TekniktenEndikasyona tüm yönleriyle KRAS mutasyon Analizi 22. Ulusal PatolojiKongresi 7-11 Kasım 2012, Antalya Moleküler Patoloji

Transkript

1 TekniktenEndikasyona tüm yönleriyle KRAS mutasyon Analizi 22. Ulusal PatolojiKongresi 7-11 Kasım 2012, Antalya Moleküler Patoloji Prof.Dr. Sibel Erdamar Çetin Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı

2

3 3 domainden oluşur: Ekstrasellüler domain Transmemran domain Sitoplazmik Domain (Tirozin kinaz domain)

4 Normal hücrede bölünme

5

6 Anti EGFR Hedefe Yönelik Tedavi AntiEGFR monoklonal antikorlar Cetuximab, Panitumumab Tirozin kinaz inhibitörleri Gefinitib, Erlotinib Ligand toksin ve immunotoksin konjuganlar Antisense oligonükleotitler EGFR/ligand etkili aşılar

7 EGFR- Hedefe yönelik tedavi

8

9

10

11

12

13

14 RAS PROTOONKOGEN AİLESİ 1970 de Scolnick EM tarafından bulundu Scolnick EM:Proc Natl Acad SCİ USA, 67:1970 Kirsten Ras Sarcoma viral onkogen (KRAS) Harvey Murine sarcoma viral oncogen (HRAS) NRAS %90 homoloji gösterir, ilk 165 aa aynıdır. Küçük GTP-bağımlı protein süper ailesi (G proteinleri)

15 G protein ailesi: 20-40kDa, monomerik proteinler GDP ve GTP ye bağlanırlar Yak 150 G proteini saptandı. Bunlar 5 aileye ayrılır: Ras, Rho,Rab, Sar1/Arf, Ran.

16

17 Ras proteinlerinin Aktivasyon Döngüsü

18

19 RAS Ailesindeki mutasyonlar tüm insan malignitelerininyaklaşık %30 unda bulunmuştur: Pankreas Kolorektal Akciğer Karsinomları Solid tümörlerde ensık kodon 12, 13 ve 61 de aminoasit değişimleri görülmektedir.

20 Human Kras Onkogeni Kras Onkogeni KRK ların %30 unda kras mutasyonu >3000 kras nokta mutasyonu Kras genindeki somatik mutasyonlar tek aminoasit değişimlerine yol açar EGFR mutasyonlarından bağımsız En sık ekzon 2; kodon 12 ve 13 Daha az kodon 61 ve 146

21

22 Kras Mutasyonu Ras sinyal ileti yolunda sürekli aktivasyon Anormal hücre proliferasyonu ve diferansiyasyonu İleri Evre Artan metastatik potansiyel Kötü prognoz Azalmış DFS ve OS

23

24

25

26

27

28

29 KRAS bir Biomarkerdır Kras geninin genetik statusunun tespiti önemlidir. İmmunhistokimyasal bir yöntem yok Moleküler metotların kullanılması gereklidir.

30 Kolorektal Karsinomlarda Kras Mutasyonu COSMIC database Sanger Center codon DNA protein aminoacid WT GGT GGC Glycine AGT GGC c.34g>a p.g12s Serine CGT GGC c.34g>c p.g12r Arginine TGT GGC c.34g>t p.g12c Cysteine GAT GGC c.35g>a p.g12d Aspartate GCT GGC c.35g>c p.g12a Alanine GTT GGC c.35g>t p.g12v Valine GGT GAC c.38g>a p.g13d Aspartate Mutasyonların %98 i ekson 2 de kodon 12 ve 13 de olmaktadır

31 KRAS Mutasyon tipleri

32 KRAS MUTAYON ANALİZİ PREANALİTİK AŞAMA

33 DOKUNUN SEÇİMİÇOK ÖNEMLİDİR

34 Özellikle hazır bloklarda dikkatli olunmalı Gönderen Doktor Orijinal Tanı Hazır bloktaki numara ile orijinal Patoloji Raporu mutlaka karşılaştırılmalı Birden fazla biyopsi/rezeksiyon varsa enaz nekroz olan en çok invaziv alanı olan blok seçilmeli Mutlaka yeni kesit yapılarak tanı konfirme edilmeli

35 Tümör püritesi: Yüksek oranda nontümöral dokular (destek dokusu, inflamatuar hücreler, nekrotik debriler elimine edilmelidir Tümör oranını artırabilmek için microdiseksiyon uygulanabilir: Testin doğruluğu için elde edilen dokunun en az %75 i tümör dokusundan oluşmalıdır

36

37 pürite Genel olarak en az nekroz içeren En fazla invaziv alan içeren blok şeçilmeli Adenom zemininde gelişmiş olanlarda mümkün olduğunca invaziv alan seçilmeli

38 Fiksasyon: Fiksasyon tipi. Formaldehit halen moleküler testler için güvenilirdir Pikrik asit içeren, dekalsifikasyon solusyonlar Fiksasyon süresi 24 saatin üzerinde DNA miktarı ve kalitesi azalır

39 Hunt JL, Arch Lab Med, 2007

40

41

42 Karaciğer metastazlarında yaygın nekroz olabilir. Rektum tümörlerinde neoadjuvan KT/RT sonrası tümör kalmayabilir, yada çok az miktarda olabilir. Bu durumda preop biyopsi materyaline ulaşılması denenebilir.

43

44

45

46 KRAS Mutasyonunun tespiti DOKUNUN SEÇİMİ ÇOK ÖNEMLİDİR! Doku genomik DNA primer tumor/metastatik tümör Donmuş doku/ formalin fikse Parafin blok HE boyasız Sanger-sequencing ARMS -PCR analiz PCR/sequencing hybridization, Pyro-sequencing

47

48 ANALİTİK AŞAMA

49

50 KRAS Mutasyon tespitinde kullanılan yöntemler 1. Sanger-sequencing (didesoxy-termination sequencing) 2. pyro-sequencing 3. allele-specific PCR (ARMS -PCR) 4. melting point analiz 5. chip-hybridisation 6. HPLC 7. diğer

51

52 Didesoxy-Sequencing Perkel J. The Scientist 40, Sep 2004

53 KRAS-Mutasyon Analizi electropherogram didesoxy-sequencing Kullanım spektrumu: Nokta mutasyonu: KRAS, BRAF, JAK2 delesyon: ckit, EGFR insersiyon: ckit, EGFR sonuç: electropherogram kompleks teknoloji Sensitivite ~ %70

54 KRAS2/E2. F: 5 -GTG TGA CAT GTT CTA ATA TAG TCA-3 KRAS2/E2. R: 5 -CTG TAT CAA AGA ATG GTC CTG CAC-3

55

56

57

58

59

60

61 Pyro-sequencing pyrogram GGTGGCGTAG WT AA A CC GGTGGCGTAG TT c.35g>a

62 KRAS-Mutasyon Analizi pyrogram Pyro-sequencing Kullanım spektrumu: Nokta mutasyonu: KRAS, BRAF, JAK2 delesyon: (ckit, EGFR) insersiyon: (ckit, EGFR) typing: (HPV, Bakteriler ) metilasyon: MGMT sonuç: pyrogram sensitivite: 2 5 % Microdiseksiyonla yapılabilir

63

64 ARMS -PCR amplification refractory mutational system ARMS -PCR = allele specific PCR

65 PROBLAR DNA ya bağlanan (binding) boyalar (SYBR Green) Hidrolizasyon probları(taqman) Molecular beacons Scorpions FRET (Floresan rezonans enerji transferi) probları

66 ARMS -PCR scorpion probe DxS Ltd.

67 KRAS-Mutasyon Analizi ARMS -PCR result: amplification plot Kullanım spektrumu: Nokta Mutasyonları: KRAS, BRAF, EGFR sensitivite ~ 1 % Mikrodiseksiyon yapılabilir

68

69

70 MİKROARRAY CİHAZI ÇİPLERİ Film çip Film rulosu Spotlanmış array Mikroarray çipi

71 Reg Reg Reg B B B Ref Duplike ya da triplike spotlara DNA dizilir Dışta kalan sinyaller elimine edilir Arkaplan ışımasının konrolü amacıyla 5 adet spot DNA içermez Hibridizasyon kontrolü yapılır

72 Anti-zip code (18-24 bp) Cy5-dCTP Zip code (bioçipte spotlanmış) Özgün genetik varyant

73 REAL-Time PCR KRAS Codon 12: Gly12Asp, Gly12Ala, Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Arg, Gly12Cys KRAS Codon 13: Gly13Asp Microarray teknik KRAS Codon 12: G12A, G12C, G12D, G12F, G12R, G12S, G12V KRAS Codon 13: G13A, G13AC, G13D, G13R, G13S, G13V KRAS Codon 61: Q61E, Q61H, Q61K, Q61L, Q61P, Q61R BRAF Codon 600: V600A, V600D, V600E, V600KRM

74 Sıra No. K-Ras Mutasyon Analizi Sonucu Sıra K-Ras Mutasyon Analizi Sonucu No. Light Cycler 480 Infiniti Light Cycler 480 Infiniti 1 12ASP (GGT>GAT) 12ASP 21 Negatif G12ASP 2 Negatif Negatif 22 Negatif Negatif 3 Negatif Negatif 23 Negatif Negatif 4 Negatif Negatif 24 Negatif Negatif 5 13ASP (GGC>GAC) V600KRM(BRAF) 13ASP 25 Negatif Negatif 6 12ALA (GGT>GCT) 12ALA 26 Negatif Negatif 7 Negatif Negatif 27 Negatif Negatif 8 Negatif Negatif 28 Negatif Negatif 9 Negatif Negatif 29 Negatif Negatif 10 Negatif Negatif 30 Negatif Negatif 11 Negatif Q61L(KRAS CODON61) 31 Negatif Negatif 12 Negatif V600A(BRAF) 32 Negatif Negatif 13 13ASP (GGC>GAC) 13ASP V600KRM(BRAF) 33 Negatif Negatif 14 Negatif Q61H1??? 34 Negatif V600E1(BRAF) 15 Negatif Q61H1(KRAS CODON61) 35 Negatif Negatif 16 Negatif Negatif 36 12CYS (GGT>TGT) Sonuçsuz 17 Negatif Negatif 37 12ALA (GGT>GCT) 12ALA 18 Negatif Negatif 38 12SER (GGT>AGT) 12SER 19 12ASP (GGT>GAT) 12ASP 20 12VAL (GGT>GTT) 12VAL

75 KRAS Mutasyon Analizi CTF Patoloji AD Serisi N=401 Kras mutasyonu + n: 177 (%44,1) Braf mutasyonu + n:22 (%5,1) Kras WT olanlarda BRAF (+): n=17 KRAS+/BRAF+: n=5

76 %44,1 KRAS (+) KRAS(-)

77 CTF (%) n=401 Jung ve ark (%)n=879 12ASP 36,5 12ASP 36 13ASP 21,4 12VAL 21,8 12VAL 19,5 13ASP 18,5 12CYS 7,5 12CYS 7,8 12SER 6,3 12SER 6,5 12ALA 3,5 12ALA 6,0 Jung ve ark. Pathology Research and Practice, 2009 n=879 primer, 139 metastaz Kras(+) %39.3

78 Kras WT 61,9±5,42 0,021 Kras kodon 45± 3,88 12/13 Lİ 65,9±5,7 0,020 Lİ+ 52,7±4,3 PNİ- 69,2±6,7 0,030 PNİ+ 47,4±3,1 Vİ- 64,3±4,7 0,020 Vİ+ 49,8±5,4

79 Fatih Selcukbiricik, Sibel Erdamar, Canan Ünlü Özkurt, Deniz Tural, Evin Büyükünal, Mustafa Özgüroğlu, Fuat Demirelli, Süheyla Serdengeçti. THE ROLE OF K-RAS AND B-RAF MUTATIONS AS BIOMARKERS IN METASTATIC COLORECTAL CANCER. BUON; December 2012

80 Moleküler-Patolojik analiz Yanlış negatif nedenleri 1. Deteksiyon sistemlerinin sensitiviteleri: Sanger-sequencing: ~ % 70 tümör DNA pyro-sequencing: ~ % 2 5 tümör DNA ARMS -PCR: ~ % 1 tümör DNA 2. Yanlış blok 3. Az miktarda tümör hücresi içermesi 4.Doku tespiti? 5.DNA miktarı

81 Kras mutasyon testi İnformasyon 5-10 gün KRAS-wildtype GGTGGC Onkolog doku Patolog Parafin blok

82 Kalite Kontrol Sistemleri Validasyon Avrupa Patoloji Derneği (ESP) EMQN (European Molecular Genetics Quality Network UKNEQAS (UK National External Quality assessment for molecular genetic)

83

84

85

86

87

88

89 Raporlama Gönderen doktor Hangi blok kullanıldı Kesitteki tümör yüzdesi Ne kadar DNA kullanıldı Hangi teknik kullanıldı Sensitivitesi nedir Hangi bölgeler incelendi Mutasyon sonucu Kras mutasyonu görüldü/görülmedi (negatif/ pozitif ifadesi kullanılmamalı) Kras mutasyon alt tipi Tekniğe bağlı olarak bilgisayar çıktısı rapora eklenmeli

90 Kras mutasyon alt tipleri Raporda yer almalı mı?

91 JAMA, 2010

92

93

94

95

96

97 Highly accurate, massively parallel next generation sequencing approaches.. the dna is in our hands..

98

99

100

101

102 CTF PATOLOJİ AD MOLEKÜLER PATOLOJİ LABORATUVARI Biol.Esra Simsir Biol.Canan Özkurt Uzm.Dr.Şebnem Batur Uzm.DrNuray Kepil TEŞEKKÜRLER

103

104

105

106

107 Kolorektal Karsinomlarda Kras 0.03 (14) 0.02 (15) 0.01 (17) 0.02 (18) 0.09 (19) 0.05 (22) 0.01 (23) 0.01 (27) 0.01 (31) 0.01 (35) 0.08 (59) 0.01 (60) 1.47 (61) 0.01 (63) 0.01 (72) 0.01 ( (117) 0.09 (146) mutasyon spektrumu COSMIC database Sanger-Center (13) (12) 0.02 (5) 0.02 (8) 0.02 (9) 0.03 (11)

108 Kras Mutasyon Analizi Kim tarafından yapılmalıdır? Hangi doku, nasıl kullanılmalıdır? Kim Tarafından değerlendirilmelidir? Hangi Yöntemler kullanılmalıdır?

109 Hedefe Yönelik tedaviler Terapi ajanı Tümor Hedef Biomarker/ araştırıcı Trastuzumab Herceptin, Roche Meme Karsinomu Growth factor receptor HER2 HER2, Patolog Rituximab MabThera, Roche B-celllymphoma Surface molecule on B-cells CD20 CD20, Patolog Imatinib Glivex, Novartis GIST KIT-receptortyrosinkinase c-kit, Patolog Panitumumab Vectibix, Amgen Kolorektal Karsinom Growth factor receptor EGFR KRAS Patolog Cetuximab Erbitux, Merck-Serono