GENEQUALITY DDK/G17 KULLANICI KILAVUZU. Kod 04-44A Kod 04-44R

Transkript

1 KULLANICI KILAVUZU GENEQUALITY DDK/G17 Kod 04-44A Kod 04-44R Duchenne ve Becker muskuler distrofi için gende 3, 4, 6, 8, 13,17, 19, 43, 44, 45,47, 48, 49, 50, 51, 52, 60 delesyonlarının belirlenmesi için kit

2

3 1. ÜRÜN BİLGİSİ HATA! YER İŞARETİ TANIMLANMAMIŞ. 2. KİT İÇERİĞİ 6 3. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI 8 4. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER 8 5. GÜVENLİK KURALARI Genel güvenlik kuralları Kit hakkında güvenlik kuralları KİT İÇERİĞİNDE OLMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Reaktifler Cihazlar Materyaller REAKTİFLERİ HAZIRLAMA GİRİŞ TEST PRENSİBİ ÜRÜN TANIMI Ekson hakkında bilgiler ÜRÜN TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELE Taze ve donmuş tam kan PROTOKOL Taze ve donmuş tam kandan DNA ekstraksiyonu DNA AMPLİFİKASYONU 19 Pag 3

4 13.1. Multipleks amplifikasyon I Multipleks amplifikasyon II Multipleks amplifikasyon III Thermal protokol Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi Agaroz jel elektroforezi Örnek yükleme SONUÇLARIN YORUMLANMASI SORUN GIDERME TEST LIMITLERI TEST PERFORMANSI Özgünlük Duyarlılık REFERANSLAR Yararlı websiteleri 28 Pag 4

5 1. ÜRÜN BİLGİSİ Bu kullanıcı kılavuzu aşağıdaki ürünleri içerir: DDK/G17 (kod A) Ekson 3, 4, 6, 8, 13, 17, 19, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 60 ın DNA amplifikasyonu ile Duchenne ve Becker muskuler distrofide gen delesyonlarının tanımlanması için kit. Amplifikasyon ve agaroz jelde görüntüleme için tüm reaktifleri içerir. Kod Ürün Pkg 04-44A-25 DDK/G17 25 test 04-44A-50 DDK/G17 50 test DDK/G17- amplifikasyon reaktifleri (kod R) Ekson 3, 4, 6, 8, 13, 17, 19, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 60 ın DNA amplifikasyonu ile Duchenne ve Becker muskuler distrofide gen delesyonlarının tanımlanması için reaktifler. Amplifikasyon için reaktifleri içerir. Kod Ürün Pkg 04-44R-25 DDK/G17- amplifikasyon reaktifleri 25 test 04-44R-50 DDK/G17- amplifikasyon reaktifleri 50 test Pag 5

6 2. KİT İÇERİĞİ DİKKAT! Farklı içerikler farklı kitler ile ilişkilidir. (kısaltma: X= kit içeriğinde bulunan komponent; 0= kit içeriğinde bulunmayan komponent) KUTU P 20 C DE SAKLANIR kod 04-44A kod 04-44R AÇIKLAMA X X Thermostabil Taq DNA polimerase ETİKET AB Taq 5 U/μL TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test Kırmızı 45 µl 90 µl 15 µl X X 10X Buffer 10X Buffer X X dntps dntps X X MgCl 2 MgCl X X Primer 3F/R X X Primer 6F/R X X Primer 8F/R X X Primer 45F/R X X Primer 48F/R X X Primer 50F/R X X Primer 60F/R X X Primer 4F/R X X Primer 13F/R X X Primer 17F/R Primer 3F Primer 3R Primer 6F Primer 6R Primer 8F Primer 8R Primer 45F Primer 45R Primer 48F Primer 48R Primer 50F Primer 50R Primer 60F Primer 60R Primer 4F Primer 4R Primer 13F Primer 13R Primer 17F Primer 17R Mavi Mavi Mavi Mavi Mavi Mavi Mavi Yeşil Yeşil Yeşil Pag 6

7 X X Primer 19F/R Primer 19F Primer 19R Yeşil X X Primer 43F/R Primer 43F Primer 43R Mor X X Primer 44F/R Primer 44F Primer 44R Mor X X Primer 47F/R Primer 47F Primer 47R Mor X X Primer 49F/R Primer 49F Primer 49R Mor X X Primer 51F/R Primer 51F Primer 51R Mor X X Primer 52F/R Primer 52F Primer 52R Mor X X Mineral Yağı Mineral Yağı 3 ml 5 ml 1,2 ml KUTU F +2 / +8 C DE SAKLANIR kod 04-44A kod 04-44R X 0 X 0 AÇIKLAMA Elektroforez için yükleme buffer Ethidium Bromide solusyonu (2,5 mg/ml) ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test 6X Blue Mavi 1X 225μL 1X 450μL 1X 75μL Ethidium Bromide toksik R S 36/37 45 Kırmızı 1X 180μL 1X 300μL 1X 70μL X 0 DNA Moleküler Ağırlık Markır MW Markır Sarı 1X 200μL 1X 380μL 1X 60μL Pag 7

8 KUTU A +15 / +25 C DE SAKLANIR kod 04-44A kod 04-44R X 0 X 0 AÇIKLAMA Yüksek rezolusyon elektroforez için Agaroz Elektroforez buffer TRIS-Acetate-EDTA ph: 8,00 ETİKET HR AGAROZ TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test 1X 26 g 1X 50 g 1X 8 g 50X TAE 1X65mL 1X125mL 1X25mL 3. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore saklanmalıdır. Özellikle: KUTU P Box FKUTU F Box AKUTU A -20 C de saklanır +4 / +8 C DE SAKLANIR +15 / +25 C DE SAKLANIR Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. 4. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; Son kullanım tarihi geçmiş kit parçalarını kullanmayın; Pag 8

9 Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: Filtreli uç kullanın; Biyolojik örnekler, ekstrakte edilmiş DNA, kit içeriğindeki referans DNA ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır. PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. Sık sık eldiven değiştirin. Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. Kullanmadan once PCR premiksi oda ısısında eritin; Taq DNA polymerase ekleyin ve oda ısısında ya da buz kabında oldukça hızlı DNA purifiye edin. 5. GÜVENLİK KURALLARI 1.1. Genel Güvenlik Kuralları Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. Ağızla pipetleme yapmayın. Bilinen hiçbir diagnostik metod enfektif ajalnların yok olduğunu garanti etmez. Tüm klinik örnekleri potansiyel enfeksiyonu ajanı olarak kabul edip o şekilde kullanmak gerekir; Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile Pag 9

10 temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121 C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solusyonları otoklavlamayın!!) Pag 10

11 1.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir: Tehlikeli Komponentler: ETHIDIUM BROMIDE (04-44A kit içinde bulunur) 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiumbromide <2% Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 23 ve R 68 S 36/37 45 İnhalasyon için toksik. Geri dönülmez etkiler riski. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir. Özellikle Ethidium Bromide için, agaroz jelde dilusyona kadar. Konsantre Ethidium Bromide uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Seyreltilmiş Ethidium solusyonu ile çalışırken daima laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu sistem kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları takip edin. Ethidium Bromide kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile temizleyin. İstenildiğinde ürünlerin Materyal Güvenlik Data Sheetleri gönderilebilir. Pag 11

12 6. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 1.3. Reaktifler DNA ekstraksiyon reaktifleri; Steril DNase ve RNase free su; Agaroz jelde elektroforez ile DNA görüntülemesi için reaktifler (04-44R kiti gerektirir) Cihazlar Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNA eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl); Thermalcycler; Tartı; Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga; Mikrosantrifüj (max rpm); Kimyasal kabin (Ethidium Bromide uygulamasında kullanılması önerilir); Agaroz minijel için yatay elektroforez haznesi; Güç kaynağı ( V); UV Transilluminator; Foto kamera ya da imaj analizör Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl; µl); TAE dilusyonu için dereceli silindirler (1L); Agaroz jel hazırlamak için pyrex şişe ya da Becker; Parafilm. Amplifikasyon için 0.2 ml ya da 0.5 ml steril test tüpleri. Amplifikasyon mastermiksinin hazırlanması için steril 1.5 mltest tüpleri Pag 12

13 7. REAKTİFLERİ HAZIRLAMA 1 L TAE Buffer (1X) hazırlamak için: 20 ml 50X TAE (04-44A kitinde bulunur) ile 980 ml distile su karıştırın. Pag 13

14 8. GİRİŞ Distrofi, malnutrisyon ile dokunun anormal büyümesi olarak tanımlanır. En iyi bilinen dejeneratif hastalık muskuler distrofidir. Farklı tiplerde muskuler distrofi vardır, fakat en sık ve ciddi olan, ismini 19. yüzyılın ortalarında tanımlayan Fransız bir nörolojist olan Guillaume Duchenne den alan Duchenne (DMD) dir. Bu hastalığa, kısalma sırasında kasları hasardan koruyan bir protein olan distrofin eksikliği neden olur. İlk semptom, 3-5 yaşlarında başlayıp yürüme kaybına kadar ilerleyen zayıf kalça kaslarıdır. Sonra bu hastalık kollar ve insan gövdesine yayılır. Sonuç olarak omurgada anormal eğilmeler olur çünkü hiçbir kassal destek yoktur. Muskuler distrofi hastalarında organlar da etkilenir. Kalp ve merkezi sinir sistemi ile problemler hastaların yaklaşık %10 unda düşük düzeyde mental reterdasyon olarak görülebilir. Alelik form Becker distrofi erteleme ve daha fazla benin gelişme ile farklılaşmıştır. Duchenne formundan etkilen hastalar 11 yaşına gelmeden tekerlekli sandalye ile kısıtlanırken; aynı yaşlarda Becker formundan etkilenen hastalar hala yürüyebilirler. Bu hastalığın sıklığı canlı doğumlarda 1.5/10,000 ve 1.5/100,000 arasındadır. Distrofin proteininde yol gösteren analizler göstermiştir ki; DMD de tamamen yok olmuş ya da büyük ölçüde azalmışken, BMD de daima görünür fakat miktarı ve/veya boyutları azalmıştır (Hoffman ve ark., 1988; Monaco ve ark., 1988). Duchenne-Becker muskuler distrofisinin tanısı klinik testlere (Gowers pozitif işaret) ve şüpheli durumlarda bazı laboratuar testlerine dayanır: C.P.K. (kreatinfosfokinaz), L.D.H. ve transaminaz. Son set testler düzensiz sonuçlara sahiptir, muskuler biyopsi ve DNA moleküler tanısı yapılacaktır. Gerçekte, tedavi ve fizik terapi yoktur ve kardiyovasküler sistemin rutin kontrolü bu hastalıkla oluşan hasarları sınırlar. Araştırmacılar genetik terapileri değerlendirmiştir (bozuk gen değişimi ya da myoblast transplantları rejeksiyona göre problemlere sahiptir) (Roberts ve Dickson, 2002; Clemens ve Duncan, 2001) yeni muskuler fiberlerin büyümesi için kök hücrelerin kullanılması ve kaslarda az miktarda bulunan distrofin benzeri bir protein olan utrofinin yönetilmesi. Günümüz çalışmaları göstermiştir ki; Duchenne ve Becker distrofi aynı gende mutasyonlar ile kaynaklanmaktadır ve aynı hastalığın çeşitleri olabilir. Gen, şüpheli, en az 79 eksondan oluşur ve X kromozomunda 2,5Mb kapsar (Koenig ve ark., 1987; Roberts ve ark., 1993). Kadınlar iki X kromozomuna Pag 14

15 sahip olduğundan bu hastalık erkeklerde daha yaygındır ve bu nedenle taşıyıcı anneden oğullarına geçer (olguların üçte birinde hastalık anne tarafından aktarılmaz, fakat yeni mutasyonlarla oluşur). Moleküler araştırma metodları, doğru olarak distrofin için gende düzensizlikler gösterir. Bu teknikler, hastalık başlangıcında üç ay içinde hastalığı tanımlayabilen koryon villus örneklerinde çalışılabilir. Tanımlanan mutasyonların yaklaşık %65 i, bir ya da daha fazla ekson içeren intragenetik delesyonlar (Koenig ve ark., 1987; Forrest ve ark., 1988; Den Dunnen ve ark., 1989) ve olguların %5-8 inde duplikasyonlardır (Hu ve ark., 1988). Distrofin geninin duplikasyon ve delesyon çalışmaları için geleneksel metod daima cdna problarını kullanan Southern blottır. Bu metod ayrıca büyük miktar ve yüksek kalitede klinik örnekler gerektirir. Moleküler araç (multipleks amplifikasyon) küçük miktarlarda ve iyi kaliteli olmayan örneklerde dahi hızlı bir analiz metodudur (1-2 gün). Bu hastalığın tanısını doğrulayabilir ve aile genetik danışmanlığı için değerli bir gereç olarak kullanılarak prenatal tanı için kullanılabilir. Pag 15

16 9. TEST PRENSİBİ PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürlerde ilk DNA amplifikasyonu metodudur. (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda nükleik asitin üç segmenti yer alır: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid primerler kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dntpler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Amplifikasyon reaksiyonunun geniş biyolojik örneklerde uygulanabilmesinin yanında, PCRın oldukça küçük DNA segmentlerini de amplifiye edebilmesinden başlangıç DNAsı kısmi olarak yıkılabilir. Dikkatlice seçilen primer miksi kullanan multipleks amplifikasyon aynı reaksiyonda eş zamanlı olarak farklı DNA dizileriniamplifiye edebilir. 10. ÜRÜN TANIMI Bu kit üç multipleks amplifikasyon reaksiyonu ile Duchenne-Becker muskuler distrofi delesyonlarında genin ekson 3, 4, 6, 8, 13, 17, 19, 43, 44, 45, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 60 ın delesyonlarının analiz eder. Pag 16

17 1.6. Ekson amplifikasyonunda bilgiler PRİMER ÇİFTİ AMPLİFİYE BÖLGE AMPLİFİKASYON BOYUTU (bp) Primer 3F/3R Ekson Primer 4F/4R Ekson Primer 6F/6R Ekson Primer 8F/8R Ekson Primer 13F/13R Ekson Primer 17F/17R Ekson Primer 19F/19R Ekson Primer 43F/43R Ekson Primer 44F/44R Ekson Primer 45F/45R Ekson Primer 47F/47R Ekson Primer 48F/48R Ekson Primer 49F/49R Ekson Primer 50F/50R Ekson Primer 51F/51R Ekson Primer 52F/52R Ekson Primer 60F/60R Ekson Pag 17

18 11. ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN- MUAMELESİ 1.7. Taze ve donmuş tam kan Kan, tüm gerekli sterilite önlemleri takip edilerek rutin prosedürler ile toplanmalıdır. Kan EDTAlı olarak alınmalıdır. Heparin gibi diğer koagülasyon ajanları TAQ polymerase ın güçlü inhibitörleridir ve bu yüzden amplifikasyon reaksiyonunun verimliliğini bozar. Taze kan kısa bir süre +2 C / +8 C de saklanabilir; eğer bu kısa sürede DNA ekstrakte edilmeyecekse örneğin 20 C de saklanması gereklidir. 12. PROTOKOL 1.8. DNA EKSTRAKSİYONU (taze ya da donmuş tam kandan) Tam ve saf DNA izole eden herhangi bir ekstraksiyon metodu kullanılabilir. Amplifikasyon için kullanılan DNA solusyonu yaklaşık 30 ng/µl konsantrasyonda tasarlanmıştır; bu nedenle elde edilen ekstraksiyon solusyonunun, eğer gerekli ise, paragraf 13 de belirtildiği gibi herbir tüpe eklemek için ekstrakte DNA miktarının seyreltileceği akılda tutulmalıdır. Ekstraksiyon protokolü hakkında daha fazla bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun, laboratorio@abanalitica.it, faks (+39) ya da tel. (+39) ). Pag 18

19 13. DNA AMPLİFİKASYONU 1.9. Multipleks amplifikasyon I Amplifikasyon reaktiflerini ve mavi kapaklı tüpte bulunan tüm primerleri eritin. Steril bir test tüpünde aşağıdaki reaksiyon miskini hazırlayın: N X 2,5 μl 10X Buffer N X 0,75 μl MgCl 2 N X 2,5 μl dntps N X 1 μl Primer 3F N X 1 μl Primer 3R N X 1 μl Primer 6F N X 1 μl Primer 6R N X 1 μl Primer 8F N X 1 μl Primer 8R N X 1 μl Primer 45F N X 1 μl Primer 45R N X 1 μl Primer 48F N X 1 μl Primer 48R N X 1 μl Primer 50F N X 1 μl Primer 50R N X 1 μl Primer 60F N X 1 μl Primer 60R N X 3,75 µl H 2 O N X 0,5 μl AB Taq N = Örnek Sayısı Analiz edilen örnekler ile birlikte daima bir negatif kontrol (bir tane mikse DNA yerine distile su ekleyin) ve bir pozitif kontrol (önceden test edilmiş delesyona uğramamış genomik DNA) amplifiye edilmesi iyi bir uygulamadır. Reaktifleri karıştırın, kısa bir süre santrifüj edin ve amplifikasyon için steril test tüplerine 24 μl miks alikuatlayın, her birine bir iki damla mineral yağı ve 1μL ekstrakte DNA ya da negatif kontrol için 1μL su veya 1μL pozitif kontrol ekleyin. Pag 19

20 1.10. Multipleks amplifikasyon II Amplifikasyon reaktiflerini ve mavi kapaklı tüpte bulunan tüm primerleri eritin. Steril bir test tüpünde aşağıdaki reaksiyon miskini hazırlayın: N X 2,5 μl 10X Buffer N X 0,75 μl MgCl 2 N X 2,5 μl dntps N X 1 μl Primer 4F N X 1 μl Primer 4R N X 1 μl Primer 13F N X 1 μl Primer 13R N X 1 μl Primer 17F N X 1 μl Primer 17R N X 1 μl Primer 19F N X 1 μl Primer 19R N X 9,75 µl H 2 O N X 0,5 μl AB Taq N = Örnek Sayısı Analiz edilen örnekler ile birlikte daima bir negatif kontrol (bir tane mikse DNA yerine distile su ekleyin) ve bir pozitif kontrol (önceden test edilmiş delesyona uğramamış genomik DNA) amplifiye edilmesi iyi bir uygulamadır. Reaktifleri karıştırın, kısa bir süre santrifüj edin ve amplifikasyon için steril test tüplerine 24 μl miks alikuatlayın, her birine bir iki damla mineral yağı ve 1μL ekstrakte DNA ya da negatif kontrol için 1μL su veya 1μL pozitif kontrol ekleyin.. Pag 20

21 1.11. Multipleks amplifikasyon III Amplifikasyon reaktiflerini ve mavi kapaklı tüpte bulunan tüm primerleri eritin. Steril bir test tüpünde aşağıdaki reaksiyon miskini hazırlayın: N = Örnek Sayısı N X 2,5 μl Buffer 10X N X 0,75 μl MgCl 2 N X 2,5 μl dntps N X 1 μl Primer 43F N X 1 μl Primer 43R N X 1 μl Primer 44F N X 1 μl Primer 44R N X 1 μl Primer 47F N X 1 μl Primer 47R N X 1 μl Primer 49F N X 1 μl Primer 49R N X 1 μl Primer 51F N X 1 μl Primer 51R N X 1 μl Primer 52F N X 1 μl Primer 52R N X 5,75 µl H 2 O N X 0,5 μl AB Taq Analiz edilen örnekler ile birlikte daima bir negatif kontrol (bir tane mikse DNA yerine distile su ekleyin) ve bir pozitif kontrol (önceden test edilmiş delesyona uğramamış genomik DNA) amplifiye edilmesi iyi bir uygulamadır. Reaktifleri karıştırın, kısa bir süre santrifüj edin ve amplifikasyon için steril test tüplerine 24 μl miks alikuatlayın, her birine bir iki damla mineral yağı ve 1μL ekstrakte DNA ya da negatif kontrol için 1μL su veya 1μL pozitif kontrol ekleyin. Pag 21

22 1.12. Thermal protokol Kısa bir süre santrifüj edin ve test tüplerini aşağıdaki programda thermalcyclera koyun: 1 cycle 94 C 3 minutes 27 cycle 94 C 65 C 30 seconds 4 minutes 1 cycle 65 C 6 minutes Storage 4 C Amplifikasyon boyutları: Bakınız paragraf Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi Agaroz jel elektroforezi %4 agaroz jel hazırlayın: 2 g Agaroz tartın ve 50 ml 1X TAE içine dökün. Solusyonu berrak oluncaya kadar manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga içine bırakın. Jelin soğumasına izin verin (3-5 dakika), sonra 10 μl 2.5 mg/ml Ethidium Bromide solusyonu ekleyin. NOT: Ethidium Bromide güçlü bir mutajenik ajandır: Daima eldiven kullanın ve bu reaktifle ya da içeren jel ile çalışırken tercihen kimyasal güvenlik kabini altında çalışın. Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında soğuyana kadar bekleyin ya da jel katı hale gelene kadar buzdolabına koyun. Jel katılaştığında tarakları dikkatlice alın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye dikkat edin) ve trayi elektroforez tankına geçirin. Jeli tamamen kaplayacak şekilde (jel yüzeyinin 1-2mm üzerinde) uygun miktarda 1X TAE buffer dökün. Pag 22

23 Örnek yükleme Test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın: 2 µl 6X Blue* 10 µl PCR ürünü ya da DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW Markır)* Miksi jel kuyucuklarına yükleyin; güç kaynağını açın ve voltajı V a ayarlayın. Çalışma sonunda, jeli UV transilluminatore koyun ve amplifikasyon ürünlerinin boyutunu referans DNA Moleküler Ağırlık Markır ile karşılaştırarak sonuçları analiz edin. * = 6X Blue ve DNA Moleküler Ağırlık Markır 04-44A kit içinde bulunur; Başka bir yükleme buffer ya da DNA Moleküler Ağırlık Markır kullanıldığında sağlayıcı bilgilerini takip edin. *DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW): DNA fragmanları: , 404, 353, 242, 190, 147, 110, 89, 67, 34, 26 bp. %4 agaroz jelde bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları %4 agaroz jelde bazen görünmek için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı). *NOT: DNA Moleküler Ağırlık Markır * kit içinde bulunan, kod. sadece 04-44Ada bulunur. NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın. Pag 23

24 14. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Eklenen kontroller beklenen sonuçları verdiğinde: KONTROL Delesyon olmamış DNA SONUÇ Tüm beklenen bandların varlığı YORUM Multipleks amplifikasyon doğru çalışmıştır Negatif kontrol Bandların yokluğu Kontaminasyon görülmez Agaroz jelde amplifiye ürünlerden görünür bandlar aşağıdaki gibi yorumlanır: SONUÇ Tüm amplifiye eksonlardan ürünlerin varlığı Bir ya da daha fazla amplifiye ürünün yokluğu YORUM Örnek, analiz edilmiş eksonlar için delesyonları önler Örnek, amplifiye ürünlerden kaybolan eksonlar için delesyonludur Fig. 1: Bir delesyonlu olmayan kişi için üç multipleksin amplifikasyon ürünlerinin 1X TAE ile %4 agaroz jel elektroforezi, Sütun 1: Sütun 2: Sütun 3: Sütun 4: DNA Moleküler Ağırlık Markır Multipleks I Multipleks II Multipleks III Pag 24

25 15. SORUN GİDERME Test edilen örneklerden amplifikasyon ürünü yoktur ve delesyonu olmayan DNA dahildir Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır Uygun volümde birpipet ve uç kullanın (pipet aralığı μl) düşük miktarlar için; Matriks çalışması içindeki DNA polimerazı görsel olarak değerlendirin: Bu mümkündür, çünkü gliserolde bulunan enzim kısmen ağırdır; Alternatif olarak, tüp duvarına konulmuş olan TAQ polymerasın görsel olarak teyit edin, sonra kısa bir süre santrifüj edin. Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır. Thermalcycler programının uygunluğunu ve kullanıcı kılavuzundaki sıcaklık profilini kontrol edin. Kit uygun şekilde çalışmaz Premiks, enzimler ve referans DNAyı -20 C de saklayın; -Premiks ve reaktifleri tekrar tekrar dondurup/çözdürmekten sakının. Test edilmiş örneklerde amplifikasyon ürünü yoktur, fakat delesyon olmamış DNA da iyi bir elektroforez paterni vardır Ekstraksiyon aşaması sırasında olası problemler: Ekstraksiyon metodunun uygun olduğundan ve tüm bilgileri doğru şekilde takip ettiğinizden emin olun; Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar DNA ekstraksiyonu yapın. Pag 25

26 Amplifikasyon inhibe olmuştur DNA ekstraksiyonunu düşük miktarda kan ile tekrar edin. Amplifiye ürünlerin agaroz jelde görüntülenmesinden sonra aspesifik ürün ya da ekstra band görülmesi Thermalcycler sıcaklık değişimlerini çok yavaş yapın. Thermalcycler değişikliklerini uygulayın. Amplifikasyon reaksiyonunun hazırlanması oda ısısında çok uzun zaman alır. Oda ısısında çalışma zamanınızı hızlandırın; Buz üzerinde çalışın. Başlangıç örnekleri yıkılmış DNA içerir Ekstraksiyon aşamasını başka bir başlangıç klinik örneği kullanarak tekrarlayın; Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin. faks (+39) , ya da tel. (+39) Pag 26

27 16. TEST LİMİTLERİ Kit performansı aşağıdaki durumlarda azalır: Klinik örnekler bu analiz için uygun değildir (örnekler doğru saklanmamış, EDTA dan başka bir anrikoagülen kullanılmış); Amplifikasyon reaksiyonunun inhibitörlerinin görülmesi ya da uygun olmayan ekstraksiyon sistemi kullanılması nedeniyle DNA amplifiye olmaz. 17. TEST PERFORMANSI Özgünlük En önemli bilgi bankasında uygulanan primer dizisi spesifik olmayan dizilerin yokluğunu değerlendirir ve Duchenne-Becker muskuler distrofi için gendeki eksonların spesifik amplifikasyonunu garanti eder Duyarlılık Bahsedilen referanslar rapor etmiştir ki;bu tip testler DMD-BMD geninde delesyonların %98 ini tanımlayabilir (Beggs ve ark.,1990). Pag 27

28 19. REFERANSLAR Beggs AH, Koenig M, Boyce FM et al. Hum Genet 86 (1), 45-48, Clemens PR and Duncan FJ. Curr Neurol Neurosci Rep 1(1), 89-96, Den Dunnen JT, Grootscholten PM, Bakker E et al. Am J Hum Genet 45 (6), , Forrest SM, Cross GS, Flint T et al. Genomics 2 (2), , Hoffman EP, Fischbeck KH, Brown RH et al. N Engl J Med 318 (21), , Hu XY, Burghes AH, Ray PN et al. J Med Genet 25 (6), , Koenig M, Hoffman EP, Bertelson CJ et al. Cell 50 (3), , Monaco AP, Bertelson CJ, Liechti-Gallati S et al. Genomics 2 (1), 90-95, Roberts M and Dickson G. Curr Opin Mol Ther 4 (4), , Roberts RG, Coffey AJ, Bobrow M et al. Genomics 16 (2), , Saiki RK, S Scharf, F Faloona et al. Science 230, , Yararlı websiteleri Pag 28

29 Pag 29

30 Pag 30

31

32 AB ANALITICA srl Via Svizzera PADOVA, (ITALY) Tel Fax info@abanalitica