Ahi Evran Universitesi Tıp Fakültesi Eğitim Araştırma Hastanesi Nefroloji Bilim Dalı/Kırşehir 2

Transkript

1 Aydın Güçlü 1, Haydar Ali Erken 2, Gülten Erken 2, Yavuz Dodurga 3, Arzu Yay 4, Özge Özçoban 4, Hasan Şimşek 5, Aydın Akçılar 6, Fatma Emel Koçak 7 1 Ahi Evran Universitesi Tıp Fakültesi Eğitim Araştırma Hastanesi Nefroloji Bilim Dalı/Kırşehir 2 Balıkesir Üniversitesi Tıp Fakültesi Fizyoloji Ana Bilim Dalı/Balıkesir 3 Pamukkale Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı/Denizli 4 Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Ana Bilim Dalı/Kayseri 5 Dumlupınar Üniversitesi Tıp Fakültesi Fizyoloji Ana Bilim Dalı/Kütahya 6 Dumlupınar Üniversitesi Tıp Fakültesi Deneysel Araştırma Birimi/Kütahya 7 Dumlupınar Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Ana Bilim Dalı/Kütahya

2 Diyabetik nefropati SDBY nin en önemli sebeplerindendir Son zamanlarda diyabetik nefropatinin gelişiminde metabolik ve hemodinamik değişikliklerin ana faktör olduğu görüşünün yerine inflamasyon, hipoksi, ve apoptosisi de içine alan çok sayıda faktörün etkili olduğu görüşü ağırlık kazanmaktadır.

3 Apoptosis programlanmış hücre ölümü olarak tanımlanır. Apoptosis her ne kadar çok hücreli organizmalar için doğal bir olay olsa da artmış apoptosis diyabetik komplikasyonların gelişiminde hayati rol oynar. Hipergliseminin çeşitli dokularda apoptosisi indüklediği gösterilmiştir. Apoptosis diyebetik mikrovasküler ve makrovasküler komplikasyonların gelişiminde hayati rol oynar. Su J, Zhou L, Kong X, Yang X, Xiang X, Zhang Y, Li X, Sun L: Endoplasmic reticulum is at the crossroads of autophagy, inflammation, and apoptosis signaling pathways and participates in the pathogenesis of diabetes mellitus. J Diabetes Res DOI: / Romeo G, Liu WL, Asnaghi V et al. Activation of nuclear factor-kappa B induced by diabetes and high glucose regulates a proapoptotic program in retinal pericytes. Diabetes 2002; 51:

4 Kaspas aracılı apoptosisin diyabetik nefropati patogenezinde önemli bir mekanizma olduğu gösterilmiştir. Apoptosis çeşitli regülatuvar genlerle düzenlenmektedir. TNFα ve HIF-1α apoptosisi regüle ettiği gösterilmiştir. Kumar ve arkadaşları HIF-1α düzeyinin diyabetik nefropatide interstisiyel fibrosisis ve serum kreatinin değeri ile ilişkili olduğunu göstermişlerdir. Tang ve arkadaşları interstisiyel fibrosisle korele olarak HIF-1α düzeyinin arttığını göstermişlerdir. TNFα nın diyabetik nefropatinin patogenezinde önemli rol oynadığı gösterilmiştir.

5 Ozon tedavisinin apoptosis üzerine etkisi bazı çalışmalarda gösterilmiştir. Fuccio ve arkadaşları ozon tedavisinin orbitafrontal kortekste caspas-1 gen ekspresyonunu inhibe ettiğini göstermişlerdir. Haj ve arkadaşları ozon tedavisinin intestinal iskemi reperfüzyon modelinde apoptosisi inhibe ettiğini göstermişlerdir. Fuccio C, Luongo C, Capodanno P, Giordano C, Scafuro MA, Siniscalco D, Lettieri B, Rossi F, Maione S, Berrino L: A single subcutaneous injection of ozone prevents allodynia and decreases the over-expression of pro-inflammatory caspases in the orbito-frontal cortex of neuropathic mice. Eur J Pharmacol. 2009; 28; 603: Haj B, Sukhotnik I, Shaoul R, Pollak Y, Coran AG, Bitterman A, Matter I: Effect of ozone on intestinal recovery following intestinal ischemia-reperfusion injury in a rat. Pediatr Surg Int 2014; 30 :

6 Ozon tedavisinin diyabetik nefropatide oksidatif stres üzerine olumlu etkileri gösterilmiştir, ancak etki mekanizması hakkında yeterli bilgi yoktur. Bizim amacımız ozon tedavisinin diyabetik nefropatide caspase 1, 3, 9, ve apoptosisle ilişkili genlerden TNFα and HIF-1α gen ekspresyonu üzerine etkisini araştırmaktı

7 Çalışma Dizaynı: 300 gr ağırlığında 42 erkek Sprague-Dawley cinsi rat kullanıldı. Ratlar randomize olarak 6 gruba ayrıldı. (n=7): Kontrol (C), Ozone (O), Diabetik (D), ozone ile tedavi edilmiş diabetik (DO), insulin ile tedavi edilmiş diabetik (DI), ve ozone ve insulin ile tedavi edilmiş diyabetik (DOI).

8 Diyabet tek doz STZ (Sigma-Aldrich Co., Taufkirchen, Germany) solution (60 mg/kg) ile indüklendi. STZ enjeksiyonundan 48 saat sonra kuyruk veninden glukometre aracılığıyla kan şekeri ölçüldü (Accu-Chek; Roche Diagnostics Co., Mannheim, Germany). Kan şekeri 300 üzerinde olanlar diyabetik olarak sınıflandırıldı

9 Ozon ozon jenaratörü ile elde edildi (Dr. J. Hänsler OZONOSAN GmbH, Iffezheim, Germany). 1.1 mg/kg i.p., 6 hafta boyunca günde 1 kez 1 dakika süresi içerisinde enjekte edildi( O, DO, ve DOI grouplarına) Bu dozaj ve daha önce yapılmış olan çalışmalardan alınmıştır. Morsy MD, Hassan WN, Zalat SI: Improvement of renal oxidative stress markers after ozone administration in diabetic nephropathy in rats Diabetology & Metabolic Syndrome DOI: / León OS 1, Menéndez S, Merino N, Castillo R, Sam S, Pérez L, Cruz E, Bocci V: Ozone oxidative preconditioning: a protection against cellular damage by free radicals. Mediators Inflamm 1998; 7:

10 Bu doz ozonun toksisite oluşturmadan antioksidan özelliği gösterdiği gösterilmiştir. Insulin (3 IU) (Novo Nordisk Co., Bagsvaerd, Denmark) injekte edildi (DI and DOI groups) (i.p. 1 ml sf içerisinde, 6 hafta boyunca her gün). Ek olarak 1 ml sf C,O,D,DO gruplarına injekte edildi.

11 Ratlar ketamine/xylazine (90 and 10 mg/kg, respectively, i.p.) İle anastetize edildi. Böbrek dokuları genetik ve histolojik analiz için çıkarıldı. RNA izolasyonu ve apoptosisle ilişkili genlerin analizi Böbrek trizol solusyonunda küçük parçalara ayrıldı.

12 Total RNA yı dokudan izole etmek için RNA isolation reagent (Tri reagent) prosedürü (Sigma, St. Louis, MO, USA) kullanıldı. Bütün genlerin RT-PCR analizi için StepOne Plus RT- PCR kullanıldı. Gen ekspresyon analizi için Rat primerleri kullanıldı (Tablo-1).

13 Tablo 1: one-step RT-PCR için kullanılan primerler

14 Histolojik Değerlendirme: Periodic acid- Schiff (PAS) ile epitheliyal hücreler, proksimal tubul, bazal lamina kalınlığı boyandı. Olympus BX51 microscope (Olympus BX-51, Japan) kullanılarak dokular incelendi.

15 Tablo-2: Apoptosisle ilişkili gen ekspresyonları: kontrol grubuna göre karşılaştırılması p< 0, 05 Group 1: Diabet+ ozone+ insulin Group 2: Diabet +insulin Group 3: diabet +ozone Group 4: diabet Group 5: ozone HIF-1α: hypoxia inducible factor alfa TNF-α: Tumor necrosis factor alpha

16 Tablo-3: diyabet + ozon tedavisi verilen grubun gen ekspresyonlaının diyabetik ratlarla karşılaştırılması p< 0, 05

17 Tablo-4: Diabet+insulin+ozone tedavisi grubunun diyabet+ozon tedavisi grubuna göre apoptosis gen ekspresyonlrının karşılaştırılması p< 0, 05

18 Fig 1 Control A Ozone RC PC PC DC RC PC Diabet B DC PC DC * Diabet+Ozone * DC RC RC * RC * * RC RC DC DC PC * PC DC PC RC PC C D

19 Fig 1 Diabet+Insulin * * RC PC DC Diabet+Insulin+O zone PC PC DC RC DC E PC F

20 Diyabetik rat böbreklerinde inflamatuvar hücreler, dejenere renal korpuskül, bazal membranda kalınlaşma, proksimal kıvrımlı tubulde hiperselülarite ve ödem görüldü. Ozon tedavisi verilen grupta böbrek yapısı normaldi. Ozon tedavisi verilen grupta açık bir şekilde histopatolojik yapıda düzelme görüldü. İnsülin ve diyabet grubunda hitopatolojik yapıda düzelme görüldü. STZ+ Insulin+ Ozone tedavisi grubunda böbrek dokusunda belirgin düzelme görüldü.

21 Sonuç: Biz caspase 1, 3, 9,TNFα ve HIF-1α gen ekspresyon düzeyinin diyebetik grupta arttğığını gösterdik. Biz çalışmamızda ilk defa ozon tedavisinin diyabetik nefropatide caspase 1, 3, 9, HIF-1α and TNF-α gen ekspresyon düzeylerini azalttığını ve ozon tedavsi ile diyebetik nefropatide histopatolojik düzeyde düzelme olduğunu gösterdik. Liadis N, Murakami K, Eweida M, Elford AR, Sheu L, Gaisano HY, Hakem R, Ohashi PS, Woo M: Caspase-3-Dependent β-cell Apoptosis in the Initiation of Autoimmune Diabetes Mellitus Mol Cell Bioe 2005 ; 25: Ho FM, Liu SH, Liau CS, Huang PJ, Lin-Shiau SY. High glucose-induced apoptosis in human endothelial cells is mediated by sequential activations of c-jun NH(2)-terminal kinase and caspase-3. Circulation 2000; 101: Koenen TB, Stienstra R, van Tits LJ, de Graaf J, Stalenhoef AF, Joosten LA, Tack CJ, Netea MG: Hyperglycemia activates caspase-1 and TXNIP-mediated IL-1b transcription in human adipose tissue. Diabetes 2011; 60: Güçlü A, Yonguç N, Dodurga Y, Gündoğdu G, Güçlü Z, Yonguç T, Adıgüzel E, Turkmen K: The effects of grape seed on apoptosis-related gene expression and oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rats. Ren Fail 2015; 37:

22 Biz diyabet + insülin tedavisi verilen grupta diyabetik gruba göre caspase 1, 9, ve TNFα gen ekspresyon düzeylerinde belirgin gerileme olduğunu gösterdik. Diabet+insulin+ozone tedavisi grubunun diyabet+ozon tedavisi grubuna göre apoptosis gen ekspresyonlrının karştırdığımızda caspase 1, 9,TNFα ve HIF-1α düzeylerinde belirgin gerileme olduğunu gösterdik

23

24 Bu çalışmanın diyabetik nefropatide ozon tedavisinin etkisi üzerine ilerde yapılacak olan çalışmalara ışık tutacağına inanıyoruz.