ Amplifikasyon < 30 Neg Neg Geçerli sonuç Örnek FAM kanal DNA HSV II. JOE kanal DNA HSV I. ROX kanal (sadece 4xiQiCycler) Internal Kontrol

6 Örnek B3, B4, B6 ve B9 pozitif (HSV II type), örnek С5-F5 pozitif (HSV I tip), örnek C7 negatif, G4 Poz C+ HSV II, F6 Poz C+ HSV I, G10 DNA-buffer. Analitik hassasiyet Kit HSV I/II Typing Real-TM, 500 kopya/ ml den az olmayan % 100 duyarlılıkla testlerin HSV I ve II tespitini sağlar. Tespit, negatif numuneler tarafından kontrol standardını ve dilüsyonlarını gerçekleştirir. Hedef bölge: glikoprotein Sacace Biotechnologies Srl 18 San Carlo str., Caserta, Italy