GLUTAMAT TAŞIYICISI EAAT2 İN TRANSKRİPSİYONU VE REGÜLASYONUNUN KONTROLÜ

Transkript

1 T. C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GLUTAMAT TAŞIYICISI EAAT2 İN TRANSKRİPSİYONU VE REGÜLASYONUNUN KONTROLÜ Doktora Tezi Dr. Oğuz GÖZEN Tez Danışmanı: Prof. Dr. Şakire PÖĞÜN EGE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ FİZYOLOJİ ANABİLİM DALI BORNOVA-İZMİR Mayıs, 2008

2 ii

3 iii Sevgili annem ve sevgili babama

4 ÖNSÖZ Bu çalışma, Johns Hopkins Üniversitesi, Nöroloji Anabilim Dalı, ALS araştırma merkezi laboratuvarlarında gerçekleştirilmiştir. Bugüne kadar hayallerimin peşinden koşmam gerektiğine her türlü zorluğa rağmen inanan, eğitimim amacı ile bana ihtiyaçları varken kendilerinden uzak kaldığım zamanları anlayış ile karşılayıp bana destek olan sevgili babama ve sevgili anneme teşekkürü borç bilirim. Uzmanlık eğitimim boyunca danışmanlık görevimi üstlenen, gerçekten inandığım her hedefe ulaşabileceğimi aşılayan, çalışmalarımın her aşamasından yol gösteren, bana inanan Prof. Dr. Şakire PÖĞÜN e sonsuz teşekkür ederim. Çalışmalarımı laboratuvarında gerçekleştirmeme olanak sağlayan, her aşamada bilimsel desteğini esirgemeyen, küçük verileri bir araya getirerek gizledikleri büyük resmi görmeyi öğreten Prof Dr. Jeffrey D. Rothstein e teşekkür ederim. Doktora eğitimim süresince gösterdikler anlayış, özveri, sabır ve inanılmaz destek için başta anabilim dalı başkanımız Prof. Dr. Gönül Peker olmak üzere tüm Fizyoloji anabilim dalı ailesine teşekkür ederim. Laboratuvarda birlikte çalışma fırsatı bulduğum ve çalışmalarıma temel teşkil edecek yaklaşımları öğrendiğim Doç. Dr. Burcu Balkan, Doç Dr. Ersin Koylu ve Prof. Dr. Lütfiye Kanıt a teşekkür ederim Tez çalışmalarım süresince yurtdışında bulunduğum zamanlarda aileme ve bana sonsuz destek olan başta Dr. Eda Bayram olmak üzere tüm Bayram ailesine teşekkür ederim. İzmir, 2008 Oğuz Gözen iv

5 İÇİNDEKİLER 1. BÖLÜM GİRİŞ VE AMAÇ Glutamat: En önemli eksitatör nörotransmiter Beyinde çok yüksek miktarda glutamat vardır Hücre dışı glutamat Glutamatın hücre dışı sıvıdan uzaklaştırılması Glutamat metabolizması Glutamin glutamat döngüsü Glutamin ve laktat taşıyıcıları Glutamat reseptörleri NMDA reseptörleri AMPA ve Kainat reseptörleri Metabotropik Glutamat Reseptörleri Glutamat taşıyıcıları Hücre membranında yer alan glutamat taşıyıcıları Hücre içi glutamat taşıyıcıları Mitokondriye glutamat taşınması Sinaptik veziküllere glutamat taşınması EAAT2 nin yapısı ve lokalizasyonu Eksitotoksisite ve Nörodejenerasyon Akut Eksitotoksisite Sekonder Eksitotoksisite Eksitotoksisite ve Nörodejeneratif Hastalıklar...22 v

6 2. BÖLÜM GEREÇ VE YÖNTEM Küçük Molekül Kütüphaneleri Bileşiklerin uygulamalar için hazırlanması Hücre Kültürleri HEK293 Hücre serisi kültürleri H4 Hücre serisi kültürleri HIA Hücre serisi kültürleri Vektörlerin hazırlanması Bakteri suşları ve büyüme koşulları Plazmitler Moleküler Genetik Teknikleri Plazmit DNA izolasyonu Enzim kesimi Enzim ile kesilen DNA örneklerinin saflaştırılması Agaroz Jel elektroforezi Agaroz Jelden DNA fragmanlarının izolasyonu Ligasyon reaksiyonu Kompetan hücre hazırlanması ve transformasyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) poge2fl plazmit haritası ve klonlama stratejisi Delesyon vektörleri haritaları Yönlendirilmiş Mutagenez ile mutant plazmitlerin yapımı Transfeksiyon Lusiferaz ekspresyonu ölçülmesi...48 vi

7 2.1.7 Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu Total RNA İzolasyonu RNA ve DNA miktarlarının spektrofotometrik ölçümü Ters Transkripsiyon (reverse transcription) (RT) ile cdna eldesi Kantitatif Gerçek Zamanlı (Real Time) PZR (RT-PZR) Western Blot tekniği İstatistiksel analizler BÖLÜM BULGULAR Hızlı tarama bulguları S29 EAAT2 promotorunu aktive eder S29 EAAT2 mrna miktarında artışa neden olur Western blot S29 EAAT2 promotorunu aktive eder EAAT2 promotor bölgesi fragmanlarının aktivitesi Transkripsiyon faktörü bağlanma dizisi mutantları BÖLÜM Tartışma BÖLÜM Sonuç ve öneriler BÖLÜM Özet Abstract BÖLÜM...80 vii

8 7.1 Yararlanılan kaynaklar Özgeçmiş...90 viii

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1 Glutamin Glutamat döngüsü Şekil 2 Glutamat reseptörlerinin sınıflandırması Şekil 3 Glutamat taşıyıcılarının membran topoloji modelleri Şekil 4 EAAT2 ile glutamat taşınması ve iyon değişimi ile eşleşmesi Şekil 5 EAAT2 geni ekson ve intron dizilimi Şekil 6 Hızlı taramada kullanılan 384 çukurlu tabaklar verilerine bir örnek...25 Şekil 7 Kullanılan DNA cetvelleri...32 Şekil 8 poge2fl plazmit haritası...37 Şekil 9 pbluescript II KS+ plazmit haritası...38 Şekil 10 pogb2472 plazmiti haritası...39 Şekil 11 PZR reaksiyonlarında kullanılan primer çiftlerinin ürün haritası...40 Şekil 12 pog959 ait dizi üzerinde yapılan yönlendirilmiş mutasyonlar...44 Şekil 13 Yönlendirilmiş mutasyon yapılmasında izlenen yol...46 Şekil 14 Hızlı tarama sonuçları (Lusiferaz aktivitesi)...57 Şekil 15 Hızlı taramada aktif bileşiklerin lusiferaz yanıtları...59 Şekil 16 EAAT2 mrna düzeyleri Şekil 17 Western Blot sonuçları...62 Şekil 18 H4 hücrelerinde (FL) kullanılarak görülen lusirefaz aktivitesi...63 Şekil 19 HIA hücrelerinde (FL) kullanılarak görülen lusirefaz aktivitesi...64 Şekil 20 EAAT2 promotor bölgesi fragmanlarının aktivitesi...65 Şekil 21 EGR bağlanma bölgesi mutasyonunun promotor aktivesine etkisi..67 Şekil 22 K proteini bağlanma bölgesi mutasyonunun promotor aktivesine etkisi...68 Şekil 23 NFkB bağlanma bölgesi mutasyonunun promotor aktivesine etkisi 69 Şekil 24 EAAT2 promotor bölgesinde oluşturulan mutasyonların lusiferaz aktivitesine etkisi Şekil 25 TNF Reseptörü 1 aktivasyonu ile indüklenen sinyal yolu ix

10 TABLOLAR DİZİNİ Tablo 1 Glutamat taşıyıcısı alt tiplerinin ekspresyon paterni...16 Tablo 2 Eksitotoksisiteye neden olan hücre içi yolaklar...20 Tablo 3. Standart PZR bileşen miktarları ve son konsantrasyonları...35 Tablo 4: Standart PZR koşulları...36 Tablo 5 Yönlendirilmiş mutasyon PZR koşulları...43 Tablo 6 Hedeflenen mutasyon dizileri ve mutajenik primerler...45 Tablo 7 cdna sentez reaksiyonu...51 Tablo 8 RT-PZR primer setleri...52 Tablo 9 RT-PZR reaksiyonu bileşenleri...52 Tablo 10 RT-PZR koşulları...53 x

11 1. BÖLÜM 1.1 GİRİŞ VE AMAÇ Glutamat, eksitatör sinapslarda bulunan en önemli nörotransmiterdir. Glutamatın sinaptik aralıktan EAAT2 (Eksitatör Amino Asit Taşıyıcısı 2) aracılığı ile astrositlere taşınması postsinaptik nöronun uyarılmasının sonlandırılmasında rol oynayan en önemli mekanizmalar içerisindedir. Astrosit membranında bulunan EAAT2 seviyelerinin azalması glutamatın sinaptik aralıkta birikmesine neden olmaktadır. Glutamat sinaptik aralıkta enzimatik olarak yıkılmamakta ve postsinaptik membranı uyarmaya devam etmektedir. Postsinaptik nöronun sinaptik aralıkta biriken glutamat ile sürekli uyarılması postsinaptik nöronda hasara neden olmakta ve glutamat eksitotoksisitesi olarak adlandırılmaktadır. EAAT2 ekspresyonu eksitatör sinapslarda sinaptik iletimin sağlıklı sürdürülmesi açısından önem taşımaktadır. Amyotrofik lateral sklerozis (ALS) ve diğer bazı nörodejeneratif hastalıklarda EAAT2 ekspresyonunun azaldığı gösterilmiştir. Günümüzde ALS tedavisinde kullanım lisansı olan tek ilaç Riluzole dur. Riluzole N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptör antagonisti gibi davranarak etkisini glutamaterjik sistem üzerinden göstermektedir. ALS de EAAT2 ekspresyonunun seçici olarak arttırılması nöron hasarının durdurulmasında yararlı olabilecek yaklaşımlardan biridir, ancak henüz seçici olarak EAAT2 ekspresyonunu arttıran bir bileşik tanımlanmamıştır. Küçük molekül kütüphaneleri ilaç geliştirmede kullanılan, rasgele sentezlenmiş yüz binlerce bileşikten oluşan önemli kaynaklardır. Bu kütüphaneler hızlı tarama deneyleri ile aranan etki için hücre kültürü

12 modellerinde taranabilmektedir. Elde edilen veriler ışığında belirlenen aday moleküller veya molekül aileleri daha ileri çalışmalarla geliştirilerek klinik kullanımı mümkün olan ilaçlar sentezlenebilmektedir. Bu çalışmanın amacı, EAAT2 geni promotor bölgesinin, transkripsiyonda rol oynayan önemli transkripsiyon faktörleri ve bu faktörlerin bağlanma dizileri (sekans) açısından karakterize edilmesidir. Küçük molekül kütüphanelerinin hızlı tarama deneyleri ile incelenmesi sonucu tanımlanan aktif bileşiklerden transkripsiyonu uyaran etkenler olarak yararlanılmış ve bu yolla promotor bölgeye bağlanan olası transkripsiyon faktörleri ve bağlanma dizileri araştırılmıştır. Klinik ile ilişkilendirildiğinde ise, amacımız nörodejenerasyon ve özellikle ALS de önemli rol oynadığı düşünülen EAAT2 geni promotor bölgesinin fonksiyonel analizinin yapılmasıdır. Hipotezimiz, EAAT2 geninin transkripsiyonunun regüle edilebileceği ve bu regülasyonu sağlayan etkenlerin ALS tedavisinde kullanılabileceğidir. Sunulan çalışmada hipotezimizin sadece ilk kısmı sınanmaktadır. Tedaviye yönelik araştırmalar ve ilaç geliştirilmesi, ilerideki çalışmalar ile mümkün olabilecektir. 2

13 1.2 GENEL BİLGİLER Glutamat: En önemli eksitatör nörotransmiter Bir amino asit olan L-glutamat, memeli merkezi sinir sistemindeki en önemli nörotransmiterlerdendir ve algı, bellek ve öğrenme gibi bir çok beyin fonksiyonu için gereklidir 1-3. Glutamat ayrıca merkezi sinir sisteminin gelişiminde görülen sinaps indüksiyonu ve eliminasyonu, hücre migrasyonu, faklılaşması ve ölümünde önemli rol oynar. Sinir sistemindeki birçok nöron ve glial hücrenin plazma membranlarında glutamat reseptörleri bulunur 4-6. Glutamat ayrıca periferik dokularda ve endokrin hücrelerde de sinyal iletici olarak rol oynar Beyinde çok yüksek miktarda glutamat vardır Beyinde glutamat konsantrasyonları, bölgesel farklılıklar göstermekle birlikte, 5 ila 15 mmol/kg yaş ağırlık düzeyindedir 8. Bu yaklaşık 2 13 mm konsantrasyona denk gelmektedir. Ancak bu yüksek miktarın sadece çok küçük bir bölümü ekstraselüler alanda bulunmaktadır. Ekstraselüler sıvı toplam beyin dokusu hacminin %13-22 sini oluşturmaktadır. Ekstraselüler sıvıda glutamat konsantrasyonu 3-4 µm iken serebrospinal sıvıda yaklaşık 10 µm dir 9. Bu bilgilerin ışığında, hücre içi glutamat konsantrasyonunun hücre dışı konsantrasyonunun birkaç bin katı olduğu söylenebilir. En yüksek glutamat konsantrasyonları sinir terminallerinde izlenmektedir 10,11. Glutamatın bu kompartımanlara dağılımı dinamiktir. Bu dağılım enerji kaynaklarının durumuna yüksek derecede bağımlıdır. Eğer enerji kaynakları tükenir ve hücre enerji yetmezliğine girerse, öncelikle glutamat hücrelerden dışarı sızacaktır. İkinci olarak hızla glutamat döngüsü başlayacak, glutamat 3

14 sürekli olarak hücrelerden sızacak ve devamlı olarak hücre dışı sıvıdan uzaklaştırılacaktır Hücre dışı glutamat Glutamat etkisini glutamat reseptörleri üzerinden gösterir. Bu reseptörler onları eksprese eden hücrelerin yüzeyinde bulunur. Bu nedenle reseptör uyarılmasını belirleyen etmen hücreyi çevreleyen hücre dışı sıvıdaki glutamat konsantrasyonudur. Hücre dışı glutamat konsantrasyonlarının düşük düzeylerde tutulması kritik öneme sahiptir. Bu sinaptik ve ekstrasinaptik iletişimde daha yüksek sinyal/gürültü oranının sağlanabilmesi için gereklidir. Ayrıca glutamat reseptörlerinin aşırı uyarılması zararlıdır ve bu nedenle yükselen glutamat konsantrasyonları toksiktir. Bunlarla birlikte, ekonomik nedenlerle, salınan glutamatın yeniden kazanılması da önemlidir. Buna karşın hücre içi glutamat genellikle zararsız olarak kabul edilir, ancak tamamen etkisiz olduğu düşünülmemelidir. Glutamatın pankreasın beta hücrelerinde hücre içi haberci olarak işlev gördüğü ve burada glutamat taşıyıcılarının hücre yüzeyinde bulunacak miktarının belirlenmesinde rol oynadığı düşünülmektedir Glutamatın hücre dışı sıvıdan uzaklaştırılması Glutamat tüm hücre dışı sıvılardan hızla uzaklaştırılmaktadır çünkü glutamat reseptörleri hemen hemen tüm hücresel elemanlarda (soma, dendritler, sinir sonlanmaları) bulunmaktadır. Dolayısıyla, reseptörlerin sürekli uyarılmasını engellemesi sadece sinaptik aralıktaki değil, sinaptik aralık 4

15 dışındaki (ekstrasinaptik) hücre dışı sıvılarda da glutamat konsantrasyonları düşük tutularak gerçekleştirilmektedir. Glutamatı hücre dışı alanda metabolize eden bir enzim bulunmamaktadır. Dolayısıyla, reseptörleri çevreleyen hücre dışı alandan glutamatı uzaklaştırmanın tek yolu glutamat geri alımıdır 13,14. Basit difüzyon ile glutamatın sinaptik aralıktan milisaniyeler içinde uzaklaştırılması önemli görünmesine karşın bu etki ancak sinaptik aralık dışında hücre dışı glutamat konsantrasyonları düşük seviyelerde tutulduğunda etkili olmaktadır. Sonuç olarak hücre dışı glutamat konsantrasyonlarının uzun süreli düşük düzeylerde tutulması, glutamat geri alımı ile olmaktadır. Glutamat geri alımı, glutamat taşıyıcı proteinleri ile yapılır. Glutamat taşıyıcıları, plazma membranının her iki tarafı arasındaki elektrokimyasal gradiyanı sürücü güç olarak kullanırlar. Hem nöronlar, hem glial hücreler glutamat taşıyıcıları eksprese ederler. Yüksek miktarlarda glutamat salımını takiben glutamat geri alımının baskılanması, saniyeler içinde hücre dışı glutamat konsantrasyonlarının yükselmesine yol açar. 5

16 1.2.2 Glutamat metabolizması Hücreler tarafından geri alınan glutamat, metabolik süreçlerde (protein sentezi, enerji metabolizması) kullanılabilir veya tekrar transmiter olarak kullanılmak üzere depolanır. Sinir sonlanmalarında, transmiter olarak yeniden kullanım doğrudan gerçekleşmektedir. Glutamat, bir veziküler glutamat taşıyıcısı ile sinaptik veziküller içine alınır ve daha sonra ekzositoz ile salınır Ayrıca glutamatın, doğrudan sitozolden de bir miktar salınması olası görülmektedir. Astrositlerde, hücre dışı sıvıdan alınan glutamat, glutamine dönüştürülebilir. Glutamin, hücre dışı alana salınır ve nöronlar tarafından alınarak tekrar glutamata çevrilebilir. Nöronlar ve astrositler arasında görülen bu glutamat ve glutamin trafiğinin glutamat için ana geri dönüşüm yolu olduğu düşünülmektedir. Buna glutamin-glutamat döngüsü denir 18,19. Glutamin normal koşullarda hücre dışı alanda µm konsantrasyonda bulunur 9. Ancak bu sinaptik iletişimi etkilemez ve toksik değildir çünkü glutamin, glutamat reseptörlerini uyarmaz Glutamin glutamat döngüsü Glutamat astrositlerce geri alındıktan sonra iki farklı yolu izleyerek glutamin veya alfa-ketoglutarat a dönüşebilmektedir. Glutamine dönüşüm ATP ye bağlı ve gliaya özel olan glutamin sentetaz enzimi ile olmaktadır 20,21 (Şekil 1). Alfa-ketoglutarata dönüşüm iki farklı yoldan gerçekleşebilmektedir. Ya glutamat dehidrogenaz ile deaminasyona uğramaktadır ya da transaminazlar ile transaminasyon geçirmektedir. Alfa-ketoglutarat trikarboksilik asit döngüsüne katılarak süksinat, fumarat ve malata metabolize 6

17 edilebilmektedir. Malat ise trikarboksilik asit döngüsünde daha ileri metabolize edilebilmektedir veya dekarboksile edilerek piruvata ve indirgenerek laktata dönüşebilmektedir 22. Hem glutamin hem laktat astrositlerce hücre dışı sıvıya verilebilmektedir. Bu glutamin ve laktat hücre dışı sıvıdan nöronlar tarafından alınıp kullanılabilmektedir. Nörotransmiter glutamat beyinde tamamıyla glutaminden sentezlenmemektedir. Aynı şekilde astrositlere geri alınan tüm glutamat da glutamine çevrilmemektedir. Ayrıca glutamin her zaman glutamatın prekürsörü olarak davranmamakta, nöron için enerji kaynağı olabilmektedir. Halen nöronal glutamat geri alımının, astrosit glutamat geri alımına oranla ne büyüklükte olduğu bilinmemektedir. In vitro ortamda glutaminin glutamat için prekürsör olduğu gösterilmiştir 23 (Şekil 1). Bu dönüşümü destekleyen in vivo kanıtlar bulunmakla birlikte bu kanıtlar pek ikna edici değildir. Beyine uygulanan radyoaktif işaretli glutamin büyük oranda karbondioksite metabolize olmaktadır 24. Bu bulgular glutaminin nöronal enerji substratı olarak işlev gördüğünü desteklemektedir 25. Ayrıca bazı nöron alt gruplarında glutaminin glutamata dönüşmesini sağlayan mitokondriyal glutaminaz ekspresyonu bulunmamaktadır 26. Bu nedenlerle glutaminin glutamat prekürsörü olarak görev üstlenmesi söz konusu olmakla birlikte, bu duruma gerçekte olduğundan fazla yer verildiği görülmektedir 27. Yakın zamanda glutamatın glutaminden bağımsız sentezi de bildirilmiştir. Nöronların glutaminden bağımsız glutamat sentezi, piruvat karboksilasyonu yeteneklerine bağlıdır 28,29. 7

18 Şekil 1 Glutamin Glutamat döngüsü Glutamin ve laktat taşıyıcıları Glutamin bir çok farklı taşıyıcı için substrattır. Bunlar arasında sodyuma bağımlı A, ASC ve N tipi taşıyıcılar ile sodyumdan bağımsız sistem 1 tipi taşıyıcılar bulunur. Glutaminin astrositlerden hücre dışı ortama verilmesi yeni klonlanan, sistem N glutamin taşıyıcısı SN1 (NAT1) ile gerçekleşmektedir 31,32. Nöronlar hücre dışı sıvıdan glutamini özel glutamin taşıyıcıları olan sistem A taşıyıcısı GlnT (SAT1) 33 ve SAT2 (ATA2) 34 ile almaktadırlar. Bu taşıyıcılar glutamaterjik nöronlarda bol miktarda eksprese edilmektedir. 8

19 Laktatın astrositlerden hücre dışı sıvıya atılması ve nöronlar tarafından alınması ise farklı monokarboksilik asit taşıyıcıları (MCT1, MCT2 ve MCT4) ile gerçekleşmektedir Glutamat reseptörleri Moleküler klonlama yöntemi ile üç farklı glutamat reseptör proteini ailesi tanımlanmıştır (Şekil 2) Bu reseptör ailelerinden ilki bir glutamat analoğu olan N-metil-Daspartat (NMDA) ile uyarılabilmektedir. Bu gruba ait olan NR1, NR2A, NR2B, NR2C, NR2D, NR3A VE NR3B reseptörleri NMDA reseptörleri olarak adlandırılmaktadır. Alfa-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazol propiyonik asit (AMPA) ve kainat ile aktive olan diğer bir grup reseptör proteinine AMPA/Kainat reseptörleri denilmektedir. Bu grup AMPA ve kainat reseptörleri olarak ikiye ayrılmaktadır. GluR1-4 reseptörleri AMPA reseptörleri iken GluR5-9, KA1 ve KA2 reseptörleri kainat reseptörlerini oluşturmaktadır. NMDA, AMPA ve kainat reseptörleri glutamat kapılı iyon kanallarıdır ve iyonotropik glutamat reseptörleri olarak anılmaktadırlar. NMDA, AMPA ve kainat reseptörleri sodyumun hücre içine girişine, potasyumun hücre dışına çıkışına, membran depolarizasyonuna ve/veya alt ünite kompozisyonuna bağlı olarak hücreye Ca 2+ girişine neden olmaktadırlar. AMPA reseptörleri düşük afinitelidir ve glutamat ile uyarıldıklarında hızla açılırlar. Ancak hızlı duyarsızlaşırlar ve hızlı oluşan, çabuk sönen depolarizasyona sebep olurlar 43,44. NMDA reseptörlerinin glutamata afiniteleri daha yüksek ve inaktivasyonları yavaştır. 9

20 Üçüncü grup reseptörleri G-proteinine bağlı reseptörler oluşturmaktadır ve metabotropik reseptörler (mglur1-8) olarak adlandırılmaktadır. Şekil 2 Glutamat reseptörlerinin sınıflandırması NMDA reseptörleri NMDA reseptörü göreceli olarak daha büyük miktarda Ca 2+ geçişine izin vermektedir. NMDA reseptörünün uyarılarak iyon kanalının açılması için öncelikle NMDA reseptöründe bulunan glisin bağlama bölgesine glisinin bağlanması gerekmektedir. Bu durumda iken glutamatın bağlanması ile iyon kanalı açılmaktadır ancak kanal içine bağlı bulunan Mg 2+ hücre içine iyon girişi gerçekleşememektedir. Bu Mg 2+ iyonu nedeniyle iyonu sadece, reseptörü içeren nöron AMPA reseptörleri veya diğer hızlı depolarizasyona neden olan kanalların etkinleşmesi ile kısmen depolarize olduğunda bağlanma bölgesini terk etmektedir ve kanal açılmaktadır. NMDA reseptörleri AMPA reseptörlerine oranla çok uzun süre açık kalırlar (AMPA reseptörlerinin 10

21 açık kalma süresi milisaniyelerle ifade edilirken, NMDA reseptörleri yüzlerce milisaniye açık kalır). Ayrıca AMPA reseptörlerine göre yüksek miktarda Ca 2+ geçirirler. Bu özellikleri NMDA reseptörlerinin, bellek oluşumu ve hareket regülasyonu gibi sinaptik plastisite içeren süreçler için uygun olabileceğini düşündürmektedir. NMDA reseptör alt ünite genleri NR1, NR2A, NR2B, NR2C, NR2D, NR3A ve NR3B dir. NR3B alt ünitesi sadece kısmi genomik dizi olarak bilinmektedir. NMDA reseptörlerinin çoğu heteromerik NR1 ve NR2 alt ünitelerinden meydana gelmektedir (Örn: Nr1/NR2A veya NR1/NR2C). NR1 temel alt ünitedir ve tüm NMDA reseptörlerinin bir bölümünü oluşturur. NR2 alt üniteleri kanalın açık kalma süresini, kanal geçirgenliğini ve Mg 2+ duyarlılığını belirlemektedir 46,47. NR3A alt ünitesi, NR1 ve NR2 komplekslerinin tek kanal iletkenliğini azaltmaktadır ve özellikle embriyonik gelişimde NMDA reseptör fonksiyonunu sınırladığı düşünülmektedir 48. Tüm bu genler farklı ekspresyon paternlerini izlemektedir 49. NR1 geni çoğunlukla nöron tipi hücrelerde eksprese edilmektedir. Bazı hücrelerde, örneğin serebellar Purkinje hücreleri, retina horizontal hücreleri ve medulla spinalis viseral motor nöron hücrelerinde eksprese edilen tek NMDA alt unitesidir AMPA ve Kainat reseptörleri Santral sinir sisteminde AMPA reseptörleri bir çok sinapsta genel amaçlı eksitatör iletişimden sorumludur. AMPA reseptörlerinin özellikleri yüksek temporal kesinlikte çalışmalarına ve kısa gecikme ile aksiyon potansiyeli başlatılmasında rol almalarına olanak sağlamaktadır. AMPA reseptörleri GluR1-4 alt ünitelerinden oluşan heteromerlerdir. Komplekste GluR2 alt ünitesinin bulunması reseptörü Ca 2+ a daha az 11

22 geçirgen hale getirmektedir 47,51. GluR4 alt ünitesine sahip reseptörlerin kinetiği daha hızlıdır. GluR1 mrna sı hipokampus, amigdala ve serebellar Bergmann bölgelerindeki gliada bol miktarda görülürken GluR2 genel olarak her bölgede eksprese edilmektedir. Ancak serebellar granül hücreleri, neokorteks ve hipokampusta daha fazla miktarda izlenmektedir. GluR2 sadece GABAerjik internöronlarda daha düşük seviyelerde bulunmaktadır 47,52. GluR3 en çok neokorteks ve hipokampusta bulunurken GluR4 serebellumda yüksek miktarda izlenmektedir. Kainat reseptörlerinin cevapları AMPA reseptörlerine oranla daha küçüktür. Hipokampal CA1 bölgesindeki glutamaterjik sinapslarda, kainat reseptörü aracılı en yüksek sinaptik cevap AMPA reseptör cevabının onda birinden daha küçüktür 53. Kainat reseptörleri tarafından başlatılan yavaş eksitasyon, aksiyon potansiyelinin başlatılma eşiğine yakın olan membran potansiyelini düzenlemekte ve sinaptik aktivite ile entegre etmektedir. 53 Kainat reseptörleri mglur5-9, KA1 ile KA2 nin homomerik ve heteromerik komplekslerinden oluşmaktadır 54. KA1 hipokampal CA3 piramidal hücreleri ile dentat granül hücrelerinde eksprese edilirken KA2 tüm beyinde orta düzeyde bulunmaktadır. KA1 ayrıca glial hücreler ve korpus kallosumda da görülmektedir Metabotropik Glutamat Reseptörleri Metabotropik glutamat reseptörleri (mglur) G proteinleri ile ilişkilidir. Uyarılmaları hem elektriksel hem de metabolik olaylara neden olmaktadır. Sekiz farklı mglur klonlanmış olup, bunlar farmakolojik özellikleri, amino asit benzerlikleri ve sinyal ileti sistemleri göz önünde bulundurularak üç gruba 12

23 ayrılmıştır. Grup I (mglur1 ve 5) fosfolipaz C ile ilişkilidir. Uyarılmaları fosfoinositollerin hidrolizine ve membran depolarizasyonuna neden olur. Grup II (mglur2-3) ve grup III (mglur4, 6-8) ise iyon kanalları ve adenilat siklazın (AC) inhibisyonu ile ilişkilidir Glutamat taşıyıcıları Beyin hücreleri glutamatı taşıma özelliğine sahip bir çok protein eksprese ederler. Bunların bazıları hücre membranında bulunurken bazıları intraselülerdir Hücre membranında yer alan glutamat taşıyıcıları Beyin hücreleri, plazma membranlarında sodyuma bağımlı yüksek afiniteli' glutamat taşıyıcıları ve glutamat-sistein değiştiricisi, glutamataskorbat değiştiricisi ve glutamat-gaba değiştiricisinden oluşan diğer bir grup taşıyıcıyı eksprese ederler. Sodyuma bağımlı glutamat taşıyıcıları bu çalışmanın odağını oluşturmaktadır ve buradan sonra kısaca glutamat taşıyıcıları olarak adlandırılacaklardır. Beş farklı glutamat taşıyıcısı (Eksitatör Amino Asit Taşıyıcısı = EAAT) klonlanmıştır 59 ; a- EAAT1 (GLAST) 60,61 b- EAAT2 (GLT1) 62 c- EAAT3 (EAAC) 63 d- EAAT4 64 e- EAAT5 65. Bu taşıyıcıların hepsi Na + ve K + bağımlı olarak L-glutamat taşımaktadırlar. Klonlanan bu beş farklı glutamat taşıyıcısının protein 13

24 dizilimleri %50-60 oranında benzerdir. Ayrıca diğer nötr amino asit taşıyıcıları (Alanin-serin-sistein taşıyıcısı AST1 ve AST2) ile %30 40 benzerlik göstermektedirler 66. Bu proteinler aynı gen ailesine aittirler ve bilinen başka bir protein ailesi ile anlamlı benzerlik göstermezler. (Tablo 1) Bakteriyel glutamat taşıyıcısı homoloğunun kristal yapısının elde edilmesi ile taşıyıcının sekiz transmembran bölümü olduğu, karboksi ve amino terminallerinin intraselüler olduğu ve büyük ölçüde trimerler şeklinde bulunduğu düşünülmektedir 67 (Şekil 3). 14

25 Şekil 3 Glutamat taşıyıcılarının membran topoloji modelleri Sistein tarama mutagenezi çalışmalarına dayanan A Seal ve arkadaşları ve B Grunewald ve arkadaşlarına ait EAAT2 membran topoloji modelleri. C. X ışını kristalografisi ile gösterilen GLTph membran topolojisi. 15

26 Glutamat Taşıyıcısı Alt Tipi İnsan Homoloğu Hücre Tipi Anatomik Yerleşim Serebellum, Korteks, Med. Spinalis GLAST EAAT1 Astrosit, Oligodendrosit GLT1 EAAT2 Astrosit GLT1b EAAT2B Astrosit EAAC1 EAAT3 Nöron EAAT4 EAAT4 Purkinje Hücreleri EAAT5 EAAT5 Fotoreseptörler, bipolar hücreler Tüm beyin ve Med. Spinalis Tüm beyin ve Med. Spinalis Hipokampus, Serebellum, Striatum Serebellum Retina Tablo 1 Glutamat taşıyıcısı alt tiplerinin ekspresyon paterni Hücre içi glutamat taşıyıcıları Glutamat hücre içine girdiğinde daha ileri dağılıma uğramaktadır. Hücre içi taşıyıcılar mitokondrial glutamat taşınmasından ve glutamatın sinaptik veziküllere taşınmasından sorumludurlar Mitokondriye glutamat taşınması Glutamatın substratı olduğu bir çok enzim mitokondride yer almaktadır. Buna bağlı olarak mitokondri içine glutamat taşınması önemlidir ve iki farklı yol ile yapılmaktadır 70. a- Proton-Glutamat eş taşıyıcısı b- Glutamat-Aspartat zıt taşıyıcısı 16

27 Sinaptik veziküllere glutamat taşınması Glutamaterjik sinir sonlanmalarında, glutamat nörotransmiter olarak kullanılmak üzere sinaptik veziküllere taşınır. Glutamat, plazma membranı glutamat taşıyıcılarına benzer taşıyıcılar ile sinaptik veziküllerde biriktirilir 71. Veziküler transport sodyum ve potasyumdan bağımsızdır, L-glutamat için seçicidir, düşük Cl - konsantrasyonları ile uyarılmakta ve kuinolinik asit ile baskılanmaktadır 72,73. Veziküler glutamat taşınması vakuoler H + -ATPaz ile gerçekleştirilen internal pozitif membran potansiyeli ile çalışmaktadır. Bu ATPaz veziküler membranda bulunmaktadır ve veziküle H + pompalamaktadır EAAT2 nin yapısı ve lokalizasyonu Glutamatın sinaptik aralıkta metabolize olduğuna ilişkin hiç bir bilgi bulunmamaktadır. Bu nedenle glutamatın sinaptik aralıktan uzaklaştırılmasındaki tek yolun glutamat taşıyıcıları olduğu düşünülmektedir. EAAT2, sinaptik aralıktan glutamatın astrositlere taşınmasında en önemli taşıyıcı olup, Na + bağımlı yüksek afinitelidir. EAAT2 beyinde astrositlere özgüldür ve glutamatın astrositler içine alınması ciddi bir elektrokimyasal potansiyel farkına karşı gerçekleştirilmek zorundadır. EAAT2, glutamat alımını inorganik iyonların taşınması ile eşleştirmektedir. Bu iyonlarda elektrokimyasal potansiyel farkı şeklinde depolanan serbest enerji glutamatın taşınması için kullanılmaktadır. Bu eşleşme, glutamatın sinaptik aralıktan etkin temizlenmesi için zorunludur. EAAT2, taşınan her glutamat için üç Na + ve bir H + iyonunu glutamat ile birlikte hücre içine alırken, bir K + iyonunu hücre dışına çıkartmaktadır 75 (Şekil 4). Buna dayalı yapılan hesaplar, EAAT2 nin 17

28 fizyolojik koşullar altında glutamatı, hücre içersinde 5x10 6 kat yoğunlaştırabileceğini göstermektedir 75. EAAT2 nin kemirgenlerden ilk izole edilen analoğu GLT1 dir ve EAAT2 ile yüksek oranda homoloji göstermektedir. Transgenik GLT1- knockout fareler spontan oluşan ve dramatik şekilde gelişerek ölümcül olan epileptik nöbetler geçirmekte ve bu nöbetler NMDA ile indüklenen nöbetleri andırmaktadır 76. Farmakolojik olarak EAAT2 diğer yüksek afiniteli glutamat taşıyıcı izoformlarından farklıdır ve taşınamayan inhibitörler olan dihidrokainat ve kainat ile inhibe edilmektedir 77. Şekil 4 EAAT2 ile glutamat taşınması ve iyon değişimi ile eşleşmesi 76 EAAT2 geni 11. kromozomda p13-p12 lokalizasyonunda yer almaktadır. Oldukça büyük bir gendir ve toplam uzunluğu 168 kilobazdır. On bir adet eksonu bulunmaktadır. Ekson 1 ile Ekson 2 arasında yer alan İntron 1 yaklaşık olarak 100 kilobazdır. EAAT2 geni promotor bölgesi GC adacıklarından zengindir ve TATA kutusu içermemektedir (Şekil 5). 18

29 Şekil 5 EAAT2 geni ekson ve intron dizilimi Eksitotoksisite ve Nörodejenerasyon Glutamat reseptörlerinin anormal aktivasyonu nöron ölümüyle sonuçlanan önemli ortak yollardan birini oluşturmaktadır. Glutamatın, merkezi sinir sisteminde nöronlar üzerinde öldürücü etkisi olduğu 1957 de Newhouse ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir 79. Daha sonra bu etki eksitotoksisite olarak adlandırılmıştır. Postsinaptik glutamat reseptörlerinin aşırı aktivasyonu presinaptik aşırı glutamat salımına veya glutamat geri alımının yetersizliğine bağlı olabilmektedir. Glutamat toksisitesine katkıda bulunan diğer faktörler, postsinaptik glutamat reseptörlerinin yerleşimi ve moleküler yapısı, diğer iyon kanallarının aktivitesi ve glutamat reseptörlerinin aktivasyonundan sonra hücre içinde gerçekleşen downstream olaylara bağlı olabilmektedir. Glutamata bağlı nöronal hasarın moleküler temelleri henüz tam olarak bilinmemektedir, ancak toksik etkilerde rol oynadığı düşünülen bazı yolaklar tanımlanmıştır. Bunların arasında kalpain, protein kinaz C, lipaz, fosfolipaz, endonükleaz gibi enzimatik yollar, araşidonik asit zinciri, ksantin oksidaz ve nitrik oksit sentaz ile ilişkili yolaklar bulunmaktadır 80. Eksitotoksik süreçte anahtar basamaklardan biri hücre içi kalsiyum homeostazının bozulması ve hücre içi serbest kalsiyum düzeylerinin artmasıdır. Bozulan kalsiyum 19

30 homeostazında bahsedilen enzimatik yolaklar rol almaktadır. Deneysel çalışmaların çoğu glutamatın akut nöron hasarı etkisi üzerine yoğunlaşmaktadır. Glutamatın nörotoksik etkisi dolaylı yoldan, hücre içi glutatyon düzeylerinin azalmasına bağlı olarak da ortaya çıkabilmektedir 81. Sistein hücre içine, aynı zamanda glutamatı hücre dışına atan, sistein taşıyıcısı ile alınmaktadır. Bu taşıyıcının sürücü gücü glutamatın konsantrasyon gradyanıdır. Eksitotoksisitede görüldüğü gibi hücre dışı glutamat konsantrasyonunda meydana gelen bir artış bu gradyan farkını değiştirmekte ve sisteinin hücre içine taşınmasını azaltmaktadır. Sistein, glutatyon yapılması için gerekli bir prekürsördür. Eksitotoksisite durumunda antioksidan ve serbest radikal temizleyicisi olan glutatyonun hücre içi düzeyleri etkilenmektedir 82. Eksitotoksisiteye neden olan hücre içi yolaklar Tablo 2 de özetlenmiştir. 1. Kalsiyuma bağımlı enzimatik yolaklar Proteazlar (Kalpain, ksantin oksidaz) Protein Kinazlar Fosfatazlar Fosfolipazlar Nitrik oksit sentaz Endonükleazlar 2. Hücre içi serbest radikallerin artışı Araşidonik asit zinciri Ksantin oksidaz Nitrik oksit sentaz 3. Sistein alımı ile yarışma sonucun oluşan glutatyon eksikliği Tablo 2 Eksitotoksisiteye neden olan hücre içi yolaklar 20

31 Akut Eksitotoksisite İn vitro çalışmalar glutamat toksisitesinin iki ayrı fazı olduğunu göstermektedir. İlk olarak depolarizasyon ile hücre içine sodyum ve klor iyonları ile birlikte su girmektedir ve akut nöronal şişmeye neden olmaktadır. Agonistin bu evreden ortamdan uzaklaştırılması ile bu etki geri dönebilmektedir. İkinci faz sırasında nöronal NMDA reseptörleri, GluR2 alt birimi olmayan AMPA reseptörleri ve dolaylı olarak voltaj kapılı kalsiyum kanallarından kalsiyum girmektedir 83. Normal koşullarda hücre içi kalsiyum seviyeleri çok sıkı kontrol altında tutulmaktadır ve 0.1 µm ın altındadır 84. Ancak glutamat reseptörlerinin aşırı aktivasyonu hücre içi kalsiyum homeostazını bozmakta ve hücreye zarar veren bir dizi biyokimyasal olaylar zincirini tetiklemektedir. Bu olaylar doğrudan hasara neden olabilecekleri gibi serbest radikallerin oluşumuna yol açarak dolaylı olarak da etki gösterebilmektedirler. Ancak ilk etapta bu etkiler geri dönüşlüdür. İlk olarak bu eksitotoksik etkilerin oluşmasında NMDA tipi glutamat reseptörlerinin sorumlu olduğu düşünülmüştür çünkü NMDA tipi reseptörler hücre içine kalsiyum girişine izin vermektedir. Ancak eksitotoksisitenin NMDA olmayan glutamat reseptörlerinin uzun süreli agoniste maruz kalmasıyla da oluşabildiği bilinmektedir 85. Kalsiyum glutamatın toksik etkilerinin oluşmasında önemli bir medyatör olduğu için kalsiyuma geçirgen AMPA reseptörü eksprese eden nöronlar glutamat toksisitesine daha duyarlıdır. Akut eksitotoksisite karakteristik morfolojik değişikliklere neden olmaktadır. Dendritler ve perikaryon şişmekte, bunu organel hasarı, çekirdek hasarı ve hücre ölümü izlemektedir 86. Bazı nörolojik hastalıkların oluşumunda akut eksitotoksik yoldan bahsedilmektedir. Bu hastalıklar arasında domoik 21

32 asit zehirlenmesi, inme, hipoksik iskemik beyin hasarı, hipoglisemik beyin hasarı, epilepsi-status epileptikus, kafa travması ve bazı diğer toksik ensefalopatiler bulunmaktadır Sekonder Eksitotoksisite Eksitotoksisite başka patolojik olaylar tarafından tetiklenen sekonder süreçler şeklinde de ortaya çıkabilmektedir. Süreci başlatan olaylar nöronun enerji metabolizmasını bozan olaylar olabilmektedir. Bu durumda normal istirahat membran potansiyelinden uzaklaşılmaktadır ve NMDA reseptörlerinin voltaja bağımlı magnezyum bloğu ortadan kalkmaktadır. Sonuç olarak NMDA reseptörü hücre dışı glutamat normal düzeylerde olmasına rağmen aşırı miktarda uyarılmaktadır. Bu sekonder eksitotoksisite belki de belirli kronik nörodejeneratif hastalıklarda hücre ölümüne katkıda bulunan mekanizmalardan biri olabilir. Bu durumda, glutamat reseptörlerinin ekspresyonunda veya glutamat düzeylerinde bir anormallik olmamasına rağmen, glutamat reseptörlerinin aktivasyonunun toksik etki göstermesi mümkündür Eksitotoksisite ve Nörodejeneratif Hastalıklar Nörodejeneratif hastalıklar ileri orta yaşlarda ortaya çıkan morbiditelerin önemli nedenleri arasında bulunmaktadır. Çeşitli akut ve kronik nörodejeneratif hastalıklar eksitotoksisite ile ilişkilendirilmektedir. Ne yazık ki glutamat reseptörü antagonistleri kullanılarak yapılan klinik çalışmalar aşırı reseptör aktivasyonunu istenen şekilde baskılayamamış, ciddi yan etkilerle de birlikte, sağlanan klinik yarar yetersiz kalmıştır. Santral sinir sisteminde hücre dışı glutamat konsantrasyonu glutamat taşıyıcıları ve sistein-glutamat 22

33 değiştiricileri aracılığı ile çok düşük seviyelerde tutulmaktadır 87. Anti-sense knockdown tekniğinin geliştirilmesi ile birlikte sıçanda GLT-1 ekspresyonunun baskılanması, glutamat geri alımını bozmuş ve sağlıklı sıçanlarda nörodejenerasyon ortaya çıkmasına neden olmuştur 88. Daha sonra GLT-1 için knockout olan farelerde geri alımın ciddi miktarda azaldığı, epileptik nöbetlerin ortaya çıktığı ve nörotoksisiteye duyarlılığın arttığı gösterilmiştir 89. Bu bulgular glutamat toksisitesinin, diğer yönleri ile normal olan hayvanlarda, nörodejenerasyon oluşturmakta etkili olduğu düşüncesini desteklemektedir. Ancak nörodejenerasyon oluşması için glutamat taşınmasının ne derece bozulması gerektiği henüz bilinmemektedir. 23

34 2. BÖLÜM 2.1 GEREÇ VE YÖNTEM Küçük Molekül Kütüphaneleri ChemBridge Corp a ait 108,000 bileşikten oluşan merkezi sinir sistemi küçük molekül kütüphanesi EAAT2 promotor aktivasyonu için (FL) plazmiti kullanılarak COS7 hücreleri üzerinde SRI laboratuvarları tarafından hızlı taranmıştır. COS7 hücreleri maymun böbrek epitel hücreleridir ve embriyonik kökenlidirler. Hızlı tarama 384 çukurlu tabaklarda gerçekleştirilmiştir. SRI laboratuvarlarında her bir çukura robotik sistem programlanarak 20 µl içinde 3 x 10 4 hücre ekimi yapılmıştır. Hücreler ilaç uygulamasından önce bir gün süre ile 37 C ta %5 CO 2 olan koşullarda hücrelerin tabağa tutunarak tek kat hücre kültürü oluşturması için bırakılmıştır. Bileşikler kültür ortamına 5 µl besiyeri içinde eklenmiştir. Her bileşik tek dozda (10 µm) ve 24 saat süre ile uygulanmıştır. Bu taramada elde edilen promotor aktivasyonunu gösteren lusiferaz verilerine bir örnek Şekil 6 da 384 çukurlu tabak deseninde gösterilmektedir. 24

35 Şekil 6 Hızlı taramada kullanılan 384 çukurlu tabaklar verilerine bir örnek Bileşiklerin uygulamalar için hazırlanması Bu çalışmada kullanılan tüm küçük moleküllere ait stoklar 100 mm konsantrasyonda olacak şekilde DMSO içinde çözülmüştür. Stoklar -80 C de saklanmıştır. Hücre kültürüne 10 µm son konsantrasyonda eklendiklerinde 1/10 4, 1 µm son konsantrasyonda eklendiklerinde 1/10 5 dilüsyonda kullanılmaktadırlar Hücre Kültürleri HEK293 Hücre serisi kültürleri HEK293 (ATCC #CRL-1573) insan böbrek epitelinden elde edilen hücre serisidir. Transfeksiyon deneylerinde hızlı büyümeleri, yüksek transfeksiyon oranları ve lusiferaz çalışmalarına uygunlukları nedeniyle kullanılmışlardır. 25

36 HEK293 hücre kültürü üretilmesinde %10 fetal dana serumu (Hyclone SH HI) içeren glikoz oranı yüksek (4,5 g/l) DMEM (Sigma D5796) besi yerinden yararlanılmıştır. Son yıllarda besi yerinde glutamat taşıyıcısı EAAT2 yapımına etkileri gösterildiği için beta laktam antibiyotikler kullanılmamıştır. Kültürler sadece steril teknikler kullanılarak kontaminasyondan korunmuşlardır. Kültürler arası fetal dana serumundan kaynaklanan farkları önlemek için tüm HEK293 kültürlerinde aynı lot numarasına sahip serum kullanılmıştır. Kültürler T75 veya 10cm lik tabaklarda %70 alan hücreler tarafından doldurulana (confluent) dek beklenmiş ve transfeksiyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Transfeksiyondan saat sonra ilaç uygulamalarının yapılacağı 96 çukurlu tabaklara her çukurda 5x10 4 hücre olacak şekilde ekilmişlerdir. Pasajlama işleminde %0.05 lik tripsin-edta (Sigma 59417C) kullanılmıştır. Hücreler, tripsin inhibitörü olan serumdan arındırmak için bir kez 3 ml tripsin ile yıkanmıştır. Yıkamanın hemen ardından hücreler 4 ml tripsin çözeltisi içinde 37 C de 5 dakika bekletilmiştir. Tabaktan ayrılan hücrelerin daha ileri sindirimini durdurmak amacı ile ortalama 10 ml serum içeren besi yeri eklenmiştir. 15ml lik tüpe alınan hücreler 1000 dev/dk hızında 3 dakika süre ile santrifüje edildikten sonra hücreleri içeren pelet 10ml besi yerinde serbestleştirilmiştir. Yapılan hücre sayımı sonrasıda uygun oranda seyreltilerek 96 çukurlu tabaklara ekilmiştir H4 Hücre serisi kültürleri H4 (ATCC #HTB-148) insan nöroglioma materyelinden edle edilmiş, astrositik özellikler gösteren hücre serisidir. Transfeksiyon deneylerinde hızlı 26

37 büyümeleri, astrositlere olan benzerlikleri, endojen olarak düşük miktarda EAAT2 eksprese etmeleri, orta düzeyde transfeksiyon oranları ve lusiferaz çalışmalarına uygunlukları nedeniyle kullanılmışlardır. H4 hücre kültürü üretilmesinde %10 fetal dana serumu (Hyclone SH HI) içeren yüksek glikoz (4,5g/L) DMEM (Sigma D5796) besi yerinden yararlanılmıştır. Besi yerinde yakın zamanda glutamat taşıyıcısı EAAT2 yapımına etkileri gösterildiği için beta laktam antibiyotikler kullanılmamıştır. Kültürler sadece steril teknikler kullanılarak kontaminasyondan korunmuşlardır. Kültürler arası fetal dana serumundan kaynaklanan farkları önlemek için tüm H4 kültürlerinde aynı lot numarasına sahip serum kullanılmıştır. Kültürler T75 veya 10 cm lik tabaklarda %60-70 alan hücreler tarafından doldurulana dek beklenmiş ve transfeksiyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Transfeksiyondan saat sonra ilaç uygulamalarının yapılacağı 96 çukurlu tabaklara her çukurda 1x10 4 hücre olacak şekilde ekilmişlerdir. Pasajlama işleminde %0.05 lik tripsin-edta (Sigma 59417C) kullanılmıştır. Hücreler tripsin inhibitörü olan serumdan arındırmak için bir kez 3 ml tripsin ile yıkanmıştır. Yıkamanın hemen ardından hücreler 4 ml tripsin çözeltisi içinde 37 C de 5 dakika bekletilmiştir. Tabaktan ayrılan hücrelerin daha ileri sindirimini durdurmak amacı ile ortama 10 ml serum içeren besi yeri eklenmiştir. 15 ml lik tüpe alınan hücreler 1000 dev/dk hızında 3 dakika süre ile santrifüje edildikten sonra hücreleri içeren pelet 10 ml besi yerinde serbestleştirilmiştir. Yapılan hücre sayımı sonrasıda materyal uygun oranda seyreltilerek 96 çukurlu tabaklara ekilmiştir. 27

38 HIA Hücre serisi kültürleri HIA (Human Immortalized Astrocytes) cerrahi insan beyin materyelinden edle edilmiş, Prof Dr. Ahmet HÖKE nin laboratuvarında geliştirilmiş astrositik özellikler gösteren hücre serisidir (yayın aşamasında). Transfeksiyon ve kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) deneylerinde saf astrosit kültürü olmaları, endojen olarak düşük düzeylerde EAAT2 eksprese etmeleri, orta düzeyde transfeksiyon oranları ve lusiferaz çalışmalarına uygunlukları nedeniyle kullanılmışlardır. Ancak bu hücrelerin büyüme hızları HEK293 ve H4 hücrelerine oranla oldukça yavaştır. HIA hücre kültürü üretilmesinde %10 fetal dana serumu (Hyclone SH HI) içeren yüksek glikoz (4,5g/L) DMEM (Sigma D5796) besi yerinden yararlanılmıştır. Yakın zamanda besi yerinde glutamat taşıyıcısı EAAT2 yapımına etkileri gösterildiği için beta laktam antibiyotikler kullanılmamıştır. Kültürler sadece steril teknikler kullanılarak kontaminasyondan korunmuşlardır. Kültürler arası fetal dana serumundan kaynaklanan farkları önlemek için tüm HIA kültürlerinde aynı lot numarasına sahip serum kullanılmıştır. Kültürler T75 veya 10 cm lik tabaklarda %70-80 alan hücreler tarafından doldurulana dek beklenmiş ve transfeksiyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Transfeksiyondan saat sonra ilaç uygulamalarının yapılacağı 96 çukurlu tabaklara her çukurda 1x10 4 hücre olacak şekilde ekilmişlerdir. 28

39 Kantitatif PZR çalışmasında kullanılan HIA hücrelerine transfeksiyon uygulanmamıştır. Kantitatif PZR için 6 çukurlu tabaklar kullanılmış ve her çukura 8x10 5 hücre ekilmiştir. Pasajlama işleminde %0.25 lik tripsin-edta (Sigma 59429C) kullanılmıştır. Hücreler tripsin inhibitörü olan serumdan arındırmak için bir kez 3 ml tripsin ile yıkanmıştır. Yıkamanın hemen ardından hücreler 4 ml tripsin çözeltisi içinde 37 C de 5 dakika bekletilmiştir. Tabaktan ayrılan hücrelerin daha ileri sindirimini durdurmak amacı ile ortama 10 ml serum içeren besi yeri eklenmiştir. 15 ml lik tüpe alınan hücreler 1000 devir/dakika (dev/dk) hızında 3 dakika süre ile santrifüje edildikten sonra hücreleri içeren pelet 10ml besi yerinde serbestleştirilmiştir. Yapılan hücre sayımı sonrasıda uygun oranda seyreltilerek 96 çukurlu tabaklara ekilmiştir Vektörlerin hazırlanması Bakteri suşları ve büyüme koşulları Bu çalışmada Escherichia coli suşu olan XL1-Blue (Stratagene #200249) kompetan hücre olarak kullanılmıştır. XL1-Blue reca1 enda1 gyra96 thi-1 hsdr17 supe44 rela1 lac [F proab lac1zdeltam15 Tn10 (Tet r )] genotipik özelliklerine sahiptir. XL1-blue hücreleri tetrasikline dirençlidir. XL-1 hücreleri endonükleazdan (enda) yoksundur, bu nedenle yüksek kalitede miniprep DNA eldesi için elverişlidir. Ayrıca rekombinasyon yetenekleri de (reca) yoktur, bu eklenti (insert) stabilitesini sağlamaktadır. hsdr mutasyonu klonlanan DNA nın EcoK endonükleaz sistemi ile parçalanmasına engel olur. 29

40 XL1-Blue uygun antibiyotik eklenen (ampisilin 100µg/ml, higromisin 200 µg/ml, tetrasiklin 12.5 µg/ml) Luria-Broth (LB) besi yerinde çoğaltılmıştır. XL1-Blue kompetan hücreleri pbsii KS + (yüksek kopya sayılı plazmit) plazmiti için kullanılmıştır. pbsii KS + nin küçük boyutu (3 kb) klonlama ve yönlendirilmiş mutasyon gibi moleküler genetik çalışmaları için oldukça uygundur Plazmitler Bu çalışmada pbsii KS + (Stratagene #212207) ve pgl4.14 (Promega E6694) plazmitleri kullanılmıştır Moleküler Genetik Teknikleri Plazmit DNA izolasyonu Miniprep plazmit DNA izolasyonu farklı plazmit izolasyon kitleri (Promega Wizard Plus SV miniprep #A1330, Qiagen Qiaprep Spin Miniprep #27104, Macherey Nagel Nucleospin Plasmid) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Plazmit izolasyonu için 5 ml kültür 37 C sıcaklıkta saat süre ile inkübe edilerek hazırlanmıştır. Qiagen Qiaprep Spin Miniprep protokolüne uyularak, bakteriyel hücreler büyüdükten sonra, örnekler 4000 dev/dk hızında 4 C de 10 dakika süre ile santrifüje edildi. Süpernatan atıldı ve bakteri hücrelerinden oluşan pelet 250 µl P1 tamponu içinde çözüldü ve 1.5 ml lik mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı. Üzerine 250 µl P2 tamponu eklendi ve 4-6 kez yukarı-aşağı çevrilerek karıştırıldı. Karışıma 350 µl N3 tamponu eklenerek tüpler tekrar 4-6 kez yukarı-aşağı çevrilerek karıştırıldı. Örnekler 13,000 dev/dk hızında 10 dakika süre ile santrifüje edildi. Süpernatan QIAprep spin kolonlarına aktarıldı ve 13,000 dev/dk hızında 1 dakika süre ile 30

41 santrifüje edildi. QIAprep spin kolonu daha sonra 0.5 ml PB tamponu ile yıkarak 13,000 dev/dk hızında 1 dakika süre ile santrifüje edildi. Daha sonra kolon 750 µl PE tamponu ile yıkanarak 13,000 dev/dk hızında 1 dakika süre ile santrifüje edildi. QIAquick kolonu steril mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı. DNA 50 µl distile su ile çözüldü ve 13,000 dev/dk hızında 1 dakika süre ile santrifüje edilerek plazmit DNA elde edildi Enzim kesimi Klonlama çalışmaları sırasında 500 ng plazmit DNA, 1 µl (10 ünite) enzim ile 1X enzim tamponlarını içeren çözeltide kesime uğratıldı. Reaksiyon 37 C de 1-2 saat süre ile gerçekleştirildi Enzim ile kesilen DNA örneklerinin saflaştırılması Enzim ile kesilen DNA örnekleri, alkalen fosfataz uygulanan plazmit DNA ve PZR ürünleri Qiagen QIAquick PZR saflaştırma kiti (Qiagen #28104) kullanılarak saflaştırıldı. Qiagen QIAquick PZR saflaştırma protokolüne uyularak, 1 hacim örnek için 5 hacim PB tamponu kullanıldı. Örnek QIAquick kolona yüklenerek 13,000 dev/dk hızında 1 dakika santrifüje edildi. Kolon 750 µl PE tamponu ile yıkandı ve 13,000 dev/dk hızında 1 dakika santrifüje edildi. Kolon steril mikrosantrifüj tüpüne aktarılarak DNA µl saf su ile çözüldü. 13,000 dev/dk hızında 1 dakika santrifüje edilerek saflaştırılmış DNA elde edildi Agaroz Jel elektroforezi 1xTBE tampon çözeltisi içerisinde %0.7 veya %1 lik (w/v) agaroz jel hazırlandı. Mikrodalga fırında agaroz eritilerek yaklaşık 55ºC ye soğuması beklendikten sonra son konsantrasyonu 250 µg/ml olacak şekilde etidyum 31

42 bromid (5 mg/ml) eklenerek karıştırıldı ve jel kalıbına döküldü. Donmasının ardından tarak çıkartıldı ve jel; elektroforez tankına alındı. Jelin üzerini örtecek hacimde 1xTBE tamponu eklendi. 20 µl hacimdeki PCR ürünleri 6x DNA yükleme tamponu ile karıştırılarak (son konsantrasyon 1x) kuyucuklara yüklendi. DNA boyutunu belirleyen cetvelden (DNA ladder) kuyucuk başına 0.5 µg kullanıldı.şekil 7 de kullanılan DNA cetvellerine ait bantların baz çifti (bç) olarak büyüklükleri gösterilmiştir. Ürünler sabit 100V elektrik akımı altında yürütüldü. Şekil 7 Kullanılan DNA cetvelleri 50 bç (baz çifti) DNA cetveli (MBI Fermentas, Litvanya), B) 100 bç DNA cetveli (MBI Fermentas, Litvanya), C) 1 kb DNA cetveli (NEB, ABD). Elektroforez işlemi sonucunda DNA ürünleri UV transilüminatör (2011 Macrovue, LKB) ile görüntülendi ve Polaroid gel-cam fotoğraf makinesi ile belgelendi. 32

43 Agaroz Jelden DNA fragmanlarının izolasyonu Enzim ile kesilen DNA örnekleri (40-60 µl içinde 500 ng plazmit DNA) %1 lik agaroz jelde yürütülerek DNA fragmanları birbirinden ayrıldı. İstenen DNA fragmanını içeren agaroz jel bandı kesilerek çıkartıldı. Bu işlem sırasında DNA nın korunması için UV ışık ile temas minimumda tutulmaya çalışıldı. Kesilen jel parçası tartılarak yaklaşık hacmi hesaplandı. (100 mg jel yaklaşık olarak 100 µl ye eşittir). Agaroz jelden DNA izolasyonu için Qiagen Qiaquick Jel ekstraksiyon kiti (Qiagen #28704) üretici talimatlarına uyularak kullanıldı. Her bir hacim jel örneği için 3 hacim QG tamponu eklenerek agaroz 50 C ta 10 dakika süre ile çözüldü. Jelin çözünmesine yardımcı olmak amacıyla tüpler her 2-3 dakikada 10 saniye süre ile vortekslendi. Jel tamamen çözüldükten sonra 500 bç ile 4 kbç (kilobaz çifti) arasında büyüklükteki DNA fragmanlarının kazanımını arttırmak amacı ile 1 hacim izopropanol karışıma eklendi. Örnekler DNA nın bağlanması için Qiaquick kolona yüklenerek 13,000 dev/dk hızında 1 dakika santrifüje edildi. Kolon 750 µl PE tamponu ile yıkandı ve 13,000 dev/dk hızında 1 dakika santrifüje edildi. Kolon steril mikrosantrifüj tüpüne aktarılarak DNA 30 µl saf su ile çözüldü. 13,000 dev/dk hızında 1 dakika santrifüje edilerek saflaştırılmış DNA elde edildi Ligasyon reaksiyonu Ligasyon reaksiyonları için MBI Fermantas T4 ligaz (MBI Fermantas #EL0334) kullanıldı. Vektör ve eklenti DNA nın konsantrasyonları OD 260nm ölçümü veya agaroz jeldeki işaretleyiciler ile karşılaştırılarak belirlendi. Vektör ve eklenti DNA nın pmol değerleri pmol = 1.52 pmol x µg DNA/ DNA nin kbç 33

44 formülü ile hesaplandı. Ligasyon reaksiyonu karışımı vektörün 4 katı oranında eklenti DNA içerecek şekilde hazırlandı. (x pmol vektör, 4x pmol eklenti, 2 µl 10x ligasyon tamponu, 4 ünite T4 ligaz ve ddh 2 O ile 20 µl ye tamamlandı). Ligasyon reaksiyonu 22 C de 1-2 saat süre ile inkübe edildi Kompetan hücre hazırlanması ve transformasyon XL-1 Blue kompetan hücreleri 50 ml LB+Tet besiyerinde 500 ml lik cam kap içinde önceden hazırlanan kültürün 500 µl si ile inoküle edildi. İnoküle edilen kültürler 37 C de 175 dev/dk hızında çalkalanarak OD 600nm = olana dek inkübe edildi. Daha sonra hücreler buz üzerine alındı. Bu noktadan sonra ısı şokuna dek hücreler buz üzerinde korundu. Kompetan hücreler 4000 dev/dk hızında 10 dakika süre ile 4 C de santrifüje edildi. Süpernatan atıldı ve kompetan hücrelerden oluşan pelet 25 ml (kültürün yarısı hacimde) 4 C de bekletilen 100 mm CaCl 2 içinde çözüldü ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edildi. Hücreler 4000 dev/dk hızında 10 dakika süre ile 4 C de santrifüje edildi. Süpernatan atıldı ve hücrelerden oluşan pelet 2.5 ml (kültür hacminin 1/20 si) 4 C ye soğutulmuş 100 mm CaCl 2 içinde çözüldü. Kompetan hücreler 100 µl lik alikotlara ayrıldı. -80 C de saklanacak stoklara son konsantrasyonu %10 olacak şekilde gliserol eklendi. Transformasyon için 100 µl kompetan hücreye ng DNA eklendi ve buz üzerinde 45 dakika inkübe edildi. 45 dakikanın sonunda 5 dakika süre ile 37 C de tutularak ısı şoku uygulandı. İşlemin sonunda hücre membranlarının tamiri amacı ile 1 ml LB besi yeri eklenerek 37 C de 1 saat karıştırılarak inkübe edildi. Hücreler 4000 dev/dk hızında 1 dakika süre ile oda sıcaklığında santrifüje edildi. Pelet 100 µl LB besi yerinde çözülerek uygun antibiyotiği içeren seçici LB-agar tabaklara ekildi ve bir gece 37 C de inkübe edildi. 34