2 Gilissen et al., EJHG 2012

Transkript

1 Klinik Pratikte Ekzom Dizilemesi Dr. Zafer Yüksel Tıbbi Genetik Uzmanı / Tıbbi Raporlama Ekim 2016

2 2 Gilissen et al., EJHG 2012

3 Genom Samanlık Varyantlar İğne 3,200,000,000 baz/haploid genome >200,000 kodlayan ekzon (> baz) > 4,000,000 «benign» varyant (SNV)/kişi Çoğu (>20.000) «benign» yapısal varyant/kişi Moleküler genetik tanı testleri genom başına bir (veya birkaç) mutant baz tanımlamaya çalışıyor. 3

4 Tüm Ekzom Dizilemesi (WES) Gerçekler ve Rakamlar Ekzom bütün kodlayan bölgeleri içermektedir; bunlar ekzonlardır. Yaklaşık ~21,000 gene ait 200,000 ekzon Ekzom genomun %1 den biraz fazlasını oluşturmaktadır. Mendeliyen Haslıklara neden olan hastalık oluşturucu mutasyonların %85 i kodlayan ekzon bölgelerinde. Bugün itibariyle, 4,842 Mendeliyen fenotipin moleküler temeli kesfedilmiş Henüz, 1,617 fenotipin moleküler temeli bilinmemekte 15,379 gen OMIM de tanımlanmış 4

5 Yeni nesil dizileme iş akışı Metzler Nat Rev Genet (2010) 11:

6 Illumina Kütüphane Hazırlığı Özel biyotin-işaretli problar istenen bölgeye bağlanır Manyetik streptavidin boncukları biyotine bağlanır Head et al. Biotechniques Manyetik destek üzerinde istenilen fragmanların çoğaltılması 6

7 Bütüncül WGS / WES / CES akış şeması WES/CES örneği WGS örneği Çoğaltma protokolü PCR sız protokol WES CES WGS Evrensel Illumina Biyoinformatik Yazılım Zinciri Illumina Yazılım Zinciri Sağlam Varyant Veritabanı WGS raporu WES raporu CES raporu 7

8 Illumina Yazılım Zinciri Fastq Hazırlığı Kalite Kontrolü Bwa-mem ve tek basamakta sıralama Harita Sıralaması Baz rekalibrasyonu GATK en iyi pratik Indel düzenlenmesi Üçlü varyant çağırma GATK, Freebayes, samtools Bileşik varyant çağırma İstatistik Tek varyant çağırma Veritabanı yüklemesi 8

9 The Human Phenotype Ontology (HPO) Genel Terim Organ Anomalisi Kalpdamar Anomalisi HPO insan genetik sendromlarında karşılaşılan fenotipik anomalilerin standartlaştırılmış kelime dağarcığını sağlamaktadır. Kalp Anomalisi Kalp Malformasyonu Kardiyak Septa Anomalisi Kardiyak atriyum Anomalisi Atriyal Septum Anomalisi Atriyal Septal Defekt Özel Terim 9

10 Derin fenotipleme ve veritabanı oluşturulması 10

11 Seizure Global developmental delay Abnormal facial shape Spasticity Microcephaly 11

12 Biyoinformatikçileri çok ama çok sevelim >60,000 varyant / ekzom (!) Hepsi mümkün olan bütün bilgi ile dipnotlandırılmış! 12

13 Varyantları Önceliklendirme: Sıklık ve Fonksiyon Gilissen et al., EJHG

14 Varyant dipnotasyonu Hepsi mümkün olan bütün bilgi ile dipnotlandırılmış! Varyantı gösteren okumaların yüzdesi Bilinen SNP? GO terimleri? Yolaklar? OMIM? VARYANT HGMD? HGMD? HGMD? PubMed Korunmuşluk Skoru? Diğer ekzomlar Other exomes Diğer ekzomlar Fare KO Fenotipi? Varyant temelli dip not Gen temelli dip not 14

15 Variant Annotation ExAC MitImpact 2 dbscsnv SnpEff dbnsfp HGMD 15

16 Varyant Önceliklendirme ~60K total varyant Ekzonik/splice varyantlarını tanımlamak için gen temelli dipnotlandırma ~13K varyant Biyoinformatik ~3K varyant Eş anlamlı ve korunmayan varyantların çıkartılması dbsnp ve 1000 Genom Projelerindeki varyantların çıkartılması Varyant sınıflandırması/ CentoMD ~150 varyant ~10 gen 1-2 gen Sağlıklı popülasyonda yüksek sıklıkta bulunan fonksiyon kaybettirici «Gereksiz» genlerin çıkartılması Aile bireyleri arasındaki ortak genotip Resesif hastalık bileşik heterozigosite varyantlar Filtrelenmiş Resesif hastalık homozigot varyantlar Hepsi Dominant monogenik hastalık 16

17 Richards et al., (2015) Genetics in Medicine 17

18 Richards et al., (2015) Genetics in Medicine 18

19 CentoMD Fenotip ve genotip arasındaki açığı kapatmakta CAP/CLIA sertifikalı kalite Human Phenotype Ontology (HPO) 19

20 CentoMD gerçekler ve rakamlar (Ekim 2016) Gen İlişkili fenotip Analiz edilen bireyler Ülke Tanımlanan benzersiz varyant Tanımlanan allel Yayınlanmamış ilişkili genetik varyant > 22,000 > 2,900 > 74,000 > 100 > 2.2 milyon > 200 milyon ~ %56 20

21 Rastlantısal Bulgular CENTOGENE ACMG rehberine uymaktadır 21

22 Klinik dizileme? EVET Klinik uygulamar için genom veya ekzom dizilemesi tıp pratiğine girmiş bulunmaktadır. Amaç: köken olarak genetik olduğundan şüphelenilen nadir, klinik olarak tanınamayan veya çok güç tanınabilen hastalıkların tanısını koymak Leslie G. Biesecker and Robert C. Green, NEJM, 19 June

23 WES öncesi Genetik testlerin sayısı ve tipi Valencia et al PMC

24 Kendi sonuçlarımızdan: 997 aile Patojenik ve muhtemel patojenik n=325 33% Negatif n=409 41% Önemi bilinmeyen varyant n=263 26% (Trujillano, Bertoli-Avella et al., accepted) Lee et al., JAMA, 2014: N= 814, Trio 31%, Solo 22% Yang et al., JAMA, 2014, n= % Farwell et al., Genet. in Medicine, 2014 N= % 24

25 CentoCard Hazırlık Örnek Hazırlaması Kan, amniyotik sıvı Örnek Transferi Örnek Toplanması Örneğin Kurutulması

26 Vaka Örneği - WES Paylaşılan klinik bilgi: 5 aylık kız Büyüme geriliği, Azalmış kafatası kemikleşmesi, Lenfödem, Hipertrofik kardiyomyopati, Kardyiomegali, Patent duktus arteriosus, Mitral yetmezlik, Sol ventriküler hipertrofi ve İmmünyetmezlik Gen (transkript) Varyant Zigosite Hastalık, Kalıtım (OMIM No) İndeks Anne Baba Varyant Sınıflandırması INSR (NM_ ) c.433c>t (p.arg145cys) Hom. Het. Het. Donohue sendromu, Leprechaunism, OR (246200) Patojenik (Sınıf 1) IFNGR2 (NM_ ) c.705c>a (p.tyr235*) Hom. Het. Het. İmmünyetmezlik 28, mikobakteriyozis, OR (614889) Patojenik (Sınıf 1) 26

27 Vaka Örneği - WGS Paylaşılan Klinik Bilgi: 2 yaş erkek Kilo alamama, hipokalemi, hipomagnezemi ve alkalozis. Etkilenmemiş ebeveynler akraba ve benzer şekilde etkilenmiş iki tane daha erkek çocukları mevcut. Bartter sendromu düşünülmüş. WES negatif intronik kapsama yok Gen (transkript) SLC12A3 (NM_ ) Varyant Zigosite Hastalık, Kalıtım (OMIM No) İndeks Anne Baba c c>t Hom. Het. Het. Gitelman Sendromu (263800, AR) Varyant Sınıflandırması Patojenik (Sınıf 1) 27

28 WES in Dezavantajları Çoğaltma hataları: Bu en önemli dezavantajdır. Ekzom, hibridizasyon veya amplifikasyon yöntemlerinden herhangi biri ile «zenginleştirilirken» dizileme hataları oluşturmaktadır. Aynı zamanda DNA yı PCR ile amplifiye ediyoruz, bu da hatalara sebep oluyor çünkü bütün bölgeler aynı biçimde amplifiye edilememektedir. Kapsama problemleri: Çoğaltma ve amplifiye basamakları nedeniyle ortaya çıkmaktadır ve bölgelerin zayıf kapsanmasına veya kapsanmamasına yol açmaktadır. Ekzonlarda olmayan mutasyonlar (ör. düzenleyici elementlerde ise) tespit edilememektedir. Çözüm: Tüm genom dizilemesi (WGS) yapmak 28

29 WES ya da WGS: Neler farklıdır? Ekzom Sadece kodlayan bölgeye odaklanmaktadır (ekzon) Daha düşük maliyet Daha hızlı Hedef bölgenin tam olmayan yakalanması Bilinen biyolojiye yönelik taraflılık (tıbbi olarak anlamlı genler) Genom Tam dizi Yüksek maliyet Bilgi İşlem Zorlukları: oluşan verinin büyüklüğü 29

30 Gelecekte WGS WGS büyük ihtimalle WES in yerini alacak çünkü: Yöntemsel olarak bakarsak; daha iyi çünkü daha az hataya, daha homojen kapsamaya ve daha iyi indel analiz özelliğine sahip Genomun ekzonik olmayan bölgelerine dair bilgimiz artmakta ve bu bölgeleri değerlendirmek mümkün hale gelecek Giderek ucuzlamakta 30

31 WGS şimdi ne zaman endike? WES endikasyonu olduğu durumlarda endikasyon mevcuttur: Heterojenite Benzer fenotip bir çok gen Entellektüel yetersizlik/gelişme geriliği, epilepsi, müsküler distrofi, ataksi, nöropati, işitme kaybı veya retinitis pigmentoza Belirsiz fenotipler Kesin olmayan fenotipler Atipik klinik takdim VEYA WES negatif 31

32 Hastalık oluşturucu varyantların tanımlanması Bütün vakaların %21 i Mendeliyen hastalıkları olan vakaların %34 ü Üçlü aile örneklerinin (Trio) %57 sinde 32

33 WGS ve WES Neden öneriyoruz Hastalık oluşturucu varyantların tanımlanmasında oldukça etkin: WES başarı oranı %33 lere yaklaşmakta Kısa geri dönüş süresi / maliyet-etkinlik Binlerce genin ayni anda tarafsız değerlendirlmesi Çifte tanı imkanı mümkün Büyük ölçüde heterojen genetik hastalıklarda özellikle faydalı 33

34 İlginiz için teşekkür ederim. Dr. Zafer Yüksel Tıbbi Genetik Uzmanı / Tıbbi Raporlama CENTOGENE AG Schillingallee Rostock, Almanya Tel: E-posta: İnternet: zafer.yueksel@centogene.com