Sekonder Hemofagositik Lenfohistiyositoz li çocukların plazma mikrorna profillemesi

Transkript

1 Sekonder Hemofagositik Lenfohistiyositoz li çocukların plazma mikrorna profillemesi Ali Bay, Enes Coşkun, Serdar Öztuzcu, Fatih Yilmaz, Sercan Ergün, Elif Aktekin Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Hematoloji Kliniği

2 Amaç Bu çalışmada sekonder HLH li hastaların ve sağlıklı kontrollerin plazmalarında 379 mirna nın ekspresyonu araştırıldı. Hasta grubu ile sağlıklı çocukların plazma mirna ekspresyon seviyelerini kıyaslarak çocukluk çağı sekonder HHL si için yeni bir biyomarker belirlemeyi amaçladık. Bu çalışma literatürde bu konuda yapılan ilk araştırmadır.

3 Giriş Hemofagositik lenfohistiyositoz (HLH), NK hücreleri ve sitotoksik T hücrelerinin aşırı aktivasyonu sonucunda oluşan, nadir ancak ciddi oranda ölümcül olabilen hiperinflamatuar bir hastalıktır. HLH kontrolsüz ve disfonksiyonel immun yanıtın yol açtığı bir hastalıktır. 1. Bode SF, Lehmberg K, Maul-Pavicic A, et al. Recent advances in the diagnosis and treatment of hemophagocytic lymphohistiocytosis. Arthritis Res Ther. 2012;14:213.

4 Bilinen genetik mutasyonu bulunmayan ve genetik yatkınlık düşündürmeyen HLH tanılı hastalar sekonder HLH olarak sınıflandırılırlar.

5 SEKONDER HLH İnfeksiyonlarla ilişkili (İAHS) virüsler (VAHS) bakteriler parazitler Malign hastalıklarla ilişkili (MAHS) Metabolik hastalıklarla İlaçlarla ilişkili Romatolojik hastalıklarla ilişkili (MAS) 5

6 (1) HLH ile uyumlu moleküler tanı (2) Aşağıdaki 8 tanı kriterinden en az 5 inin gösterilmesi Ateş Splenomegali Sitopeni (periferik kanda 3 seriden en az 2 sinde görülen) - Hemoglobin (< 90 g/l) - Trombosit (< /L) - Nötrofil (< /L) Hipertrigliseridemi ve/veya hipofibrinojenemi - Açlık trigliseridi 3.0 mmol/l ( 265 mg/dl) - Fibrinojen 1.5 g/l Kemik iliği, dalak ya da lenf nodlarında malignite kanıtı olmadan hemofagositozun gösterilmesi Ferritin 500µg/L Düşük NK hücre aktivitesi Tanı 2004 Kriterleri Çözünebilir CD U/mL 6

7 Mikro RNA Endojen olarak sentezlenen, kodlama yapmayan sekansa özgül biçimde hedef gen expresyonunda regülasyon yapan, nukleotid uzunluğunda tek sarmallı RNA lardır. mirna lar DNA dan uzun premirna olarak transkripte edildikten sonra Drosha RNAaz III enzimiyle daha küçük parçalara ayrılıp nukleusun dışına taşınırlar. pre- mirna ribonukleaz Dicer tarafından kesilip olgun çift sarmallı mirna elde edilir. Bu olgun mirna dan oluşan tek sarmallı mirna, RNA-induced silencing complex (RISC) e katılır.

8 mirna lar intron genlerinden kodlanırlar. RISC hedef mrna nın tranlasyon yapılmamış 3 veya 5 komplementer bölgesine bağlanıp okunma çerçeveleri ve promoter bölgeleri açar. mrna kesilmesi veya translasyonel represyon aracılığıyla mirna lar gen ekspresyonun negatif regülasyonunu veya upregülasyonunu gerçekleştirirler. Bir gen birçok mirna tarafından regüle edilebilir. 93. Bartel, D. P. (2004). MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 116, Hammond, S. M. (2005). Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Letters, 579, Okamura, K., Hagen, J. W., Duan, H., Tyler, D. M., & Lai, E. C. (2007). The mirtron pathway generates microrna-class regulatory RNAs in Drosophila. Cell, 130, Ruby, J. G., Jan, C. H., & Bartel, D. P. (2007). Intronic microrna precursors that bypass Drosha processing. Nature, 448, Gregory, R. I., Chendrimada, T. P. & Shiekhattar, R. MicroRNA biogenesis: isolation and characterization of the microprocessor complex. Methods Mol. Biol. 342, (2006). 98. Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F. & Plasterk, R. H. Substrate requirements for let 7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic Acids Res. 32, (2004). 99. Lytle, J. R., Yario, T. A. & Steitz, J. A. Target mrnas are repressed as efficiently by microrna binding sites in the 5' UTR as in the 3' UTR. Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, (2007) Lee, I. et al. New class of microrna targets containing simultaneous 5'-UTR and 3'-UTR interaction sites. Genome Res. 19, (2009) He, L. & Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat. Rev. Genet. 5, (2004) Bohnsack, M. T., Czaplinski, K. & Gorlich, D. Exportin 5 is a RanGTP-dependent dsrna-binding protein that mediates nuclear export of pre-mirnas. RNA 10, (2004) Vasudevan, S., Tong, Y. & Steitz, J. A. Switching from repression to activation: micrornas can up-regulate translation. Science 318, (2007).

9 Cortez, M. A. et al. MicroRNAs in body fluids the mix of hormones and biomarkers Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, (2011); published online 7 June 2011; doi: /nrclinonc

10 A.Etheridge,et al.,extracellularmicrorna:anewsourceofbiomarkers,mutat.res.:fundam.mol.mech. Mutagen. (2011),doi: /j.mrfmmm

11 İnsan genomunda çok yaygın olarak bulunurlar; transkripsiyon hücre siklus regülasyonu sinyal transdüksiyonu hücre çoğalması hücre büyümesi apoptozis yağ metaboliması nörogenezis mirna regulasyonundaki bir bozukluk otoimmun, kardiyovasküler, enfeksiyöz, metabolik, nörolojik ve onkolojik hastalıklara yol açabilir.

12 Hastalar ve Metod Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk hematoloji kliniğininde sekonder HLH tanısı konulan 11 hasta ve yaş ve cins dağılımı benzer olan 11 sağlıklı çocuk çalışmaya alındı. HLH Tanısı HLH 2004 tanı kriterlerine göre kondu. Çalışmaya alınan hastalar HLH nin ana kriterlerinden en az beş tanesini sağlıyordu

13 MiRNA için kan örnekleri tanı anında tedavi başlanmadan önce alındı. Sekonder HLH li hastaların ve sağlıklı kontrollerin plazmalarında 379 mirna nın ekspresyonu araştırıldı.

14 mirna izolasyonu HLH hastalarından ve kontrollerden tam kan örnekleri EDTA lı tüplere alındı rpm de santrifüj edildi. Sonra mirna ları da içeren total RNA plazmadan mirneasy Mini Kit (Qiagen, GmbH, Hilden, Germany, Cat. No.:217004) kullanılarak ekstrakte edildi.

15 cdna konversiyonu İzole edilen RNA örnekleri TaqManmiRNA Reverse Transcription Kit kullanılarak komplementer DNA (cdna) ya çevrildi. PreAmplifikasyon cdna örnekleri qrt-pcr reaksyonuna sokulmadan önce TaqManPreAmp Master Mix. kullanılarak preamplfiye edildi. Preamplifiye edilmiş cdna örnekleri sonraki işlemler için -20 C saklandı. Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction (qrt-pcr) QRT-PCR reaksyonları (BioMark; Fluidigm, San Francisco, CA) isimli enstruman ile gerçekleştirildi.

16

17 İstatistik metodu mir-34a-5p normalizasyon için kullanıldı. SPSS 14 programı için dağılımların homojenitesine göre Man Whitney U testi ve student t testi kullanıldı. p<0.05 olan değerler anlamlı olarak kabul edildi.

18 Sonuçlar Bu çalışma 11 HLH li ve 11 sağlıklı çocuk üzerinde yapıldı. HLH grubunda 5 erkek 6 kız hasta HLH grubunda ortalama yaş 103±17 ay Kontrol grubunda ortalama yaş 98±37 ay

19 Hastaların karakteristikleri Table 1 Patientcharacteristics Patient no Gender M F M F F F F M F M M Age (month) Concurrent disease Hepatitis A idiopatic Chronicgra Brain CRF MDS Brucellosis Thyphoid CRF İdiopatic Hepatitis A nulamatous abcess due fever disease to TOFF Detected agent stafilococuc Stafilococu c Brucella S.tyhphi EBV IgM Hgb 7 6 7,4 8,3 8,1 9 9,6 9,8 5,4 7,6 9,2 WBC Plt Triglyceride Fibrinogen Ferritin Alt Ast Hemophagocytosis Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Prolonged fever Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Hepatosplenomegaly Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Outcome live live live Live live live Live live Live Live live

20 Hastaların karakteristikleri Patient no Gender M F M F F F F M F M M Age (month) Concurrent Hepatiti idiopati Chronic Brain Chronic Myelod Brucello Thyphoi Chronic İnfectio Hepatiti disease s A c granula abcess renal ysplasti sis d fever renal us s A matousd due to failure c failure Mononu isease TOFF syndrom cleosis e Detected Staphyl Staphyl Brucella S.tyhphi Ebstein agent ococcus ococcus Barr Virus

21 Hastaların karakteristikleri Patient no Hemoglobin (g/dl) 7 6 7,4 8,3 8,1 9 9,6 9,8 5,4 7,6 9,2 WBC (/mm 3 ) Platelet (/mm 3 ) Triglyceride (mg/dl)

22 Hastaların karakteristikleri Patient no Fibrinogen (mg/dl) Ferritin (ng/ml) ALT (IU/L) AST (IU/L)

23 Hastaların karakteristikleri Patient no Hemophagocytosis in bone marrow Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Prolonged fever Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Hepatosplenomegal y Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Positive Outcome live live live Live live live Live live Live Live live

24 Table 2 List of completelyexpressedmirnas Number of patients Mean Std. Deviation mir-34a-5p 22 12,7378 1,76340 Housekeeping gene mir-205-5p 22 13,8944 2,05745 mir-302c-3p 22 12,6458 2,82873 mir-483-5p 22 13,6035 5,99616

25 Anlamlı kat değişimi tespit edilen mirna lar Table 3: List of mirnas that have significant fold change MiRNA HLH Control Expression % Fold change P mir-205-5p ,00 6,21 0,01 mir-194-5p ,82 163,36 0,009 mir-30c-5p ,27 0,10 0,03 mir-192-5p ,91 926,02 0,043 mir , ,62 0,055

26 MiRNA ekspresyon seviyeleri ile yaş, cinsiyet, eşlik eden hastalık ve laboratuvar değerleri arasındaki korelasyon saptanamadı.

27 Tartışma

28 Tartışma HLH de anlamlı ekspresyon değişimi gösteren mirna ların hedef aldığı imflamasyonla ilişkili genler (TargetScan ve MiRanda veri tabanlarına göre) Targeted gene mir-205-5p mir-194-5p E2F1 P300 mir-30c-5p MUC17

29 mir-205-5p mir-205-5p 6,21 kat artmış olarak bulundu. Transkripsyon faktör E2F1, protein sentezinin G1/S fazında önemli role sahiptir; böylelikle hücre ömründe ve çoğalmasında kritik role sahiptir. (20) Hücre siklusuyla ilişkili protein E2F5 kronik inflamasyonda upregüle olmaktadır. (22) Bu bağlamda E2F1 ve E2F5 genlerini hedef alan mir 205-5p nin artmış ekspresyon seviyesi HLH gelişimi ve progresyonunu etkileyen immun yanıtın yeni keşfedilen regülatörleri olarak düşünülebilir. mir-205-5p nin hedef proteinleri de E2F1 ve E2F5 dir. 20. Vara D, Bicknell KA, Coxon CH, et al. Inhibition of E2F abrogates the development of cardiac myocyte hypertrophy. J Biol Chem. 2003;278: Wu J, Pajoohesh-Ganji A, Stoica BA, et al. Delayed expression of cell cycle proteins contributes to astroglialscar formation and chronic inflammation after rat spinalcord contusion. J Neuroinflammation. 2012;9:169.

30 mir-194-5p mir-194-5p 163,36 kat artmış olarak bulundu. Nükleer faktör kappa B(NF-KB) imflamasyonda ve hücre ömründe rol alan genlerin transkripsyonunun regülasyonunda önemli rol oynar. PARP-1 and p300 sinerjistik şekilde TNF alfa ve LPS e yanıt olarak NF-KB genin ekspresyonunu arttırırlar((24). mir-194-5p hedef geni de p300 dür. 24 Hassa PO, Buerki C, Lombardi C, et al. Transcriptional coactivation of nuclear factor-kappab-dependent gene expression by p300 is regulated by poly (ADP)- ribose polymerase-1. J Biol Chem. 2003;278:

31 mir-30c-5p mir-30c-5p 9 kat azalmış olarak bulundu. MUC17 kolon epitel hücrelerinde eksprese olur. İmflamatuar ve neoplastik durumlarda ekspresyonu azalır. (25) Bizim bulgularımızda MUC17 yi hedef olan mir-30c-5p nin HLH li hastalarda ekspresyonunun azaldığını tespit ettik. 25 Senapati S, Ho SB, Sharma P, et al. Expression of intestinal MUC17 membrane-bound mucin in inflammatory and neoplastic diseases of the colon. J Clin Pathol 2010;63:

32 Son söz Biz bu çalışmayla mir-205-5p, mir-194-5p ve mir-30c- 5p nin HLH için yararlı markerlar olabileceğini gösterdik. Yeni keşfedilmiş bu biyomarkerlarla diğer tanı yöntemlerinin kombine kullanımı, HLH li hastalarda, hastalığın progresyonunun daha iyi anlaşılmasında yarar sağlayabilir. İmflamasyonla ilişkili HLH patogenezinde rolü olan mirna ların spesifik rolünün belirlenmesi için daha büyük ve homojen gruplarda çalışmalara ihtiyaç vardır.

33