Figen Zihnioğlu. Ege Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyokimya Bölümü, Bornova/İzmir.

Transkript

1 PROTEİN İZOLASYON VE SAFLAŞTIRILMASI Ş Figen Zihnioğlu Ege Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyokimya Bölümü, Bornova/İzmir.

2 Proteinler; Fonksiyon Tüm organizmalarda kompleks k fonksiyonlar ve metabolik reaksiyonların çoğu proteinlerce gerçekleştirilmektedir. Kataliz, Yapı, Hareket, Savunma, Regülasyon, Transport, Depo, Strese Yanıt vb. birçok fonksiyondan sorumludurlar. Protein Fonksiyonu Yapıya bağımlığ

3 Proteinler; Fonksiyon Biyolojik bir kompartımanda bulunan proteinlerin sayısı, fonksiyonların kompleksliği ile orantılıdır. Canlı yaşamını ilgilendiren hemen hemen her konuda proteinlerin önemli olması nedeni ile yapılarının ve biyokimyasal özelliklerinin araştırılması zorunludur.

4 Bir proteinin amino asit kompozisyonu ve dizisinin aydınlatılması öncelikle ilgili proteinin saf olarak eldesini gerektirir. Gerçekçi bir yaklaşım ile % 100 saflık beklemek mümkün değildir.!!! ğ Bir proteinin saflaştırma stratejisinde bir seri ayırma metodu ve adımı yer alır. Her bir protein için saflaştırma prosesi p ç ş p ilgili protein için spesifiktir.

5 Protein Saflaştırılmasının Amacı 1. Endüstriyel Kullanım 2. Araştırma; Yapı Analizi Amaca göre saflık kriteri değişir. Endüstriyel (farmasötik preparatlar hariç) kullanım; Yüksek miktarda, kararlı, iyi karakterize edilmiş, düşük maliyette, saflık oranı yüksek olmayan preparatlar P t i k i i it di i i Protein; yapı, kompozisyon veya amino asit dizisi analizi; mümkün mertebe saf ve homojen preparatlar

6 Protein Saflaştırılması; Planlama Protein saflaştırılmasında göz önünde bulundurulması gereken ana kriterler; 1. Saflık 2. Verim 3. Ekonomi

7 Protein Saflaştırılması;Planlama- Strateji Protein Kaynağı Protein Üretimi Protein Kazanımı (Ekstraksiyon) k Genel Yaklaşım Ön Saflaştırma Konsantrasyon Kaba Fraksiyonlama İleri Düzeyde Ayırma Yüksek Rezolüsyon Kromatografik ve Elektroforetik Teknikler Saflık Kontrolü Karakterizasyon

8 Protein Saflaştırılması Planlama- l Strateji t İstenilen saflıkta, en az adımla ve yüksek verimle protein saflaştırılmasında uygun işlem sırasının ilgili bilgiler doğrultusunda planlanması son derece önemlidir. Saflaştırma amacı Hedef proteinin kaynağı ve lokalizasyonu Hedef proteinin miktarı(ekspresyon seviyesi) Fizikokimyasal ve biyolojik özellikleri

9 Protein Saflaştırılması Planlama- Strateji Planlamada ilk ve önemli yapılması gereken iyi bir literatür taraması ile ilgili proteinin fizikokimyasal ve biyokimyasal özellikleri hakkında detaylı bilgi i toplamaktır. Örneğin tabiatı

10 Saflaştırma stratejisi geliştirmede protein özellikleri

11 Protein Saflaştırılması Planlama- l Strateji t Kaynak seçimi Mikroorganizma Hayvan Bitki Seçim Amaca bağlı

12 Lokalizasyon Hedef protein; organizmanın (hayvan, bitki, M/O) spesifik bir kısımında olabilir. Örneğin; Hayvan M/O Bitki İskelet kası, karaciğer, kalp, Intraselüler, Yaprak, çiçek, kök, kan,,p pankreas, vb. Ekstraselüler gövde,tüber,, tohum vb. Tür ve organ tipi kullanılacak yöntemin belirlenmesinde önemlidir!!!!!!

13 Kaynak seçimi sonrası protein saflaştırılmasına başlamadan önce göz önüne alınması gereken kriterler Sıcaklık İyonik şiddet ve ph Organik çözgenler ve deterjanlar Protein Konsantrasyonu Köpük/film oluşumu Proteolitik enzimler

14 Protein Saflaştırılması; l Planlama- Strateji Protein saflaştırmasında sabit yöntem yoktur. Genel strateji göz önüne alınarak ayrılacak proteinin özelliklerine göre yöntemler araştırıcı tarafından seçilir. (Boyut/Kütle, Çözünürlük, Yük, Hidrofobisite, Afinite vb. )

15 Protein saflaştırma adımlarının seçiminde ve kombinasyonunda pratikçe önemli kriterler Amaç; istenilen saflıkta en hızlı ürün eldesi Her bir teknik rezolüsyon, kapasite, hız ve verim arasında bir denge ve uyumluluk l olmasını gerektirir.

16 Saflaştırma sırasındaki kayıplar Saflaştırma prosedüründe adım sayısı mümkün mertebe azaltılmalıdır!!!

17 Saflaştırmada hedeflenen protein miktarı, saflaştırma seviyesi ve amacı; protokol seçimini etkilemektedir.

18 Protein Saflaştırılmasının aşt as İzlenmesi e es Protein saflaştırılması çok adımlı bir prosestir ve her adımında saflaştırmanın gidişinin izlenmesi gereklidir. Total protein tayini Hedef proteinin tayini Saflık tayini Safsızlıkların uzaklaştırılması için yöntemler

19 Saflaştırma Etkinliği Spesifik Aktivite (Unite/mg protein) Total Enzim Aktivitesi / Total Protein Kat saflaştırma = Fraksiyonun spesifik aktivitesi it i Orijinal spesifik aktivite Saflaştırma verimi Fraksiyondaki ki Total Protein Verim(%) = X 100 Orijinal Preparattaki Total Protein Fraksiyondaki Total Aktivite Verim(%) = X 100 Orijinal Preparattaki Total Aktivite

20 Protein Saflaştırma ş Stratejisi Tüm proteinler e için evrensel e bir saflaştırma stratejisi verilemez!!! Hedef proteinin özelliklerine göre araştırıcının alternatif yöntemler arasından en uygun planlamayı kendisinin yapması gereklidir. Her zaman basit olmalı ve adım sayısı az olmalı!!

21 Intraselüler Proteinlerin Saflaştırılması

22 Ekstraselüler Proteinlerin Saflaşt tırılması

23 Membran Proteinlerinin Saflaştırılması

24 Protein Saflaştırılmasında Kullanılan Ön Ayırma Teknikleri Temel Teknikler 1. Hücre Parçalama/ Homojenizasyon / Ekstraksiyon k 2. Berraklaştırma 3. Ekstraktın Deriştirilmesi İleri Düzeyde Ayırma Teknikleri Kromatografik Teknikler Konvansiyonel Sıvı (LC; düşük basınç) FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography; orta basınç) HPLC(High Performance Liquid Chromatography; yüksek basınç) Saflık Kontrolü ve Karakterizasyon Elektroforetik Teknikler PAGE, SDS-PAGE, IEF, 2D-PAGE vb. (Saflık kk kontrolü, Fraksiyonlama, Molekül külkütl kütlesi ve İzoelektrik l nokta tayini, alt birim ve izoenzimlerin belirlenmesi)

25 Ön Ayırma Teknikleri 1. Hücre Parçalama/ Homojenizasyon / Ekstraksiyon Hücre Küçük Moleküller Amino asit, Monosakkarit, Nükleotid, FFA Hücre Homojenizasyonu Makromoleküller Nükleik Protein Polisakkaritler asit Organel Ayrılması Hücre Debrisi Kaba parçalama - Blender Sert materyaller - Öğütücüler - Makaslar /değirmen oluşturmak için önce hücre pastası parçalanmalı

26 Ön Ayırma Teknikleri-1; Homojenizasyon Doku ve Hücre Parçalama teknikleri Fiziksel veya mekanik Blenderlar, öğütücüler homojenizatörler, Aşındırılar ile agitasyon (ball mill, bead mill) Sıvı ve Katı Ekstrusyon (French Press) Ultrasonikasyon Kimyasal (Lizis) Isı ile muammele Dondurma- eritme Desikasyon Osmotik şokk Litik enzimler Alkali ile muammele Deterjanlar ve çözgenler

27

28 Öğütücüler

29 Ball mill

30 Mekanik olmayan yöntemler Isı Osmotik şok Enzimatik Alkali Deterjanlar/organik çözgenler vb..

31 Hücre Parçalama Duyarlılığı Sonik Agitasyon Sıvı Katı Presleme Presleme Hayvan hücreleri Gram, bacilli & cocci Gram + ve bacilli Maya Gram + ve cocci Sporlar Miseller (7; çok iyi, 1; çok dirençli)

32 Protein parçalama/homojenizasyon prosesinin etkinliğinin belirlenmesi; Ekstraktta total protein tayini İlgili protein bir enzim ise aktivite tayini veya proteinin spesifik bir özelliğinin kullanılması ile varlığının kantitatif belirlenmesi Canlı hücre sayımı

33 Ön Ayırma Teknikleri-2; Berraklaştırma İzolasyon sırasında farklı adımlarda partiküllerin uzaklaştılması. En çok kullanılan iki teknik; * Santrifüj Diferansiyal, Yoğunluk Gradient;Subselüler fraksiyonlama * Filtrasyon(mikrofiltrasyon) Partiküllerin boyutu ve yoğunluğu hangi tekniğin kullanılacağını l ğ belirler. l

34 Berraklaştırma;Santrifüj Merkez kaç kuvveti etkisi altındaki partiküllerin bağıl molekül kütlelerine, yoğunluklarına, kompozisyonlarına ve şekillerine i bağımlı ğ davranış göstermesi prensibine dayanmaktadır. Rölatif Santrifüj Kuvveti(RCF) RCF = ω2 r rpm 2 RCF = r g 1000 RCF = Rölatif Santrifüj kovveti ω =Açısal hız g = Gravitasyonel kuvvet r = partikülün rotasyon merkezine uzaklığı ğ rpm = dönüş/dak

35 Nomogram; (RCF, i.e., g-force) RPM

36 Diferansiyal Santrifüj Homojenatın fraksiyonlanarak ayrılması, merkez kaç kuvvetinin kademeli olarak arttırılması Bileşiğin ayrılması, zamana, devir sayısına, partikül büyüklüğüne ve yoğunluğuna bağlıdır.

37 Yoğunluk Gradient Santrifüj Moleküllerin yoğunluk farklarına göre bir tüpte oluşturulan yoğunluk gradienti boyunca ayrılması Bölgesel Hız İzopiknik

38 Ön Ayırma Teknikleri-2; Berraklaştırma Filtrasyon Yarı geçirgen g bir membrana hidrostatik basınç uygulaması ile seçilen membranın gözenek boyutuna bağlı ğ olarak partiküllerin uzaklaştırılması ş Mikrofiltrasyon Nanofiltrasyon Ultrafiltrasyon Membran filtrasyon modülleri; düz tabaka, tübüler, hollow fiber ve karıştırmalı hücre olarak yapılacak işleme göre tercih edilir.

39 Membran Tipleri; Modülleri Tübüler (Spiral) Düz tabaka (flat sheet) Karıştırmalı Hücre Hollow fibre

40 Mikrofiltrasyon Boyuta bağımlı; Membranlar mikroporöz Yarı geçirgen bir membrana hidrostatik tik basınç uygulaması ile mikron boyutlu partiküllerin sıvılardan uzaklaştırılması Mikrofiltrasyonun farklı uygulamaları: Biyoreaktörlerden hücrelerin toplanması Solüsyonlardan virüs uzaklaştırılması Meyva suyu ve meşrubatların berraklaştırılması Hücrelerin fermentasyon ortamından uzaklaştırılması Su saflaştırılması Hava filtrasyonu Sterilizasyon

41 Ön Ayırma Teknikleri-3 Ekstraktın Deriştirilmesi Ultrafiltrasyon Liyofilizasyon (Dondurarak kurutma) Çöktürme Yöntemleri İzoelektrik çöktürme İyonik şiddeti azaltarak çöktürme Salting in İyonik şiddeti arttırarak çöktürme Salting out Organik çözgenler ile çöktürme Organik polimerler ile çöktürme Denaturasyon ile çöktürme y ç Diyaliz (Vakum diyalizi, tuz giderilmesi)

42 Ekstraktın Deriştirilmesi-1 Ultrafiltrasyon Molekül kütle ve şekillere göre ayrılma Etkin kuvvet; santrifüj veya basınç

43 Karıştırmalı Hücre Santrifüj Üniteleri i >0.5 ml >2ml 10-15ml

44 Ultrafiltrasyon Membran Gözenekleri; cut-off NMWC; Nominal Molecular Weight Cut-off NMWC; Membrandan geşmesi mümkün olmayan globuler molekülün minimum molekül kütlesi. Linear --- Globuler!!! Ultrafiltrasyon ile konsantrasyon alternatif metodlara göre avantajlıdır: Santrifügasyon sonrası çöktürmede, faz değişimine bağlı olarak düşük geri kazanım söz konusudur. Liyofilizasyon; uzun proses zamanı gerektirir ve tuz vb Liyofilizasyon; uzun proses zamanı gerektirir ve tuz vb. moleküllerinde aynı anda deriştirilmesi ile sonlanır.

45 Ultrafiltrasyon; Diafiltrasyon Düşük molekül kütleli moleküllerin ortamdan uzaklaştırılması Tampon değişimi

46 Ekstraktın Deriştirilmesi-2 Dondurarak kurutma; Liyofilizasyon Liyofilizasyon; uzun proses zamanı gerektirir ve tuz vb. moleküllerinde aynı anda deriştirilmesi ile sonlanır!!!

47 Ekstraktın Deriştirilmesi-3 Çözünürlük;Çöktürme Yöntemleri Çöktürme yöntemleri herhangi bir analiz öncesi veya uygun saflaştırma adımı sonrası proteinlerin i konsantre edilmesinde ve/veya izolasyonunda kullanılırlar. Çöktürmede kullanılan madde izleyen saflaştırma adımlarında ve ölçüm yöntemlerinde(protein, aktivite vb.) girişim yapabilir. Bu nedenle çözünen preparat; p diyaliz, diafiltrasyon veya jel filtrasyon gibi yöntemler ile uzaklaştırılmalıdır. Ucuz ve kolay Çözünürlüğü ü etkileyen faktörler; Yapı ve boyut Yük Çözgen

48 Çöktürme Yöntemleri ph ı Değiştirerek Çöktürme Izoelektrik Çöktürme pi = ph Protein amfoterik; yüzey; + ve - iyonlar ph > pi ; protein ( - )yüklü ph < pi ; protein ( + ) yüklü ph = pi ; (+) = (-) Moleküller birbirini iter Elektrostatik t tik çekim Çözünürlük izoelektrik noktada en az

49 Çöktürme Yöntemleri İyonik Şiddetini Değiştirerek Çöktürme salting in Çözünme salting out Presipitasyon

50 Çöktürme Yöntemleri İyonik şiddeti düşürerek ü çöktürme; salting in Düşük ş konsantrasyonlarda eklenen tuz, yüklü proteinlerin çözünürlüğünü artırır. Protein üzerindeki yük etkileşimleri ş korunur İyonik şiddetin düşürülmesi ile agregasyon. Seyrelme Örn; serum globulinleri

51 Çöktürme Yöntemleri İyonik şiddeti arttırarak çöktürme; salting out Yüksek konsantrasyonlarda nötral tuz ilavesi ile çözünürlüğün ğ azalması; en sık kullanılan metod Tuzlar proteinleri, denatürasyon, proteoliz veya bakterial kontaminasyona karşı ş korurlar. Salting out ; protein yüzeyindeki hidrofobik bölge tabiatına ve molekül kütlesine bağımlıdır. ğ

52

53 Çöktürme Yöntemleri Organik Çözgenler ile Çöktürme Ortamın dielektrik sabitini düşürürler; çözünürlük Hidrofobik ve elektrostatik etkileşim Genelde kullanılan organik çözgenler; Etanol Aseton Metanol Propan-1-ol Propan-2-ol Dioxan

54 Çöktürme Yöntemleri Organik Çözgenler ile Çöktürme Ortamın dielektrik sabitini düşürürler; çözünürlük Hidrofobik ve elektrostatik etkileşim Genelde kullanılan organik çözgenler; Etanol Propan-1-ol Aseton Propan-2-ol ol Metanol Dioxan

55 Çöktürme Yöntemleri Organik Polimerler ile Çöktürme Bazı organik polimerler, (örn; polietilen glikol:peg) organik çözgenler gibi davranırlar, ancak çok küçük konsantrasyonlarda daha fazla etkindirler. Denaturasyon ile Çöktürme Organik çözgenler Yüksek sıcaklık Aşırı ph değişimi

56 Diyaliz Yarı geçirgen membranlardan konsantrasyon gradienti yönünde molekül büyüklüğüne bağlı difüzyon Proteinlerin; i tuz, iyon ve küçük ük moleküllerden ayrılması

57 Diyaliz Membranları Selüloz asetat, polisülfon, polikarbonat, polietilen, poliolefin, polipropilen, PVDF

58 İleri Ayırma Teknikleri Kromatografik Teknikler Bir karışımda bulunan iki veya daha fazla sayıdaki bileşenin, birbiri ile karışmayan iki faz arasındaki dağılımı Sıvı Kromatografisi (LC) Durağan(Stasyoner) Faz: Katı Haretketli (Mobil) Faz: Sıvı LPLC MPLC HPLC <5 bar 6-50 bar > 50 bar μm 15-60μm 3-5μm Kolon Dedektör

59

60 Kromatografik Teknikler Sıvı Kromatografisi (LC) Moleküler Özellikler esas alınarak yapılan kromatografik sınıflama Moleküler Özellik Kromatografi Yöntemi Polarite Dağılma ğ Yük İyon Değişim (Anyon, Katyon,IEF) Moleküler kütle Jel Filtrasyon Hidrofobisite Hidrofobik Etkileşim(HIC) Spesifik molekül Afinite it bağlama

61 Ayırma Prosesine etki eden parametreler

62 Elüsyon 1. İzokratik Elüsyon 2. Gradient Elüsyon - Adım adım(step-wise) elüsyon - Lineer gradient elüsyon

63 İyon Değişim Kromatografisi Proteinlerin Yüklerine Göre Ayrılması: Protein yükü ortam ph sına göre değişken (ph > pi Anyon- Değişim) (ph < pi Katyon- Değişim) Elüsyon İzokratik Kesikli Gradient ph veya iyonik şiddet

64

65 İyon Değişim Kromatografisi Prosedürü

66

67 İyon Değişim Kromatografisi Avantajları; Büyük hacimlerde ve miktarlarda(1-5 g/100 ml) örnek uygulanabilmesi, Çok farklı koşulların kullanılabilmesi l i İyon değiştiricilerin rejenere edilebilmesi Dezavantajları; Proteinin kolon ph ve iyonik şiddetine benzer olması gerekliliği, Büyük hacimler için diyaliz, tuz uzaklaştırma ve seyrelme sorun olduğundan güvenirliğinin az olmasıdır.

68 a a a a Kromato-odaklama odaklama Chromatofocusing İzoelektrik noktalara dayalı ayırım ph gradienti kolon içinde oluşturulur. Anyon değişim matriksi ve amfolit kullanımı a a Avantajları; a a Mükemmel rezolüsyon a Farklı ph aralıklarının kullanılabilmesi a Dezavantajları; a a a a a Pahalı Kayıplar açısından ph nın bilinmesi zorunluluğu Kapasite yüksek değil

69 Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi(HIC) Proteinlerin Yüzey hidrofobisitesine Göre Ayrılması: Kesikli Gradient Tuz Elüsyon ph değişimi Polarite değişimi Deterjan ilavesi

70 Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi(HIC) Proteinlerin Yüzey hidrofobisitesine Göre Ayrılması: Avantajları; Büyük örnek hacimleri ile çalışılabilir. Büyük ük protein miktarları ile çalışılabilir. l Matriks dayanıklı Koşullar ayarlanabilir Dengeleme kolay- direkt (NH 4 4) 2 SO 4 sonrası kullanım Dezavantajları; Bağlanma için yüksek tuz konsantrasyonu çökelmelere sebep olabilir.

71 Jel Filtrasyon Kromatografisi Geçirgenlik / Moleküler Elek Kromatografisi Proteinlerin Boyutlarına Göre Ayrılması:

72 Jel Filtrasyon Kromatografisinin Uygulamaları Ekstraktın deriştirilmesi Grup ayırmaları(desalting) Fraksiyonlama(analitik, preparatif) Moleküler kütle tayini Protein bağlanması ve kompleks oluşumu için denge sabitlerinin hesaplanması Agregat oluşumu proteinlerin ve Agregat oluşumu, proteinlerin ve denatürasyonunun analizi

73

74 Jel Filtrasyon Kromatografisi Geçirgenlik / Moleküler Elek Kromatografisi Avantajları; Basit Kolay Uygulanabilir Dezavantajları; Düşük kapasite Seyrelme Örneğin vizkozitesinin düşük olması gerekliliği

75 Afinite Kromatografisi Proteinlerin i diğer bir moleküle spesifik bağlanmaları ile ayrılmaları Seçimli ve Bağlanma geri dönüşümlü Ligantlar; Substratlar veya analogları, İnhibitörler(kompetitif), Metaller, Kofaktörler Antikorlar vb. Enzimler: Antikor: Lektin: Nükleik asit: Hormon, vitamin: Substrat, inhibitor, kofaktor Antijen, virus, hücre Polisakkarit, glikoprotein, hücre reseptörü Komplementer baz dizisi, histon, nukleik asit, polimeraz, bağlanan protein Reseptör, Taşıyıcı protein

76 Afinite Kromatografisinin Prensibi

77 Küçük MW Ligantlar Makromoleküler ligantlar Mono-spesifik Ligantlar Grup-spesifik Ligantlar Steroid, hormon reseptörler Staph.ProteinG - Human IgG Enzim inhibitörleri enzimler Strept.Protein A - Fc Antibody Enzim substratları- enzimler NAD,NADP Dehidrogenazlar Antikorlar(macro) antijenler Nukleotidler- bağlayıcı proteinler Biotin avidin Karbohidratlar - lektinler Polymixin B- endotoxin Lektinler(macro)-glikoproteinler Calmodulin- kinazlar, polimerazlar, dehidrogenazlar Pseudo(Biomimetic) Ligantlar Cibacron Blue F3 G-A; Kinazlar, fosfatazlar, dehidrogenazlar albumin, interferon vb. Procion Red HE- 3B; dehidrogenazlar, karboksi peptidaz, interferon Orange A: laktat dehidrogenaz Green A: CoA proteinleri

78 Küçük molekül kütleli ligantlar için; Spacer arm Hidrofilik Nötral Kararlı Protein bağlamamalı

79 Afinite Kromatografisi

80 Afinite Kromatografisi Prosedürü

81 Matriksler Matriks Agaroz (çapraz bağlı) Poliakrilamid/agaroz Akrilamid/akrilat id/ k Oligoetilenglikol/ metakrilat türevleri Silika (CPG: controlled pore glass) Affi-gel (Bio-Rad) Sepharose (Pharmacia) Acti-gel (Sterogene) Avid-gel (BioProbe) Reacti-gel ( Pierce) Ultragel (IBF) Eupergit (Fluka) Fractogel (Merck) TSK (Tosohaas)

82 Afinite Kromatografi Tipleri 1. Biyospesifik Afinite Kromatografisi 2. İmmüno Afinite Kromatografi 3. Lektin Afinite Kromatografi 4. Boya-Ligand Kromatografi 5. Metal-Şelat Kromatografi(IMAC) 6. Kovalent Kromatografi 7. Protein A Kromatografi

83

84 Afinite Kromatografisi Avantajları; Yüksek Spesifiklik Az saflaştırma adımı Düşük konsantrasyonlardaki hedef protein saflaştırılması Dezavantajları; Pahalı stasyoner faz Ligant seçiminin uygunluğu ve yeterliği Protein ligantların sert elüsyon koşullarında düşük stabiliteli olması

85 Kromatografik Tekniklerin Uygunluğu

86 Biyolojik bir kompartmanda bulunan proteinlerin i sayısı, fonksiyonların kompleksliği ile orantılı Sonuç: Kompleks sistemlerde yüksek ayırım gücüne sahip yöntemlerin kullanılması l ve geliştirilmesi gerekli!!!. Multidimensional i l Teknikler Kompleks protein/peptid karışımlarının multidimensional ayırımları; ortogonal ve birbiri ile uyumlu iki veya daha fazla ayırma yönteminin birlikte ( on-line / off-line ) kullanılmasını kapsar.

87 Multidimensional Teknikler Protein spesifik biyokimyasal ve biyofiziksel parametreler Elektroforez 2D-PAGE (Jel Tabanlı) IEF/SDS-PAGE CE/CE Kromatografi 2D-HPLC 3D-HPLC IEX/RP IEF/SCX/RP Afinite/RP RP/SCX/RP IEF/RP Afinite/SCX/RP SEC/RP CZE/RP, CIEF/RP, SEC/RP/CZE, IMAC/MEKC, GC/GC Kütle Spectrometrisi: on-line Biyoinformatik

88 Sonuç olarak, multidimensional ayırmalar tek yönlü yöntemler ile kıyaslandığında; 1. duyarlılık, 2. benzer grupların birbiri yanında ayırımları ve identifikasyonuna olanak sağlaması, 3. yüksek rezolüsyon, 4. doğru, tekrarlanabilir vehızlı sonuçlar alınabilmesi i 5. otomasyona müsait olması.nedeniyle değerli olup, geliştirilmeye açıktır.

89 Elektroforetik Teknikler Elektroforez; bir elektrik alanın etkisi altında yüklü bir partikülün göç etmesi olarak tanımlanabilir. Amino asitler, peptidler, proteinler, nükleotidler ve nükleik asitler gibi önemli biyolojik moleküller iyonize olan gruplar içerirler ve herhangi bir ph da elektrikçe yüklü katyonlar(+) veya anyonlar(-) olarak bulunurlar. Bir elektrik alan etkisi ile bu yüklü partiküller net yüklerine bağımlı ğ olarak katoda veya anoda doğru ğ göç ederler. Elektriksel alanda göç hızları veya mobiliteleri; alanın şiddetine, moleküllerin net yüküne, büyüklüğüne, şekillerine ve moleküllerin hareket ettikleri ortamın iyonik şiddetine, vizkozitesine ve sıcaklığına bağlıdır.

90

91 Elektroforetik Teknikler Jel Elektroforezi Protein Elektroforezi Proteinler; Amfoterik ( +, - ) Net yük ortamın ph sına bağımlı pi = ph net yük 0 ph> pi negatif yük, anoda göç ph< pi positif yük, katoda göç

92 Elektroforetik Teknikler Jel Elektroforezi PAGE uygulamaları l Saflık kkontrolü Fraksiyonlama Molekül Kütlesi Tayini İzoelektrik l Nokta Tayini i Alt birimlerin Belirlenmesi İzoenzimlerin belirlenmesi vb.

93 Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) Polimerizasyon Akrilamid; monomer N-N-metilen bis akrilamid; çapraz bağlayıcı NNN N t N,N,N,N -tetrametilen t til diamin(temed); i katalizör Amonyum persülfat; inisiyatör-katalizör

94 1. Doğal-PAGE PAGE Tipleri Biyolojik(enzim) aktivite kaybı yok. Mobiliteyi etkileyen faktörler: yük; molekül kütlesi ve şekil * Sürekli Bölge Elektroforezi (CZE) * Multifazik Bölge Elektroforezi (MZE) *N Non-İyonik İ Deterjanlar ile Elektroforez (Az Çözünür proteinler) 2. Denaturing-PAGE Biyolojik(enzim) aktivite kaybı var. *SDS SDS-PAGE(Molekül kütlesi) * Üre İçeren Jeller İzoelektrik Odaklama(IEF) 2D-PAGE

95 Doğal-PAGE; Sürekli Bölge Elektroforezi(CZE) Uniform akrilamit konsantrasyonu Homojen tampon sistemi Ayırım; yük ve moleküler kütle Jel konsantrasyonu ~ protein boyutu Tampon sistemi; bazik(ph ). Protein negatif yüklü; anoda göç Bazik proteinler anodik uçtan uygulanmalı l Avantajları Hızlı ve basit ph nın proteinin stabilitesine göre seçilebilmesi Dezavantajları Düşük ayırma kapasitesi Seyreltik örnekler için uygun değil

96 Doğal-PAGE PAGE; Multifazik Bölge Elektroforezi(MZE) Discontinuous Electrophoresis Disc elektroforezi Heterojen tampon sistemi Ayırım;Yük ve moleküler kütle SDS-PAGE e benzer; sadece SDS yok Avantajları Ayırma kapasitesi iyi Dezavantajı Protein-protein etkileşimleriş Değişik ph koşullarının stabiliteyi etkilemesi

97 2. Denaturing-PAGE; SDS-PAGE SDS (sodium dodecyl sulfate) proteinlerin net yükünü maskeler: proteinlerin hepsi negatif yüklü ve aynı şekilde Ayırım; Moleküler kütle(mr) 1.4 g SDS / g protein Kuvvetli denatüre edici DTT ve merkaptoetanol gibi indirgeyici ajanlar disülfit bağlarının parçalanması için kullanılır. l Na +

98 SDS-PAGE; Laemmli Sistemi i Düzenleyici i jel(stack) - ph ve iyonik şiddetin dengelenmesi -Örneğin konsantre edilmesi Band keskinleştirme etkisi; [Cl - ] > [protein-sds] > [glicinat] Anod/Katod Tamponu: Tris+Glisin+SDS; ph=8.3 Örnek Tamponu: Tris-Cl, ph=6.8) [protein-sds]

99 Dedeksiyon fiksasyon Etanol/asetic asit/su (4/1/5) [1 saat/ gece boyu] boyama Analitik Jeller; Gümüş boyama Mikropreparatif p Jeller; Coomassie Bril. Blue

100 Jel Boyama Tekniklerinin Dedeksiyon Duyarlılıkları Protein Dedeksiyon Duyarlılığı 100 ng CBB R 250 Boyama Tekniği ~ 100 ng Negatif-Zn-imidazol ng Negatif Cu ng CBB G ng Gümüş ng Gümüş + glutaraldehit 1-2 ng SYPRO floresan boyalar pg Radyokimyasal

101 Florosan Boyalar 1. Etidyum Bromür, 2. SYBR Yeşili, 3. Multipleks, 4. SYPRO Red, 5. SYPRO Orange, 6. Nile Red

102 Molekül Kütlesi Tayini (Mr)

103 İzoelektrik Odaklama (IEF) İzoelektrik noktalara göre ayırım. İzoelektrik Nokta Tayini

104 Blotlama (Elektrotransfer) PVDF (Polivinilidendiflorür) membranlara blotlama sonrası: Poinceau S, Amido Black, Coomassie blue R Sulforodamin, İmmuno dedeksiyon, Kolloidal Altın

105 2D- Elektroforez Binlerce proteinin tek adımda ayrılması İki iyi ayırma tekniğinin kombinasyonu; 1.Yön 2.Yön IEF : yüke bağımlı ayırma (ph gradienti) SDS-PAGE : moleküler kütleye bağımlı ayırma Her bir teknik kendi başına 100 bileşiği ayırma kapasitesine sahiptir. Birleştiklerinde ayırma teorik olarak 10 4 polipeptidtir.

106 2D- Elektroforez; Her tip hücre proteinlerinde kullanılabilir. (bitki, M/O, hayvan, hücre, doku kültürleri vb.) Bir adımda protein izolasyonu (dizi analizleri ve seçimli antikor tanımlanması) Kompleks protein karışımlarının ayrılması ve tanımlanması Kompleksliğin derecesinin belirlenmesi(heterojenlik) Genetikçe polimorfik materyallerin belirlenmesi pi ve MW (bağıl) belirlenmesi Kalite kontrol ve protein saflığının analizi Fonksiyonel protein bazında genetik farklanmaların analizleri, Hücre içeriğinin farklanması ve hastalık teşhisi, Post-translasyonel modifikasyonların belirlenmesi, Hücre proliferasyonu, farklanma ve transformasyonun incelenmesi, Subtraktif analizler,

107 2D-PAGE Örnek Hazırlığı İzoelektrik odaklama SDS-PAGE Protein Spot Dedeksiyonu Jellerin değerlendirilmesi

108 Örnek Hazırlığı Örneğin orijinine bağlı olarak farklanır. Sıvı azotta dondurma, öğütme, ğ sonikasyon-homojenizasyon 9 M üre, 1% DTT, 2-4 % w/v CHAPS, 2 % Amfolitler(pH 3-10), 10 mm proteaz inhibitörü Çözünürleştirme Ökaryotik dokulardaki proteinlerin çokluğu ve farklılığı; Ön-fraksiyonlama Optimizasyon

109 1. YÖN Izoelektrik Odaklama (IEF) Sürekli bir ph gradientinde izoelektrik noktalara göre ayırma (tüp jel/ipg)

110 İmmobilize ph Gradient strip kullanımı(ipg) ph gradienti; poliakrilamid matriks fiberlerine kopolimerizasyon ile oluşturulur. immobiline IPG-stripleri farklı ph aralıklarında ticari olarak temin edilebilmektedir. (örn; ph 3-10, 4-7, 3-6, 6-12, 4-5) Strip uzunluğu: (7, 11, 17, 24 cm) PROTEAN IEF HÜCRESİ

111 IEF Sonrası; dengeleme ve -S-S- bağlarının indirgenmesi(jeller) Tris-HCl (50 mm) ph 6.8, Üre 6 mm, Gliserol (30 % v/v), SDS (2 % w/v), DTE (2 %) solüsyonda 12 dak. bekletilir. -SH ların blokajı için; iyodoasetamid içeren benzer karışımda 5 dakika bekletilir. 2. Yöne uygulama hemen yapılmayacak ise -70 o C de petri kaplarında saklanabilir.

112 2D-PAGE: 2. Yön: SDS-PAGE Boyuta bağımlı ğ Ayırma Laemmli Sistemi Düzenleyici jel kullanılmaz Jel Boyutu Küçük Jeller; 6.5 x7.5 cm 100 protein spotu Büyük Jeller; 30 x 40 cm protein spotu

113 2D-PAGE fiksasyon Etanol/asetik asit/su (4/1/5) [1 saat / gece boyu] Boyama Gümüş Coomassie blue Floresan boyalar Radioizotopik İşaretleme vb.

114 Translasyon sonrası modifikasyonlar için kullanılabilecek l k bazı floresan jel boyaları Total protein SYPRO Ruby Gliko ikoprotein Pro-Q Emerald Fosfoprotein Pro-Q Diamond

115 pi ph 3 ph 10 Mr

116 2D-PAGE; Görüntüleme Lazer Scanner Fluorescence imager Phosphorimager 2D-PAGE Jellerin Değerlendirilmesi ğ il i İdentifikasyon ve Karakterizasyon Manual Bilgisayarlar Software Sistemleri (Otomatik Değerlendirme) Biyoinformatik Araçlar

117 2D-PAGE VERİ TABANLARI Image Data Biyolojik bir örnek için birden fazla referans jel haritaları Yazılı İnformasyon Verilen jeller üzerinde her bir spotun Verilen jeller üzerinde her bir spotun MW, IP, proteinin adı, identifikasyon metodu, bibliyografik referansları, diğer veritabanları ile kıyaslamaları

118 2D-PAGE VERİ TABANLARI WORLD-2DPAGE SWISS-2DPAGE YPM htpp:// YEAST 2D-PAGE htpp:// ECO2DBASE htpp:// f / Sub2D htpp:// Aberdeen 2-D db htpp:// Maize 2-D db htpp://moulon.moulon.inra.fr/imgd/ l f/i Fly 2-D db htpp://tyr.cmb.ki.se LSB 2-D db htpp://1scb.com/2dmaps/patterns.htm HSC-2DPAGE htpp:// harefield nhs HEART-2DPAGE htpp:// HP-2DPAGE htpp:// Danish 2-D db htpp://biobase.dk/cgi-bin/celis Emb.stem cell htpp:// A375 UCSF 2-D htpp://rafael.ucsf.edu/2dpagehome.html Colon carcinoma htpp://

119 Karakterizasyon

120 Proteomik Proteom teknolojisi, proteom çalışmaları ş Farklı dinamik koşullarda, hücre, doku veya vücut sıvılarındaki proteinlerin kantitatif analiz teknolojisi Tek-tek analiz global analiz Hipoteze dayalı araştırma keşife dayalı araştırma

121 Genomik Transkriptomik Proteomik DNA neyin mümkün olabileceğini, i RNA neyin olası olduğunu, Proteinler gerçekte ne olduğunu ifade eder Sonuç: İntegrasyon

122 Aynı Genom - Farklı Proteom Proteom 1 Biyolojik Değişimler (morfogenez) Proteom n Proteom 1 Proteom 2, 3, 4 Proteom n

123 Proteomik Ekspresyon (Klasik) Proteomik: Protein atlası oluşturulmasını Diferansiyal i protein ekspresyon analizi i Fonksiyonel (Targetted) Proteomik: Hücredeki tüm proteinlerin dinamik ekspresyonlarının belirlenmesi; Post-translasyonel modifikasyonlar Protein-protein, protein-ligand etkileşimleri Dizi yapı fonksiyon ilişkileri

124 Proteom Analizinde Genel Strateji Örnek hazırlığı Protein ve Peptidlerin Ayrılması Ayrılan protein ve peptidlerin i İdentifikasyonu(MS) Biyoinformatik (Veri Değerlendirmesi)

125 Temel Proteomik Analiz Şeması Multidimensional Teknikler Multidimensional Teknikler Protein spesifik biyokimyasal ve biyofiziksel parametreler

126 MS için Örnek Hazırlığığ Jelden spot kesimi ve parçalanması Yıkama (destaining) Parçalama (trypsin) Peptid ekstraksiyonu Temizleme (desalting) Zi Ti Pi tt Ti f ZipTip Pipette Tips for Microaffinity Biomolecule Purification

127 KÜTLE SPEKTROMETRİSİ Protein Analizi (MW, saflık) Protein identifikasyonu (haritalama) Peptid Dizi Analizi Post-translasyonel translasyonel modifikasyonların belirlenmesi Amino asit, karbohidrat ve lipid bileşenleri Karbohidrat dizi analizi Kaynak Analizör Dedektör MALDI-TOF, ESI-TOF, Q-TOF, nanolc-ms/ms, SELDI-TOF vb.

128 Klasik Proteom 2D-elektroforez Jellerin görüntülenmesi Jellerin Dökümantasyonu Jel Analizi ve Spot Seçimi Protein spotlarının çıkarılması pi.mw MS için örnek hazırlığı Protein veri tabanları Verilerin karşılaştırılması MALDI-TOF Benzer veri tabanları Diğer veri tabanları Oluşturulan veri tabanları Tüm Veriler

129 Global Protein Analizi; Fonksiyonel Proteom 2D-Jel Elektroforezi M W ph Subtraktif ktifanaliz Otomatik değerlendirme ile kıyaslama Diferansiyel protein dağılım seviyeleri Farklanmalar İlave spotlar Eksilen spotlar Artan/Azalan Kompozit jeller

130 Yardımcı Teknikler PRO OTEOMIK 2D-PAGE 2D-HPLC MALDI-TOF-MS Two Dimensional Polyacrylamide lamide Gel Electrophoresis Two Dimensional Liquid Chromatography Matrix Assisted Laser Desorption /I onization Time of Flight Mass Spectrometry LC-ESI-MS/MS Liquid Chromatography Electro Spray Ionization - Tandem Mass Spectrometry CIEF/MS 2D-DIGE ICAT FLIM/FRET LCM SELDI-MS Biochips Capillary Isoelectric Focussing Electrophoresis/ Electrospray mass spectrometry Two Dimensional Differential Imaging Gel Electrophoresis Isotope-Coded Affinity Taging Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy/ Fluorescence Resonance Energy Transfer Laser Capture Microdissection (Sample preparation of tissue specimens) Surface Enhanced Laser Desorption / Ionization Mass Spectrometry Protein/Peptide/Antibody Arrays Yeast-twotwo hybrid Assays (protein-protein interactions), Edman Degradation(N-terminalterminal sequence), Recognition molecule libraries, Affinity / Immunoaffinity, Removal of high abundance proteins, Computational function prediction, Crystallography, NMR, Transgenic animals, etc.