T.C. KOCAELİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "T.C. KOCAELİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI"

Nuray Ayşe Ersöz
8 yıl önce
İzleme sayısı:

1 T.C. KOCAELİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI KLON VE NORMAL SIĞIR EMBRİYO PLASENTALARINDA İNSÜLİN BENZERİ BÜYÜME FAKTÖR-I (IGF-I), VASKÜLER ENDOTELYAL BÜYÜME FAKTÖR (VEGF) VE NÖRONAL HÜCRE ADHEZYON MOLEKÜL (N-CAM) EKSPRESYONUN İMMÜNOSİTOKİMYASAL VE MOLEKÜLER TEKNİKLERLE İNCELENMESİ Fatih KARAKAYA Kocaeli Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Yönetmeliğinin Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Programı İçin Öngördüğü YÜKSEK LİSANS TEZİ Olarak Hazırlanmıştır KOCAELİ 2013

MOLEKÜL (N-CAM) EKSPRESYONUN İMMÜNOSİTOKİMYASAL VE MOLEKÜLER TEKNİKLERLE İNCELENMESİ Fatih KARAKAYA Kocaeli Üniversitesi Sağlık

2 T.C. KOCAELİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI KLON VE NORMAL SIĞIR EMBRİYO PLASENTALARINDA İNSÜLİN BENZERİ BÜYÜME FAKTÖR-I (IGF-I), VASKÜLER ENDOTELYAL BÜYÜME FAKTÖR (VEGF) VE NÖRONAL HÜCRE ADHEZYON MOLEKÜL (N-CAM) EKSPRESYONUN İMMÜNOSİTOKİMYASAL VE MOLEKÜLER TEKNİKLERLE İNCELENMESİ Fatih KARAKAYA Kocaeli Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Yönetmeliğinin Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Programı İçin Öngördüğü YÜKSEK LİSANS TEZİ Olarak Hazırlanmıştır Tez Danışmanı: Prof. Dr. Hakkı DALÇIK 2. Tez Danışmanı: Prof. Dr. Sezen ARAT Bu çalışma Kocaeli Üniversitesi (Proje No: 2010 / 84) ve TÜBİTAK-KAMAG-106G005 projesi kapsamında desteklenmiştir. KOCAELİ

Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Yönetmeliğinin Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Programı İçin Öngördüğü YÜKSEK LİSANS TEZİ Olarak Hazırlanmıştır Tez Danışmanı: Prof.

3 ÖZET Klon ve Normal Sığır Embriyo Plasentalarında İnsülin Benzeri Büyüme Faktör-I (IGF- I), Vasküler Endotelyal Büyüme Faktör (VEGF) ve Nöronal Hücre Adhezyon Molekül (N-CAM) Ekspresyonun İmmunositokimyasal ve Moleküler Tekniklerle İncelenmesi Bu çalışma kapsamında Anadolu Yerli Sığır Irklarının Klonlanması projesi kapsamında canlı doğumla sonuçlanan klon örneklerin doğumlarından sonra elde edilen klon plasentalar ve kontrol grubu olarak da normal doğum yapmış olan sığırların plasentaları moleküler ve immunositokimyasal teknikler kullanılarak incelenmiştir. İnceleme işlemi klon sığırlarda görülen bazı anomalilerin ve plasentada gerçekleşen yapısal ve moleküler bozuklukların normal plasenta ile karşılaştırılarak ilişkilendirilmesi amaçlanmıştır. Klonlama çalışmalarında Somatik Hücre Nüklear Transfer Yöntemi (SCNT) kullanılmıştır. Klonlamada dönor hücre kaynağı olarak, Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Çiftliği nde bulunan erkek boz boğa ve Yalova daki bir dişi bireyden örnekler alınmıştır. Kontrol grubu olarak ise Tekirdağ Muratlı da bulunan Aksa Çiftliği nde iki normal doğum plasenta örneği alınmıştır. Boz ırkına ait kıkırdak hücresinden bir, fibroblast hücresinden bir ve granüloza hücresinden üç adet sağlıklı klon elde edilmiştir. Toplamda canlı doğum klon sayısı beş olmasına karşın bir taşıyıcı annenin ikiz gebelik meydana getirmesi sebebiyle toplamdaki klon plasenta örneği sayısı dörttür. Buna karşılık olarak iki normal plasenta örneklenmiştir. Her bir örnek plasentanın maternal, fetal ve total olmak üzere üç kısmı örneklenmiştir. Örneklenen her bölge histolojik incelemeler için %4 lük PFA içinde fikse edilmiş, moleküler yöntem için (RNA izolasyonu) ise -20ºC de örnekler transfer edilmiş, izolasyon aşamasına kadar ise - 80ºC de muhafaza edilmişlerdir. Fikse edilmiş materyallerin doku takipleri gerçekleştirilmiş ve parafin bloklarda kesit alınana kadar saklanmıştır. Daha sonra mikrotom ile 5µm kalınlığında alınan kesitler öncelikle hematoksilen eosin boyama protokolüne göre boyanmış, temel mikro-anatomik incelemeleri gerçekleştirilmiştir. Aynı preparatlar daha sonra immunositokimyasal olarak incelenmiştir. Bu inceleme için, suda bekletilen preparatlara proteaz enzimi 30 dk. boyunca uygulanmıştır. Ardından, non-immun serumda 15 dk. bekletilmiş ve takibinde buffer ile sulandırılmış primer antikorlarda (IGF-I, VEGF, NCAM, Abcam) 2 saat oda ısısında inkübe edilmişlerdir. Primer antikordan sonra yıkama yapılmış ve biyotinle işaretli sekonder antikorda bekletilerek ardından streptavidin-peroxidase ile muamele edilmiştir. Yıkamaların ardından DAB ile muamale edilerek boyama işlemi tamamlanmıştır. 3

sonra elde edilen klon plasentalar ve kontrol grubu olarak da normal doğum yapmış olan sığırların plasentaları moleküler ve immunositokimyasal teknikler kullanılarak incelenmiştir.

4 RNA izolasyonu için Trizol kullanılmış ve manuel olarak çalışılmıştır. Örnek alınmış dokular steril olarak yaklaşık mg. lık parçalar halinde steril temiz bir havan içinde sıvı azotla muamele edilmek suretiyle fiziksel olarak parçalanmıştır. Fiziksel parçalanmayı takiben Trizol Reagent ilave edilmiş ve pipetaj ile doku ile trizolün karışması sağlanmıştır. Santifüjleri takiben RNA izole edilmiş, kalite kontrolleri ve NanoDrop okumaları gerçekleştirilmiş, daha sonra cdna (Fermentas) Kit kullanılarak, cdna sentezi gerçekleştirilmiştir. InRa ve Ensemble DNA veri bankalarından yararlanılarak tasarlanan Primer ler IDT firmasına sipariş verilmiş; IGF-I, VEGF ve NCAM için alınmış olan primerler ile PCR (PZR) yapılmıştır. PCR ürünleri jele aktarılmış, jel görüntü sonuçları elde edilmiştir. Daha ileri analiz yapabilmek için RT-PCR işlemi, normal PCR için kullanılan primerler kullanılarak yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar amplifiye olma miktarlarına göre saptanmıştır. Her iki analiz sonucunda da elde edilen bulgulara göre, klon plasenta örnekleri ve normal plasenta örnekleri arasında anlamlı bir fark bulunamamıştır. 4

Fiziksel parçalanmayı takiben Trizol Reagent ilave edilmiş ve pipetaj ile doku ile trizolün karışması sağlanmıştır.

5 ABSTRACT Evaulation of Expression of Insulin-like Growth Factor-I (IGF-I), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and Neuronal Cell Adhesion Molecule (N-CAM) by Immunositochemical and Molecular Technics "Cloning of the Anatolian Domestic Bull" project, which resulted in the birth of live specimens of plasentalar and the resulting clone after clone since birth as a normal control group born of bovine plasentaları are explored using molecular and immunositokimyasal techniques. Some anomalies seen in cattle clones and review process are realized compared with the normal structural and molecular disorders associated with placenta. In somatic cell cloning of additional nuclear Transfer method (SCNT). Donor as the source of the cells, located in Uludag University Veterinary Faculty Farm male gray bull and a female individuals samples taken in Yalova. The control group is located in Tekirdag Muratli was taken from two normal placenta instance in the Aksa Farm. A cartilage cell, fibroblast cell belonging gray bull and three healthy cell clone was obtained from granulosa cells. Although the total number of live births is a clone of the mother's twin pregnancy occurred five accomplished due to the carrier the whole clone number of instances of the placenta is four. In turn an example of two normal placenta. Each instance of the placenta, maternal, foetal and a total of three. histological examinations for each sampled region 4% PFA in has been fixed, the molecular method (RNA) is -20ºC to the examples that have been transferred, the insulation is kept at-80 C until they are ready to be used. They have been fixed in paraffin blocks section of tissue is stored until the proceedings. Then the microtome with 5 µm thickness according to the sections of painted, painting primarily hematoxylin eosin protocol based on micro-anatomical review was carried out. The same drugs then immunositochemical. For this review, held in water protease enzyme 30 min. has been applied throughout the preparates. Then, non-immune serum diluted with buffer and 15 min. buffer on primary anticores (IGF-I, VEGF, NCAM, Abcam) were incubated at room temperature for 2 hours. Primary anticores applied and after washing streptavidin-peroxidase is then marked with the secondary has been waiting and then DAB applied and dyeing process has been completed. Trisol RNA isolation for used manually. Sample parts as sterile for about mg in liquid nitrogen with a clean sterile porcelain table into pieces to be treated, by physically 5

of bovine plasentaları are explored using molecular and immunositokimyasal techniques.

6 perished. Trizol Reagent has been added to the following physical fragmentation and mixing of texture with the trisol by pipets. Centrifuged and RNA isolated, quality controls and has been read, then the NanoDrop cdna (Fermentas) was carried out using cdna synthesis Kit. Making use of DNA data banks, InRa and Ensemble designed Primer, IDT firm order can be granted; IGF-I, VEGF, and NCAM is taken with primers for PCR. PCR products were obtained, transferred to a gel gel image results. For further analysis, RT-PCR process has been used with normal PCR primers. Results were obtained by amplifiying ratios. By the whole results, examples of normal placenta and the cloned ones were no siginificant difference between them. 6

Making use of DNA data banks, InRa and Ensemble designed Primer, IDT firm order can be granted; IGF-I, VEGF, and NCAM is taken with primers for PCR.

Benzer belgeler

ISSN: Yıl /Year: 2017 Cilt(Sayı)/Vol.(Issue): 1(Özel) Sayfa/Page: Araştırma Makalesi Research Article

ISSN: Yıl /Year: 2017 Cilt(Sayı)/Vol.(Issue): 1(Özel) Sayfa/Page: Araştırma Makalesi Research Article VII. Bahçe Ürünlerinde Muhafaza ve Pazarlama Sempozyumu, 04-07 Ekim 2016 ISSN: 2148-0036 Yıl /Year: 2017 Cilt(Sayı)/Vol.(Issue): 1(Özel) Sayfa/Page: 173-180 Araştırma Makalesi Research Article Akdeniz