ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ KIRKAĞAÇ KAVUNUNDA HIYAR MOZAİK VİRÜSÜNE KARŞI BAZI BİTKİ AKTİVATÖRLERİNİN ETKİLERİNİN BELİRLENMESİ Ahmet GENÇ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI ANKARA 2012 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi KIRKAĞAÇ KAVUNUNDA HIYAR MOZAİK VİRÜSÜ NE KARŞI BAZI BİTKİ AKTİVATÖRLERİNİN ETKİLERİNİN BELİRLENMESİ Ahmet GENÇ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. İ. Özer ELİBÜYÜK Bu çalışmada Kırkağaç kavununda Hıyar Mozaik Virüsü ne (Cucumber mosaic virus, CMV) karşı acibenzolar-s-methyl (Actigard ) ve ISR-2000 bitki aktivatörlerinin etkileri belirlenmeye çalışılmıştır. Ankara da 2011 yılında yapılan surveyler sonucunda CMV, DAS-ELISA yöntemi ile hastalık belirtilerini gösteren kavunlar üzerinde tespit edilmiştir. Çalışmada Ankara nın Kazan ilçesinden izole edilen CMV izolatı (CMV K15) kullanılmıştır. Çalışmada acibenzolar-s-methyl (Actigard ) ve ISR-2000 bitki aktivatörlerinin değişik dozlarda, kontrollü sera koşullarında CMV nin kavun bitkilerinde sebep olduğu hastalığa karşı etkinlikleri tespit edilmiştir. Kavun bitkileri Actigard ve ISR-2000 uygulandıktan 72 ve 96 saat sonra CMV ile enfekte edilmiştir. Bu bitkiler kontrol bitkilerine göre simptom çıkış süresi, bitki boyu ve yaprak genişliği bakımından bitki çiçeklenme aşamasına gelinceye kadar takip edilmiş ve elde edilen veriler istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Actigard 6 mg/80 ml, 8 mg/80 ml, 10 mg/80 ml, dozlarında uygulanmış ve virüs simptomlarını kontrole göre 4-26 gün aralığında geciktirmiştir. ISR 2000 ise 36 µl/80 ml, 72 µl/80 ml, 144 µl/80 ml, dozlarında uygulanmış ve virüs simptomlarını yine kontrole göre 0-15 gün aralığında geciktirmiştir. Aktivatör uygulanan bitkilerde teşvik edilmiş dayanıklılıktan dolayı meydana gelen lignin sentezi ile H 2 O 2 (hidrojenperoksit) birikimi yapılan histokimyasal boyamalar ile değerlendirilmiştir. ISR-2000 kavunlarda lignin oluşumu ve H birikimini Actigard a göre daha çok teşvik etmiştir. Mart 2012, 44 sayfa Anahtar Kelimeler: CMV, acibenzolar-s-methyl, ISR-2000, kavun, histokimyasal boyama i

3 ABSTRACT Master Thesis DETERMINATION OF EFFECTS OF SOME PLANT ACTIVATORS TO CUCUMBER MOSAIC CUCUMOVIRUS IN MELON cv. KIRKAĞAÇ Ahmet GENÇ Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Plant Pathology Supervisor: Prof. Dr. İ. Özer ELİBÜYÜK In this study, the effects of acibenzolar-s-methyl Actigard and ISR-2000 plant activators against Cucumber mosaic virus (CMV) in melon cv. Kırkağaç were determined. In the results of surveys conducted in Ankara in 2011, CMV was detected in symptomatic melons by DAS-ELISA tests. In the study, the CMV isolate (CMV K15) was isolated from the melons in Kazan district of Ankara. The plant activators acibenzolar-s-methyl (Actigard ) and ISR-2000 were used in this study. Effects of the activators were determined under controlled greenhouse conditions in respect to their different concentrations. Melon seedlings were treated by acibenzolar- S-methyl and ISR-2000 and then the treated melons were inoculated by CMV 72 and 96 h after activator treatments. Both of CMV infected and control plants, in respect to symptom expression time, plants lengths and leaf width up to the plants flowering period were monitored. The data analyzed by using statistical methods. Actigard was sprayed on melons at doses of 6 mg/80 ml, 8 mg/80 ml, 10 mg/80 ml. Doses were delayed CMV symptoms for 4-26 days by comparing to positive controls. And ISR-2000 was sprayed on melons at doses of 36 µl/80 ml, 72 µl/80 ml, 144 µl/80 ml. Doses were delayed CMV symptoms for 0-15 days by comparing to positive controls. Histochemical staining was applied to determine lignification and H 2 O 2 accumulation in the plants due to systemic inducing resistance triggered by the activators. ISR-2000 induced high degree of lignification and H 2 O 2 production than Actigard. March 2012, 44 pages Key Words: CMV, acibenzolar-s-methyl, ISR-2000, melon, histochemical staining ii

4 TEŞEKKÜR Çalışmalarımın yürütülmesinde bilgi ve deneyimi ile çalışmalarımı yönlendiren ve desteğini benden esirgemeyen danışman hocam Sayın Prof. Dr. İ. Özer ELİBÜYÜK (Ankara Üniversitesi Bitki Koruma Anabilim Dalı ) e sonsuz teşekkür ederim. Tez çalışmalarımı yapmış olduğum sera bölmesinin teminini sağlayan Sayın Prof. Dr. M. Oktay GÜRKAN (Ankara Üniversitesi Bitki Koruma Anabilim Dalı ) a teşekkür ederim. Çalışmamın tüm aşamalarında çok büyük bir özveri ile yardımcı olan ve hiçbir desteği benden eksik etmeyen dostum Zir. Yük. Müh. Ahmad Hekmat KASHTBAN a minnettarlıkla teşekkür ederim. Hep olduğu gibi, bu çalışmam sırasında da manevi destek ve yardımlarıyla yanımda olan canım Zir. Yük. Müh. Ayla EMİR e en içten dileklerimle teşekkür ederim. Son olarak bugünleri görmemi sağlayan ve her daim karşılıksız sevgi ve destekleriyle beni ben yapan AİLEME ne kadar teşekkür etsem azdır. Ahmet GENÇ Ankara, Mart 2012 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii SİMGELER DİZİNİ ve KISALTMALAR... v ŞEKİLLER DİZİNİ...vi ÇİZELGELER DİZİNİ... vii 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Yurt Dışında Yapılan Çalışmalar Türkiye de Yapılan Çalışmalar MATERYAL VE METOD Materyal Çalışma materyali hakkında bilgiler Serolojik çalışmalarda kullanılan materyal Mekanik inokulasyon çalışmalarında kullanılan materyal Dayanıklılığın uyarılması çalışmalarında kullanılan materyal Histokimyasal boyama çalışmalarında kullanılan materyal Metod Bitki örneklerinin toplanması ve muhafazası Mekanik inokulasyon çalışmaları Serolojik çalışmalar DAS-ELISA testi Saksı denemeleri Histokimyasal boyamalarla lignin sentezinin belirlenmesi Histokimyasal boyamalarla H 2 O 2 sentezinin belirlenmesi ARAŞTIRMA BULGULARI CMV ile Bulaşık Bitkilerin Belirlenmesi Dayanıklılığın Uyarılması Çalışmaları Bitki aktivatörlerinin enfeksiyon oranına etkileri İstatistiksel analizler (Actigard ) Actigard ın simptom çıkış süresi üzerinde etkisi Actigard ın bitki boyu üzerinde etkisi Actigard ın yaprak genişliği üzerinde etkisi İstatistiksel analizler (ISR-2000 ) ISR-2000 in simptom çıkış süresi üzerinde etkisi ISR-2000 in bitki boyu üzerinde etkisi ISR-2000 in yaprak genişliği üzerinde etkisi HİSTOKİMYASAL BOYAMALARLA LİGNİN SENTEZİNİN BELİRLENMESİ HİSTOKİMYASAL BOYAMALARLA H 2 O 2 SENTEZİNİN BELİRLENMESİ TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ iv

6 SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ K 0 Kontrol Doz 0 A 1 Actigard Doz 1 A 2 Actigard Doz 2 A 3 Actigard Doz 3 I 1 ISR-2000 Doz 1 I 2 ISR-2000 Doz 2 I 3 ISR-2000 Doz 3 BNYVV Beet necrotic yellow vein virus BSBV Beet soil borne virus BTH Benzothiadiazol CABYV Cucurbit aphid-borne yellows virus CMV Cucumber mosaic virus DAB 3,3 -diaminobenzidine ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay g Gram H 2 O 2 Hidrojen peroksit ISR Uyarılmış Sistemik Dayanıklılık (Induced Systemic Resistance) L Litre M Molar Mg Miligram Ml Mililitre nm Nanometre PBS Tuzlu fosfat tamponu PRSV Papaya ring spot virus RNA Ribonükleikasit RdRp RNA dependent RNA polymerase (RNA ya bağlı RNA polimeraz) SKD Sistemik Kazandırılmış Dayanıklılık SqMV Squash mosaic virus TMV Tobacco mosaic virus TSWV Tomato spotted wilt virus TYLCV Tomato yellow leaf curl virus w/v Ağırlık/Hacim WMV Watermelon mosaic virus ZYMV Zucchini yellow mosaic virus Μl Mikrolitre v

7 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 3.1 Şiddetli mozaik ve damarlar arası kabarcıklaşma ve şekil bozukluğu gösteren kavun yaprakları...8 Şekil 3.2 Şiddetli mozaik ve damarlar arası kabarcıklaşma gösteren bir kavun yaprağı...9 Şekil 3.3 Çalışmada izlenen yollar..13 Şekil 3.4 Seradaki deneme düzeni...17 Şekil 5.1 A-) ISR-2000 uygulanmış bitki örneklerinde lignifikasyon...30 Şekil 5.2 A-) ISR-2000 uygulanmış bitki örneklerinde lignifikasyon...31 Şekil 6.1 Bitki aktivatörü uygulanan bitkilerde H 2 O 2 33 vi

8 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1 ABD de Actigard ın ruhsatlı olduğu hastalık ve hastalık etmenleri Çizelge 3.2 Aktivatör uygulamalarında kullanılan deneme planı...18 Çizelge 3.3 ISR-2000 uygulamasında kullanılan dozlar...19 Çizelge 3.4 Actigard uygulamasında kullanılan dozlar...19 Çizelge 4.1 ELISA Testi Sonuçları Çizelge 4.2 ASM uygulanan bitkilerde mekanik inokulasyon sonucu simptom gösteren bitki oranı...23 Çizelge 4.3 ISR-2000 uygulanan bitkilerde mekanik inokulasyon sonucu simptom gösteren bitki oranı Çizelge 4.4 Actigard ın farklı doz ve uygulama zamanlarının simptom çıkış süresi üzerine etkileri...24 Çizelge 4.5 Actigard ın farklı doz ve uygulama zamanlarının bitki boyu üzerinde etkileri Çizelge 4.6 Actigard ın farklı doz ve uygulama zamanlarının yaprak genişliği üzerinde etkileri Çizelge 4.7 ISR-2000 in farklı doz ve uygulama zamanlarının simptom çıkış süresi üzerinde etkileri Çizelge 4.8 ISR-2000 in farklı doz ve uygulama zamanlarının bitki boyu üzerinde etkileri Çizelge 4.9 ISR-2000 in farklı doz ve uygulama zamanlarının yaprak genişliği üzerinde etkileri vii

9 1. GİRİŞ Türkiye hektarlık sebze üretim kapasitesine sahiptir ve ülkemizde yaklaşık 22 milyon ton sebze üretilmektedir. Kabakgiller (kavun, karpuz, hıyar ve kabak) tüm sebzeler içerisinde % 33 lük payla önemli bir yere sahiptir (Anonim 2010). Kavun (Cucurbita melo L.) tonluk üretimi ile Türkiye de kabakgiller içerisinde önemli türlerdendir. Bunun tonu Ankara da üretilmektedir. Bu miktar, Türkiye kavun üretiminin % 15,6 lık kısmını oluşturmaktadır (Anonim 2010). Kabakgiller pek çok virüs hastalığına konukçuluk etmekte ve bu virüsler, ürünlerde önemli miktarlarda ürün kayıplarına neden olmaktadır. Kabakgiller (Cucurbitaceae) familyası içindeki bitki türlerinde hastalık yapan ve ekonomik zararlara sebebiyet veren çok sayıda viral etmen mevcuttur (Zitter vd. 1996). Dünyada kabakgiller içerisinde zararlı 32 adet virüs ve benzeri hastalık etmeni tespit edilmiştir. Bunlar içerisinde hıyar mozaik virüsü (Cucumber mosaic virus, CMV), kabak sarı mozaik virüsü (Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV), kabak mozaik virüsü (Squash mosaic virus, SqMV), karpuz mozaik virüsü II (Watermelon mosaic virus II, WMV II), papaya halkalı leke virüsü (Papaya ring spot virus, PRSV) kabakgillere zarar veren önemli virüslerdendir (Lisa ve Lecoq 1984). Türkiye de kabakgil yetiştirilen bölgelerdeki virüslerden en önemli olanlarının CMV, ZYMV, PRSV, WMV2 ve kabakgil afit-kökenli sarılık virüsü (Cucurbit aphid-borne yellows virus, CABYV) olduğu bildirilmektedir. Bunlardan CMV, yaygınlığı ve oluşturduğu zarar açısından yurdumuzda kabakgillerin önemli virüslerindendir (Nogay 1983, Ertunç 1992, Yılmaz vd. 1992, Şevik ve Sökmen 2001). Ankara ili kavun alanlarında daha önce yapılan bazı çalışmalar (Ertunç 1992) ve gözlemler sonucunda Kırkağaç ve Kazan (Ova) kavununda özellikle Cucumber mosaic virus unun ekonomik kayıplara yol açtığı belirlenmiştir. 1

10 Hıyar mozaik virüsü (CMV), Cucumovirus grubuna dahil, yuvarlak ve 29 nm çapında partiküllere sahip bir hastalık etmenidir (Anonim 2009). CMV, kavunların dışında diğer kabakgilleri de hastalandırabilmekte ve bunların dışında da geniş bir konukçu dizisine sahiptir (Anonymous 2006); virüs Aphis craccivora ve Myzus persicae gibi bazı yaprak bitlerince non persistent olarak ve mekanik şekilde taşınmaktadır (Anonymous 2006). Kavun bitkileri CMV ile enfekte oldukları zaman ilk belirti olarak yapraklarda damarlar arasında küçük sarı yeşil lekeler şeklinde görülür. Bu ilk belirtiden sonra şiddetli bir mozaikleşme (sarı-yeşil lekelenme) oluşur, daha ileri dönemde damarlar arasında koyu yeşil alanlarda kabarcıklaşma başlar; meyvelerde ise koyu yeşil renkli lekelerle, birbirine karışmış açık sarımsı-yeşil lekeler meydana gelir, koyu yeşil kısımlarda genellikle siğil benzeri çıkıntılar veya kabartılar gelişir. Meyvelerde şekil bozuklukları da görülür (Anonymous 2004). CMV yi de içeren bitki virüsleriyle mücadelede daha çok kültürel önlemler, kimyasal önlemler (vektörlerle mücadele amacıyla), fiziksel savaşım, dayanıklı bitki kullanımı, karantina önlemleri ve biyoteknolojik yöntemler kullanılmaktadır. Bu yöntemlerle viral hastalıklar ancak kısmen kontrol altında tutulabilmekte, bunlardan pestisitlerle vektör mücadelesi çevre kirliliği yaratabilmekte ve belirli bir emek ve masraf gerektirmektedir. Biyoteknolojik yöntemler ise daha çok farklı organizmalardan gen aktarımı esasına dayanmaktadır. Etkili, ekonomik ve uygulanması kolay mücadele yöntemlerine gereksinim duyulduğu için son yıllarda yeni mücadele yöntemleri üzerinde çalışmalar hız kazanmıştır. Özellikle fungal ve bakteriyel hastalık etmenlerine karşı uygulanan ve bitkinin doğal savunma mekanizmasının uyarılması esasına dayanan Sistemik Kazandırılmış Dayanıklılık (SKD, SAR; Systemic Acquired Resistance) yöntemi viral etmenler için yapılan çalışmalarda da son yıllarda ön plana çıkmaya başlamıştır. Bitki aktivatörlerinin şimdiye kadar Tobacco mosaic virus (TMV, Tütün mozaik virüsü), CMV, ZYMV (Hiroki ve Takahide 2003), Tomato yellow leaf curl virus (Domates sarı yaprak kıvırcıklığı, TYLCV) (Fanigliulo vd. 2009), Beet soil borne virus (Şeker pancarı toprakla taşınan virüs, BSBV), Beet necrotic yellow vein virus (Şeker pancarı nekrotik sarı damar virüsü, BNYVV) (Mouhanna vd. 2003), Tomato mosaic virus (Domates mozaik virüsü, ToMV) (Madhusudhan vd. 2008), Tomato spotted wilt virus (TSWV, 2

11 Domates lekeli solgunluk virüsü) (Mandal vd. 2001) ve değişik Potyvirus ların (Mejia vd. 2009) enfeksiyonu ve hastalık şiddetine etkisi başka kültürel uygulamalarla da karşılaştırılarak araştırılmıştır (Smith-Becker vd. 2003, Momol vd. 2004). Sistemik kazandırılmış dayanıklılık (SKD), bitkide bir enfeksiyona karşı uzun süre sürecek, daha çok patojene karşı ve gelecekteki muhtemel patojen enfeksiyonlarına karşı gösterilen bir dayanıklılık reaksiyonudur. SKD fiziksel bariyerler gibi mevcut dayanıklılık mekanizmalarından farklı olarak fitoaleksin sentezi, aşırı duyarlılık (hipersensitif reaksiyon) gibi teşvik edilebilir dayanıklılık mekanizmalarından oluşmaktadır. Bunlardan başka SKD bitkide yaralanma veya ozmotik streslerden kaynaklanan tepkilerle ilgili değildir (Ryals vd. 1996). Bitki aktivatörleri de hastalık etmenlerinin enfeksiyonunu önleyen veya azaltan doğal ve/veya sentetik kimyasal maddelerdir. Bazı bitki aktivatörleri ürünü nitelik ve nicelik olarakta olumlu yönde etkiler. Günümüzde SKD yi teşvik etmek için bitkilerde bakteri proteinleri, maya özütleri, acibenzolar-s-methyl, UV ışık, β-amino butyric asit (BABA), salisilik asit, benzothiadiazole gibi biyotik ve abiyotik uyarıcılar kullanılmaktadır. Bu maddelerin uyarısı sonucu bitkide SKD harekete geçirilmekte ve aşırı duyarlılık reaksiyonu, ligninleşme, papilla oluşumu, patojenisite ile ilişkili proteinlerin (PR) sentezi, fitoaleksinlerin sentezi şeklinde değişik savunma mekanizmaları aktive edilmektedir (Ryals vd. 1996). Bu çalışmada, Actigard (acibenzolar-s-methyl) ve ISR-2000 gibi aktivatörlerin Kırkağaç kavunu üzerindeki CMV enfeksiyonunun etkilerini azaltıp azaltamadığı, simptom çıkış süresini geciktirip geciktiremediği ve bitki gelişimi üzerine olan etkilerinin (bitki boyuna ve yaprak genişliğine olan etkileri) yanında bitkinin virüs ve aktivatörle olan muamelesinden sonra bitkide oluşan tepki mekanizmaları (H 2 O 2 ve lignin birikimi) araştırılmıştır. 3

12 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1 Yurt Dışında Yapılan Çalışmalar Momol vd. (2000), çalışmalarında tarlada domateslerde metal malç+ Actigard (ASM)+ insektisit kombinasyonunun TSWV enfeksiyonunu % 76 ya varan oranda azalttığını belirtmişlerdir. Domates fidelerini şaşırtmadan 1 hafta önce, ASM (Actigard ) ile (2g/4000 bitki) yıkamışlar ve şaşırtmadan sonra 15 günde bir olmak üzere 4 kez daha yine ASM yapraklara püskürtülmüştür (26,25 gr/ha). Pappu vd. (2000a), tütünleri tarlaya şaşırtmadan 5-7 gün önce sera ortamında ASM (2 g/7000 bitki) ve imidacloprid (9,9 g/1000 bitki) etki maddeli insektisit, tarlada ise haftada bir 3 veya 4 uygulama olmak üzere ASM (6,17 g/ 1 da) ve imidacloprid (6,83 g/ 1 da) etki maddeli insektisit ile spreylemişlerdir ve hastalığın çıkış oranını kontrole göre en az % oranında düşürmüştür. Pappu vd. (2000b), Gürcistan da farklı yıllarda yaptıkları yaptıkları çalışmada tütünlerde ASM (1 kg/ ha) veya (25 g/ 7000 bitki) ile imidacloprid uygulamalarının TSWV nin neden olduğu hastalık oranını % 30 a varan oranda azalttığını belirtmişlerdir. Csinos vd. (2001), yaptıkları sera denemelerinde tütünde ASM uygulaması (8 g/7000 bitki) ile TSWV enfeksiyonunun azaldığını rapor etmişlerdir. Mandal vd. (2001), tarafından yürütülen bir çalışmada, ASM (4 g/7000 bitki) ve/veya imidacloprid uygulamasının tarla koşullarında TSWV enfeksiyonunu önemli ölçüde azalttığı tespit edilmiştir. ASM hıyarlarda CMV enfeksiyon oranını azaltmış ve bitkilerde simptom çıkış süresini geciktirmiştir (Hiroki ve Takahide 2003). 4

13 Mouhanna vd. (2003), ASM uygulaması sonucu şeker pancarlarında Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) ve Beet soil borne virus (BSBV) enfeksiyonunu azalttığını tespit etmişlerdir. Cantaloupe kavunlarında CMV ye karşı ASM (25, 50, 100 µg/ml dozlarda) kullanılarak dayanıklılık kazandırma çalışmasında özellikle genç yapraklarda viral belirtilerin azaldığı, simptom çıkış süresinin de arttığı görülmüştür (Smith-Becker vd. 2003). Csinos vd. (2004 a,b), tütünlerde Actigard +imidacloprid uygulamasının TSWV nin şiddetini % 8-45 oranında azalttığını ve bitki verimini de artırdığını bildirmişlerdir. Momol vd. (2004), çalışmalarında UV yansıtmalı malç, ASM ve bazı insektisitlerin TSWV nin neden olduğu hastalık ve bu virüsü taşıyan çiçek thripslerinin populasyon dinamikleri üzerine etkilerini araştırmışlar ve UV yansıtmalı malçların thrips kolonizasyonun üzerine siyah polietilen örtülerden daha etkili olduğunu, acibenzolar-smethyl in hastalık etkisinin yoğun olduğu bölgede TSWV enfeksiyonunu indirgediğini ve UV yansıtıcı malç, acibenzolar-s-methyl ve insektisit uygulamalarının beraber kullanımının TSWV enfeksiyonunu azaltmada oldukça başarılı olduğunu belirtmişlerdir. Chinnasri ve Sipes (2005), tütünlerde ASM (1-3,7 g/da) ve ananaslarda ASM (0,2 g-0,4 g/l) konsantrasyonlarının bu bitkilerde hafiften şiddetliye kadar değişik oranlarda fitotoksiteye sebep olduğunu kaydetmişlerdir. Tütün bitkisi üzerinde ilk yapraklı dönem ile kotiledon döneminde ASM uygulamasının (4.6 g/10000 bitki) yaprak biti populasyonunu azaltma ve TSWV enfeksiyonunu düşürme üzerine etkilerinin araştırıldığı bu çalışmada, Actigard, imidacloprid (Admire) ve bu ikisinin birlikte kullanımı thrips populasyonlarını az miktarda etkilemiştir. Uygulamalar TSWV simptom çıkış miktarını belirgin bir şekilde azaltmıştır. TSWV simptomlarının azalmasında Actigard ve Admire ın birlikte 5

14 uygulanması, tek başına Actigard uygulamasından çok daha etkili olmuştur (Blackley vd. 2004, Mcpherson vd. 2004, Johnson 2006). TMV ve ToMV enfeksiyonundan önce 2 aylık Nicotiana glutinosa bitkilerinin primer yaprakları 100 ppm ASM ye daldırılmıştır. Lokal simptomlar kontrole oranla sırasıyla % 67-79, lokal leke büyüklüğü de % oranında azalmıştır. ASM biberlerde TMV nin neden olduğu simptom miktarını % 68, leke büyüklüğünü % 37 oranında azaltmıştır. ASM uygulanmış domateslerde ToMV den kaynaklanan simptom miktarı % 66, leke büyüklüğü de % 39 oranında azalmıştır (Madhusudhan vd. 2008). Mandal vd. (2008), çok düşük konsantrasyonlarda ASM nin (0,6 mg/1 bitki) tütünlerde fitotoksik olduğunu bildirmişlerdir. Nischwitz vd. (2008), TSWV enfeksiyonuna karşı tütünlerde yaptıkları sera çalışmalarında fideleri şaşırtmadan 4 gün önce ASM uygulaması (2 g/7000 bitki) yapmış ve virüs enfeksiyon oranını düşürdüğünü bildirmişlerdir. Parkunan vd. (2008), Amerikan tütünlerinde ASM yi mg/l dozlarında uygulamış ve bu dozların fitotoksiteye sebep olup bitki boylarını kısalttığını bildirmişlerdir. Fanigliulo vd. (2009), yaptıkları sera çalışmalarında UV yansıtıcı malçlarla birlikte ASM yi (3 g/100 l) şaşırtmadan önce ve şaşırttıktan sonra 15 günde bir olmak üzere domates bitkilerinin yapraklarına spreylemiş ve Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) enfeksiyonunu % 7-10 oranında azalttığını tespit etmişlerdir. Sirigu ve Nannini (2009), sera ortamında domateslerde yaptıkları çalışmada, bitkileri her birine 1,15 mg ASM düşecek şekilde spreylemiş ve TYLCV hastalığının görünme oranının % oranında azaldığını kaydetmişlerdir. Mejia vd. (2009), domateslerde Potyvirus enfeksiyonuna karşı ASM uygulamalarının (% 0.08), simptomların görünme oranını % 50 azalttığını bildirmişlerdir. 6

15 2.2 Türkiye de Yapılan Çalışmalar Türkiye de aktivatörlerin virüsler de dahil olmak üzere bitki hastalık etmenlerine karşı etkileri ile ilgili az sayıda çalışma bulunmaktadır. Kabak bitkilerine ACTIGARD (0,1-0,2-0,4 g/l) uygulamasından 48 saat sonra yapılan ZYMV-FM inokulasyonu simptomun çıkış süresi üzerine etkili olmuş ve kontrol bitkilere göre uygulama yapılan bitkilerde gün süre ile simptom çıkışında gecikme gözlenmiştir ancak 24, 72 ve 96 saatlik bulaştırmaların simptom çıkış zamanı üzerine belirgin bir etkisi olmadığı saptanmıştır. MESSENGER (0,25-0,50-1g/l) ve ISR-2000 ( ml/l) uygulamalarının her ikisinde ise yalnızca 72 saat sonra yapılan ZYMV-FM inokulasyonu simptomun çıkış süresi üzerine etkili olmuş ve kontrol bitkilere göre uygulama yapılan bitkilerde MESSENGER da 10 gün, ISR-2000 de gün süre ile simptom çıkışı gecikmiştir (Çalışkan 2007). ASM nin CMV ye karşı etkinliğinin araştırılması amacı ile yapılan çalışmada tütün çeşitlerinde (Nicotiana tabacum Samsun ve Nicotiana rustica) CMV simptom çıkışında gecikme gözlenmiş, enfeksiyon şiddeti ve simptom türünde herhangi bir farklılık gözlemlenmemiştir (Çalışkan ve Kamberoğlu 2009). Bal kabaklarında ZYMV ye karşı Actigard ve ISR-2000 bitki aktivatörlerinin etkilerinin belirlenmesi amacıyla yapılan çalışmada en uygun dozların ISR-2000 için 90 ml/100 l su Actigard için 67 ve 87 g/da olduğu belirlenmiş. Actigard uygulamasının simptom çıkışını 5-21 gün arasında geciktirdiği, ISR-2000 in ise simptom çıkış süresinde etkisi olmadığı ancak bitki gelişimini olumlu yönde etkilediği belirtilmiştir (Kashtban ve Elibüyük 2011). 7

16 3. MATERYAL VE METOD 3.1 Materyal Çalışma materyali hakkında bilgiler Bu tez çalışmasında kullanılan CMV inokulumu 2010 yılında Kazan, Polatlı ve Şereflikoçhisar ilçelerinde yapılan surveyler sonucu Ankara nın Kazan ilçesindeki şiddetli mozaik (sarı-yeşil lekelenme), damarlar arasında koyu yeşil kabarcıklaşma ve yapraklarda şekil bozukluğu şeklinde belirtiler gösteren Kırkağaç kavunu bitkilerinden (Şekil 3.1 ve 3.2) izole edilmiştir. Kırkağaç kavunu koku ve aroması ile türk tipi kavunu temsil etmesi, Ankara ilinde bolca üretilmesi ve çalışma materyali olarak kolay temin edilebilmesi açısından bu çalışmada tercih sebebi olmuştur. Laboratuvar çalışmaları Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü Fitopatoloji Anabilim Dalı Fitopatoloji laboratuvarında, bitkilerle ilgili çalışmalarda kontrollü bölüm serasında yapılmıştır. Şekil 3.1 Şiddetli mozaik ve damarlar arası kabarcıklaşma ve şekil bozukluğu gösteren kavun yaprakları 8

17 Şekil 3.2 Şiddetli mozaik ve damarlar arası kabarcıklaşma gösteren kavun yaprağı Serolojik çalışmalarda kullanılan materyal Serolojik çalışmalarda DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich ELISA) için, arazide CMV ile enfekte olduğundan şüphelenilen kavun yaprakları bitkisel materyal olarak kullanılmıştır. ELISA testlerinde CMV, ZYMV, PRSV, WMV ve SqMV antiserumları, ELISA tabakaları, mikropipetler, pipet uçları, tampon solüsyonlar, havan ve havaneli ve ELISA okuyucusu materyal olarak kullanılmıştır Mekanik inokulasyon çalışmalarında kullanılan materyal Mekanik inokulasyon çalışmalarında, araziden toplanan ve ELISA testleri sonucunda CMV ile enfekteli olduğu belirlenen kavun bitkilerinden alınan yapraklar kullanılmıştır. Saksı çalışmalarında kullanılan ve farklı bitki aktivatörlerinin uygulandığı Kırkağaç kavunu bitkileri üzerine CMV yi bulaştırmak için mekanik inokulasyonlar yapılmış ve inokülasyondan 7 gün sonra tipik belirtiler görülmeye başlanmıştır. Belirtilerin şiddetlendiği 15. günde yapraklar hasat edilmiştir. Bu yapraklardan çıkarılan özsu, 9

18 aktivatör denemelerinde kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan bitkilere yapılan mekanik inokulasyon çalışmalarında, havan ve havaneli, cam spatül, fosfat tampon çözeltisi ve selit (celite) kullanılmıştır. Mekanik inokulasyon çalışmalarında kullanılan kavun tohumlarının ekilmesi ve fidelerin yetiştirilmesi için kum, toprak ve torf karışımı (1:1:1) ve plastik saksılar da diğer materyalleri oluşturmuştur Dayanıklılığın uyarılması çalışmalarında kullanılan materyal Sera koşullarında yapılan dayanıklılığın uyarılması çalışmalarında, ISR-2000 ve Actigard olmak üzere iki farklı bitki aktivatörü, serolojik olarak teşhis edilmiş CMV izolatı ile kavun bitkileri materyal olarak kullanılmıştır. Acibenzolar-S-methyl (ASM) piyasada Bion % 5 WP ve Actigard 50 WG (Syngenta) ticari isimleriyle satılmaktadır ve Actigard Türkiye de ruhsatlı değildir. Bion Avrupa ve Türkiye de ruhsatlıdır. ISR-2000 ise sistemik kazandırılmış dayanıklılık ajanı olarak piyasaya sunulmuştur. ASM benzothiadiazol (BTH) gurubundan benzo [1,2,3] thiadizaol-7-carbo thioicacid-s-methyl ester etkili bir kimyasaldır. Actigard salisilik asitin sentetik bir analoğu olup pek çok üründe dayanıklılığı 4 gün içerisinde uyarmaktadır. Bu dayanıklılık değişik ürünlerde pek çok fungus, bakteri ve virüs hastalıklarına karşı etki yapmaktadır. Actigard bitki koruma ürünü olarak ABD de aşağıdaki hastalıklara karşı ruhsatlanmıştır (Çizelge 3.1). 10

19 Çizelge 3.1 ABD de Actigard ın ruhsatlı olduğu hastalık ve hastalık etmenleri Ürün Etmen Hastalık Acı biber Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Bakteriyel leke Pseudomonas syringae pv. tomato Bakteriyel benek Brassicaceae Peronospora parasitica Mildiyö (Lahanagiller) Xanthomonas campestris Siyah damar çürüklüğü Pseudoperonospora cubensis Yalancı mildiyö Sphaerotheca fuliginea Erysiphe cichoracearum Külleme Cladosporium cucumerimum Uyuz Cucurbitaceae Bakteriyel meyve Acidovorax avena pv. citrulli (Kabakgiller) lekesi Xanthomonas campestris pv. cucurbitae Bakteriyel yaprak lekesi Pseudomonas syringae pv. lachrymans Köşeli yaprak lekesi Marul Bremia lactucae Mildiyö Peronospora destructor Mildiyö Soğan Iris yellow spot virus Iris sarı leke virus hastalığı Xanthomonas axonopodi pv. allii Yaprak yanıklığı Ispanak Peronospora tabacina Mildiyö Bu çalışmada kullanılan aktivatör olan ISR-2000 ise biyolojik, organik ve doğal ekstraktlar formülasyonundan oluşan yeni bir üründür; etkili maddesi Lactobacillus acidophilus, maya ekstraktı, bitki ekstraktı ve benzoik asitten meydana gelmektedir. 11

20 3.1.5 Histokimyasal boyama çalışmalarında kullanılan materyal Histokimyasal boyama çalışmalarında, ISR 2000 ve Actigard olmak üzere iki farklı bitki aktivatörü uygulanarak yapılan saksı denemeleri sonunda, dayanıklılığın uyarıldığı kavun bitkilerinden alınan kök, gövde ve yaprak parçaları ile cam şişeler, steril bistüri, pens, metal kap, aliminyum tel, DAB (diaminobenzidine) boyama seti, phloroglucinol, chloralhydrate, metanol, saf su ve faz kontrast mikroskop, ışık mikroskobu ve stereoskobik mikroskop materyal olarak kullanılmıştır. 3.2 Metod Bu çalışmada kullanılan ve CMV izolatı olarak saptanan ve tanılanması ile dayanıklılığın uyarılması çalışmalarında izlenen yollar şekil 3.3 de verilmiştir. 12

21 SURVEY VE 1 ÖRNEK TOPLAMA 6 VERİLERİN ANALİZİ 2 ÖRNEKLERİN BUZ KUTUSUNDA VE UYGUN KOŞULLARDA LABORATUVARA TAŞINMASI 5 ELISA TESTİ 3 ELISA TESTİ 4 MEKANİK İNOKULASYON VE DENEME KURMA Şekil 3.3 Çalışmada izlenen yollar Bitki örneklerinin toplanması ve muhafazası Çalışmada kullanılan CMV izolatının elde edilmesi amacıyla, Ankara Kazan ilçesine yapılan arazi surveylerinde, simptomatolojik olarak CMV ile bulaşık olduğundan şüphelenilen kabakgil bitkilerinden sap, gövde, yaprak ve meyve örnekleri alınmış ve kağıt torbalara konulmuştur (Araziden toplam 50 örnek toplanmıştır). Torbalara numara verilerek buz kutusu içerisinde uygun şartlar altında laboratuara getirilmiş ve yapılacak olan çalışmalarda kullanılmak üzere, 4-7 gün gibi kısa bir süre için 4 C de, daha uzun süreler için ise, -20 C de güvenli bir şekilde saklanmaya bırakılmıştır. Arazi çıkışları, 2010 yılının Temmuz-Eylül aylarında yapılmıştır. Sera koşullarında, CMV ile bulaşık olan bitkilerin tespit edilmesi için öncelikle simptomatolojik incelemeler yapılmıştır. Örnek alınan bitkilerde, CMV den ileri gelen yaprak ve meyvelerde bozulma, sistemik 13

22 mozaikleşme, kloratik ve nekrotik lezyonlar, damarlar arası kabarcıklaşma, genç sürgünlerde iplikleşme gibi simptomlar aranmıştır. CMV tarafından oluşturulan bu simptomları gösteren Kavun yaprakları çalışmada materyal olarak kullanılmıştır Mekanik inokulasyon çalışmaları ELISA testleri sonucunda CMV ile bulaşık olduğu saptanan bitkilerden elde edilen CMV izolatının serolojik tanısı, saksı denemelerinde kullanılan CMV ile bulaşık yeterli miktarda bitki dokusunun elde edilmesi ve saksı çalışmalarında bitki aktivatörü uygulanan kavun bitkilerine CMV nin bulaştırılması Smith ve Becker e (2003) göre aşağıdaki şekilde yapılmıştır. CMV ile bulaşık bitkilerden alınan bitki dokuları 0.02 M fosfat tampon çözeltisi (ph 7.0) içeren steril porselen havanda ezilmiş ve bitki özsuyu daha önceden selit serpilmiş test bitkilerinin yapraklarına mekanik olarak inokule edilmiş ve daha sonra inokule edilen yapraklar çeşme suyu ile zararlandırmadan yıkanmıştır Serolojik çalışmalar Serolojik çalışmalarda; Arazi çıkışlarında toplanan ve simptomatolojik olarak CMV ile bulaşık olduğundan şüphelenilen kavun bitkileri (50 örnek), mekanik inokulasyon çalışmaları sonunda simptom gözlenen bitkiler, saksı denemelerinde bitki aktivatörlerinin uygulandığı kavun bitkileri ve denemenin sonunda belirti gözlenen kavun bitkileri DAS-ELISA yöntemi ile test edilmiştir DAS-ELISA testi Simptomatolojik bakımdan CMV simptomlarına benzeyen bitki yaprakları DAS-ELISA yöntemiyle testlenmiş, daha sonra testlenecek olanlar ise buzdolabında 4 C de veya 14

23 derin dondurucuda -20 C de saklanmıştır. DAS-ELISA yöntemi (Clark ve Adams 1977) e göre aşağıdaki şekilde yapılmıştır. 1. Virüs IgG leri antiserumların satın alındığı firmanın belirttiği yönteme göre, ph 9.6 kaplama tamponu ile sulandırılmış (1/1000 v/v) ve ELISA tabakalarının (plate) her bir çukuruna 100 µl konularak tabakaların üzeri kapatılmış ve 37 C de 4 saat inkübe edilmiştir. 2. İnkübasyondan sonra yıkama tamponu ile tüm çukurlar 3 er dakikadan üç kez yıkanmıştır. 3. Örnek tamponu ile 1/20 (w/v) oranında havan ve havaneli yardımıyla ezilmiş örneklerinin özsuları tabakalara yine 100 µl konulmuş ve 4 C de bir gece boyunca inkübe edilmiştir. 4. İnkübasyondan sonra yıkama tamponu ile tüm çukurlar 3 er dakikadan üç kez yıkanmıştır. 5. Konjugat tamponu (ph 7.4) içerisinde firmanın önerdiği şekilde sulandırılacak olan alkalin fosfataz enzimi ile işaretli IgG tabakalardaki çukurlara 100 er µl konulmuş ve 37 C de 5 saat inkübe edilmiştir. 6. İnkübasyondan sonra, yıkama tamponu ile tüm çukurlar üç kez yıkanmıştır. 7. Enzimin substratı olan p-nitrophenyl phosphate (1 mg/ml) substrat tamponunda (ph 9,8) çözülmüş ve çukurlara 100 µl konmuştur. Tabakalar bu şekilde karanlıkta, oda sıcaklığında dk inkübe edilmiştir. 8. Ölçümler ELISA okuyucusu (ELISA reader) ile 405 nm dalga boyunda yapılmıştır. 15

24 DAS-ELISA yöntemi çift tekerrürlü çalışılmış olup negatif örnek ölçüm değerinin 2 katı ve yukarısı pozitif olarak kabul edilmiştir (Uyemoto vd. 1989) Bitki aktivatörlerinin enfeksiyon oranına etkileri Bitkilerde dayanıklılığın uyarılması çalışmalarının bir bölümü olan ve uygun dozun ve zamanın belirlenmesi amacı ile yapılan saksı denemeleri, dayanıklılık uyarıcılar Actigard ve ISR-2000 kullanılarak aşağıda açıklanmıştır. Saksı denemeleri, öncelikle CMV ye karşı dayanıklılığın uyarılması çalışmalarında kullanılan iki farklı etkili maddeye sahip olan bitki aktivatörlerinin uygulanacak doz miktarları ile bitkide en etkili oldukları zamanın tespiti amacıyla yapılmıştır. Saksı denemeleri tesadüf blokları deneme desenine göre Csinos vd. (2004) in belirttiği şekilde oluşturulmuştur (Şekil 3.4). Her bir karakter (bitki aktivatörü) için kontrol (bitki aktivatörü uygulanmamış CMV ile inokule edilen bitkiler) ile birlikte 60 bitki ISR için ve 60 bitki Actigard için kullanılmıştır. Actigard 6 mg/ 80 ml, 8 mg/ 80 ml ve 10 mg/ 80 ml, ISR-2000 ise 36 µl/ 80 ml su, 72 µl/ 80 ml su, 144 µl/ 80 ml su, konsantrasyonlarında çeşme suyu içerisinde hazırlanmış ve kavun fidelerine püskürtülerek uygulanmıştır (ilk gerçek yaprakların çıkmış olduğu dönemde) (Kang ve Buchenauer 2001, Baysal vd. 2003). Bitki aktivatörlerinin bitki bünyesinde en etkili olduğu zamanın belirlenmesi amacıyla, bunların bitkiye uygulanmasından sonraki 72. ve 96. saatleri takiben aynı bitkiler üzerine, serolojik tanısı yapılmış CMV izolatı mekanik inokulasyon yöntemi ile bulaştırılmıştır (Louws vd. 2001, Kang ve Buchenauer 2001, Bokshi vd. 2003, Baysal vd. 2003). 16

25 Şekil 3.4 Seradaki deneme düzeni Actigard ve ISR-2000 uygulandıktan sonra 72 ve 96 saat sonra virüs uygulaması sonucu bitkilerde gözlenen simptomlar inokulasyondan sonraki kontrol bitkilerinde ilk simptom çıkış tarihinden itibaren değerlendirilmeye başlanmıştır. Her faktör 10 tekerrürden ibaret olup toplam kullanılan bitki sayısı 140 dır ve deneme planı aşağıdaki gibi kurulmuştur (Çizelge 3.2). 17

26 Çizelge 3.2 Aktivatör uygulamalarında kullanılan deneme planı ZAMAN DOZ 1 DOZ 2 DOZ 3 ISR ISR ACTIGARD ACTIGARD KONTROL KONTROL TOPLAM 140 Uygulamadan, bitkinin çiçeklenme aşamasına kadar gelen süre içerisinde bu kavun bitkileri üzerinde CMV simptomlarının varlığı, simptomların çıkış zamanı, bitki boyu, yaprak genişliği istatistiki olarak, simptom şiddeti ise görsel olarak değerlendirmeye alınmıştır. İstatistiksel analizlerde MİNİTAB ve SPSS paket programları kullanılmıştır. Bu çalışmada sonuçlar, bitki aktivatörlerinin uygulanmadığı kontrol bitkiler üzerinde ilk simptom çıkışının gözlenmesi ile değerlendirmeye başlamıştır. Dayanıklılık uyarıcıların bitkilerle muamelesinden sonra belirlenen zaman aralıklarında virüs inokulasyonu yapılıp, bitkide CMV ye karşı bir reaksiyon olarak gelişen SKD (sistemik kazandırılmış dayanıklılık) mekanizmasının en etkili olduğu uygun zaman aralığı ve doz belirlenmiştir. Bitki aktivatörlerinin CMV ye karşı kullanılabilecek en etkin dozlarının belirlenmesi amacıyla yapılan saksı denemeleri de aşağıdaki şekilde yürütülmüştür. Bu amaçla yapılan çalışmalarda bitki aktivatörü ISR-2000 kullanım prosedüründe belirtilen doz miktarı ile bu dozun yarısı ve iki katı şeklinde 3 farklı doz kullanılmıştır (Çizelge 3.3). Ön denemelerde, bal kabaklarına yapılan Actigard uygulamaları sonucu, firmanın önerdiği dozun fitotoksik olduğu görülmüştür. Bu nedenle fitotoksik olmayan 3 farklı doz (Çizelge 3.4) şeklinde uygulama yapılmıştır ve bu dozlar denemeye en 18

27 uygun dozlar olarak bulunmuştur (Kashtban 2011). Bu denemede, diğer çalışmalarda olduğu gibi tesadüf blokları deneme desenine göre kurulmuş ve 10 tekerrürden oluşmuştur ve bu denemelerde her bir karakter için kontrol ile birlikte 140 kavun bitkisi kullanılmıştır. Kullanılan bitki aktivatörlerinin dozları çizelge 3.3 ve 3.4 te verilmiştir. Bitki aktivatörlerinin uygun dozunun saptanması amacıyla yapılan çalışmalarda, kavun bitkilerine bitki aktivatörlerinin ilk uygulamasından sonra 1 hafta arayla 2 kez daha bitki aktivatörü uygulanmış ve değerlendirilmiştir. Simptomatolojik olarak gözlenen ve değerlendirilen bu bitkilerden alınan kök, gövde ve yaprak dokuları histokimyasal boyamalarda materyal olarak kullanılmıştır. Çizelge 3.3 ISR-2000 uygulamasında kullanılan dozlar Bitki aktivatörü Doz 1 Doz 2 Doz 3 ISR ml/100 l su 90 ml/100 l su 180 ml/100 l su Çizelge 3.4 Actigard uygulamasında kullanılan dozlar Bitki aktivatörü Doz 1 Doz 2 Doz 3 Actigard 6 mg/ 80 ml 8 mg/80 ml su 10 mg/80 ml su Histokimyasal boyamalarla lignin sentezinin belirlenmesi Aktivatör uygulamasından 72 ve 96 saat sonra virüs inokülasyonu yapılan ve kontrol grubu olarak sadece virüs uygulanan bitkiler (aktivatör uygulama zamanından 72 ve 96 saat sonra) alınan yaprak, kök ve gövde parçaları kullanılmıştır. Bitki aktivatörlerinin 19

28 kullanılması sonucu, enfekteli bitki dokularının enfeksiyon ve reaksiyon yerlerinde ortaya çıkan lignin sentezi, phloroglucinol/hcl Testi ile belirlenmiştir. Actigard ve ISR-2000 uygulaması yapılan kavun bitkileri saksılardan kök bölgesi zararlandırılmadan çıkarılmış ve çeşme suyunda yıkanmıştır. Bu bitkilerin kök ve gövdelerinden steril bir bistüri ile 3-5 mm uzunluğunda, yapraklarından ise, yaklaşık 5 mm çapında kesitler alınmıştır. Bitki dokularındaki klorofiller, % 1 oranında phloroglucinol katılmış methanol içerisinde, dakika kaynatılarak uzaklaştırılmıştır. Daha sonra beyazlaşan doku örnekleri, kloralhidrat (2.5 g/1 ml saf su) içerisinde 24 saat bekletilerek dokular şeffaflaştırılarak temizlenmiştir. Metanol yardımı ile klorofil uzaklaştırılarak, kloralhidrat ile temizlenen dokular steril bir lam üzerine alınarak, üzerine 1-2 damla konsantre HCl ilave edilerek 10 dak. bekletilmiştir. Daha sonra bu dokuların üzerine birkaç damla % 50 lik gliserin çözeltisi damlatılmış ve lamel kapatılarak bu şekilde hazırlanan preparatlar incelenmiştir. Enfekteli dokuların üzerine HCl eklendikten ortalama 10 dak. sonra, ligninlenmiş yapılar koyu pembeturuncu bir renk oluşturmuştur. Boyanmış dokuların 3-5 saat sonra renklerini kaybetmeleri nedeniyle preparatlar, mümkün olduğunca kısa süre içerisinde, stereoskobik mikroskop veya ışık mikroskobu kullanılarak incelenmiş ve görüntü alınmıştır (Gahan 1984, Vallet vd. 1996, Soylu 1999) Histokimyasal boyamalarla H 2 O 2 sentezinin belirlenmesi Dayanıklılığın uyarıldığı kavun bitkilerinde, enfekteli dokularda enfeksiyon ve reaksiyon yerlerinde meydana gelen H 2 O 2 sentezi, DAB (3,3 -diaminobenzidine) testi ile belirlenmiştir. Bu yöntemde de bitki dokuları aynen lignin sentezinin belirlenmesi yönteminde olduğu gibi alınmıştır. Enfekteli dokular önce karanlıkta dak. arasında DAB içerisinde (DAB erimesi güç olduğu için HCl ile ph sı 3.8 e getirilmiş saf suyun içinde çözülmüş ve mikropor filtreyle filtre edilmiştir) bekletilmiştir. Bitki dokularından klorofilin uzaklaştırılması için methanol içerisinde dakika kaynatılarak beyazlaşan doku örnekleri, kloralhidrat (2,5 g/1 ml saf su) içerisinde 24 saat bekletilerek ve dokular 20

29 şeffaflaştırılarak temizlenmiştir. Metanol yardımıyla klorofil uzaklaştırılarak kloralhidrat ile temizlenen dokular steril bir lam üzerine alınarak, üzerine birkaç damla %50 lik gliserin çözeltisi damlatılmış ve lamel kapatılarak hazırlanan preparatlar incelenmiştir. Dayanıklılığın uyarıldığı yerlerde kahverengi renk değişimleri gözlenmiştir. Boyanmış dokuların 3-5 saat sonra renklerini kaybetmeleri nedeniyle, hazırlanan preparatlar, mümkün olduğunca kısa süre içerisinde, ışık mikroskobu ya da stereoskobik mikroskop kullanılarak incelenmiş ve görüntü alınmıştır (Soylu 1999). Boyama işlemleri tüm bitkiler için gerçekleştirilmiştir. 21

30 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1 CMV ile Bulaşık Bitkilerin Belirlenmesi Bu tez çalışmasında kullanılacak CMV izolatını belirlemek amacıyla Ankara ilinde survey çalışmaları yapılmış (kavun, kabak, bal kabağı, salatalık bitkileri test edilmiş), sonuçta Kazan ilçesinde yetiştirilen kavunlardan şiddetli hastalık belirtisi gösteren ve DAS ELISA ile yalnızca CMV enfeksiyonunun bulunduğu bir kavun bitkisi (belirtilerinin şiddetli ve ELISA absorbans değerinin en yüksek olması sebebiyle) izolat kaynağı olarak kullanılmıştır. Elisa testi sonucunda bitkilerdeki saptanan virüsler ve sayıları aşağıda belirtilmiştir. Çizelge 4.1 ELISA testi sonuçları Testlenen Bitki Türü Saptanan Virüs/Virüsler Enfekteli Bitki Sayısı Kavun CMV 17 ZYMV 5 SqMV 3 WMV 0 PRSV 0 CMV+ZYMV 6 ZYMV+SqMV 2 Kabak ZYMV 10 CMV 4 ZYMV+CMV 2 Salatalık CMV 1 Toplam Dayanıklılığın Uyarılması Çalışmaları Bitki aktivatörlerinin enfeksiyon oranına etkileri Kontrol (+) olarak kullanılan bitkiler üzerinde ilk simptomlar mekanik inokulasyondan 7 gün sonra gözlenmiştir. Bu belirtiler yapraklarda mozaik ve damarlar arasında kabarcıklaşma şeklindedir. Kontrol (+) bitkileri ve Aktivatör uygulandıktan 72 ve 96 22

31 saat sonra virüsle inoküle edilen bitkilerdeki enfeksiyon oranı ve yüzdeleri Çizelge de verilmiştir. Yapılan istatistiksel analizler kontrol örnekleri ile deneme bitkileri arasındaki enfeksiyon yüzdeleri arasındaki farklılığın önemli olmadığını ortaya koymuştur. Yani, belirtiler gecikse de sonuçta tüm aktivatör uygulamalarında CMV belirtileri görülmüştür. Çizelge 4.2 Actigard uygulanan bitkilerde mekanik inokulasyon sonucu simptom gösteren bitki oranı Doz A 1 A 2 A 3 K 0 Simptom Gösteren Bitki Sayısı ve Zaman Yüzdesi* 72 8 bitki % 80 A 96 7 bitki % 70 AB bitki % 100 A 96 7 bitki % 70 AB 72 7 bitki % 70 AB 96 7 bitki % 70 AB 72 9 bitki % 90 A bitki % 100 A *Tukey (P=0.05) testine göre aynı harfler alan ortalamalar arasındaki fark istatistiksel olarak önemsizdir. Çizelge 4.3 ISR-2000 uygulanan bitkilerde mekanik inokulasyon sonucu simptom gösteren bitki oranı Doz Zaman Simptom gösteren bitki sayısı ve yüzdesi* I bitki % 70 AB bitki % 100 A 72 7 bitki % 70 AB I bitki % 70 AB 72 8 bitki % 80 A I bitki % 70 AB 72 9 bitki % 90 A K bitki % 100 A *Tukey (P=0.05) testine göre aynı harfler alan ortalamalar arasındaki fark istatistiksel olarak önemsizdir. 23

32 4.3 İstatistiksel Analizler (Actigard ) Actigard ın simptom çıkış süresi üzerinde etkisi Yapılan Tukey testi sonucunda Actigard ın 72 saatlik uygulamalarında başta Doz 1 olmak üzere, tüm dozlar simptom çıkışı üzerinde etkili olmuş ve önemli bulunmuştur. 96 saatlik uygulamalarda ise Doz 2 ve Doz 3 simptom çıkışını geciktirmiştir. Ancak Doz 1 in 96 saatlik uygulamasının etkili olmadığı görülmüştür. Çizelge 4.4 Actigard ın farklı doz ve uygulama zamanlarının simptom çıkış süresi üzerine etkileri Doz 72 Saat Ort. Simptom Çıkış Süresi (gün)* 96 Saat Ort. Simptom Çıkış Süresi (gün)* A ± 1.58 A ± 1.8 CD A ± 2.62 B ± 0.32 BC A ± 0.32 B ± 0.6 BC K ± 0.4 D ± 2.4 CD *Tukey (P=0.05) testine göre aynı harfler alan ortalamalar arasındaki fark istatistiksel olarak önemsizdir Actigard ın bitki boyu üzerinde etkisi Actigard aktivatörünün, bitki boyu üzerine etkileri aşağıda verilmiştir. Kullanılan dozlardaki Actigard ın, bitki boyu üzerine etkisi Tukey testine göre belirlenmiştir. Yapılan testlerde, varyasyonların çok geniş bir skala oluşturmasından dolayı, ortalamalar arasındaki farklar çok fazla olsa bile, Tukey test sonuçlarına göre hepsi aynı istatistiki grup içerisinde yer almaktadır. Bu da bu testte ortaya çıkan sonuçların istatistiki olarak anlamlı olmadığını göstermektedir (Çizelge 4.5). 24

33 Çizelge 4.5 Actigard ın farklı doz ve uygulama zamanlarının bitki boyu üzerinde etkileri Doz 72 Saat Ort. Bitki Boyu (cm)* 96 Saat Ort. Bitki Boyu (cm)* A ± A ± A A ± A ± A A ± A ± 4.52 A K ± 9.73 A ± A *Tukey (P=0.05) testine göre aynı harfler alan ortalamalar arasındaki fark istatistiksel olarak önemsizdir Actigard ın yaprak genişliği üzerinde etkisi Analiz sonuçlarına bakıldığında genel itibarı ile Actigard ın yaprak genişliğini istatistiksel olarak etkilemediğini görmekteyiz. Bu denemede Actigard, 72 ve 96 saatlik uygulamalarının tamamında yaprak genişliği üzerinde istatistiksel olarak çok büyük bir etki yapmamış ve bütün dozlar ve kontroller aynı istatistiki grup içinde yer almıştır. Bu denemeden Actigard ın bizim kullandığımız dozlar ve saat aralıklarında, yaprak genişliği üzerinde büyük etkileri olmadığı gözükmektedir (Çizelge 4.6). Çizelge 4.6 Actigard ın farklı doz ve uygulama zamanlarının yaprak genişliği üzerinde etkileri Doz 72 Saat Ort. Yaprak Genişliği (cm)* 96 Saat Ort. Yaprak Genişliği (cm)* A ± 0.95 AB ± 0.67 B A ± 0.71 B ± 0.92 AB A ± 0.67 B ± 0.45 B K ± 1.49 A ± 0.67 AB *Tukey (P=0.05) testine göre aynı harfler alan ortalamalar arasındaki fark istatistiksel olarak önemsizdir. 25

34 4.4 İstatistiksel Analizler (ISR-2000 ) ISR-2000 in simptom çıkışı üzerinde etkisi ISR 2000 in simptom çıkış süresi üzerine Tukey test sonuçları aşağıda ayrıntılı olarak incelenmiştir. Bu denemede ISR-2000 in 72 saatlik uygulamalarında yalnız Doz 3 istatistiksel olarak simptom çıkış süresini geciktirmiş ve önemli bulunmuştur. Doz 1 ve Doz 2 nin ise etkisi olmamıştır. 96 saatlik uygulamalarda ise yalnızca Doz 1 istatistiksel olarak simptom çıkış süresini geciktirmiş ve önemli bulunmuştur. Doz 2 ve Doz 3 ün ise etkisi olmamıştır (Çizelge 4.7). Çizelge 4.7 ISR-2000 in farklı doz ve uygulama zamanlarının simptom çıkış süresi üzerinde etkileri Doz 72 Saat Ort. Simptom Çıkış Süresi (gün)* 96 Saat Ort. Simptom Çıkış Süresi (gün)* I ± 0.49 C ± 1.96 AB I ± 2 BC ± 0.2 C I ± 2.94 A ± 0.37 C K ± 0.4 C ± 2.04 BC *Tukey (P=0.05) testine göre aynı harfler alan ortalamalar arasındaki fark istatistiksel olarak önemsizdir ISR-2000 in bitki boyu üzerinde etkisi ISR-2000 aktivatörünün, bitki boyu üzerine etkileri aşağıda verilmiştir. Kullanılan dozlardaki ISR-2000 in, bitki boyu üzerine etkisi Tukey testine göre belirlenmiştir. 26

35 Yapılan testlerde, Actigard da olduğu gibi varyasyonlar çok geniş bir skala oluşturmaktadır. Dolayısıyla ortalamalar arasındaki farklar çok fazla olsa bile, Tukey test sonuçlarına göre hepsi aynı istatistiki grup içerisinde yer almaktadır. Bu da bu testte ortaya çıkan sonuçların istatistiki olarak anlamlı olmadığını göstermektedir (Çizelge 4.8). Çizelge 4.8 ISR-2000 in farklı doz ve uygulama zamanlarının bitki boyu üzerinde etkileri Doz 72 Saat Ort. Bitki Boyu (cm)* 96 Saat Ort. Bitki Boyu (cm)* I ± A ± A I ± A ± A I ± A ± 5.3 A K ± 9.73 A ± A *Tukey (P=0.05) testine göre aynı harfler alan ortalamalar arasındaki fark istatistiksel olarak önemsizdir ISR-2000 in yaprak genişliği üzerinde etkisi Bu analize baktığımızda, ISR-2000 in yaprak genişliğini etkilemediğini görmekteyiz. Analiz detayları aşağıdadır. Bu denemede ISR-2000, 72 ve 96 saatlik uygulamalarının tamamında yaprak genişliği üzerinde istatistiksel olarak çok büyük bir etki yapmamış ve bütün dozlar ve kontroller aynı istatistiki grup içinde yer almıştır. Bu denemeden ISR-2000 in bizim kullandığımız dozlar ve saat aralığında yaprak genişliği üzerinde çok büyük etkileri olmadığı görülmektedir (Çizelge 4.9). 27

36 Çizelge 4.9 ISR-2000 in farklı doz ve uygulama zamanlarının yaprak genişliği üzerinde etkileri Doz 72 Saat Ort. Yaprak Genişliği (cm)* 96 Saat Ort. Yaprak Genişliği (cm)* I ± 0.87 AB ± 0.66 A I ± 0.78 AB ± 0.69 AB I ± 0.71 AB ± 0.37 B K ± 1.49 A 5.12 ± 0.67 AB *Tukey (P=0.05) testine göre aynı harfler alan ortalamalar arasındaki fark istatistiksel olarak önemsizdir. 28

37 5. HİSTOKİMYASAL BOYAMALARLA LİGNİN SENTEZİNİN BELİRLENMESİ Histokimyasal boyamalar Actigard ve ISR 2000 uygulanan bitkilerde 72 ve 96 saat sonra yapılan CMV inokulasyonunun SKD mekanizmasını uyarıp uyarmadığı ve uyarıyorsa hangi zamanın en uygun olduğunun belirlenmesi için yapılmıştır. Bu çalışmalar sonunda bitki aktivatörü uygulanan bitkilerde lignifikasyonun yoğunluğunda ve dağılımında farklılıklar gözlenmiştir. Ligninleşme boyanma yoğunluğu temel alınarak (açık renkten koyu renge doğru gidildikçe ligninleşme miktarı artmaktadır) her iki aktivatör uygulamasında da sırasıyla en çok gövde, kök ve yaprakta belirlenmiştir. Lignin boyanmasında Phloroglucinol HCl ile reaksiyona girmekte ve lignin oluşum noktalarını sabitleyerek koyu turuncu veya pembemsi bir renk almasını sağlamaktadır. Aktivatör uygulamasından 72 ve 96 saat sonra virüs inokulasyonu yapılan bitkilerin boyama sonuçlarına bakıldığı zaman ISR-2000 in Actigard a göre çok daha fazla ligninleşmeye yol açtığı görülmüştür (Şekil ) Actigard uygulaması yapılan bitkiler üzerinde uygulanan lignin boyamasında boyanma bakımından dozlar ve zaman bakımından hiçbir fark görülmemiştir. Ayrıca Kontrol 72 saatle, Actigard 72 saatlik uygulama yapılan bitkiler arasında da fark görülmemiştir. Ancak 96 saatlik uygulamalar göz önüne alındığında Kontrol 96 saatlik uygulamanın ISR-2000 ve Actigard ın 96 saatlik uygulamalarından daha az ligninleşmeye sebep olduğunu görmekteyiz. Bununla birlikte ISR-2000 uygulanan bitkilerle yapılan boyama çalışmalarında 72 saatte, Doz 2 de boyanmanın en belirgin olduğu ve bunu Doz 3 ve Doz 1 in izlediği tespit edilmiştir. 29

38 A 1 2 B 1 2 Şekil 5.1.a. ISR-2000 uygulanmış bitki örneklerinde lignifikasyon. (Gövde 1, Kök 2) b. Actigard uygulanmış bitki örneklerinde lignifikasyon. (Gövde 1, Kök 2) 30

39 A B Şekil 5.2.a. ISR-2000 uygulanmış bitki örneklerinde lignifikasyon. (Yaprak) b. Actigard uygulanmış bitki örneklerinde lignifikasyon. (Yaprak) 31

40 6. HİSTOKİMYASAL BOYAMALARLA H 2 O 2 SENTEZİNİN BELİRLENMESİ Saksı denemeleri sonucunda dayanıklılığın uyarıldığı bitkilerden alınan kök, gövde ve yaprak dokuları ile yapılan bu çalışmada, Actigard ve ISR-2000 uygulamasından sonra sırasıyla 72 ve 96 saat sonra virüs inokulasyonunun, SKD mekanizmasının uyarılması için uygun zaman aralığı olduğu tespit edilmiş ve dayanıklılığın en yüksek seviyede uyarıldığı bu bitkilerden alınan dokularda H 2 O 2 birikimi belirlenmiştir. H 2 O 2 sentezinin belirlenmesinde; H 2 O 2 DAB ile reaksiyona girmiş ve peroksidaz varlığında kırmızımsı ve kahverengi renge dönüşmüştür. Bitki aktivatörü uygulanan bitkilerde, H 2 O 2 yoğunluğunda ve dağılımında farklılıklar gözlemlenmiştir. H 2 O 2 birikimi bitkinin dokusunda en çok yapraklarda ve köklerde gözlemlenmiştir. Yapılan 42 örnek boyamasında yaprak örnekleri ve kök örneklerinin çoğunda H 2 O 2 birikimi gözlenmiş ve çok az da gövdede bu birikim tespit edilmiştir. Yapılan tüm aktivatör çalışmalarında, 96 saatlik uygulamalar sonucunda, 72 saatlik uygulamalara göre daha fazla H 2 O 2 birikimi tespit edilmiştir, bununla birlikte ISR bitki aktivatörü uygulaması sonucu, Actigard uygulamalarına göre daha fazla birikim elde edilmiştir (Şekil 6.1). Actigard bitki aktivatörü uygulamaları sonucunda Doz 2 de Doz 3 den fazla, Doz 3 te de Doz 1 den fazla H 2 O 2 birikimi gözlenmiştir. Ancak, Doz 2 ile Doz 3 arasındaki fark oldukça azdır. Bununla birlikte H 2 O 2 birikiminin kontrol bitkilerindeki varlığı Actigard uygulanmış bitkilerden alınan örneklerle hemen hemen aynıdır. Birikim gövdede iletim demetlerinde ve daha az miktarda iletim demetlerinin etrafında, yapraklarda ise damar aralarında, çok az da damarlarda gözükmüştür. ISR-2000 bitki aktivatörü uygulamaları sonucunda ise, Doz 2 ve Doz 3 birbirine eşit Doz 1 de ise daha az H 2 O 2 birikimi gözlemlenmiştir. Konrol bitkilerindeki birikim ise Doz 2 ve Doz 3 de olan birikim kadardır. Birikim Actigard da olduğu gibi, gövdede iletim demetlerinde ve daha az miktarda iletim demetlerinin etrafında, yapraklarda ise damar aralarında, çok az da damarlarda gözükmüştür. 32