Xp21.2 Bilinen en büyük genlerden bp X kromozomunun % 1,5 i Gen/ekzon oranı %0,6 (13956 bp) BİLİNEN EN AZ 8 DOKU SPESİFİK PROMOTER BÖLGESİ,

Transkript

1 Duchenne/Becker Müsküler Distrofi sinden etkilenmiş olgularda DMD gen mutasyonlarının MLPA ve yeni nesil dizileme teknolojisi ile araşbrılması Güven Toksoy, PhD İÜ, İTF, Tıbbi Gene9k AD

2 Xp21.2 Bilinen en büyük genlerden bp X kromozomunun % 1,5 i Gen/ekzon oranı %0,6 (13956 bp) BİLİNEN EN AZ 8 DOKU SPESİFİK PROMOTER BÖLGESİ, 2 POLY A EKLENME BÖLGESİ, Chr X EN AZ 21 FARKLI RNA KIRPILMA BÖLGESİ 2

3 DMD 32 feno9p, 3371 MUTASYON BÜYÜK DELESYONLAR ~%60 BÜYÜK DUPLİKASYONLAR ~%7 NOKTA MUTASYONLARI ~%25 3

4 Moleküler tanı RFLP, Southern blo^ng, Mul9pleks PCR, FISH, MLPA, Array, Delesyon ve duplikasyonlar Sanger dizileme, Yeni nesil dizileme Nokta mutasyonları, küçük değişimler

5 2010 yılında cdna tasarımı, tüm gen Sanger primer tasarımları yapıldı 2013 yılında yurt dışı merkezli ilaç geliş9rme projesi kapsamında 81 örnek MLPA çalışmasına ve normal çıkan 32 örnek için NGS ile dizi çalışmasına alındı. Proje sonrasında DMD geni için MLPA ve NGS çalışmaları ile ru9n hizmete başlandı. 1. Basamak : MLPA delesyon ve duplikasyon taraması a- Çok ekzonlu delesyon ya da duplikasyon à Anne de taşıyıcılık taranması, varsa ailede taşıyıcıların belirlenmesi b- Tek ekzon delesyon ya da duplikasyonà Sanger de ilgili ekzonu pcr ile dizilemek, prob bağlanma bölge dizisi ile ilgili küçük in/del leri ve SNP leri dışlama à Anne de taşıyıcılık taranması, varsa ailede taşıyıcıların belirlenmesi c- MLPA da delesyon ve duplikasyon saptanmayan olgular yeni nesil dizileme ile DMD gen targeted panel taraması 2. Basamak : Yeni nesil dizileme (IonTorrent PGM) ile DMD gen targeted panel taraması, Sanger ile doğrulama 5 ITF Tıbbi GeneIk : DMD/BMD

6 NM tüm ekzonlar + Dp427c Exon DELESYON /DUPLİKASYON ANALİZLERİàMLPA SALSA MLPA P034-P035 (CE-IVD)

7 60 Mb - 2 Gb 7 Nokta mutasyonu küçük del/dup à dizi analizleri İonAmpliseq tasarımı pipeline versiyon 2.2 HGMD Tüm ekzonlar + <10 bp intronik hedef + 30 derin intronik mutasyon 148 amplikon 2 pool (74/74) bp bp büyüklükte ekzon 24 5 ucundan 15 bp ekzon 27 5 ucundan 9 bp Ion PGM plalorm Ion Reporter somware 10 ng DNA yeterli

8 ANALİZ DİZİLEME VARYANT İNCELEME VE FİLTRELEME RAPORLAMA 8 IonTorrent PGM çalışması

9 Toplam indeks sayısı :267 Tüm örneklere MLPA yapıldı 142 OLGUDA MLPA NORMAL 125 büyük del/dup saptandı (%46,86) ÇOK EKZON İÇEREN DELESYON 87 OLGU TEK EKZON DELESYON 19 OLGU ÇOK EKZON DUPLİKASYON 12 OLGU (1 OLGU PARÇALI) TEK EKZON DUPLİKASYON 7 OLGU Ortalama coverage deep sayısı : 492 (48 olgu henüz çalışılmadı) 61 olguda nokta mutasyonu (%64) (!!%55,3) 3 missense ve 5 splice site mutasyonunda patojenite şüpheli 35 olguda mutasyon saptanmadı (%37,2) NGS Mutasyon saptama oranı: (%64) (%55,3?) 9 Bulgular Targeted DMD geni NGS paneli 94 olgu çalışıldı

10 nnos ACTIN DYSTROGLICAN SYNTROPHIN DYS-1 DYS-2 DYS-3 BINDING BINDING BINDING BINDING ÇOK EKSON İÇEREN DELESYON 88 OLGU TEK EKSON DELESYON 18 OLGU ÇOK EKSON DUPLİKASYON 12 OLGU (1 OLGU PARÇALI dup) TEK EKSON DUPLİKASYON 7 OLGU DELESYON DUPLİKASYON 10

11 nnos ACTIN DYSTROGLICAN SYNTROPHIN DYS-1 DYS-2 DYS-3 BINDING BINDING BINDING BINDING VARYASYON SAPTANDI (% 54,3 NOVEL) 9 SPLICE-SITE MUTATION; 2 KNOWN, 6 NOVEL 29 NON-SENSE MUTATION; 21 KNOWN, 8 NOVEL 6 MISSENSE MUTATION; 2 KNOWN, 3 NOVEL 17 FRAME-SHIFT MUTATION ; 6 KNOWN, 10 NOVEL 3 missense, 5 splice site mutasyonu patojenite açısından şüpheli Saptanan varyasyon Klinik ön tanı Histopatoloji Ekson 13: NM_ c.1513g>c (p.val505leu) KRONİK MİYOPATİ DYS I,II, III BOYANMASI NORMAL (rs ) Ekson 16: NM_ c.1988c>t (p.ala663val) TÜM BOYAMALAR NORMAL, DİSTROFİNOPATİ? Anne taşıyor, sağlıklı dayı taşımıyor, DMD TİPİ DİSTROFİNOPATİYİ DÜŞÜNDÜRECEK BULGU YOK 1. BİYOPSİ DYS1,2,3 NEGATİF BOYANMA, ANTİ35DAG, 43 DAG, 50 DAG ÇOK ZAYIF İNCE Ekson 43: NM_ c.6132t>c (p.ser2044ser) Novel SARKOGLİKANOPATİ / BMD? 2. BİYOPSİ DİSTROFİNİN ÜÇ EPİTOPUNDA DA NORMAL BOYANMA PATERNİ, SARKOGLİKAN ANTİ ALFA BETA GAMMA VE DELTA NEGATİFE YAKIN DİSTROFİNOPATİ (DMD TİPİ) DYS I,II,III İLE BİRKAÇ REVERTAN LİFTEKİ ZAYIF VE KESİNTİLİ BOYANMA DIŞINDA NEGATİF.!! INTRON 13: NM_ c c>g (rs ) DİSTROFİNOPATİ (DMD TİPİ) DİSTROFİN BOYANMASI NEGATİF!! INTRON 36: NM_ c g>t Novel DİSTROFİNOPATİ (DMD TİPİ) DYS I,II,III İLE BİR ADET REVERTAN LİF DIŞINDA NEGATİF!! INTRON 50:NM_ c g>c Novel INTRON 67:NM_ c a>c Novel DİSTROFİNOPATİ??!! INTRON 78:NM_ c T>C Novel DİSTROFİNOPATİ??!! 11

12 MLPA da tek ekzon del/dup ü delesyonlarında bir kontrol örneği ile PZR yapılmalı, ürün alınırsa Sanger dizi, ü duplikasyonlarında PZR ve Sanger dizi yapılmalıdır MLPA Ekzon 26 da delesyon MLPA probunun bağlanma noktasında nokta mutasyonu; Ekzon 26 da c.3487c>t (p.gln1163*) de novo Ekzon 26 SALSA-MLPA prob L25402 İndeks NM_ :c.3487C>T (p.gln1163*) de novo Anne 12 İLGİNÇ OLGULAR

13 Prob bağlanma bölgesinde mutasyon ; örnek 2 ekzon 64 de heterozigot delesyon??? Anne, taşıyıcı Ekzon 64 SALSA-MLPA prob L25398 NM_ :c.9312_9322delAGCTTATAGGA (NP_ :p.A3105Cfs*23) indeks Novel 13 İLGİNÇ OLGULAR

14 Prob bağlanma bölgesinde mutasyon ; örnek 3 ekzon 68 de hemizigot delesyon??? Ekzon 68 SALSA-MLPA prob L28035 NM_ :c.9854_9863delTGAGACTGGA (NP_ :p.Met3285Asnfs) CD951684;rs İLGİNÇ OLGULAR

15 Bir erkek olguda mozaik (heterozigot) mutasyon saptandı Yeni nesil dizilemede mozaiklik saptama avantajı! (Ekzon 10) c.1033c>t (p.q345ter) novel heterozigot 1 olguda veritabanı bilgisi düzel9ldi ; NM_ :c.8762A>G (p.his2913arg) BMD ilişkili olarak bildirilmiş, farklı bir ailede aynı ekzon da farklı bir mutasyonun segregasyonu araşwrılırken sağlıklı erkekte saptandı, tanı düzel9ldi. 15

16 Mul9pleks PCR ile delesyon saptanmayan olguların MLPA ile taranmalı Yeni nesil teknolojisi DMD olgularında moleküler tanı verimliliğini arxrdı (+ %30) Tek ekson del/dup Sanger dizileme ile incelenmeli (%15) Yeni nesil dizilemede mutasyon sapmayan olgular derin intronik mutasyonlar açısından cdna dizilemesi, Protein çalışmaları? Kas biyopsisi yapıldığında RNA eldesi ve cdna dizilenmesi tanıya katkı sağlayabilir Klinik ve histopatolojik bilgi moleküler sonuçların analizinde yol gösterici Klinik tanının net olmadığı durumlarda daha geniş targeted paneller ya da WES önerilebilir, sonuçların yorumlanması - Gene9k işbirliği!! Taşıyıcıların saptanması ve/veya segregasyonların belirlenmesi açısından aile çalışmaları çok önemli 16 Sonuçlar

17 DR. ADNAN YÜKSEL DR. HATİP AYDIN DR. AYCAN ÜNALP DR. HÜLYA KAYSERİLİ DR. AYÇA ASLANGER DR. KUTLUHAN YILMAZ DR. AYFER SAKARYA GÜNEŞ DR. MEHMET TÜRE DR. BÜLENT KARA DR. MİNE ÇALIŞKAN DR. COŞKUN ÖZDEMİR DR. MURAT ERDOĞAN DR. ÇAĞLA ÇINAR BALCIOĞLU DR. MUZAFFER POLAT DR. ERDİ ŞAHİN DR. PINAR TEKTÜRK DR. FEYZA DEYMEER DR. PİRAYE OFLAZER DR. FİGEN BAYDAN DR. SİNAN ÇOMU DR. GONCA BEKTAŞ DR. ÜNSAL YILMAZ DR. HACER DURMUŞ DR. YEŞİM PARMAN DR. HALUK TOPALOĞLU 17 İşbirliği için teşekkürler

18 Prof. Dr. Hülya Kayserili Prof. Dr. Seher Başaran Prof. Dr. Zehra Oya Uyguner Uz. Dr. Umut Alwnoğlu Uz. Dr. Şahin Avcı Doç. Dr. Birsen Karaman Dr. Tuğba Kalaycı Dr. Leyli Şentürk Dr. Güven Toksoy Dr. Çağrı Güleç Uz. Bio Volkan Karaman Uz. Bio Fa9h Tepgeç Bio. Gülendam Bağırova Bio. Burcu Sevinç Bio. A. Rıza Agayev Tkn. Alev Yalın 18 İTF Tıbbi GeneIk AD