Isozyme lerle moleküler tanımlama tekniği

Transkript

1 Uludağ University, Faculty of Agriculture, Plant Protection Department, Bursa, Turkey 3. WORKSHOP IN TAXONOMIC ACAROLOGY 09-10/07/2013, BURSA, Turkey Isozyme lerle moleküler tanımlama tekniği Sunan: Doç. Dr. Nabi Alper KUMRAL

2 Aminoasitler Aminoasitler bir amino grubu, bir karboksil grubu ve bir yan zincirden oluşmaktadırlar. Amino asitler birbirlerine peptid bağlarıyla bağlanırlar. 20 aminoasidin birleşmesiyle oligopeptid, 80 ve daha fazla aminoasidin birleşmesiyle polipeptid oluşur.

3 Aminoasitler Polipeptid zincirlerin katlanmasıyla oluşan protein yapıları: birincil, ikincil, üçüncül ve dördüncül yapıdır.

4 Aminoasitler Aminoasitlerin temel görevi proteinleri oluşturmaktır. İkinci görevi ise amino asit dilini oluşturmaktır. Amino asit yan zincir irilikleri, yükleri, şekilleri, hidrofilik veya hidrofobik oluşları ve reaksiyona girme dereceleri bakımından farklıdır. Yan zincirin sudaki çözünürlüğüne göre amino asitler 3 gruba ayrılırlar. 1. Hidrobik aminoasitler: suda ya hiç çözünmezler yada az çözünürler.alanin, valin, lösin gibi. 2. Hidrofilik aminoasitler: bunlar su severler. Arjinin, lizin gibi. 3. Özel aminoasitler: sistein, prolin gibi

5 Protein yapısı ve özellikleri Proteinler aminoasitlerin zincir halinde birbirlerine bağlanmasından oluşan büyük moleküllü bileşiklerdir.

6 Amino asit: Proteinin temel yapısı NH 3 + Amino grubu R C H COO - Karboksilik asit grubu Zincirin farklı taraflarında bulunan R, 20 farklı aminoasitin özelliklerini belirler. Her proteinin kendisine has özelliklerinin olmasını sağlayan özel amino asit dizilimleri vardır.

7 Bu zincirde bir amino asitin karboksil grubunun bir diğerinin amino grubuna bağlanmasıyla oluşan bağ peptit bağı olarak adlandırılır.

8 Bir karboksilik asit; bir su molekülünün serbest bırakılması ile bir amino grubu olarak yoğunlaşır. R 1 R 2 NH 3 C COO - + NH 3 + C COO - + H H H 2 O H 2 O R 1 R 2 R 3 NH 3 C CO NH C CO NH C CO A H F G Peptid bağı N S T H D Peptid bağı K G S H A Aminoasit dizilimi birincil yapı olarak adlandırılır.

9 Aminoasit dizilimi, bir gende, DNA bazlı dizilim olarak kodlanır. DNA molekülü = G C G C T T A A G C G C C G C G A A T T C G C G DNA bazlı dizilim

10 Gen proteinin kopyası, genom ise hayatın kopyasıdır Genome Protein Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Gen Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein Protein

11 Proteomics ve Protein Tanımlanması

12 Proteinlerin yüksek işlem hacimli yaklaşımlar kullanılarak; geniş ölçekli görüntülenmesi, ifade edilmesi, değişimi ve ilişkilerinin belirlenmesidir.

13 Neden? Belirlenmiş olan genler gen sayısı < protein sayısı Belirlenmiş olan proteinler

14 Amacı Tüm proteinlerin listelenmesi Fonksiyonlarının belirlenmesi Birbirleriyle olan etkileşimlerinin anlaşılması

15 Proteomics Teknolojisi Jel Elektroforez Mass-spectrometre Protein çipleri Maya 2 hibrit metot

16 Allozimler: Protein elektroforezi genetik polimorfizm saptanması için etkin bir yöntem olmuştur. Akarlarda birçok enzimatik sistem üzerinde çalışılmıştır. 16

17 Osakabe (1987), Japonya'da farklı bitki türlerinde saptanan Panonychus citri türünün diyapozdaki ve aktif bireylerinin spesifik olmayan esterase (EST) enzim farklılıklarını polyacrilamide jel elektroforezi (PAGE) metodu kullanılarak belirlemiştir. 17

18 Osakabe (1991), Japonya'da üç farklı bölgeden topladığı Panonychus citri türünün popülasyonlarının spesifik olmayan esterase (EST) enzim farklılıklarını polyacrilamide jel elektroforezi (PAGE) metodu kullanılarak belirlemiştir. 18

19 Ayrıca, aynı türde dişi ve erkekler arasındaki farklılıklar da belirlenmiştir.

20 Gotoh ve Ishikawa (1992), Japonya'da Panonychus cinsine ait 3 farklı türün PAGE metodu kullanılarak esterase (EST) enzimindeki farklılıklar gösterilmiştir. 20

21 Goka ve Takafuji (1997), Japonya'da Tetranychus urticae nin 10 farklı popülasyonunda EST, Phosphoglucoisomerase (PGI) ve glucose- 6phosphate-dehydrogenase (G-6-PD) enzimlerindeki farklılıkları göstermiştir. 21

22 Goka ve Takafuji (1997), Japonya'da Tetranychus cinsine ait 7 farklı türün PAGE metodu kullanılarak Phosphoglucoisomerase (PGI) ve malate dehydrogenase (MDH) enzimlerindeki farklılıklarını belirlemişlerdir. Sonuç olarak, bu türlerin ayrımında bu markırların oldukça kullanışlı olduğunu bildirmişlerdir. 22

23 Kıtashima ve Gotoh (1997), Japonya'da bulunan sibling türlerden Panonychus osmanthi ve P. citri nin F1 hibridlerinde görülen farklılıklar spesifik olmayan EST enzimleri taranarak belirlenmiştir. 23

24 He ve ark. (1999), bir kene türü oln Boophilus microplus türünün Glutathione S-transferase (GST) ın saflaştırılması ve karekterizasyonunu ortaya koymuşlardır. 24

25 Bu çalışmada ayrıca MALDI-TOF metodu kullanılarak GST nin karekterizasyonu ortaya konmuştur.

26 Navajas ve ark. (2001), Neoseiulus fallacis nin piretroitlere dayanıklılığınının aspartate aminotransferase (Got), phosphoglucomutase (Pgm), esterases (Est) ve glucosephosphate isomerase (Pgi) allozimleri ile ilişkisini elektroforetik olarak isoelektrik odaklama metodu (IEF) ile belirlemişlerdir. 26

27 Ay ve ark. (2005), Türkiye de Antalya ve Isparta nın çoğrafik olarak farklı yerlerinden toplanan Tetranychus urticae popülasyonlarında EST enzimleri taranarak farklılıklar görüntülenmiştir. 27

28 Konanz ve Nauen (2004), Tetranychus urticae nin abamectine dayanıklı popülasyonalarında Glutathione S-transferase (GST) ın saflaştırılması ve karekterizasyonunu göstermişlerdir. 28

29 Niu ve ark. (2011), Panonychus citri türünün Glutathione S-transferase (GST) ın saflaştırılması ve karekterizasyonunu belirlemişlerdir. 29

30 Mahdavi ve ark. (2012), İran da Tetranychus urticae nin chlorpyrifos a dayanıklı popülasyonlarında EST ve GST enzimlerinin saflaştırılması ve karekterizasyonunu ortaya koymuşlardır. 30

31 Yorulmaz ve Ay (2013), Türkiye de hexythiazox a dirençli Neoseiulus californicus popülasyonlarındaki CaEST enziminin farklılıklarını PAGE metodu ile ortaya koymuştur. Figure 3. Esterase zones in the different strains of the Neoseiulus californicus individuals (A, esterase zones of the susceptible population and B, esterase zones of the HEX14 population).

32 Poliakrilamit Jel Elektroforezi Poliakrilamit jeller, vinil polimerizasyonuyla akrilamit monomerlerinin uzun poliakrilamit zincirleri ve genellikle ortama belli miktarda bis olarak bilinen N,N -metilen-bis-akrilamit ilavesiyle çapraz bağlanmalar yaparak oluşur. Akrilamit/bis karışımı polimerleşmeyi katalizleyen amonyum persülfat ile TEMED varlığında polimerleşerek jel yapısı kazanır.çapraz bağlanmalar sonucu oluşan porların büyüklüğü akrilamit ve bisakrilamitin başlangıç konsantrasyonlarına bağlıdır. Poliakrilamit jel elektroforezi küçük DNA moleküllerini ayırmak için uygundur. Manuel DNA dizi analizi çıkarmak için ve sadece birkaç tekrarlı dizi bakımından farklı olan mikrosatellit DNA moleküllerini ayırmak için kullanışlıdır. Poliakrilamit jeller genellikle gümüş nitrat veya etidyum bromür ile boyanarak nükleik asitlerin görüntülenmesi sağlanır. 32

33 33

34 Jel Elektroforez 1-D Jel Elektroforez 2-D Jel Elektroforez 3-D Jel Elektroforez (görüntüleme)

35 1-D Jel Elektroforez 1) Örnek Hazırlanması Protein Ekstraksiyonu Memeli dokulardan Eritrositlerden Yumuşak bitkisel dokulardan Mayalardan ektraksiyon Bakterilerden ektraksiyon Yağlı dokulardan ektraksiyon Protein Konsantrasyonun Belirlenmesi Warburg-Christian yöntemi Biüret yöntemi Bradford yöntemi Lowry yöntemi

36 DNA, RNA veya Protein moleküllerinin, elektriksel ortamda jel kalıp üzerine ayrıştırılarak aktarılması işlemidir. 36

37 37

38 38

39 Jel Elektroforez Aşamaları Örnek hazırlanması Jel elektroforez Protein emdirimi belirlenmesi Protein

40 PROTEİN EKTRAKSİYONU Tampon çözelti eklenmesi Örneklerin koyulup ezilmesi Örneklerin santrifüjlenmesi Süpernatant çekilmesi

41 GST Enzim saflaştırılması Glutathione-Sepharose 4B affinity kromatografi yöntemi kullanılır. Akar bireyleri (100 mg) 10 ml soğuk sodyum fosfat tamponunda (0.02 M,pH 7.3) buz üstünde homojenize edilir. Homojenat g de 4oC de 5 dk. santrifüj edilir. Pelletler uzaklaştırıldıktan sonra, Supernatant g de 4oC de 15 dk. santrifüj edilir. Elde edilen supernatant enzim kaynağı olarak kullanılır. Enzim kaynağı kullanılmadan önce 0.45 um HV filter dan geçirilir. Kolon 20 ml sodyum fosfat ile yıkanır ve %1 lik Triton X li 6 ml fosfat tamponu ile kolona yüklenir. Daha sonra 2x10 ml bu tamponla iki defa yıkanır. Son olarak, saf enzim 50mM Tric-HCL + 5 mm glutathione, ph 8.0 tamponu ile toplanır.

42 EST Enzim saflaştırılması Sapharose CL-6B jel filitrasyon affinity kromatografi yöntemi kullanılır. Akar bireyleri (10 g) 50 ml 10 mm Tris-HCl (ph 7.5) buz üstünde homojenize edilir. Homojenat g de 4oC de 5 dk. santrifüj edilir. Pelletler uzaklaştırıldıktan sonra, Supernatant g de 4oC de 15 dk. santrifüj edilir. Elde edilen supernatant enzim kaynağı olarak kullanılır. Kolona aynı tamponla enzim kaynağı yüklenerek saf 5 ml EST kaynağı toplanır.

43 PROTEİN KONSANTRASYONU Örneklerin ve standart proteinin(bsa) mikroplakalara yüklenmesi Boya çözeltisinin eklenmesi Elisa reader da boyanın özelliğine göre belirli bir nm de( ) okuma yapılması Toplam protein miktarının belirlenmesi

44 ESTERAZ ENZİMİ ELEKTROFOREZ PROTOKOLÜ Ornstein Davis-Biorad metodu 1-Stok akrilamid: 30 g Akrilamid 0.8 g bis-akrilamid 100 ml saf suda hacme tamamlanır. Watman 1 nolu filitreden süzülür. Yaklaşık 1 ay +4 C de saklanabilir. 2-Yoğun jel buffer: 1.5 M Tris -HCL ph: g Tris Base 80 ml saf suda çözülür. ph 8.8 e 6N HCL ile ayarlanır. Hacim 100 ml ye tamamlanır. +4 C de saklanabilir. 6N HCL : Önce 25 ml saf su konur. Üstüne ml %30 luk HCL konur ve saf suyla 100 ml hacme tamamlanır. 3- seyreltik jel buffer: 0.5M Tris- HCL ph:6.8 6g Tris Base 80 ml saf suda çözülür. ph 6.8 e 6N HCL ile ayarlanır. Hacim 100 ml ye tamamlanır. +4 C de saklanabilir. 4- %10 luk Amonyum persülfat (APS): 0.1g APS 1 ml saf suda çözülür. Günlük hazırlanır.

45 Küçük delikli jel %7.5 (ayırıcı-separeting jel) Solution 7.5% Distilled Water ml 30 %Stock Acrylamide Solution 7.5 ml 4 X Resolving Tris Solution 7.5 ml TEMED 60 µl 10 % ammonium persulphate 150 µl karıştırılır ve yaklaşık 25 dk dan sonra donmaya başlar. Düzgün bir yüzey için çok ince doymuş n- butanol dökülür. Tam polemerizasyon için en az bir saat beklenmelidir. Daha sonra n-butanol su ile yıkanır. Su kurutma kağıdı yardımıyla jele dokunmadan emdirilir.

46 Büyük delikli jel %3.5 ( Ayırıcı separeting jel) Solution 3.5 % Distilled water 7.4 ml 30 % Stock Acrylamide Solution 1.5 ml 4 X Resoloving Tris Solution 3.0 ml TEMED 20 ul 10 % Ammonium Persulphate 100 ul karıştırılır ve alt jelin üstüne dökülür ve taraklar yerleştirilir. Yaklaşık saat sonra donmaya başlar.

47 Homojenizasyon sıvısı 3.2 g sukroz tartılır. 10 ml triton x 100(%0.1 lık çözelti: 100 ml de 0.1 g Triton X-100) de çözülür. Stok için bromocresolpruple den 0.05 g tartılır ve 10 ml saf suda çözülür. Stoktan bromocresolpruple den 200µl çekilip yukarıdaki sukroz karışımına eklenir. Örnek Hazırlama 50µl homojenizaston sıvısı her bir ependorf tüpüne (1.5 ml )yüklenir Örneğin durumuna göre (bradfordtaki protein miktarlarına göre ) değişen sayıda bireyler ezici çubukla iyice ezilir.( panonchus için 10 birey). Daha sonra tüpler santrifüjde g de, +4 C de 6 dakika tutulur. 10 µl süpernetant dan (üstteki sıvı) çekilerek jellerin kuyucuklarına yüklenir.

48 Elektrot Buffer (Glycine buffer, ph: 8.3) 3g Tris- Base 14.4g glycine 1 lt suda çözülür. Koşturma +4 C 150 V saat (izleme boyası camın sonuna gelmeden 0.5 cm kalana kadar)

49 Boya solüsyonu Bunu için önce %1 aseton içeren 0.2 M fosfat buffer hazırlanmalıdır. 1) 0.1 M fosfat buffer Fosfat buffer için öncelikle A ve B şeklinde iki çözelti hazırlanmalıdır. A : 0.2 M NaH2PO4 için g NaH2PO4 tartılır, 1.1 ye % 1 aseton içeren saf su ile tamamlanır. B: 0.2 M Na2 HPO4 için, g Na2HPO4, 12 H2O tartılır, 1.1 ye %1 aseton içeren saf su ile tamamlanır. 0.1 M fosfat buffer (ph 7.0) 28 ml A çözeltisi 72 ml B çözeltisi ile karıştırılır ve ph kontrol edilir ve son hacim % 1 aseton içeren saf su ile 200 ml ye tamamlanır. Fast blue RR salt çözeltisi % 0.4( w/v): 0.08 g fast blue salt tartılır. 50 ml 0.1 M fosfat buffer (ph :7.0) da çözdürülür. Naphthylacetat çözeltisi: 0.1 g naphthylacetate 10 ml %50 asetonda çözülür. 4 ml çözelti 50 ml 0.1 M fosfat buffer ( ph: 7.0) + Fast Blue RR içerisine karıştırılır. Fikzasyon sıvısı : 7 ml lik asetik asit 100ml saf su ile tamamlanır.

50 Glutathione S-Transferase Enzimlerinin Doğal Olmayan Kesikli Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE) Yöntemiyle Belirlenmesi Glutathione S-transferase enzimlerinin elektrofotometrik ayrımında Sodyum dodesil sülfatpoliakrilamid jel (SDS-PAGE) kullanılır. SDS-PAGE sisteminde jel farklı tamponlarla hazırlanmış iki kısımdan oluşmaktadır. Doğal kesikli PAGE den farklı olarak küçük porlu ayırma jeli %10 olarak hazırlanır: 29.6ml saf su + 23,5 ml stok akrilamid + 17,6 ml yoğun jel tamponu (%10 SDS li) + 70 µl TEMED µl APS Yükleme jeli (%3.5) olarak, 2 ml saf su + 2,2 ml stok akrilamid + 5 ml seyreltik jel tampon (%10 luk SDS li) + 20 µl TEMED + 200µl APS Homojenizasyon sıvısı ve ticari olarak alınan 14,000-66,000 Da moleküler ağırlıkta olan markır için 2X Leamli tamponu hazırlanır. 2X Leamli tamponu için; 2,5 ml 0,5 M tris-hcl (ph 6.8) + 2 ml gliserol + 4 ml %10 SDS + 0,5 ml saf mercaporthanol + 0,5 ml bromocresolpruple (%0.001) mavisi karıştırılmış ve son hacim saf suyla 10 ml ye tamamlanır. On adet S. gilvifrons ependorf tüplere alınıp üzerine 50µl homojenizasyon sıvısında ezilir. Homojenizasyon sıvısı için 2X Leamli den 0,5 ml çekilip, üzeri 0,5 ml saf su ile tamamlanır. Markır hazırlanırken; 14,000-66,000 moleküler ağırlıkta olan markır şişesi içine 1,5 ml 1X Leamli karıştırılır. 1X Leamli; 2X Leamli den 0,75 ml çekilip, üzeri 0,75 ml saf su ile tamamlanarak elde edilir.

51 Glutathione S-Transferase Enzimlerinin Doğal Olmayan Kesikli Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE) Yöntemiyle Belirlenmesi Markır ve homojenazyon sıvısı benmari içinde 5dk kaynatılır. Denatüre hale gelen 10 µl markır ve 20 µl enzim kaynağı jellere yüklenir. 5X tank tamponu 15 g 0,025M Tris + 72g 0,192 M glisin + 5 g SDS in 1 l su içinde hazırlanır. Oda sıcaklığında 5 kez sulandırıldıktan sonra tanka doldurulur. Oda sıcaklığında 150V da 90 dakika koşturulur. Kasetlerden ayrılan jellere Hızlı Coomassie boyama yapılır. Hızlı Coomassie boyama iki aşamada gerçekleştirilmiştir. 1. Jeller bir kapta 12,5 ml izopropanol, 5 ml asetik asit, 32,5 saf su bulunduran izopropanollü fiksatif içinde, oda sıcaklığında, düşük hızda 1 saat çalkalanır. 2. hızlı boyama çözeltisi uzaklaştırılıp, jeller 10 ml asetik asit, 90 ml saf su ile hazırlanan hızlı yıkama çözeltisinde çalkalanarak yıkanır. Jeller %7 lik asetik asit içine konulmuş ve yaklaşık 1 gün sonra Jel görüntüleme sistemi ile fotoğrafları çekilr. Daha sonra jel görüntüleri GelQuant programı kullanılarak analiz edilmiş markıra göre molekül ağırlıkları hesaplanır.

52 2) Protein Elektroforez PAGE polyacrilamide gel electrophoresis kesiksiz (tek ayırıcı jel) kesikli (yükleme jeli; büyük delikli, ayırma jeli; küçük delikli)

53

54

55

56

57 Jelin Koşturulması

58 Proteinin yürüdüğünü gösteren İzleme boyası

59 Koşturma işlemi Boyama Protein jelinin boyama sonucu görüntüsü

60 Western Emdirimi (Blotting) Elektroforez sonrası jel üzerinde bir takım enzimler ortaya çıksa da çok düşük molekül ağırlıklı(1-5ng) proteinler bu jelin polimer ağı içerisinde gömülü halde bulunurlar. Bu nedenle bu proteinlerin saptanması için ayrı bir yöntem kullanmak gerekmektedir. Pasif emdirim Elektro-emdirim

61 Jeldeki protein bantlarının Islak filtredeki tampon aracılığı İle membran tarafından emilmesi (1-2 gün) Pasif Emdirim

62 Tank Aktarma Sistemi ile Emdirim (Islak Emdirim) 45 dk

63 Yarı Kuru Emdirim

64 Membrana geçirme işlemi Membrandaki boşlukların kapatılması Hedeflenen Proteine özgü antikor

65 2-D Jel Elektroforez 1) Bir örnekteki tüm proteinleri geniş bir skala içerisinde belirlemek 2) Farklılık ortaya koymada(dayanıklı-hassas)

66 Proteinlerin izoelektrik yüküne göre birikimi + ve yük taşıyan aminoasit İzoelektrik noktaları belli amfolit

67

68

69 Myzus persicae Primicarb dirençli ve hassas ırkların karboksilesterazlarının iki boyutlu elektroforezde İncelenmesi * * Kwon et al. 2008

70 Kesilerek Örnek alınması

71 Kesilen kısmın tüpe aktarımı Protease içeren Sıvı aktarımı Sonrasında buharlaşmaya bırakılır ve geriye kuru peptidler kalır

72 Sonrasında buharlaşmaya bırakılır ve geriye kuru peptidler kalır Tamamen kuruduktan sonra içerisine peptid çözücü bir diğer sıvı konulur ve analiz için hazır hale getirilir.

73 Sekans Analiz Teknikleri Mass Spektrofotometre (MS) sekans analizi Edman degredation sekans analizi

74 Mass Spektrofotometre ile Sekans Analiz Teknikleri 1 - Peptid kitle parmakizi metodu [Peptide mass fingerprinting, Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (Maldi MS)] 2 - Sekans bazlı tanımlama (Sequence based identification, Tandem MS-MS) 3 - Sıvı kromotografi-kütle spektrofotometre (LC-MS) ile sekans analizi

75 LC-MS Spektrofotometre

76 Tüp içerisindeki kürecikler tarafından peptidler uyarılır ve uyarılma derecelerine göre düzenli bir akış olur. Çözülmüş peptid sıvı kromotograf (LC) tüpüne konulur.

77 Peptidler + yükle yüklenir Elektrik yüküyle beraber ağırlığına göre ayrım olur. Bu boşlukta damla buharlaşır. İyonlar yüklü MS e geçer. 2 +, 2 yüklü çubuk Peptidler 1. kısımdan vakum İçerisinde geçer. Bunun yanında gaz moleküller 2. Kısma geçiş yapar. Genellikle Nitrojen ve argon dur.

78 Peptidler 2. kısımdaki gaz ile çarpışırlar. Peptidler kısımlara ayrılırlar ancak Kendilerini oluşturan aminoasitlere ayrılmaz. Yalnızca + yükle yüklü peptid kısımları bu plaka tarafından bir sonraki kısma gönderilir. Yükü olmayanlar direk geçiş yapar.

79 Zamanlayıcı peptid kısımlarının plakadan dedektöre kadar ne kadar sürede ulaştığını hesaplar. Ağırlığı fazla olanlar çabuk ulaşırken, Ağırlığı az olanlar daha geç ulaşacaktır. Yandaki şekilde verilmiş olan pikler peptidin ulaşma zamanı aynı zamanda ağırlığını belirlemektedir.

80 Bu yöntemle birlikte her peptid Bağındaki aminoasitin ağırlığı Belirlenebilmektedir. Bundan sonraki işlemde ise elde edilen veriler bilgisayar ortamında diğer bilinen aminoasit sekansları ile karşılaştırılır ve muhtemel protein belirlenir.

81 Primicarb dayanıklı M. persicae ırkının esteraz sekans analizi

82 Dİğer MS Teknİklerİ

83

84

85 Edman Degradation Aminoasit Sekans Analizi Bir peptid deki aminoasitlerin sekansı için kullanılan bir yöntem Terminal bir amino grubu kullanılarak işlem yapılmaktadır. Peptid deki amino grubu diğer pepttid bağları bozulmadan belirlenmektedir. Phenylisothiocyanate (HPLC de ajan kullanılan kimyasal madde) türevi Phenylthiocarbamoyl türevin aminoasit ile bağlanması Phenylthiohydantoin (PTH)- aminoasit Kromotografi

86 clc Capillary 492 Protein Sequencing System MS yerine Edman degradation kullanılması daha yaygındır. daha fazla peptid belirlenebilmesi (MS: en fazla 20) (ED: en az 30, en fazla 60)

87 Protein Array (Chip) Teknolojisi Farklı amaçlar için kullanılır; Antikor-antijen Protein-protein Protein-küçük moleküller Protein-nükleik asit Protein-lipid interaksiyonlarının belirlenmesinde kullanılır.

88 Yüzeye bilinen bir protein, antikor vb. bağlanır. Belirlenecek örnek yüzeye aktarılır.

89 Maya 2 Hibrit Metodu Mayanın gen transkripsiyonu mekanizmasından yararlanır. Bait; bilinen bir protein Prey; bilinmeyen protein İki proteinin etkileşimi Reporter gen Reporter gen oluşturan hücreler DNA sekans analizi yapılır.

90