Ç.Ü Fen ve Mühendislik Bilimleri Dergisi Yıl:2012 Cilt:28-3

Transkript

1 DOĞU AKDENİZ BÖLGESİNDE SERT ÇEKİRDEKLİ MEYVELERDE PLUM POX POTYVİRÜS (PPV, SHARKA) ÜNÜN DURUMUNUN BELİRLENMESİ VE KARAKTERİZASYONU * Determınatıon And Characterızatıon Of Plum Pox Potyvirüs (Ppv, Sharka) On Stone Fruıts At East Mediterranean Regıon Gökmen KOÇ Bitki Koruma Anabilim Dalı Saadettin BALOĞLU Bitki Koruma Anabilim Dalı ÖZET... Prunus meyvelerinin dünya çapında en önemli hasalıklarından birine neden olan Plum pox potyvirus, (Sharka, PPV); Avrupa, Asya ve Amerika da temel ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Türkiye nin Doğu Akdeniz kıyısıyla sınırlı önemli bir sofralık sert çekirdekli meyve yetiştiricilik alanı olan Çukurova bölgesinde yılları ilkbahar-yaz döneminde ani bir Sharka hastalığı çıkışı yaşanmıştır. Birkaç şeftali, nektarin, erik, kayısı ve badem çeşidinde Sharka hastalığının neden olduğu meyvede halka ve beneklenme, olgunlaşma öncesi ve olgun meyve dökümü belirtileri gözlenmiştir. PPV nin tomurcuk, yaprak ve meyvede tanısı ticari polyclonal antiserum (Bioreba, Reinac, Switzerland) kullanılarak Double Antibody Sandwich Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay (DAS ELISA) ile gerçekleştirilmiştir. Tüm izolatlar İndirek DAS- ELISA nın yanısıra Restriction Fragment Lenght Polymorfizm (RFLP) ve ırka özel primerlerle PPV-M olarak tanılanmıştır. Surveyler Silverking çeşidi nektarin, Richmay çeşidi şeftali, Priana, Precoce de tyrinthe, Nimfa çeşitlerinden kayısı ve Tuona, Ferragnes çeşidi badem bahçelerinde yoğunlaştırılmıştır. Toplamda 285 bahçeden 13 tanesi %5,31 oranında infekteli bulunmuş ve 15 adet izolat karakterizasyon için belirlenmiştir. Ek olarak Adana ilinde %12,5 ve Mersin ilinde %5,55 infeksiyon oranı saptanmıştır. Bölgesel izolatların kılıf protein gen dizi analizlerine göre PPV-M 1 ve PPV- M 2 şeklindeki alt dalın varlığı fark edilmiştir. Çukurova bölgesinde saptanan izolatlar ise badem için Türkiye de ilk kayıt niteliğindedir. Verilere bakıldığında Doğu Akdeniz de sınırlı bölgesel bulaşıklık oranlarının aksine, bahar döneminde bölge sert çekirdekli meyve üretimi için önemli bir PPV çıkışı meydana gelmiştir. Anahtar Kelimeler: Sharka, Doğu Akdeniz Bölgesi, DAS-ELISA, RT-PCR, Sert Çekirdekli Meyveler... ABSTRACT Plum pox potyvirus, (Sharka, PPV) causes one of the most serious diseases of Prunus fruit trees worldwide and has caused major economic losses across Europe, Asia and America. In the Çukurova region part of Turkey close to EastMediterrranean seaside, is important table stone fruit growing area, a sudden outbreak of Sharka disease was noticed in spring-summer of Fruits of several peach, nectarine, plum, apricot and almond varietes displayed obvious symptoms of Sharka consisting of rings and mottling spread over the whole surface of fruits and also immature and mature fruit droping. The identity of PPV was proved using commercial * Doktora Tezi -PhD. Thesis

2 polyclonal antisera (Bioreba, Reinac/Switzerland) by Double Antibody Sandwich Enzyme-linked immunosorbent assay (DAS-ELISA) in buds, leaves and fruits with symptoms. All isolates are identified as PPV-M by Indirect DAS-ELISA. Also by Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP) and strain spesific primers. The Survey was resulted in orchards of nectarine (cv.silverking), peach (cv.richmay) aptricot (cv.priana, cv.precoce de tyrinthe and cv.nimfa) and almond (cv.tuona and cv. Ferragnes) with different infection ratio. Totaly 13 orchards were found infected (% 5,31) in 285 and 15 samples were discarded as Çukurova region isolates to characterization; Additional infection percentages were %12,5 in Adana and %5,55 in Mersin provinces. As a result of Coat protein gene sequence analysis, Occurence of PPV-M 1 and PPV-M 2 subclusters were noted among the regional isolates. It seems that the isolates from almond, in Çukurova are first detected and reported at almond in Turkey. To our knowledge this is a preliminarly report of important PPV outbreak for the regional stone fruit production, in contrast to liminarly regional infection rate before in EastMediterrranean. Key Words : Sharka, East Mediterranea Region, DAS-ELISA, RT-PCR, Stone Fruits Giriş Sert çekirdekli meyve türleri ülkemizin değişik bölgelerinde değişen yoğunlukta yetiştirilmektedir. Ülkemizin özellikle Doğu Akdeniz bölgesi gibi alanları, ekolojik avantajları nedeniyle sofralık erkenci sert çekirdekli meyve üretimi için önemli bir potansiyele sahip olup bu potansiyel son zamanlarda da değerlendirilmeye başlanmıştır (Anonymous, 2000). Dünya karantina listelerinde Turunçgil endüstrisini ciddi şekilde tehdit eden Citrus Tristeza Virüsü (CTV) gibi bir öneme sahip sert çekirdekli meyvelerin önemli bir hastalığı olan Plum Pox Potyvirus (Sharka), ülkemizde Marmara, Ege ve İç Anadolu Bölgelerinde belirlenmiş olup diğer bölgeler için belirsizlik söz konusudur. Bu çalışma ile Plum Pox Potyvirüs ün Doğu Akdeniz Bölgesinde henüz varlığı kesin olarak rapor edilmemiş ancak 2005 yılı içinde yapılan ön değerlendirme çalışmalarında ELISA testi ile şüpheli olan veya enfekteli kabul edilecek örnekler belirlenmiş ve hastalığın varlığı Ülkemiz için, özelde de bölgemiz için önem kazanmış ve söz konusu örnekler kontrollü koşullarda koruma altına alınmıştır. Doğu Akdeniz Bölgesi nde etmenin varlığının saptanması konuya ilgiyi arttırmış olup belirlenmiş virüsün veya izolatlarının karakterizasyonu bu çalışmanın esas amacını oluşturmuştur. Ön çalışmaları takiben izolatların ırk ayrımları moleküler ve serolojik olarak gerçekleştirilmiş ve saptanan izolatlar yurt içi ve yurt dışında önceden saptanmış izolatlarla karşılaştırılarak özellikleri ortaya konmuştur. Sert çekirdeklilerde ekonomik kayıplara neden olan PPV nin Doğu Akdeniz Bölgesindeki yaygın etkileri ve b * u bölgede izolatların yeni saptanmış olması, virüs izolatlarının biyolojik ve serolojik özellikleri hakkında yeterli çalışmaların bulunmayışı, mevcut olanların da yüzeysel olması nedeniyle bölgede daha detaylı çalışmaların yapılması gereği ortaya çıkmıştır. Ayrıca ülkemiz ve bölgemizde özellikle erkenci ılıman iklim meyvelerinin yetiştiriciliğine ürünlerin yüksek fiat ile pazarlanması nedeniyle ağırlık verilmektedir. Bu sebeple dış ve iç piyasada talep gören çeşitlerin üretimine ağırlık verilmiş olup üretim materyallerinin ülke içerisinde bir bölgeden diğer bölgeye geçişi ve dış ülkelerden ithalat yoluyla ülkeye girişi yapılmaktadır. Bu da

3 özellikle kültürel yöntemler haricinde herhangi bir kimyasal mücadelesi olmayan virüs ve virüs benzeri hastalık etmenlerinin kolayca ve kontrolsüz şekilde taşınmasına neden olmaktadır. Etmenin bölgede saptanıp özelliklerinin ortaya konulması; etmenin bölgeden temizlenmesi ve ileride gerçekleştirilecek virüsten ari ismine doğru fidancılık çalışmalarına kaynak sağlanması açısından önemlidir. Bu çalışma 2006 ve 2009 yılları arasında Adana, Kahramanmaraş, Mersin, Hatay, Osmaniye ve Niğde illerinde yürütülmüştür. Çalışmada Doğu Akdeniz Bölgesi nde sert çekirdekli meyve alanlarında verim azalmasına ve fidanlıklarda kayıba neden olan etmenlerden biri olarak göze çarpan Sharka hastalığının yukarıda adı geçen illerde bulunan sert çekirdekli meyve alanlarındaki varlığının ve yayılımının ortaya konması, hastalık etmeninin bahçe ve doğal koşullarda meydana getirdiği belirtilerin saptanması ve saptanan PPV izolatlarının moleküler farklıklarının belirlenmesi için amacıyla yürütülmüştür. Materyal ve Metot Materyal Araştırma materyalini oluşturan sert çekirdekli meyve örnekleri Doğu Akdeniz Bölgesi nin Kahramanmaraş, Osmaniye, Antakya, İçel, Adana ve bölge ile önemli derecede üretim materyali alışverişinde bulunan Niğde iline bağlı Ulukışla ilçesindeki sert çekirdekli meyve bahçelerinden yılları arasında alınmıştır. Çalışmada ayrıca PPV, badem ve ceviz türlerinde de hastalığa neden olduğu için ceviz ve bademde survey kapsamında tutulmuştur. Biyolojik tanılama çalışmaları amacıyla Nicotiana bentamiana, N. occidentalis, N. clevelandii, Chenopodium foetidium, Pisum sativum otsu test bitkileri mekanik inokulasyon ve Prunus persica GF 305, P. armeniaca, P. domestica, P. persica GF677, P. myrabolan 29 C, P. avium SL 65 odunsu bitkileri kullanılmıştır Mekanik inokulasyon çalışmasında [KH 2 PO 4. MW g/mol (MERCK 6345), Na 2 HPO4. 2H 2 O MW g/mol (MERCK 6576) ve %0.1 Mercaptoethanol) ] kimyasalları kullanılmıştır. Serolojik çalışmalarda survey çalışmalarında virüs benzeri hastalık belirtileri gösteren şüpheli örnekler ile herhangi bir belirti gözlenmeyen değişik bahçelerde tesadüfi olarak seçilmiş örneklerden getirilen bitkilere ait yaprak, sürgün ucu, tek yıllık sürgünlere ait kabuk dokuları, meyve, çiçek, tohum örnekleri kullanılmıştır. ELISA testi için kullanılan PPV antiserumları, LOEWE (Germany) ve BIOREBA AG (Germany) firmalarından temin edilmiştir. ELISA testi çalışmaları, PPV infekteli materyalin karışık infeksiyon durumlarının ortaya konulması amacıyla Erik Cücelik Virüsü (Prune Dwarf Ilarvirus, PDV), Erik Nekrotik Halkalı Leke Virüsü (Prunus Necrotic Ringspot Ilarvirus, PNRSV), Elma Mozaik Virüsü (Apple Mosaic Ilarvirus, ApMV) ve Elma Klorotik Yaprak Leke Virüs (Apple Chlorotic Leafspot Trichovirus, ACLSV) lerine karşıda yürütülmüştür. PPV dışında sözü edilen virüslere ait antiserumlarda Agdia (USA) ve BİOREBA (Germany) firmalarından temin edilmiştir. PPV nin M ve D ırklarının ayrımı için gerekli olan monoklonal antiserumlar ise Dr. Arben MYRTA dan (IAMB-Italy) temin edilmiştir. PPV nin moleküler olarak inceleme çalışmaları amacıyla Total Nükleik Asit (NA) ekstraksiyon çalışmalarında PPV ile infekteli sert çekirdekli bitkilerinin genç yapraklarından elde edilen bitki özsuyu kullanılmıştır. RT-PCR çalışmaları sırasında hedef nükleik asitlerin çoğaltılması amacıyla gerekli Termostabil DNA polimeraz enzimi (Taq polimeraz), GoTaq Flexi DNA Polymerase, dntp 4 tür (datp, dgtp, dctp, dttp), MgCI 2, MgCI 2 buffer Promega Corporation Madison, WI USA dan; PPV ne spesifik Primerler (Tek iplikli Oligonükleotidler), PPV nin genel tanısı için

4 kullanılan Wetzel ve ark. (1991) nın bildirmiş olduğu P1 primeri aynı zamanda PPV-D ve PPV-M ırklarının moleküler tanısı için kullanılmaktadır. Bu primer PPV-D ve PPV-M ırklarının tanısında Olmos ve ark.., (1997) nin bildirmiş olduğu PD ve PM primerleriyle kombinasyon içerisinde reverse primer olarak kullanılmaktadır. Reverse Transcriptase (M-MLV Reverse Transcriptase, RTe) enzimi ve Reverse Transcriptase buffer, 100bp DNA Ladder Marker, RNAse İnhibitör enzimi ve Restricted Fragment Lenght Polymorphizm (RFLP) aşamasında kullanan kesim enzimleri (AluI, RsaI), Buffer Tango, Fermentas firmasından temin edilmiştir. Nükleik asit çoğaltımı ve enzimle kesim işlemleri TECHNE marka GENIUS Termocyler aleti kullanılarak 200 ul steril ependorf tüplerinde yapılmıştır. Metot Survey çalışmalarına 2006 yılının Nisan ayı başlarında başlanmış ve 2009 yılı Temmuz ayına kadar vejetasyon dönemlerinde, yaz başlarında ve sonbaharda gidilerek bahçeler gezilmiş örnekler seçilerek surveyler tamamlanmıştır. Bu bitkilere PPV ile bulaşık bitkilerin genç yapraklarından mekanik inokulasyon çalışması (ISHS, 1983; Desvignes, 1999; Reyes ve ark. 2002) ye göre yapılmıştır. Survey çalışmalarından örnek olarak alınan bitkilerde virüs varlığı DAS-ELISA ile araştırılmıştır. Alınan genç yapraklarda virüs taraması Double Antibody Sandwich (DAS-ELISA) yöntemine göre yapılmıştır (Clark ve Adams, 1977; Baloğlu ve ark. 1988). DAS-ELISA sonucu pozitif olarak belirlenen örneklerde serotiplerin belirlenmesi ve atipik serolojik davranış gösteren izolat varlığını kontrol etmek amacıyla DASI-ELISA testleride (Indirect Double Antibody Sandwich-Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) gerçekleştirilmiştir. İndirek DAS- ELISA yöntemi Cambra ve ark., (1994); Levy, (2001) in belirttiği protokollere göre yürütülmüştür. Total N.A. izolasyonu; Astruc ve ark.,(1996) nın önerdiği yöntem ve Spiegel ve ark., (1996) nın önerdikleri yöntemlerin kısmi değişiklik yada modifikasyonlarla birleştirilmesi sonucu yapılmıştır. RT-PCR; ELISA, mekanik inokulasyon ve biyolojik indeksleme çalışmaları sonucu PPV ile bulaşık bitkilerin PPV tarafından infekte edildiğinin doğrulanması ve ileride sert çekirdekli bitkilerde zararlı virüs hastalıklarının tanılanmasında bu tekniğin rutin halde nasıl kullanılabileceğini, ortaya koymak, amacıyla Wetzel ve ark. (1991a) ve ve Olmos ve ark.., (1997) e göre uygulanmıştır. Tanı ve karakterizasyon çalışmalarında kullanılan PPV izolatlarının nükleik asit boyu, nükleotid dizisi ve değişik restriksiyon enzimlerine ait kesim bölgelerini taşıyıp taşımadıklarını belirlemeye yönelik olarak gerçekleştirilen RT-PCR sonucu elde edilen PCR ürünü RsaI ve AluI restrüksiyon enzimleri yardımıyla kesilmeye çalışılmıştır. Araştırma Bulguları ve Tartışma Genel örneklemede toplam 282 adet alana ait 895 bitki testlenmiştir. Testlenen alanların 276 tanesi ticari ve ev bahçelerinden oluşmuştur. Geriye kalan alanlar ise, 1 tanesi Ç.Ü. Pozantı Tarımsal Araştırma ve Uygulama Merkezi nde (POZMER) bulunan adaptasyon ve fidanlık parselinden, 1 tanesi Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü nden, 1 tanesi Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi (KSÜ) Sert Kabuklu Meyveler Araştırma Merkezi (SEKAMER) ve 3 tane özel fidanlıktan oluşmuştur. Adana ilinde 9 bahçe Mersin ilinde ise 4 bahçe PPV ile bulaşık bulunmuştur. Bu örneklerle diğer Sert Çekirdekli Meyve (SÇM) virüslerine karşı gerçekleştirilen DAS-ELISA çalışmalarında herhangi bir bulaşıklık veya karışık infeksiyon durumu belirlenmemiştir

5 Adana ve Mersin illeri dışında bölgeye yakın Osmaniye, Hatay, Kahramanmaraş ve Niğde illerinden toplanan örneklerde bu çalışmanın yapıldığı zaman aralığında herhangi bir PPV infeksiyonuna rastlanmamıştır. Bu durum bölge ile ilgi gerçekleştirilen benzeri çalışmalarla (Baloğlu ve ark., 1995; Gazel ve Çağlayan, 1998; Koç ve Baloğlu, 2006; Koç ve Baloğlu, 2007; Koç ve Baloğlu, 2009) uyum içerisinde görünürken Tolay Arıkan ve ark., (2004), Buzkan ve ark. (2005a) ve Buzkan ve ark. (2005b) ile (badem türü ile ilgili bulgular hariç) paralellik taşımamaktadır. Bademlerde saptanan PPV infeksiyonu ise Llácer ve Cambra., (2006) nın bildirdiği bulgularla benzerlik taşımaktadır. Baloğlu ve ark., (1995), tarafından bölgede yetiştiriciliği yapılan erik ve şeftali ağaçlarının Sharka hastalığı yönünden temiz bulunmalarından beri geçen yaklaşık 15 yıllık bir sürede bölgenin hastalık görüntüsü olumsuz şekilde değişime uğramıştır. Bu değişimin en temel nedeni bölgede ekonomik getirisi; üretim fazlası ve ihracat sınırlaması nedeniyle az görülen turunçgil, pamuk ve diğer endüstri bitkilerinin yetiştiriciliğine alternatif olarak sert çekirdekli meyvelerin tercih edilmesidir. Bunun sonucu bölgeye son 15 yılda yoğun ve kontrolsüz şekilde üretim materyali girişi söz konusu olmuştur. Kontrolsüz üretim materyali girişi ve yoğun şekilde sert çekirdekli meyve bahçe tesisi sonucu PPV nin bölgede 15 yıl öncekinden farklı olarak bulunabileceği fikri oluşturmuştur. Çalışma bu sebeple planlanmıştır. Doğu Akdeniz Bölgesi illerinde çoğunlukla herhangi bir sağlık sertifikasına sahip olmayan bu üretim materyalleri sayesinde bölgeye sınırlı düzeydede olsa Sharka hastalığı giriş yapmıştır. Elde edilen sonuçlara göre alınan toplam 895 örneğin alındığı 282 alandan 13 tanesi PPV ile infekteli bulunmuş olup, ortalama infekteli sert çekirdekli meyve bahçesi oranı bölge genelinde % 5,31 dir. Analizler sonucunda PPV ile infekteli sert çekirdekli meyve bahçesi oranının Adana ilinde (%12,5) Mersin iline (%5,55) göre nerdeyse iki katı oranda olduğu saptanmıştır. Sert çekirdekli meyve bahçesi bakımından Adana ve Mersin dışında örnekleme yapılan diğer illerden toplanan örneklerde herhangi bir PPV infeksiyonu saptanmamıştır. Bölgede saptanan izolat veya infekteli bahçelerin en yaşlısının maksimum 5 yaşında olduğu belirlenmiştir. Alınan örnekler içerisinde 5 yaşından büyük hiçbir bahçe de infeksiyon saptanmamıştır. Üreticilerden materyal kaynağı hakkında alınan bilgilere göre münferit bir örnek dışında hemen hemen tüm örneklerin farklı amaçlarla da olsa yerli veya ithal kaynaklarla Marmara bölgesinden Çukurova bölgesine girdiği anlaşılmıştır. ELISA testi sonucunda surveyler sırasında Adana ilinde örneklenen bahçelerde; nektarin % 40; badem %12,5; erik % 8,33; kayısı % 6,2 ve şeftali % 5,2 oranlarında PPV infeksiyonu belirlenmiştir. Mersin ilinde ise örnekleme yapılan bahçelerdeki bulaşıklık durumu; kayısı %13,04; nektarin %8,33 ve erik %4,76 şeklinde görülmüştür. Çukurova bölgesi sonuçları, Koç ve Baloğlu, (2009) ile paralellik taşımaktadır. Çukurova Bölgesinde yaptıkları survey çalışmasında gezilen 28 şeftali bahçesinden 1 i (%3,57), 24 Nektarin bahçesinden 3 ü (%12,5) ve 67 kayısı bahçesinde 3 ünün (%4,4) Sharka hastalığı ile infekteli bulduğunu bildirmiştir. Elde edilen veriler, incelendiğinde Doğu Akdeniz Bölgesi nde daha önceki sınırlı bulaşıklık oranlarının aksine bölge sert çekirdekli meyve üretimi için önemli bir PPV çıkışının ilk raporu şeklinde belirtilmiştir. Doğu Akdeniz Bölgesinde gerçekleşen surveylerde şüphelenilerek getirilen vişne, kiraz ve ceviz türlerinde herhangi bir enfeksiyon belirlenmemiştir. DAS-ELISA testi çalışmaları sonucu pozitif olarak belirlenen örneklerde serotiplerin belirlenmesi ve atipik serolojik davranış gösteren izolat varlığını kontrol etmek amacıyla DASI-ELISA gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmaya materyal olarak kullanılan tüm izolatların, epidemik açıdan en tehlikeli serotip olarak bilinen PPV-M

6 bünyesinde gruplandığı belirlenmiştir. Çalışma sonucunda aynı anda birden fazla ırk ile karışık infeksiyon halinde veya aynı anda hem PPV-M hemde PPV-D davranışı gözlenen izolata rastlanmamıştır. Bu sonuç ülkemizde yapılan diğer çalışmalarla kıyaslandığında Sertkaya ve ark. (2003); Koç ve Baloğlu, (2006); Koç ve Baloğlu, (2007) ün de benzer şekilde ülkemizde ve bölgemiz özelinde PPV nin yalnızca M ırkının mevcudiyetini rapor etmişlerdir. Çalışma sonuçlarının adı geçen kaynaklarda bildirilen sonuçlarla uyum içerisinde olduğu sonucuna varılmıştır. Gerçekleştirilen mekanik inokulasyon çalışmalarında, C.foetidium da sistemik klorotik beneklenme ve nekrotik merkezli lokal lezyon simptomları ortaya çıkmıştır. N.benthamiana da türünde sistemik klorotik beneklenme ve genel bodurluk belirtileri oluşmuştur. N.occidentalis de klorotik halkalı leke nekrozu ve genel bodurluk belirtileri kaydedilmiştir. N.clevelandii de ise makroskobik belirti kaydedilmemiş olup infeksiyon DAS-ELISA ile doğrulanmıştır. Kullanılan beş farklı otsu indikatörü içinden Pisum sativum da herhangi bir bulaşıklık ne makroskobik olarak nede DAS-ELISA ile saptanmamıştır. Paralel şekilde OEPP/EPPO, (1983) ve Nemeth, (1986) PPV nin Chenopodium foetidium, Nicotiana occidentalis, ve Nicotiana clevelandii türlerinde klorotik beneklenme ve lezyonlar oluşturduğunu bildirmişlerdir. Bu verilerin çalışmada yürütülen DAS-ELISA testlerine ait pozitif sonuçları desteklediği belirlenmiştir. Mekanik inokulasyon çalışması sonuçları doğrultusunda; kullanılan indikatör bitkilerin genel PPV belirtileri göstermesine rağmen etmenin karakterizasyonuna olanak verecek düzeyde ayrıntılı veri sağlamamıştır. Bu yöntem etmenin tanılanması ve muhafazası için uygun görülürken etmenin ırk düzeyinde ayrımı için elverişsiz olarak kaydedilmiştir (OEPP/EPPO, 1983; Nemeth, 1986; Salamon and Palkovics, 2002). Mersin Yenice erik 1 izolatının Purunus persica GF 305 bitkisinde klorotik damar açılması, şekil bozukluğu belirtilerini oluşturmuştur. Anonymous, (2001) de PPV nün P.persica GF 305 de klorotik damar açılması, yaprak şekil bozukluğu oluşturduğu bildirilmiştir. Benzer şekilde Nemeth, (1986) ve Salamon and Palkovics, (2002) tarafından da PPV nin P.persica GF-305 yapraklarında damar açılması, şekil bozukluğu oluşturduğu bildirilmiştir. OEPP/EPPO, (1983), Anonymous, (2001) ve Anonymous, (2002) PPV nin otsu ve odunsu konukçularında oluşturduğu belirtiler içerisinde P.persica GF-305 test bitkisinde oluşturduğu damar açılması ve şekil bozukluk belirtileri de sıralamışlardır. P. avium SL65 muhafaza bitkisinde ise inokulasyon başarıya ulaşmazken P. myrabolan 29C yapraklarında belirgin olmayan damar aralarında açılma belirtileri oluşmuştur. Biyolojik çalışmalardaki tüm belirtiler ve infeksiyonlar DAS-ELISA ile doğrulanmıştır. Test sonucunda negatif kontrolün en az iki katı absorbans değerleri P.avium SL 65 dışında tüm muhafaza ve deneysel konukçulardan elde edilmiştir. P.armeniaca muhafaza bitkisinde klorotik benek, klorotik damar açılması ve nekroz belirtileri oluşmuştur. Kayısı çöğürlerinin muhafaza konukçusu olarak kullanıldığında klorotik beneklenme, damar açılması ve nekroz belirtilerinin oluşabileceği Sutic., (1961) ve Anonymous, (2010) tarafından da belirtilmiştir. P.domestica muhafaza bitkisinde klorotik meşe yaprağı deseni klorotik damar açılması, klorotik damar netleşmesi (ağ şeklinde görüntü oluşumu), klorotik beneklenme ve erken yaprak sararması ve klorotik damar netleşmesi (ağ şeklinde görüntü oluşumu) belirtileri PPV Me-Ye-Er1 izolatı tarafından oluşturulmuştur. Erik çöğürleri muhafaza konukçusu olarak kullanıldığında klorotik meşe yaprağı deseni, klorotik damar açılması, oluşturduğu klorotik damar netleşmesi (ağ şeklinde görüntü oluşumu), klorotik beneklenme ve erken yaprak sararması belirtilerine benzer belirtilerin oluşabileceği Anonymous, (2010) tarafından da

7 belirtilmiştir. PPV Me-Ye-Er1 izolatı için P.persica GF 677 çeşidi şeftalixbadem melezi muhafaza konukçusu olarak kullanıldığında yapraklarda şekil bozukluğu, damar bantlaşması ve klorotik izler oluşmuştur. Bu belirtiler Anonymous, (2010) tarafından bildirilen şeftali yapraklarında şekil bozulması, damar bantlaşması ve klorotik iz belirtileri ile benzer şekilde gözlenmiştir PPV genomunun nt lik bölgesinde 243 bp lik kılıf protein genini içeren alanı çoğaltmak ve bu sayede DAS-ELISA sonuçlarını doğrulamak amacıyla, spesifik primerler (P1-P2) sentezlettirilmiştir. P1-P2 primer çiftinin kullanılması sonucu PPV kılıf protein genine ait 243 bp lik alanın RT-PCR ile çoğaltılması başarıyla gerçekleştirilmiştir. Bu sayede Çukurova Bölge izolatlarınına ait toplam nükleik asit örneklerinde PPV nin varlığı genel anlamda doğrulanmıştır. Çoğaltılması beklenen gen bölgeleri kullanılan bütün izolatlar için elde edilmiş olup, izolatlar arasında P1-P2 primer çifti ile RT-PCR sırasında uyumsuzluk gösterecek herhangi bir durumla karşılaşılmamıştır. Bu sonuç ışığında Çukurova Bölgesi PPV izolatlarının tamamının P1-P2 primer çiftiyle uygun şekilde saptanabilen izolatlar olduğu belirlenmiştir. RT-PCR sonucu elde edilen ürünler, RFLP metoduna uygun olarak enzimlerle muamele edildiğinde (Anonymous, 2009) RFLP amacıyla kullanılan RsaI enzimine karşı herhangi spesifik bir reaksiyon belirlenmemiştir. Bu sonuç ışığında PPV Çukurova Bölge izolatlarının PPV-M ırkı olabileceği varsayımı güçlenmiştir. Bu varsayımı doğrulamak amacıyla PPV-M ırkını kesebilen AluI enzimiyle aynı RT-PCR ürünleri muamele edilmiştir. AluI enzimiyle muamele sonucunda meydana gelen kesim profilinin Çukurova bölge izolatlarının PPV-M ırkı olduğunu doğrulamıştır. Bölgedeki izolatların PPV-M olduğu hem ırk spesifik primerlerle hemde RFLP yöntemi ile karşılıklı olarak doğrulanmıştır. Irk spesifik primerlerle elde edilen sonuçlar Olmos ve ark., (1997); Szemes ve ark., (2001) ile aynı yönde Sertkaya ve ark. (2003) ile benzer şekilde sonuçlanmıştır. Aynı araştırıcılar kullanmış oldukları P1, P2, PD, PM, PEA1, PEA2, PCH1 ve PCH2 primerleriyle PPV ırklarını RT-PCR ile saptamışlardır.. Kaynaklar ANONİM, Ilıman İklim Meyveciliğinde Gelişmeler II. Ders notu ANONYM, National Research Support Project 5, Supporting Research And Development Of Virus Free Pome & Stone Fruit Trees ANONYM,2009f. Protocol for Digestion of PCR Products; ANONYM, 2010d. ASTRUC, N., MARCOS, J.F., MACQUAİRE, G., CANDRESSE, T. AND PALLÁS, V., Studies on the diagnosis of hop stunt viroid in fruit trees: identification of new hosts and application of a nucleic acid extraction procedure based on non-organic solvents. Eur. J. Plant Pathol. 102: BALOĞLU, S., 1988 Doğu Akdeniz Bölgesi Trunçgillerinde Zararlı Tristeza Virüs Hastalığının Tanılanması, Arıtılması, Özellikleri Ve Serolojik Yöntemlerle

8 (ELISA ve SDS- Immunodiffision Testleri) Saptanması. Ç.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı, Doktora Tezi, 188 s. Adana. BALOĞLU, S., ÖZASLAN, M., POSLUOĞLU, N. AND YILMAZ, M. A., Adana Ve Tarsus Bölgesinde Yetiştiriciliği Yapılan Erik Ve Şeftali Ağaçlarında Erik Şarka Virüsünün ELISA Testiyle Aranması. VII. Türkiye Fitopatoloji Kongresi Bildirileri. S BUZKAN, N., OZTEKİN, V., DEMİR, M., YALCİN-MENDİ, Y. AND ILGİN, M. 2005a. Detection and control of virus diseases of apricot trees in the coolection plot of SEKAMER. KSU. J. Sci.Eng BUZKAN, N., OZTEKİN, V., DEMİR, M., YALCİN-MENDİ, Y. AND ILGİN, M.,2005b. Sanitarystatus of fruit trees with implementation of clean stocks. Asian Journal of Plant Sciences 4 (6): CAMBRA, M., ASENSİO, M., GORRİS, M. T., PEREZ, E., CAMARASA, E., GARCA, J. A., MOYA, J. J., LPEZ- ABELLA, D., VELA, C. AND SANZ, A., Detection Of Plum Pox Potyvirus Using Monoclonal Antibodies To Structural And Non-Structural Proteins. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 24, CLARK M. F. AND ADAMS, A. N., Characteristics Of The Micro-Plate Method Of Enzime Linked Immuno Sorbent Assay For The Detection Of Plant Viruses. Journal Of General Virology. 34, DESVİGNES, J. C., Virus Diseases Of Fruit Trees, CTIFL, Paris, France. GAZEL, M. H. VE ÇAĞLAYAN, K., Hatay Bölhesi Prunus Türlerindeki Virüs Hastalıklarının ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Ve Biyolojik Yöntemlerle Tanılanması. VIII. Türkiye Fitopatoloji Kongresi Bildirileri. S ISHS, Detection Of Virus And Virus-like Diseases Of Fruit Trees Acta Horticulturae, No. 130, KOÇ, G. And BALOĞLU, S., First Report Of Sharka In The Çukurova Region Of Turkey Journal Of Plant Pathology (2006), 88(S65-S67) KOÇ, G. And BALOĞLU, S., Çukurova da Sharka (PPV; Plum Pox Potyvirus) Türkiye II. Bitki Koruma Kongresi Bildirileri. KOÇ, G. ve BALOĞLU, S., 2009 Çukurova Bölgesi Nektarin, Şeftali Ve Kayısılarında Plum Pox Potyvirüs ünün Ani Çıkışı Türkiye III. Bitki Koruma Kongresi bildirileri. LLÁCER G. AND CAMBRA M Hosts and symptoms of Plum pox virus: fruiting Prunus species, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 36, LEVY, L., ELISA Laboratory Protocols For The Plum Pox Virus National Surveillance Program. http// NEMETH, M., Virus, Mycoplasma and Rickettsia Diseases of Fruit trees, Akademia Kiado, Budapest, 841. OEPP/EPPO, Data Sheets On Quarantine Organisms No. 96, Plum Pox Virus. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 13 (1). OLMOS, A., CAMBRA, M., DASI, M. A., CANDRESSE, T., ESTABAN, O., GORRIS, M. T. AND ASENSIO, M., Simultaneous Detection And

9 Typing Of Plum Pox Potyvirus (PPV) Isolates By Hemi-Nested PCR- ELISA. Journal Of Virological Methods 68, REYES, F., FİORE, N., REYES, M. A., SEPULVEDA, P., PAREDES, V. AND PRİETO, H., Biological Behavior And Partial Molecular Characterization Of Six Chilean Isolates Of Plum Pox Virus, Plant Disease, Vol.87, No.1, P SALAMON P. AND PALKOVİCS, L., Characterization of Plum Pox Virus PPV-BT-H Isolated from Naturally Infected Blackthorn (Prunus spinosa L.) in Hungary, European Journal of Plant Pathology, 108; SERTKAYA, G., ULUBAŞ, Ç. AND ÇAĞLAYAN, K., Detection And Characterization Of Plum Pox Potyvirus (PPV) By DAS-ELISA And RT- PCR/RFLP Analysis In Turkey, Turkish Journal Of Agriculture And Forestry TÜBİTAK. Vol. 27, S , SPİEGEL, S., SCOTT, S. W., BOWMAN-VANCE, V., TAM, Y., GALİAKPAROV, N. N. AND ROSNER, A., Improved Detection Of Prunus Necrotic Ringspot Virus By Polymerase Chain Reaction. Europhean Journal Of Plant Pathology, (102) SUTIC, D., Assay of transmission of sharka virus disease by sap inoculation to herbaceous plant. T. Planteavl.65, SZEMES, M., KALMA, M., BOSCIA, D., NEMETH, M., KÖLBER, M. DORGAI, L., Integrated RT-PCR Nested PCR Diagnosis For Differantiating Between Subgroups Of Plum Pox Virus. Journal Of Virological Methods 92. TOLAY ARİKAN E, CAGLAYAN K And GAZEL M., H., (2004) Identification of Plum pox virus and some ilarviruses of stone fruits in Kahramanmaras district of Turkey. Acta Horticulturae, no. 657, WETZEL, T., CANDRESSE, T., RAVELONANDRO, M., AND DUNEZ, J., A Polymerase Chain Reaction Adapted to Plum Pox Potyvirus Detection. Journal Of Virological Methods, 33: