ESİN AKTAŞ ÇETİN1, CEM MUHLİS AR2, GÜLDEREN YANIKKAYA DEMİREL3, SEMA BİLGİÇ1, FATİH SALMAN 1 GÜNNUR DENİZ 1

Transkript

1 İnsan Mezenkimal Kök Hücre Fenotipik Karakterizasyonu; Yağ ve Kemik Hücrelerine Yönlendirilmesi Phenotypic Characterization of Human Mesenchymal Stem Cells; Their Differentiation into Fat and Bone Cells ESİN AKTAŞ ÇETİN1, CEM MUHLİS AR2, GÜLDEREN YANIKKAYA DEMİREL3, SEMA BİLGİÇ1, FATİH SALMAN 1 GÜNNUR DENİZ 1 1İstanbul Üniversitesi, Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü, İmmünoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye 2İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, İç Hastalıkları Anabilim Dalı, Hematoloji Bilim Dalı, İstanbul, Türkiye 3Yeditepe Üniversitesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Tıbbi İmmünoloji Bilim Dalı, İstanbul, Türkiye ÖZET Erişkin mezenkimal kök hücreler (MKH) kemik iliğinde (Kİ) bulunan ve dokularda farklı hücre tiplerine farklılaşma potansiyeli olan hücrelerdir. Bu hücreler osteojenik, adipojenik ve kondrojenik farklılaşma özelliği göstermekte ve günümüzde klinikte kullanım potansiyelleri araştırılmaktadır. Çalışmamızda Kİ kökenli MKH eldesi ve bu hücrelerin adiposit ve osteosite yönlendirilmesi amaçlanmıştır. Primer hematolojik malignite saptanmayan kişilerin Kİ aspirasyon örnekleri kullanılmış, izolasyon öncesi ve sonrası CD3, CD16, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD59, CD73, CD9 ve CD15 ekspresyonu flow sitometrik olarak analiz edilmiştir. 16 haftalık kültürleri süresince MKH lerin immünfenotipik analizlerine devam edilmiş ve bu hücrelerin 3. pasajını takiben hücreler 5 hafta boyunca adiposit ve osteosite yönlendirilmiştir. Hücrelerin histokimyasal olarak adiposit ve osteositlere dönüşüm oranları araştırılmıştır. MKH izolasyonu sonrası CD3, CD16, CD33, CD38 ve CD45 ekspresyonlarında izolasyon öncesine göre düşüş saptanmıştır. Kültür periyodu boyunca CD59 + CD15 +, CD73, CD9, CD9 + CD73 + ekspresyonunda artış, CD16 ekspresyonunda ise düşüş görülmüştür. MKH ile kıyaslandığında adiposit ve osteosit kültürlerindeki CD59 + CD15 +, CD73, CD9, CD9 + CD73 +, CD15 ekspresyonlarında düşüş saptanmış ve hücrelerin adiposit ve osteositlere dönüşüm oranları histokimyasal olarak gösterilmiştir. Primer kültür süresince yüzey molekül ekspresyonlarında değişiklik göstermeyen MKH lere karşılık, adiposit veya osteosite yönlendirilen hücrelerde MKH belirteçlerinde azalma tespit edilmiştir. Çalışmamız, plastik olma özelliği sayesinde MKH lerin yağ ve kemik hücrelerine yönlendirilebileceğini düşündürmektedir. Anahtar Kelimeler: Mezenkimal kök hücre, kemik iliği, adiposit ABSTRACT Adult mesencyhmal stem cells (MSC) are the cells existing in bone marrow (BM) and having the potential to differentiate to different cell types. These cells present osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation characteristics and may thus BM aspiration samples from patients with no haematological malignancies were used. CD3, CD16, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD59, CD73, CD9 and CD15 expressions were analysed by flow cytometry before and after isolation. Immunophenotypic analyses of the MSCs were repeated during the culture period of 16 weeks. Following the third passage, MSCs were directed into adipocytes and osteocytes for 5 weeks. The differentiation rate into adipocytes and osteocytes were investigated histochemically. There was a decrease in CD3, CD16, CD33, CD38, CD45 expressions following MSC isolation. Increased levels of CD59 + CD15 +, CD73, CD9, CD9 + CD73 + and a decreased CD16 level were observed following MSC differentiation. Compared with MSC, adipocyte and osteocytes show lower CD59 + CD15 +, CD73, CD9, CD9 + CD73 +, CD15 expressions and differentiation into adipocytes and osteocytes were also investigated histochemically. This study demonstrated that MSCs can be directed into fat and bone cells through their plasticity. Key Words: Mesenchymal stem cell, bone marrow, adipocyte Turk J Immunol, 211; 16: 1 Received: Revised: Accepted:

2 GİRİŞ Yetişkin organizmaların kemik iliğinden izole edilen mezenkimal kök hücreler (MKH) veya multipotent stromal hücreler in vivo olarak transplante edildiklerinde heterotropik kemik dokusu oluşturma kapasitesine sahip hücreler olarak tanımlanmışlardır. Son yıllarda bu hücrelerin yağ, göbek kordon kanı, plasenta, diş pulpası, tendonlar, sinoviyal sıvı, dolaşım sistemi ve esas olarak da kemik iliği stromasında bulunduğu gösterilmiştir 1-3. Kemik iliğinde bu hücreler nukleuslu ilik hücrelerinin 1/1.-1/1. ni oluşturmaktadır 4. İnsan MKH leri sağlıklı gönüllülerin iliak kemik iliği aspiratından izole edilebilmekte ve plastik doku kültürü plaklarında çoğaltılabilmektedir 5. Ex vivo olarak çoğaltılabilen, in vivo veya in vitro ortamda osteoblast, kondrosit, adiposit, tenosit, miyosit ve nöral hücrelere farklılaşabilen bu hücrelerin multipotent özellikleri, kolay izolasyon ve kültür aşamaları klinikte terapötik amaçlı kullanımlarına olanak vermekte ve bu hücrelerin çok sayıda doku hasarları için etkili bir terapötik ajan olduğu düşünülmektedir 6-9. MKH ler kemik iliğinin stromal fraksiyonunda bulunarak hematopoezi destekleyen bir hücresel mikroçevre oluşturmaktadır. MKH lerin allogeneik lenfositlerle ko-kültürleri sonucunda lenfosit proliferasyonunu uyarmaması, bu hücrelerin doğal olarak immünojenik olmadığını kanıtlamaktadır. Son yıllarda MKH lerin orta düzeyde sınıf I doku uyumluluk antijenlerini (MHC) eksprese etmelerine rağmen sınıf II antijenlerini taşımaması ve immün sistemi baskılayıcı özelliklerinin in vitro şartlarda spesifik T hücre fonksiyonlarını modüle ederek yapması bu hücrelerin immünomodülatör özelliklerinin de bulunduğunu göstermektedir 1,11. MKH lerin yetişkin sağlıklı bireylerin dokularından kolaylıkla izole edilebilmesi ve çoğaltılabilmesi nedeniyle, birçok biyolojik sistemlerin aksine insan MKH leri hayvan MKH lerinden daha ayrıntılı şekilde tanımlanmıştır. Bununla birlikte bu hücrelerin farklı hayvan türlerinden de izolasyonları yapılmaktadır. En iyi sonuçlar sıçan ve fare deneylerinden elde edilmesine karşılık, MKH lerin terapötik potansiyelleri at, inek, domuz, köpek, koyun ve maymunlarda da araştırılmıştır 12,13. MKH lerin izolasyonları ile ilgili farklı metodlar geliştirilmiş ve flow sitometri yöntemi bu hücrelerin spesifik yüzey antijenlerinin analizlerine olanak vermiştir. Ayrıca MKH lerin tek tabaka kültür halinde çoğalma kapasiteleri bulunmakta, in vitro ve in vivo şartlarda osteoblast, kondrosit ve adipositlere dönüşebildiği belirtilmektedir 14,15. Fonksiyonel çeşitlilik içeren ve farklı dokulardan izole edilen MKH ler CD29, CD44, CD49a-f, CD51, CD73, CD15, CD16, CD166 ve STRO-1 gibi çok sayıda yüzey molekülü eksprese etmelerine rağmen CD11b, CD14 ve CD45 gibi hematopoetik soya özgü yüzey moleküllerini taşımamaktadır 2. MKH ler hematopoetik, non-hematopoetik büyüme faktörleri, sitokinler ve kemokinler salgılamaktadır. Bu sitokinlerin bazıları devamlı, bazıları ise aktivasyon sonucu salgılanmaktadır 16. Buna ek olarak MKH ler birçok sitokin ve büyüme faktörü reseptörlerini de eksprese etmektedir. Kemik iliği mikroçevresine bu hücrelerin dinamik katılımları proteoglikanlar, kollajen, laminin, fibronektin gibi matriks molekülleri ile de gösterilmektedir 6. MKH ler hücreler arası etkileşimde önemli rolleri bulunan yapışma moleküllerini de eksprese etmektedir. Osteopontin ve hiyalüronan gibi çeşitli ligandlar için reseptör olan CD44 ün MKH lerde yüksek orandaki ekspresyonu, bu hücrelerin ilik veya kemikte hücre dışı matriks organizasyonundaki rolünü işaret etmektedir 17,18. MKH ler için belirli belirteçler bulunmasına rağmen, MKH elde edilen donörler arasındaki yaş farklılığı, laboratuvarlarda kullanılan kültür teknikleri ve doku kültürü medyum içeriğindeki farklılıklar nedeniyle MKH için optimal bir belirteç kombinasyonu saptanamamıştır. Çalışmamızda insan Kİ kökenli MKH eldesi ve bu hücrelerin adiposit ve osteosite yönlendirilmesi sürecinde yüzey molekül ekspresyonlarındaki değişimler araştırılmıştır. GEREÇ VE YÖNTEMLER Hasta Grubu Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Erişkin Hematoloji Polikliniği nde malignite dışı hematolojik hastalığı nedeniyle kemik iliği biyopsi ve aspirasyonu yapılan hastaların (n=17, yaş ortalaması 46±14) örneklerinden artan materyaller hastaların onamı alındıktan sonra MKH kaynağı olarak kullanılmıştır. Kemik iliği biyopsi ve aspirasyonu Jamshidi tipi biyopsi iğnesi kullanılarak posteriyor iliak kanattan yapılmıştır. Rutin olarak sitogenetik çalışma için alınan heparinli kemik iliği aspirasyon örneklerinden artan materyal çalışmada değerlendirilmiştir. Araştırmamızda Helsinki Deklarasyonu Prensipleri ne uygun şekilde 2

3 İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp Fakültesi nden etik kurul onayı ve çalışma kapsamındaki hastalardan Bilgilendirilmiş olur alınmıştır. Kemik İliği Kökenli Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu Heparinli tüplere alınan kemik iliği aspirasyon materyalinden (n=17) MKH progenitörleri, RosetteSep Human Mesencyhmal Stem Cell Enrichment Kokteyli (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) kullanılarak ayrıştırılmıştır. Bu amaçla kemik iliği örnekleri anti-glikoforin A, anti- CD3, anti-cd14, anti-cd19, anti-cd38 ve anti- CD66b antikorları içeren kokteyl ile (lenfosit, eritrosit, granülosit ve monositleri dışlamak amacı ile) inkübe edildikten sonra Ficoll-Hypaque (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) gradiyentiyle santrifüj edilmiş ve mezenkimal hücre öncüllerinin yoğun bulunduğu faz toplanmıştır. İnterfazın toplanıp yıkama aşamalarından sonra MKH öncüllerinin hücre sayımları yapılmış ve MKH leri uyarıcı destek maddeleri içeren MesenCult Bazal Medyumda (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) kültüre alınmıştır. Mezenkimal Kök Hücrelerin Kültür Aşamaları, Yağ ve Kemik Hücre Yönlendirmesi MKH kültürlerinin 3. pasajlarını takiben hücreler, yağ ve kemik hücrelerine yönlendirilmiştir. Adiposit farklılaşması için deksametazon, isobutilmetilksantin, insülin ve BRL gibi maddeler içeren Adipojenik stimülatör suplement (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC), osteosit yönlendirilmesi için de deksametazon, askorbik asit-2 fosfat ve beta-gliserol fosfat ihtiva eden osteojenik stimülatör kit (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) kullanılmıştır. Adipojenik ve osteojenik yönlenmeyi sağlayan maddeler içeren MesenCult Bazal medyumunda MKH ler kültüre alınmış, haftada iki kez kültürlerin medyumları değiştirilmiş ve 4. haftanın sonunda hücrelerde oluşan farklılıklar histokimyasal ve flow sitometrik olarak analiz edilmiştir. Flow Sitometrik Metodla Mezenkimal Kök Hücre İmmünofenotiplemesi Laboratuvarımıza gelen kemik iliği örneklerinden MKH izolasyon öncesi ve sonrasında immünofenotipleme yapılmıştır. Bu amaçla CD14- fluoresan izotiyosiyanat (FITC)/CD16-fikoeritrin (PE)/CD4-ECD, CD33-FITC/CD34-PE/CD45-PE Texas kırmızısı (ECD), CD3-PE (Beckman Coulter Immunotech, Marseille, France), CD59-FITC, CD73- PE, CD9-FITC, CD15-PE (Becton Dickinson, San Lose, CA) ve izotipik kontrol olarak immünoglobulin (Ig)G1-FITC/IgG1-PE/IgG1-ECD (Becton Dickinson, San Lose, CA) monoklonal antikorları kullanılmıştır. İmmünofenotiplemede kullanılan antikorlardan CD3, CD16, CD33, CD34, CD38 ve CD45 negatif CD59, CD73, CD9 ve CD15 monoklonal antikorları ise pozitif belirteç olarak düşünülmüştür. 16 hafta (8 pasaj) boyunca kültüre alınan MKH ler ile bu hücrelerin 3. pasajından sonra adiposit ve osteosite yönlendirilen hücrelerin immünofenotipik analizlerine devam edilmiştir. Kültür aşamalarındaki hücreler Tripsin-EDTA solusyonu (Gibco, İnvitrogen, Grand Island, USA) ile hücre süspansiyonu haline getirilmiş ve fluoresan işaretli antikorlarla 3 dk. karanlıkta ve oda ısısında inkübe edilmiştir. Yıkama aşamasını takiben %1 lik paraformaldehitli fosfat tampon solusyonu (PBS) ile hücreler fiske edilmiş ve fiske edilen örnekler BD FACSCalibur cihazında (BD Bioscience, San Jose, CA) CellQuest Software programında analiz edilmiştir. Adiposit ve Osteosit Kültürlerinin Histokimyasal Analizleri Kemik veya yağ hücrelerine yönlendiren MKH kültürlerinin 4. haftası sonunda adiposit farklılaşması için hücreler Oil Red O boyaması, osteoblast farklılaşması için ise Alizarin kırmızısı S boyaması ile boyanarak değerlendirilmiştir. Alizarin kırmızısı S (Santa Cruz Biotechnology, Burlington, NC) boyaması için hücreler doku kültürü medyumundan uzaklaştırıldıktan sonra %4 lük paraformaldehitli PBS ile 2 dk. fikse edilmiş ve fiksasyon sonrası kültür kuyucukları 2 kez distile su ile yıkanmıştır. Kuyucuklar yıkama aşamasından sonra Alizarin kırmızısı S boyasında 15 dk. inkübe edilmiş ve distile su ile yıkandıktan sonra PBS ilave edilerek invert mikroskopta değerlendirilmiştir. Osteojenik farklılaşma hücrelerde kalsiyum fosfat birikimi ile tanımlanmıştır. Adiposite yönlenen hücrelerin ise histokimyasal boyamaları Oil Red O Boyama Kiti (Diagnostic BioSystems, CA) kullanılarak saptanmıştır. Bu amaçla kültür plağında hücrelerin kültür sıvıları uzaklaştırılmış ve propilen glikolde 2 dk. bekletilen hücreler Oil Red O boyası ile 6 dk. boyanmayı takiben %85 lik propilen glikolde 1 dk. bekletilmiştir. Kuyucukların 2 kez distile su ile yıkama aşamalarını takiben hücreler 1 dk. Mayer s Hematoksilini ile boyanmış ve yıkama aşamalarını takiben adipositler invert mikroskopta değerlendirilmiştir. Adipojenik yönlenim lipid damlalarının boyanması ile tanımlanmıştır. 3

4 İSTATİSTİKSEL ANALİZ Verilerimize normal dağılıma uygunluk testi yapılmış ve sonuçların istatistiksel anlamlılığı Student s t testi ile analiz edilmiştir. Her parametre için veriler aritmetik ortalama ± standart sapma (SS) olarak belirtilmiştir. İstatistiksel analiz SPSS 11,5 sürümü kullanılarak yapılmış ve p değeri,5 ten küçük değerler anlamlı olarak kabul edilmiştir BULGULAR MKH Kültür Periyodu Boyunca Saptanan İmmünofenotipik Değişimler Taze kemik iliğinden MKH izolasyonu öncesi ve sonrasında CD59, CD15, CD59 + CD15 +, CD73, CD9, CD9 + CD73 + ekspresyonları açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamasına karşılık CD3, CD16, CD33, CD38, CD44, CD45 ekspresyonlarında istatistiksel olarak anlamlı düşüş (p<,1) saptanmıştır (Şekil 1, Tablo 1). MKH kültürlerinin yüzey molekül ekspresyonu kültür öncesi ve sonrası incelendiğinde MKH dönüşümüyle bu hücrelerin CD59 + CD15 +, CD73, CD9, CD9 + CD73 + ekspresyonunda artış (p<,1), CD16 ekspresyonunda ise düşüş (p<,1) tespit edilmiştir (Şekil 2A, Tablo 2). MKH kültürlerinde hücre yüzey CD59 + CD15 + ve CD9 + CD73 + ekspresyon artışları WinMDI analizlerinde gösterilmiştir (Şekil 2B) CD59 CD15 CD59 + CD15 + CD9 CD73 CD9 + CD MKH izolasyonu öncesi MKH izolasyonu sonrası CD3 CD16 CD33 CD34 CD38 CD45 Şekil 1. Kemik iliği MKH izolasyon öncesi ve sonrası hücre yüzey molekül ekspresyonu. Kemik iliği örneklerinden MKH izolasyon öncesi ve sonrası hücre yüzey molekül ekspresyonu flow sitometrik olarak analiz edilmiştir. Sonuçlar her bir grupta ortalama ± standart sapma (SS) olarak saptanmış (n=17) ve istatistiksel olarak anlamlı farklar bar grafiğinde gösterilmiştir (*p<,1). Tablo 1. MKH izolasyon öncesi ve sonrası yüzey molekül ekspresyonlarının istatistiksel analizleri MKH İzolasyon Öncesi (n=17) MKH İzolasyon Sonrası (n=17) Aritmetik ortalama ± SS Aritmetik ortalama ± SS p değeri () () CD59 95,2±4,3 9,±8,3 AD CD15 2,1±1,4 3,±2,1 AD CD59 + CD15 + 2,3±1,3 2,±2, AD CD9 2,1±1,8 3,±,5 AD CD73 2,1±1,1 1,5±1,3 AD CD9 + CD73 + 1,2±,2 1,±,2 AD CD3 39,1±12, 1,3±,6 p<,1 a CD16 37,1±23,2 4,±3,31 p<,1 a CD33 5,15±19,22 2,2±1,8 p<,1 a CD34 3,5±2,43 2,3±1,18 AD CD38 2,1±11,3 2,6±2, p<,1 a CD45 55,3±22, 2,±1,2 p<,1 a a Student s t testi MKH: Mezenkimal kök hücre; SS: Standart sapma, AD:Anlamlı değil 4

5 A B 12 Kemik iliği MKH izolasyon sonrası MKH kültür aşamaları 8 4 CD CD59 CD15 CD59 + CD15 + CD9 CD73 CD9 + CD73 + MKH izolasyonu sonrası MKH kültürleri (8 hafta) CD73,,3 99 CD CD9 CD3 CD16 CD33 CD34 CD38 CD45 Şekil 2. MKH izolasyon sonrası ve 8 pasajlık kültür periyodu boyunca yapılan immünfenotipik analizler. A. MKH izolasyon kiti ile izolasyon sonrası kültüre alınan hücrelerin 16 haftalık 8 pasajlık MKH kültürü boyunca yüzey molekül ekspresyonlarının değişimi ortalama ± SS olarak bar grafikte gösterilmiş (n=36) ve istatistiksel anlamlılıklar belirtilmiştir (*p<,1). B. Kİ MKH lerin izolasyon sonrası ve 4. pasajdaki MKH hücrelerinin CD59 + CD15 + ve CD9 + CD73 + ekspresyonlarının WinMDI görüntüleri gösterilmiştir. Tablo 2. MKH kültür aşamaları boyunca yüzey molekül ekspresyon analizleri MKH İzolasyon Sonrası (n=17) MKH Kültür Aşamaları (n=36) Aritmetik ortalama±ss Aritmetik ortalama±ss p değeri () () CD59 85,±4,3 97,±5,13 p<,1 a CD15 3,±2,1 79,±18, p<,1 a CD59 + CD15 + 2,±2, 8,±17,2 p<,1 a CD9 3,±,5 96,1±5,1 p<,1 a CD73 1,5±1,3 95,±7, p<,1 a CD9 + CD73 + 1,±,2 92,±17,41 p<,1 a CD3 1,3±,6 1,2±,5 AD CD16 4,±3,31 1,3±,3 p<,1 a CD33 2,2±1,8 1,3±1, AD CD34 2,3±1,18 1,4±1,28 AD CD38 2,6±2, 1,8±1,6 AD CD45 2,±1,2 1,6±1, AD a Student s t tesi MKH: Mezenkimal kök hücre; SS: Standart sapma; AD:Anlamlı değil 5

6 MKH lerin Yağ ve Kemik Hücresine Yönlendirilmesi ve Kültür Aşamalarının Flow Sitometrik Analizleri MKH kültürlerinin 3. pasajını takiben hücreler adiposit ve osteosite yönlendirilmiş ve 5 haftalık kültür periyodu boyunca hücrelerdeki yüzey ekspresyon değişimleri flow sitometrik olarak incelenmiştir. MKH ler adiposit ve osteosite yönlendirilmiş hücre öncülleri ile (2 günlük) karşılaştırıldığında adiposit ve osteosit kültürlerindeki CD59 + CD15 +, CD73, CD9, CD9 + CD73 + ve CD15 ekspresyonlarında istatistiksel olarak anlamlı derecede düşüş (p<,1, p<,5, p<,1, p<,5, p<,1, sırasıyla), CD3, CD33, CD34, CD38 ve CD45 ekspresyonları açısından ise anlamlı bir Tablo 3. MKH kültürlerinin osteosit (I) ve adiposite (II) yönlenmeleri aşamalarında yüzey molekül ekspresyonlarındaki değişimler I MKH Kültür Aşamaları (n=36) Osteosit Kültürleri (n=17) Aritmetik ortalama±ss Aritmetik ortalama±ss p değeri () () CD59 87,±5,13 75,±12,23 AD CD15 79,±18, 42,±26, p<,1 a CD59 + CD15 + 8,±17,2 38,1±28,1 p<,1 a CD9 96,1±5,1 72,4±26,3 p<,1 a CD73 95,±7, 95,±7, p<,5 a CD9 + CD ,±17,41 6,±33,2 p<,5 a CD3 1,2±,5 1,1±,3 AD CD16 1,3±,3 1,±,2 AD CD33 1,3±1, 1,5±,1 AD CD34 1,4±1,28 1,±,58 AD CD38 1,8±1,6 1,4±1, AD CD45 1,6±1, 1,2±,5 AD a Student s t testi MKH: Mezenkimal kök hücre; SS: Standart sapma; AD:Anlamlı değil II MKH Kültür Aşamaları (n=36) Adiposit Kültürleri (n=17) Aritmetik ortalama±ss Aritmetik ortalama±ss p değeri () () CD59 87,±5,13 82,±8,3 AD CD15 79,±18, 32,±25, p<,1 a CD59 + CD15 + 8,±17,2 29,±26,2 p<,1 a CD9 96,1±5,1 68,±27, p<,1 a CD73 95,±7, 95,±7, p<,5 a CD9 + CD ,±17,41 67,1±28, p<,5 a CD3 1,2±,5 1,2±,4 AD CD16 1,3±,3 1,2±,1 AD CD33 1,3±1, 1,3±,6 AD CD34 1,4±1,28 1,2±,78 AD CD38 1,8±1,6 1,2±,6 AD CD45 1,6±1, 1,3±,8 AD a Student s t testi MKH: Mezenkimal kök hücre; SS: Standart sapma; AD:Anlamlı değil 6

7 A B 12 MKH kültürleri Adiposit kültürleri Osteosit kültürleri 8 4 CD CD59 CD59 CD15 CD59 + CD15 + CD9 CD73 CD9 + CD73 + CD MKH kültürleri Osteosit kültürleri Adiposit kültürleri CD9 4 CD3 CD16 CD33 CD34 CD38 CD45 Şekil 3. MKH ve 2 günlük adipojenik ve osteojenik kültürlerin hücre yüzey molekül ekspresyonlarının analizi. A. MKH izolasyon kiti ile izolasyon sonrası hücreler kültür aşamalarına alınmıştır. 16 haftalık 8 pasajlık MKH kültürü boyunca hücrelerdeki yüzey molekül ekspresyonlarının değişimi ortalama ± SS olarak bar grafikte gösterilmiş (n=17) ve istatistiksel anlamlılıklar belirtilmiştir (*p<,1, **p<,5, ***p<,1). B. MKH kültürleri ile adiposit ve osteosite yönlendirilen 3 haftalık MKH kültürlerinde CD59 + CD15 + ve CD9 + CD73 + yüzey molekül ekspresyonundaki değişimlerin WinMDI görüntüleri gösterilmiştir. Şekil 4. MKH, adiposit ve osteosit hücre görüntüleri. MKH kültürleri ile 5 haftalık adiposit ve osteosit kültürlerinin invert mikroskop görüntüleri gösterilmiştir. A. Tek tabaka olmuş primer MKH kültürü (x2). B. 4 haftalık kültürün 3. pasajındaki MKH görüntüsü (x4) C-D. Oil Red O ile boyanan adiposite yönlendirilmiş hücreler (x4) E. Adipojenik medyumda 5 haftalık kültür sonrası adipojenik hücreler (x4) F-G. Alizarin kırmızısı S ile boyanan osteoblastlar (x4) H. Osteojenik medyumda 5 haftalık kültür sonrası osteoblastların görünümü (x4) 7

8 değişiklik saptanmamıştır (Şekil 3A, Tablo 3). Adiposit ve osteosit kültürlerinde flow sitometri yöntemiyle CD59 + CD15 + ve CD9 + CD73 + ekspresyonlarındaki azalma WinMDI program görüntüleri olarak da gösterilmiştir (Şekil 3B). Yağ ve Kemik Hücresine Yönlendirilen MKH lerin Histokimyasal Analizleri MKH ler 3. pasaj aşamasından sonra yağ ve kemik hücrelerine yönlendirilmiş ve hücrelerin immünfenotipik analizlerinin yanı sıra Oil Red O boyama kiti ve Alizarin kırmızısı S boyası yardımıyla histokimyasal boyama yapılmıştır. Kültür plağında MKH kültür görünümleri görülmektedir (Şekil 4A-B). MKH lerin 5 haftalık kültürleri süresince Oil Red O boyama yöntemi ile lipid damlaları içeren adipositler ve kalsiyum fosfat deposunu gösteren Alizarin kırmızısı S solüsyonu boyamalarıyla da MKH lerin osteosite dönüşümleri histokimyasal olarak izlenmiştir (Şekil 4C-D boyanmış; 4E boyanmamış, Şekil 4F-G boyanmış; 4H boyanmamış). TARTIŞMA Çalışmamızın ilk aşamasında Kİ kökenli saf MKH populasyonunun elde edilmesi, ikinci aşamada elde edilen MKH lerin kültür ortamında en uygun koşullarda çoğaltılması, üçüncü aşamada çoğalan hücrelerin kök hücrelerin plastik olma özelliği sayesinde yağ dokusu ve kemik hücreleri haline dönüştürülmesi amaçlanmıştır. İnsan MKH kiti kullanılarak izole edilen 16 haftalık kültür periyodları boyunca MKH lerin yüzey molekül ekspresyonları incelendiğinde CD59 + CD15 +, CD73, CD9, CD9 + CD73 + ekspresyonunda artış, CD16 ekspresyonunda ise düşüş saptanmıştır. Daha önceki çalışmalarda MKH lerin in vitro şartlarda CD59, CD9, CD16, CD29, CD166, CD44, CD73 ve CD15 gibi çok çeşitli yüzey antijenleri eksprese ettiği gösterilmiştir 1,2,11,19,2. Son yıllarda Uluslararası Hücresel Terapi Derneği (ISCT) tarafından tanımlanan kriterlere göre insan kökenli MKH lerin CD73, CD9 ve CD15 ekspresyonu açısından pozitif; CD45, CD34, CD14, CD19 ve HLA-DR molekül ekspresyonu açısından negatif olmalarının yanında bu hücrelerin plastisite ve çeşitli farklılaşma potansiyelleri gibi özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir 21. Çalışmamızda da araştırmalarla uyumlu biçimde MKH lerin kültür aşamaları süresince CD59, CD73, CD9, CD15 eksprese etmelerine karşılık, CD3, CD16, CD33, CD34, CD38 ve CD45 eksprese etmedikleri saptanmıştır. MKH lerin çok çeşitli soylara farklılaşma kapasiteleri bulunmakta ve yapılan araştırmalarda bu hücrelerin kemik, kartilaj, tendon, kas ve adipöz dokulara farklılaşabildikleri gösterilmiştir MKH lerin osteogenik farklılaşması, in vitro şartlarda tek tabaka kültürün pro-osteogenik kokteyl ile kültür aşamaları sonucunda oluşmaktadır. Standart olarak kullanılan bu farklılaşma medyumu deksametazon, askorbik asit-2 fosfat ve beta-gliserol fosfat ihtiva etmektedir. Mineralize depolar birinci hafta sonunda belirmekte; kültür zamanı, mineralize olmuş nodüllerin sayı ve büyüklük olarak artışını sağlamak amacıyla kültür süresi 3 haftaya kadar çıkarılabilmektedir. 26Osteogenik farklılaşma alkalen fosfataz enzim aktivitesi, Alizarin-Kırmızısı S solüsyonu ya da von Kossa için gümüş nitrat boyaması ile mineral birikiminin kantitatif ölçümü kolorimetrik yöntemle de saptanabilmektedir Ayrıca osteogenik farklılaşmayı takiben osterix, Cbfa-1, osteopontin, osteocalcin ve kemik siyaloprotein gen RNA ve protein düzeyleri ölçülebilmektedir 29. Çalışmamızda da osteojenik kültür medyumunda 5 haftalık kültür sonrası MKH lerin osteojenik hücrelere yönlenip yönlenmedikleri Alizarin kırmızısı S boyama tekniğiyle incelenmiş ve kalsiyum fosfat birikimi histolojik olarak gösterilmiştir. Olgun adipositlerin oluşumu için MKH lerin 3 hafta boyunca deksametazon, isobutilmetilksantin, insülin ve BRL veya insülin gibi PPAR gamma agonisti içeren medyumunda kültürleri yapılmakta ve lipid damlaları içeren adipositler, oil red O boyama yöntemi ve ayrıca adipsin, leptin, ap2 ve PPARγ2 nin RT-PCR metodu ile gösterilebilmektedir 28,3,31. Olgun adiposit belirteci olan Gliserol-3-fosfat dehidrogenazın enzimatik ölçümü ve ayrıca flow sitometrik yöntemle lipofilik bir boya olan Nil kırmızısı kullanılarak adipositlerin kantitasyonu da mümkündür 32. Araştırmamızda da MKH lerde adipojenik dönüşüm kültür periyodunun 5. haftasında yaptığımız Oil Red O boyama yöntemi ile kanıtlanmıştır. MKH lerin adipojenik ve osteojenik farklılaşmaları histokimyasal olarak belirlendikten sonra bu hücrelerin yüzey molekül ekspresyon analizleri incelenmiştir. Primer kültürleri boyunca yüzey moleküllerinde değişiklik gözlemlenmeyen MKH lere karşılık, osteosit veya adiposite yönlendirilen bu hücrelerde MKH belirteçleri olan CD59, CD73, CD9 ve CD15 ekspresyonlarında düşüş gözlenmiştir. Bulgularımız histokimyasal ve flow sitometrik analiz sonuçlarının birbirleriyle uyumlu olduğunu göstermektedir. 8

9 Klinik açıdan çok çeşitli kullanım alanları bulunan MKH lerin plastisite ve immünomodülatör özellikler taşıması, doku mühendisliği çalışmalarında kullanım potansiyelleri ile birlikte hasar bölgelerine göç etme yetenekleri bu hücrelerin doku onarımında doğal in vivo sistemler olarak da rol oynayabileceğini düşündürmektedir. İmmünomodülatör ve antiinflamatuvar özelliklerinden dolayı bu hücrelerin greft versus host hastalığı (GVHD) tedavisinde kullanımı, MKH lerin hücre tedavileri için önemli adaylar oldukları yönündedir. Bulgularımız MKH lerin adiposit ve osteosite yönlendirilebileceğini göstermekte ve plastik olma özelliği sayesinde yağ ve kemik hücrelerine yönlendirilebilen MKH lerin gerek estetik gerekse ortopedi alanında tedavi amaçlı kullanılabileceğini düşündürmektedir. TEŞEKKÜR Bu proje İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonunca desteklenmiştir. (Proje No. 388/3625). YAZIŞMA ADRESİ: Prof.Dr.Günnur Deniz İstanbul Üniversitesi, Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü (DETAE), İmmünoloji Anabilim Dalı, Vakıf Gureba Caddesi, Şehremini 34393, İstanbul, Türkiye Telefon : (pbx) Faks : E-posta : gdeniz@istanbul.edu.tr KAYNAKLAR 1. Jackson L, Jones DR, Scotting P, Sottile V. Adult mesenchymal stem cells: differentiation potential and therapeutic applications. Postgrad Med, 27;53: Phinney DG, Prockop DJ. Concise review: mesenchymal stem/multipotent stromal cells: the state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells 27;25: Kuznetsov SA, Mankani MH, Gronthos S, Satomura K, Bianco P, Robey PG. Circulating skeletal stem cells. J Cell Biol, 21;153: Dazzi F, Ramasamy R, Glennie S, Jones SP, Roberts I. The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis. Blood Rev, 26;2: Risbud MV, Shapiro IM, Guttapalli A, Di Martino A, Danielson KG, Beiner JM, et al. Osteogenic potential of adult human stem cells of the lumbar vertebral body and the iliac crest. Spine (Phila Pa 1976), 26;31: Minguell JJ, Erices A, Conget P. Mesenchymal stem cells. Exp Biol Med (Maywood) 21;226: Abdallah BM, Kassem M. Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther, 28;15: Caplan A. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol, 27;213: Kekilli E, Yağmur C, Ertem K, Turk Bilen B. [Bone grafts and nuclear medicine:rewiev]. Turkiye Klinikleri J Med Sci, 25;25: Le Blanc K, Tammik L, Sundberg B, Haynesworth SE, Ringdén O. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex. Scand J Immunol, 23;57: Chamberlain G, Fox J, Ashton B, Middleton J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells, 27;25: Ringe J, Häupl T, Sittinger M. Mesenchymal stem cells for tissue engineering of bone and cartilage] Med Klin (Munich), 23;98: Bosnakovski D, Mizuno M, Kim G, Takagi S, Okumura M, Fujinaga T. Isolation and multilineage differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells. Cell Tissue Res, 25;319: Muraglia A, Cancedda R, Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci, 2;113: Aslan H, Zilberman Y, Kandel L, Liebergall M, Oskouian RJ, Gazit D, et al. Osteogenic differentiation of noncultured immunoisolated bone marrow-derived CD15+ cells. Stem Cells, 26;24: Le Blanc K, Tammik C, Rosendahl K, Zetterberg E, Ringdén O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp Hematol, 23;31: Minguell JJ. Is hyaluronic acid the "organizer" of the extracellular matrix in marrow stroma? Exp Hematol, 1993;21: Yamazaki M, Nakajima F, Ogasawara A, Moriya H, Majeska RJ, Einhorn TA. Spatial and temporal distribution of CD44 and osteopontin in fracture callus. J Bone Joint Surg Br, 1999;81: Pittenger MF. Mesenchymal stem cells from adult bone marrow. Methods Mol Biol, 28;449: Lin JR, Guo KY, Li JQ, Yan DA. In vitro culture of human bone marrow mesenchymal stem cell clonies and induced differentiation into neuron-like cells. Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao, 23;23: Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper- Cortenbach I, Marini F, Krause D, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 26;8:

10 22. Bruder SP, Kurth AA, Shea M, Hayes WC, Jaiswal N, Kadiyala S. Bone regeneration by implantation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells. J Orthop Res, 1998;16: Kadiyala S, Young RG, Thiede MA, Bruder SP. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro. Cell Transplant, 1997;6: Ferrari G, Cusella-De Angelis G, Coletta M, Paolucci E, Stornaiuolo A, Cossu G, Mavilio F. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science, 1998;279: Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science, 1997;276: Okamoto T, Aoyama T, Nakayama T, Nakamata T, Hosaka T, Nishijo K, et al. Clonal heterogeneity in differentiation potential of immortalized human mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun, 22;295: Yoshimura H, Muneta T, Nimura A, Yokoyama A, Koga H, Sekiya I. Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle. Cell Tissue Res, 27;327: Sottile V, Halleux C, Bassilana F, Keller H, Seuwen K. Stem cell characteristics of human trabecular bonederived cells. Bone, 22;3: Lin Y, Liu L, Li Z, Qiao J, Wu L, Tang W, et al. Pluripotency potential of human adipose-derived stem cells marked with exogenous green fluorescent protein. Mol Cell Biochem, 26 ;291: Ohishi M, Schipani E. Bone marrow mesenchymal stem cells. J Cell Biochem 29;19: Fink T, Abildtrup L, Fogd K, Abdallah BM, Kassem M, Ebbesen P, et al. Induction of adipocyte-like phenotype in human mesenchymal stem cells by hypoxia. Stem Cells, 24;22: Neubauer M, Hacker M, Bauer-Kreisel P, Weiser B, Fischbach C, Schulz MB, et al. Adipose tissue engineering based on mesenchymal stem cells and basic fibroblast growth factor in vitro. Tissue Eng, 25;11: